بررسی اثرات تجویز خوراکی متفورمین روی سیستم دفاعی آنتی اکسیدانی و سلول های ناحیه CA1 هیپوکمپ در رت های نر پیر سالم

یکی از وقایع اجتناب ناپذیری که در زندگی انسان رخ می دهد پدیده سالمندی است (1). سالمندی فرایند بیولوژیکی طبیعی است که با کاهش فیزیولوژیکال در توانایی های جسمانی و شناختی همراه است. کاهش در توانایی های شناختی به طور خاص، می تواند کیفیت زندگی افراد را چه در فرایند طبیعی پیری و چه در شرایط پاتولوژیکال از قبیل بیماری های تخریب کننده ی عصبی دچار اختلال کند. در طی فرایند پیری نرمال کاهش توانایی شناختی می تواند به عنوان نقص در حوزه های خاص از جمله حافظه اپیزودیک (Episodic or declarative)، یادگیری فضایی، حافظه کاری و توجه بروز نماید. بنابراین کاهش در توانایی های شناختی یک امر اجتناب ناپذیر در فرایند سالمندی حتی بدون وجود یک بیماری نورولوژیکال مثل آلزایمر محسوب می شود (2, 3). با این حال، تفاوت های قابل توجهی بین افراد در تظاهرات این تغییرات شناختی وجود دارد که به دلیل تنوع در انعطاف پذیری و ذخیره شناختی می باشد. از این عوامل می توان به آموزش، هوش و تحریک ذهنی نام برد که مغز را قادر می سازد تا با آسیب های پاتولوژیک سازگار شده و عملکرد شناختی را حفظ کند. پیری همچنین همراه با بیماری های مختلف تخریب کننده ی عصبی است که شایع ترین آن بیماری آلزایمر است. با توجه به پیشرفت در مراقبت های بهداشتی و به دنبال آن افزایش امید به زندگی در مردم و نیز عدم وجود درمان مؤثر، شیوع بیماری های تخریب کننده ی عصبی در حال افزایش بوده و بار قابل توجهی را برای مردم ایجاد می کند (4).

مطالعات متعددی نشان داده اند که تغییرات ساختاری و سلولی در هیپوکمپ در طی فرایند پیری نرمال می توانند فرایند های شناختی همپون حافظه و جهت یابی فضایی را تحت تأثیر قرار دهند (5). هیپوکمپ گسترشی از کورتکس مغز است که به صورت لایه ای متراکم از نورون ها به شکل S در سمت داخل لوب تمپورال مغز قرار گرفته و به عنوان بخشی از سیستم لیمبیک محسوب می شود (6). اگر چه هیپوکمپ در ناحیه ساب کورتیکال مغز قرار گرفته است، اما به عنوان ساختاری ساب کورتیکال محسوب نمی شود. هیپوکمپ اولین ساختاری است که به شدت در بسیاری از اختلالات عصبی (Neuropsychiatric) از قبیل آلزایمر و صرع تحت تأثیر قرار می گیرد (7). مطالعات نشان داده اند که آسیب به هیپوکمپ می تواند موجب هر دو فراموشی رو به جلو (Anterograde amnesia) و رو به عقب (Retrograde amnesia) شود (8). هیپوکمپ نه تنها در فعالیت هایی از قبیل حافظه و یادگیری نقش بسزایی دارد، بلکه در جهت یابی فضایی (9)، حس بویایی (10)، رفتارهای عاطفی (11) و نیز در تنظیم فعالیت های هیپوتالاموس (12)  فعالیت دارد. یکپارچگی ساختاری و عملکردی هیپوکامپ برای یادگیری طبیعی و تثبیت حافظه حیاتی است و این ساختار به ویژه در فرایند پیری آسیب پذیر است (13). تحقیقات نشان داده است که تغییرات ساختاری و عملکردی هیپوکامپ با شدت و توسعه اختلالات تخریب کننده ی عصبی همراه با کاهش توانایی های شناختی در ارتباط است. در واقع، بسیاری از نقایص شناختی که با پیری دیده می شود، می تواند در مدل های حیوانی که دارای آسیب های هیپوکامپ دو طرفه هستند هر چه بیشتر نقش کلیدی هیپوکامپ را در فرایند پیری و توانایی های شناختی نشان دهد (13).

