ارزیابی اثرات دیوسمین بر حافظه و یادگیری متعاقب استفاده از علف کش پاراکوات در مدل حیوانی رت

پاراکوات یک علف کش قوی می باشد که برای کنترل علفهای هرز در کشاورزی بطور وسیعی استفاده می شود. این علف کش برای انسان و حیوانات نیز بسیار سمی می باشد و فعالیت اندامهای مختلفی نظیر ریه ها̨  کبد̜  سیستم عصبی و ... را دچار مشکل می سازد (1). سالیانه حدود دو میلیون نفر در کشورهای در حال توسعه بدلیل مسمومیت با آفت کشها در بیمارستان بستری می شوند که مسمومیت با پاراکوات بخش قابل توجهی از این مسمومیت ها را تشکیل می دهد.  مسمومیت با پاراکوات بالاترین میزان تلفات را در بین این مسمومیتها نیز بهمراه دارد (2). یکی از دلایل تلفات بالای این سم توزیع سریع آن در سراسر بدن می باشد. در موارد مسمومیت شدید پاراکوات (40 mg/kg) بدلیل اختلال در فعالیت ارگانهای مختلف ظرف چند ساعت الی یک یا دو روز بعداز مسمومیت منجر به مرگ می شود (3).

سمیت پاراکوات بدلیل تولید گونه های اکسیژن واکنشگر (ROS) می باشد. پاراکوات بوسیله سیستمهای آنزیمی متعددی در بدن متابولیزه می شود که مهمترین این سیستمها :NADPH  –سیتوکروم P450 ردوکتاز̜، گزانتین اکسیداز̜، NADPH- یوبی کوئینون اکسیدوردوکتاز̜  و نیتریک اکسید سینتاز می باشند (4).  متابولیسم پاراکوات از طریق این سیستمها تولید یک رادیکال منو کاتیون پاراکوات)  (PQ^.+ می کند. در داخل سلول این رادیکال بسرعت اکسیده می شود و PQ²⁺ بدست می آید و در این پروسه سوپراکسید تولید می شود. در این واکنش سوپراکسید بعنوان گیرنده الکترون و NADP بعنوان دهنده الکترون عمل می کنند. این واکنش در حضور آهن از طریق واکنش فنتون ادامه می یابد و تشکیل رادیکال آزاد هیدروکسیل می کند. پاراکوات بطور مستقیم یا غیر مستقیم نیتریک اکسید سینتاز را برای تولید نیتریک اکسید نیز فعال می کند. نیتریک اکسید با سوپراکسید ترکیب می شود و تولید پراکسی نیتریت می کند. تولید گونه های اکسیژن و نیتریت واکنشگر باعث مسمومیت و آسیب اکثر ارگانهای بدن می شود (4).

بدلیل مرگ ناشی از نارسایی ریوی̜ کلیوی و کبدی در مسمومیت با پاراکوات سالیان متعددی مطالعات این مسمومیت روی این اندامها متمرکز بوده است. تمایل به مطالعه سمیت عصبی پاراکوات از آنجایی مورد توجه قرار گرفت که محققین متوجه شباهت ساختمانی آن با MPTP شدند (5). MPTP نوروتوکسینی است که منجر به القائ پارکینسون در حیوانات و انسان می شود. تحقیقـات نشـان داده اسـت کـه کاربرد برخــی از انــواع آفتکشهــا از جملــه پاراکــوآت در مــزارع کشـاورزی باعـث اختـلالات عصبـی از جملـه پارکینسـون یـا لرزش غیر ارادی اندامهای بدن می شود. افــرادی کــه در تمـاس مسـتقیم بـا ایـن مـواد شـیمیایی قـرار می گیرنـد بیشـتر در معـرض خطـر ابتـلاء بـه بیمـاری پارکینسـون قـرار دارنــد ایــن افــراد شــامل کشــاورزان و کارگرانــی هســتند کــه در بخــش کشــاورزی یــا در کارخانـه تولیــد ســم کار می کننــد. همچنیــن آشــکار شــده اســت افــرادی کــه در حوالــی مناطقــی زندگــی می کننــد کــه در معــرض آفتکش هــا قــرار دارنــد احتمــال بــروز بیمــاری پارکینســون در آنها بیشتر است (6).