تغییرات سلولی زیادی با افزایش سن در مغز بوجود می آید. برای توضیح روند پیری، بیش از 300 نظریه پیشنهاد شده است، اما هیچ یک از آنها هنوز به طور کلی توسط متخصصان سالمند شناسی پذیرفته نشده است. اما با این وجود، مورد قبول ترین نظریه برای تغییرات مغزی مرتبط با پیری و کاهش توانایی های شناختی، نظریه رادیکال های آزاد است که به عنوان یک توضیح قابل قبول از واکنش های شیمیایی اولیه بر اساس فرایند پیری می باشد (14, 15). این نظریه بیان می کند که پیری منجر به افزایش فرآیندهای اکسیداتیو و کاهش مکانیسم های دفاعی آنتی اکسیدانی اندوژنوس می شود که به نوبه ی خود منجر به انباشت گونه های واکنش پذیر اکسیژن (Reactive oxygen species) و گونه های واکنش پذیر نیتروژن (Reactive nitrogen species) می شود. بنابراین در نتیجه ی آسیب به ماکرومولکول های سلولی از قبیل DNA، لیپید ها و پروتئین ها (14)، با اختلال عملکرد میتوکندری و تولید گونه های واکنش پذیر اکسیژن بیشتر همراه است (16). تحت شرایط طبیعی سیستم آنتی اکسیدانی  و گونه های واکنش پذیر اکسیژن در بدن در حالت تعادل می باشند. عدم تعادل بین تولید و سطوح گونه های واکنش پذیر اکسیژن  در بدن می تواند باعث ایجاد آسیب های اکسیداتیو گردد که در این صورت حمله گونه های واکنش پذیر اکسیژن به تمام بیوملکول ها در سلول ها منجر به مرگ سلولی و ایجاد بیماری های تخریب کننده ی عصبی در مغز شوند (17). تحت شرایط فیزیولوژیکی نرمال، میتوکندری های مغز ارگانل های حیاتی برای تولید انرژی به منظور انجام عملکردهای سلولی محسوب می شوند. محصول جانبی زنجیره های تنفسی میتوکندری، گونه های واکنش پذیر اکسیژن هستند (18). افزون براین مشخص شده است که میتوکندری های مغزی در انتقال عصبی وابسته به انرژی و تنظیم همومئوستاز یون کلسیم نقش دارند که این اعمال مکانیسم های مهمی در فرایندهای یادگیری و حافظه محسوب می شوند (19).

در شرایط نرمال اکسید کنندهایی مانند ROS و RNS  نقش مهمی در سیگنالینگ و پلاستیسیتی سیناپسی دارند. در واقع، حفظ حالت اکسایش-کاهش داخل سلولی برای عملکرد مناسب گیرنده NMDA در سیناپس های هیپوکامپ در بستر عصبی حافظه Long term potentiation (LTP) و همچنین برای عملکرد نورونی در SGZ هیپوکامپ حیاتی است (20). در رت های پیر، اختلالات LTP هیپوکامپ همراه با افزایش آسیب های اکسیداتیو به لیپیدهای سلولی همراه بود (21). بنابراین، اختلال در تنظیم وضعیت اکسایش-کاهش درون سلولی به عنوان همراه با فرآیند پیری طبیعی می تواند عواقب زیان آوری برای عملکرد نورونی و نیز پلاستیسیتی سیناپسی داشته باشد.

عوامل مختلفی به عدم تعادل در وضعیت اکسایش-کاهش داخل سلولی مرتبط با پیری کمک می کنند. افزایش در سطوح آنزیم های دخیل در تولید انرژی و افزایش استرس های اکسیداتیو و پراکسیداسیون لیپیدها (سطح مالون دی آلدئید) در هیپوکامپ مدل های مختلف جوندگان پیر گزارش شده است (22). افزون بر این، پیری با افزایش آسیب اکسیداتیو به غشای سلولی و اختلال عملکرد میتوکندریایی در هیپوکامپ مرتبط بوده، که این امر بر فرآیندهای نقل و انتقال و سطوح سوبستراهای مختلف اثر گذاشته و موجب کاهش عملکردهای مربوط به هیپوکمپ می شود (23). کاهش در عوامل آنزیمی و غیر آنزیمی سیستم آنتی اکسیدانی در هیپوکمپ انسان و جوندگان مشاهده شده است (24). این کاهش در سطوح آنتی اکسیدان ها در نتیجه ی محافظت عصبی در برابر آسیب اکسیداتیو و آسیب های مرتبط با آن روی می دهد. بنابراین افزایش حساسیت انتخابی هیپوکامپ به استرس اکسیداتیو افزایش می یابد. از سوی دیگر، کاهش توانایی های شناختی مرتبط با سن و افزایش سطح ROS هیپوکامپ می تواند با درمان آنتی اکسیدان کاهش یابد (25, 26).

متفورمین (1,1-dimethylbiguanide) یک داروی ضد دیابت از دسته ی بی گوانیدهاست که به صورت خوراکی، ارزان و قابل تحمل در دسترس بوده و به طور گسترده ای به منظور درمان دیابت نوع 2 استفاده می شود (27). متفورمین علاوه بر این که به عنوان یک داروی ضد دیابتی شناخته می شود، به علت دارا بودن خواص آنتی اکسیدانی و ضد التهابی اثرات محافظت کنندگی عصبی دارد (28). با این وجود مکانیسم های احتمالی اثرات محافظت کنندگی متفورمین در مدل بیماری ها هنوز به خوبی شناخته نشده اند (29).

مطالعه Labuzek و همکاران  نشان داد که متفورمین می تواند به راحتی و به سرعت از سد خونی-مغزی عبور کند و عنوان نمود که متفورمین دارای اثرات سودمندی از قبیل اثرات ضد التهابی و محافظت کنندگی عصبی است (30). مطالعات دیگری اثرات مفید متفورمین را در بیماران مبتلا به دیابت نوع 2 به ظرفیت آنتی اکسیدانی آن نسبت دادند. Sykiotis بیان نمود که متفورمین باعث فعال شدن Nrf2 می شود که به عنوان یک تنظیم کننده آنتی اکسیدانی عمل نموده و از طریق جابجایی هسته ای خود و فعال کردن عناصر واکنش آنتی اکسیدانی موجب تنظیم هومئوستاز آنزیم های سیستم آنتی اکسیدانی در بیماران دیابت نوع 2 می شود (31). در مطالعه ای که Martin-Montalvo و همکاران به انجام رساندند نشان داد که متفورمین از طریق کاهش استرس های اکسیداتیو و التهاب می تواند موجب سلامتی و افزایش طول عمر در موش های آزمایشگاهی شود (32). در مطالعه دیگری که توسط Algire و همکارانش انجام گرفت نشان داد که متفورمین می تواند باعث کاهش ROS و آسیب DNA شود (33).

با توجه به افزایش روز افزون جمعیت سالمندان در جوامع و مشکلاتی که فرایند پیری طبیعی در توانایی های شناختی آنان، ناشی از آسیب های اکسیداتیو به دنبال گونه های واکنش پذیر اکسیژن و بر هم خوردن سیستم آنتی اکسیدانی بوجود می آید، بنابراین تحقیق،کشف، دنبال و استفاده از داروهایی که با استفاده از آنان بتوان مشکلات شناختی ناشی از افزایش سن را کاهش داد یا به تعویق انداخت پیش از پیش از اهمیت زیادی برخوردار می شود. لذا هدف از انجام مطالعه حاضر بررسی اثرات متفورمین روی سیستم دفاعی آنتی اکسیدانی و سلولهای ناحیه CA1هیپوکمپ در رت های نر پیر می باشد.