 این سم در سیستم عصبی نورونهای دوپامینرژیک را تحت تاثیر قرار می دهد و می تواند باعث بیماریهای نورودژنراتیو گردد. مطالعات نشان داده است که آسیب نورونهای دوپامینرژیک در مسیر نیگرواستریتال ناشی از تولید بیش از حد گونه های اکسیژن واکنشگر (ROS) بوده است که بدلیل اختلال در عملکرد میتوکندریها بوجود می آید (6).

هیپوکامپ به عنوان دروازه ورودی اطلاعات به قشر مغز عمل می کند (7). پس هرگونه اختلالی در این بخش سبب عدم تثبیت مناسب اطلاعات خواهد شد و فرایند یادگیری را مختل خواهد کرد (7). هیپوکامپ از نواحی مهم سیستم عصبی در تشکیل حافظه ی فضایی می باشد (8). یادگیری فضایی یک نوع از یادگیری لحظه ای می باشد که در آن نواحی مانند لوب گیجگاهی میانی، هیپو کامپ و نواحی قشر جلویی پیشانی دخیل است (9). هیپوکامپ به عنوان قسمتی از دستگاه لیمبیک نسبت به  سموم کشاورزی و بیماری های نورودژنراتیو احساس می باشد (10, 11). تزریق پاراکوات در هیپوکامب باعث آسیب سلولهای هیپوکامپ و تشنجهای ناشی از اختلال در دستگاه لیمبیک شده است (4).

مروری بر مطالعات

پاراکوات اولین بار در سال 1882 بوسیله Rosson & Weidel توصیف شد و در سال 1962 بعنوان یک علف کش وسیع الطیف غیر انتخابی و تماسی به بازار معرفی گردید (12). Kriscenski-Perry و همکاران در سال 2002 مشاهده کردند که پاراکوات و استرس گرمایی در تخریب نورونهای حرتی نخاع دارای اثر سینرژستیک هستند (13). در سال 2007 Stelmashook  و همکاران نشان دادند که نورونهای گرانولی مغزی بالغ و نابالغ در موشهای صحرایی بوسیله پاراکوات کشته شدند (14). مطالعات روی حیوانات آزمایشگاهی بوسیله Fei و همگاران (2008)  و Kang و همکاران (2009) نشان داد که دوز خوراکی پاراکوات به میزان 10 mg/kg برای 4 ماه یا دوز مشابهه بصورت داخل صفاقی دو بار در هفته برای سه هفته متوالی باعث آسیب اعصاب در جسم تیره می شود (15, 16).

هیپوکامب نقش مهمی در یادگیری و حافظه در مغز بعهده دارد. در مورد اثرات پاراکوات روی هیپوکامب Melchiorri و همکاران در سال 1998 گزارش کردند که تزریق پاراکوات در هیپوکامب موشهای صحرایی باعث تشنجهای لیمبیک و آسیب سلولهای هیپوکامب می شود (17). مطالعات James و همکاران در سال 1998 روی کشتهای ارگانوتیپیک هیپوکامب نشان داد که پاراکوات بطور انتخابی باعث آسیب سلولهای CA1  می شود.  اگرچه بطور وسیعی اثرات سمیت پاراکوات روی مغز و هیپو کامب بررسی گردید ولی تا سال 2010 مکانیسم این سمیت روی سلولهای هیپوکامب بررسی نشده بود. تا اینکه Chen  و همکاران در سال 2010 مکانیسم آن را بررسی نمودند.  مطالعه Chen  و همکاران نشان داد که بعد از تجویز خوراکی پاراکوات یک بار در روز به مدت 28 روز با دوزmg/kg  8ʻ سلولهای هیپوکامب نامنظم گشته و سیتو پلاسم آنها متراکم گردید (4). تعداد اجسام نیسل این سلولها کاهش یافته  و نورونهای آپوپتوزی و نکروز یافتهʻ مشاهده گردید. مقادیر مالون آلدئید (MDA) و تولید گونه های اکسیژن واکنشگر در هیپوکامب موش افزایش یافت (4). فعالیت تام آنزیم سوپراکسید دیسموتاز (SOD)  بعد از تیمار با پاراکوات بطور معنی دار ی کاهش یافت (18). غلظت ATP نیز کاهش چشمگیری را نشان داد (4). این مسئله حاکی از آنست که سنتز انرژی بوسیله میتوکندریهای نورونهای هیپوکامب کاهش یافته است. مطالعه روی DNA میتو کندریایی بوسیله این گروه نیز نشان داد که  DNA میتوکندریایی در اثر استرس اکسیداتیوآسیب دیده است (19).این یافته ها نشان داد که اثر سمی پاراکوات روی هیپوکامب موش بدلیل آسیب میتوکندریایی و القای استرس اکسیداتیو می باشد و نهایتا باعث اختلال در توانائیهای یادگیری و حافظه موش می گردد (18).