• میانگین میزان فعالیت ظرفیت آنتی اکسیدانی کل (TAC) در هیپوکمپ گروه های مورد مطالعه متفاوت است.
• میانگین سطح فعالیت مالون دی آلدئید (MDA) در هیپوکمپ گروه های مورد مطالعه متفاوت است.
• میانگین تعداد سلول های سالم ناحیه CA1 هیپوکمپ در گروه های مورد مطالعه متفاوت است.
• میانگین آپوپتوتیک ایندکس در گروه های مورد مطالعه متفاوت است.

بررسی اثرات تجویز خوراکی متفورمین روی سیستم دفاعی آنتی اکسیدانی و سلول های ناحیه CA1 هیپوکمپ در رت های نر پیر سالم

• مقایسه میانگین سطح فعالیت مالون دی آلدئید (MDA)در هیپوکمپ گروه های مورد مطالعه.
• مقایسه میانگین ظرفیت آنتی اکسیدانی کل(TAC)در ناحیه هیپوکمپ گروه های مورد مطالعه.
•  مقایسه میانگین تعداد سلول های سالم در بافت ناحیه CA1 هیپوکمپ گروه های مورد مطالعه.
• مقایسه میانگین آپوپتوتیک ایندکس در گروه های مورد مطالعه.

 مراکز تحقیقاتی وپژوهشی وزارت بهداشت

پیری (Aging):پیری فرایند بیولوژیکی طبیعی است که با کاهش فیزیولوژیکال در توانایی های جسمانی و شناختی همراه است.

متفورمین: یک داروی ضد دیابت از دسته ی بی گوانیدهاست که به صورت خوراکی، ارزان و قابل تحمل در دسترس بوده و به طور گسترده ای به منظور درمان دیابت نوع 2 استفاده می شود.

هیپوکمپ: هیپوکمپ گسترشی از کورتکس مغز است که به صورت لایه ای متراکم از نورون ها به شکل S در سمت داخل لوب تمپورال مغز قرار گرفته و به عنوان بخشی از سیستم لیمبیک محسوب می شود. هیپوکمپ نه تنها در فعالیت هایی از قبیل حافظه و یادگیری نقش بسزایی دارد، بلکه در جهت یابی فضایی، حس بویایی، رفتارهای عاطفی  و نیز در تنظیم فعالیت های هیپوتالاموس  فعالیت دارد. یکپارچگی ساختاری و عملکردی هیپوکامپ برای یادگیری طبیعی و تثبیت حافظه حیاتی است و این ساختار به ویژه در فرایند پیری آسیب پذیر است.

دراین مطالعه پژوهش انجام شده از نوع تجربی می باشد.

جامعه مورد مطالعه رت های نر پیر سالم  نژاد ویستار با سن 18 ماه به وزن تقریبی 450-400 گرم می باشند.

  –معیار خروج: هر گونه تغییری که نشان دهنده ی عدم تحمل درمان با متفورمین باشد از جمله ضعف شدید جسمانی و کاهش شدید وزن

در این مطالعه 32 سر ( n=  16) رت  نژاد ویستار استفاده خواهد شد حجم نمونه و محاسبه آن طبق مقالات انجام شده است (34).  

تخصیص رت ها به گروه های مورد مطالعه به صورت تصادفی خواهد بود.

فرم اطلاعاتی شامل نتایج مربوط به میزان فعالیت مالون دی آلدئید، آنتی اکسیدان کل و نتیجه شمارش سلولهای سالم و آپوپتوتیک هیپوکمپ در تمام گروه های مورد مطالعه می باشد.

در این تحقیق از تعداد32 سر رت نر نژاد ویستار در محدوده سنی 18 ماه  استفاده خواهد شد . حیوانات در شرایط استاندارد و با دوره روشنایی و تاریکی 12ساعته و دمای 3±21 نگهداری و دسترسی آزاد به آب و غذا خواهند داشت و به روش تصادفی در گروههای زیر قرار داده خواهند شد :

گروه Control: هیچ مداخله ای صورت نمی گیرد . 

گروه Metformin : به مدت 6 ماه  روزانه  100mg/kg متفورمین از طریق آب آشامیدنی دریافت خواهند کرد.(34)

انجام آنالیزهای بیوشیمیایی:

یک روز پس از آخرین دوز دارو نیمی از حیوانات در هر گروه ( n=8) تحت بیهوشی عمیق نخاعی گردیده و مغز خارج می شود و هیپوکمپ دوطرف به سرعت خارج و در محلول تریس سرد قرار می گیرد. نمونه هیپوکمپ با محلول تریس  9/0 مولار سرد هموژنیزه و سپس در دمای 4 درجه سانتی گراد  با دور 12000 به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ  شده و محلول رویی جدا و میزان مالون دی آلدئید و آنتی اکسیدان کل اندازه گیری خواهند شد. 

اندازه گیری سطح مالون دی آلدئید(MDA):

میزان MDA با کمک تست تیوباربیتوریک اسید (TBA) اندازه گیری خواهد شد  ونهایتا لایه رنگی حاصل در طول موج 535 نانومتر اندازه گیری می شود . از تترامتوکسی پروپان به عنوان استاندارد MDA استفاده خواهد شد (35).

اندازه گیری ظرفیت آنتی اکسیدانی کل (TAC):

برای اندازه گیری قدرت آنتی اکسیدانی تام  از روش FRAP(Ferric reducing antioxidant power) استفاده می گردد . به طور خلاصه در این روش توانایی سوپرناتانت هیپوکمپ در احیای یون های فریک (Fe3+) اندازه گیری می شود . با احیای یون های فریک و تبدیل آن به یون های فرو (Fe2+) در PH اسیدی و با حضور معرف اختصاصی TPTZ ، کمپلکس آبی رنگی ایجاد می شود که در طول موج 593 نانومتر و بصورت اسپکتروفتومتریک  قابل اندازه گیری است(36).

آزمایشات هیستوپاتولوژیکی:

مغز نیمی دیگر از حیوانات (8n=) در هر گروه تحت بیهوشی عمیق پس از فیکساسیون به روش پرفیوژن ترانس کاردیال خارج و در فرمالین 10% قرار داده خواهند شد.پس از آن نمونه ها فیکس ونهایتاً قالب­گیری با پارافین و برش­ گیری کرونال با ضخامت 5 میکرون انجام خواهد شد . سپس نمونه ها با رنگ کریزیل ویوله رنگ آمیزی می شوند سلولهای سالم ناحیه CA1 هیپوکمپ شمارش و میانگین تعداد سلولهای سالم در گروههای مورد مطالعه محاسبه خواهد شد .

 آزمایشات ایمونوهیستوشیمی

رنگ آمیزی تانل جهت تشخیص سلولهای تانل مثبت طبق پروتکل شرکت Roche انجام خواهد گرفت بطور خلاصه : نمونه های پارافینه پس از دپارافینه شدن، توسط الکل های نزولی آبدهی می شوند . نفوذ پذیری توسط انکوبه کردن  نمونه ها با 20 μg/mlپروتئیناز K انجام خواهد شد . پس از آن نمونه ها توسط کیت تانل به مدت 1 ساعت انکوبه می گردند .و پس از سه بار شستشو با بافر فسفات  ، به مدت نیم ساعت با POD انکوبه خواهند شد . نهایتا با ریختن DAB  و رنگ آمیزی زمینه ای با هماتوکسیلین نمونه ها در الکل های نزولی آبگیری و با چسب انتلان مونت خواهند شد و با میکروسکوپ نوری و بزرگنمایی×400 سلول ها یی با هسته قهوه ای رنگ در 5 فیلد شمارش و آپوپتوتیک ایندکس محاسبه می گردد . محاسبه آپوپتوتیک ایندکس : (تعداد سلولهای تانل مثبت ÷ کل سلولها ی شمارش شده ) ×  100 (37).

   برای آنالیز داده ها از نرم افزار SPSS استفاده خواهد شد. برای بررسی تفاوت بین دو گروه از آزمون تی مستقل (Independent T-test) استفاده خواهد شد و در صورت نرمال نبودن داده ها از معادل غیرپارامتریک آن استفاده خواهد شد. سطح معنی داری برای تحلیل داده ها، P<0.05 در نظر گرفته می شود.