 Wu و همکاران در سال 2013 نشان دادند که مسمومیت حاد با پاراکوات ظرف یک هفته منجر به ادم آستروسیت ها واپوپتوز سلولهای عصبی در مغز مو شهای صحرایی گردید (20). مطالعات Sharin در سال 2017 نشان داد که اختلال در عملکرد میتوکندریها در اثر پاراکوات باعث مرگ نورونهای دوپامینرژیک می گردد (18).

دیوسمین یک فلاونوئید است که در مرکبات به وفور یافت شده که ساختار شیمیایی آن بصورت 3،5 و7 تری هیدروکسیل 4- متوکسی فلاوون 7- رامنوگلوکوزید می باشد. این ماده بعنوان یک فلاونوئید دارای فعالیت بیولوژیک فراوان می باشد. نشان داده شده است که دیوسمین نیز دارای اثرات نوروپروتکتیو می باشد. چندین فعالیت مهم بیولوژیک دیوسمین شامل: ضد ویروسی، ضد قارچی، ضد سرطان، ضد التهابی و آنتی اکسیدانی آن قبلا گزارش شده است (21). همچنین دارای اثرات تعدیل کننده ای در افزایش پراکسیداسیون لیپیدی و هیپرگلیسمی و افزایش فشار خون دارد (22). این فلاونوئید یک آنتی اکسیدان طبیعی شناخته شده است موجب بهبود فعالیت SOD ، گلوتاتیون پروکسیداز و کاتالاز می شود (22). دیوسمین دارای اثرات آنتی اکسیدانی زیادی هست که هنوز بطور کامل شناسایی نشده است. نشان داده شده که دیوسمین دارای اثرات بهبود دهنده فاکتورهای سلامتی در مدل موش صحرایی شده استکه بطور اختصاصی اینکار را از طریق کاهش استرس اکسیداتیو و التهاب انجام می دهد.

مطالعات قبلی نشان دادند که دیوسمین میتواند گونه های رادیکالی اکسیژن و تخریب DNA را از طریق مهار تنفس میتوکندریایی کاهش دهد

دیوسمین همچنین میتواند اثرات حفاظتی بر سیستم دفاع آنتی اکسیدانی داشته باشد.

دیوسمین می تواند میزان حافظه و یادگیری فضایی را در موشهای کوچک آزمایشگاهی و همچنین در رتهای تغذیه شده با رژیم پرچرب بهبود ببخشد. نکته قابل توجه اینکه دیوسمین بسرعت از سد خونی مغزی عور می کند و اثرات حفاظتی متعددی بر بخشهای مختلف مغز می گذارد. دیوسمین می تواند سطح GSH  را در موشهای صحرایی صرعی شده افزایش داده و سطح MDA  را در آنها کاهش دهد

با توجه به اثرات سودمند دیوسمین ولی هنوز اثرات آن بر اختلال یادگیری و حافظه ناشی از القای پاراکوات به اثبات نرسیده است. در این مطالعه اثرات پاراکوات روی هیپوکامب در موش صحرایی با استفاده از آزمایشات مازآبی موریس و تست حافظه اجتنابی بررسی می گردد و  با توجه به اینکه آنتی دوت ویژه ای برای این سم هنوز معرفی نشده است اثرات محافظتی فلاونوئید دیوسمین در برابر سمیت عصبی پاراکوات  در هیپوکامب مورد ارزیابی قرار می گیرد.