چک لیست کار با حیوانات آزمایشگاهی بر اساس کدهای راهنمای کار با حیوانات ابلاغی وزارت بهداشت' تکمیل و ضمیمه شده است.  در تمام مراحل، کار با حیوانات آزمایشگاهی بر اساس پروتوکل استاندارد کار با حیوانات آرمایشگاهی عمل خواهدشد.

مرگ و میر احتمالی حیوانات - افزایش قیمت مواد و تهیه مواد

جهت جلوگیری  از کاهش احتمالی حجم نمونه 3 نمونه در هر گروه اضافه می گردد .

متفورمین- هیپوکمپ – سیستم دفاع آنتی اکسیدانی

         .1Hajjar R, Atli T, Al-Mandhari Z, Oudrhiri M, Balducci L, Silbermann M. Prevalence of aging population in the Middle East and its implications on cancer incidence and care. Annals of oncology. 2013;24(suppl_7):vii11-vii24.

2.         Kausler DH. Learning and memory in normal aging: Academic Press San Diego, CA:; 1994.

3.         Salthouse TA. Selective review of cognitive aging. Journal of the International neuropsychological Society. 2010;16(5):754-60.

4.         Bettio LE, Rajendran L, Gil-Mohapel J. The effects of aging in the hippocampus and cognitive decline. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 2017;79:66-86.

5.         Terry Jr AV. Spatial navigation (water maze) tasks. Methods of behavior analysis in neuroscience. 2000;2.

6.         Gilbert PE, Brushfield AM. The role of the CA3 hippocampal subregion in spatial memory: a process oriented behavioral assessment. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 2009;33(5):774-81.

7.         Frisoni GB, Fox NC, Jack Jr CR, Scheltens P, Thompson PM. The clinical use of structural MRI in Alzheimer disease. Nature Reviews Neurology. 2010;6(2):67.

8.         Preilowski B. Remembering an amnesic patient (and half a century of memory research). Fortschritte der Neurologie-Psychiatrie. 2009;77(10):568-76.

9.         Stella F, Cerasti E, Si B, Jezek K, Treves A. Self-organization of multiple spatial and context memories in the hippocampus. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 2012;36(7):1609-25.

10.       Soudry Y, Lemogne C, Malinvaud D, Consoli S-M, Bonfils P. Olfactory system and emotion: common substrates. European annals of otorhinolaryngology, head and neck diseases. 2011;128(1):18-23.

11.       Toyoda H, Li X-Y, Wu L-J, Zhao M-G, Descalzi G, Chen T, et al. Interplay of amygdala and cingulate plasticity in emotional fear. Neural plasticity. 2011;2011.

12.       Koehl M, Abrous DN. A new chapter in the field of memory: adult hippocampal neurogenesis. European Journal of Neuroscience. 2011;33(6):1101-14.

13.       Geinisman Y, Detoledo-Morrell L, Morrell F, Heller RE. Hippocampal markers of age-related memory dysfunction: behavioral, electrophysiological and morphological perspectives. Progress in neurobiology. 1995;45(3):223-52.

14.       Harman D. A theory based on free radical and radiation chemistry. J. ior. Handbook of Essential Fatty Acid Biology: Biochemistry, Physiology. 1956.

15.       De la Fuente M. Effects of antioxidants on immune system ageing. European Journal of Clinical Nutrition. 2002;56(S3):S5.

16.       Balaban RS, Nemoto S, Finkel T. Mitochondria, oxidants, and aging. Cell. 2005;120(4):483-95.

17.       Scandalios J. Oxidative stress: molecular perception and transduction of signals triggering antioxidant gene defenses. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 2005;38(7):995-1014.

18.       Wang CH, Wang CC, Wei YH. Mitochondrial dysfunction in insulin insensitivity: implication of mitochondrial role in type 2 diabetes. Annals of the New York Academy of Sciences. 2010;1201(1):157-65.

19.       Moreira PI, Santos MS, Seiça R, Oliveira CR. Brain mitochondrial dysfunction as a link between Alzheimer's disease and diabetes. Journal of the neurological sciences. 2007;257(1):206-14.

20.       Huang T-T, Zou Y, Corniola R, editors. Oxidative stress and adult neurogenesis—effects of radiation and superoxide dismutase deficiency. Seminars in cell & developmental biology; 2012: Elsevier.

21.       Lynch MA. Analysis of the mechanisms underlying the age-related impairment in long-term potentiation in the rat. Reviews in the Neurosciences. 1998;9(3):169-202.

22.       Yang S, Liu T, Li S, Zhang X, Ding Q, Que H, et al. Comparative proteomic analysis of brains of naturally aging mice. Neuroscience. 2008;154(3):1107-20.

23.       Reddy PH. Amyloid beta, mitochondrial structural and functional dynamics in Alzheimer's disease. Experimental neurology. 2009;218(2):286-92.

24.       Venkateshappa C, Harish G, Mahadevan A, Bharath MS, Shankar S. Elevated oxidative stress and decreased antioxidant function in the human hippocampus and frontal cortex with increasing age: implications for neurodegeneration in Alzheimer’s disease. Neurochemical research. 2012;37(8):1601-14.

25.       Romanucci M, Della Salda L. Oxidative stress and protein quality control systems in the aged canine brain as a model for human neurodegenerative disorders. Oxidative medicine and cellular longevity. 2015;2015.

26.       Souza LC, Antunes MS, Borges Filho C, Del Fabbro L, de Gomes MG, Goes ATR, et al. Flavonoid Chrysin prevents age-related cognitive decline via attenuation of oxidative stress and modulation of BDNF levels in aged mouse brain. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 2015;134:22-30.

27.       Sharma S, Tandon VR, Roshi AM. Prescribing pattern of oral antihyperglycaemic drugs, rationality and adherence to American Diabetes Association (ADA) treatment guidelines among type 2 diabetes mellitus (T2DM) postmenopausal women. Journal of clinical and diagnostic research: JCDR. 2016;10(1):OC11.

28.       Rojas LBA, Gomes MB. Metformin: an old but still the best treatment for type 2 diabetes. Diabetology & metabolic syndrome. 2013;5(1):6.

29.       Khang R, Park C, Shin J-H. The biguanide metformin alters phosphoproteomic profiling in mouse brain. Neuroscience letters. 2014;579:145-50.

30.       Łabuzek K, Suchy D, Gabryel B, Bielecka A, Liber S, Okopień B. Quantification of metformin by the HPLC method in brain regions, cerebrospinal fluid and plasma of rats treated with lipopolysaccharide. Pharmacological Reports. 2010;62(5):956-65.

31.       Sykiotis GP, Bohmann D. Stress-activated cap'n'collar transcription factors in aging and human disease. Sci Signal. 2010;3(112):re3-re.

32.       Martin-Montalvo A, Mercken EM, Mitchell SJ, Palacios HH, Mote PL, Scheibye-Knudsen M, et al. Metformin improves healthspan and lifespan in mice. Nature communications. 2013;4:2192.

33.       Algire C, Moiseeva O, Deschênes-Simard X, Amrein L, Petruccelli L, Birman E, et al. Metformin reduces endogenous reactive oxygen species and associated DNA damage. Cancer Prevention Research. 2012;5(4):536-43.

34.     Ashrostaghi Z, Ganji F, Sepehri H. Effect of metformin on the spatial memory in aged rats. National Journal of Physiology, Pharmacy and Pharmacology. 2015;5(5):416-20.      

35.      Ohkawa, H., N. Ohishi, and K. Yagi, Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Analytical biochemistry, 1979. 95(2): p. 351-358.

36.     Benzie, I.F., Strain, J.J. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of 'antioxidant power': the FRAP assay. Anal. Biochem, 1996. 239: p. 70-76.

37.     Sarbishegi M, Khajavi O, Arab MR. Withania coagulans extract induces cell apoptosis and inhibits COX-2 expression in a rat model of benign prostatic hyperplasia. Nephro-urology monthly. 2016;8(5).

چک لیست کار با حیوانات آزمایشگاهی ضمیمه می باشد