الف: دیوسمین باعث تغییر در مدت زمان سپری شده به منظور یافتن سکوی پنهان با دستگاه موریس واتر مازنسبت به گروه های دیگر می شود.

ب: دیوسمین باعث تغییر مسافت پیموده شده به منظور یافتن سکوی پنهان با استفاده از موریس واتر مازنسبت به گروه های دیگر می شود.

پ: دیوسمین باعث تغییر زمان تاخیری برای اولین ورود به اتاق تاریک پس از اعمال شوک با دستگاه شاتل باکس نسبت به گروه های دیگر می شود.

ت: دیوسمین باعث تغییر غلظت مالون دی آلدئید نسبت به گروه های دیگر می شود.

تعیین اثرات دیوسمین بر حافظه و یادگیری متعاقب استفاده از علف کش پاراکوات در مدل حیوانی رت

الف:تعیین و مقایسه مدت زمان سپری شده به منظور یافتن سکوی پنهان در گروه های مورد مطالعه

ب:تعیین و مقایسه مسافت پیموده شده به منظور یافتن سکوی پنهان در گروه های مورد مطالعه

پ:تعیین و مقایسه زمان تاخیر برای اولین ورود به اتاق تاریک پس از اعمال شوک در گروه های مورد مطالعه

ت: تعیین و مقایسه غلظت مالون دی آلدئید در گروههای مورد مطالعه

دانشگاه علوم پزشکی زاهدان

پاراکوات : یک ترکیب شیمیایی با شناسه پاب کم 15938 است .شکل ظاهری این ترکیب ،پودر سفید است معرفترین و رایج ترین علف کش دنیا .

دیوسمین : یک فلاوونوئید است گه اثرات آنتی اکسیدانی و ضد التهابی آن در برخی بیماریها به اثبات رسیده است

تجربی

موش صحرایی نژاد ویستار بالغ نر250 -200 گرم

4 گروه موش صحرایی8 تایی براساس مطالعات قبلی(25)

 انتخاب 32  سر موش صحرایی با توجه به ملاک های مورد مطالعه وقرار گرفتن حیوان در5 گروه به صورت تصادفی می باشد.

گروه بندی:

 گروه اول: (Sham)، گروه دوم: پاراکوات، گروه سوم: دیوسمین: در این گروه دیوسمین با دوز 100 mg/kg دریافت می کنند، گروه چهارم: دیوسمین و پاراکوات

روش کار

ارزیابی حافظه و یادگیری

برای بررسی رفتار اجتنابی غیرفعال بعنوان شاخصی از یادگیری و حافظه حیوان از یک دستگاه شاتل باکس جعبه ای از جنس پلکسی گلاس و به ابعاد 20×80×20 سانتی متر دارای یک محفظه روشن ( Safe  side ) و یک محفظه تاریک (Unsafe  side ) استفاده می شود. بین این دو محفظه یک درب گیلوتینی ارتباط دهنده وجود دارد. میله های فلزی موجود در کف محفظه تاریک برای شوک دادن به پای حیوان استفاده می شود. برای اعمال تحریک به محفظه تاریک از دستگاه استیمولاتور خاص استفاده می شود. در این تحقیق روش بررسی رفتار احترازی به شرح زیر می باشد 1- مرحله سازش (Adaptation): در این مرحله هر حیوان بمدت دو روز قبل از شروع آزمایش حداقل به مدت 5 دقیقه در داخل دستگاه قرار داده می شود. 2- مرحله اکتساب (Acquisition): در این مرحله ( روز سوم) برای شروع آزمایش حیوان را در محفظه روشن قرار داده و پس از 2 دقیقه درب گیلوتینی را باز و مدت زمانی که طول می کشد تا حیوان از محفظه روشن به محفظه تاریک برود  یادداشت می گردد. این مدت زمان تحت عنوان تأخیر اولیه یا IL  ( Initial latency) اطلاق می گردد. پس از ورود حیوان درب را پایین آورده و شوک الکتریکی به میزان  0HZ,1.5MA,3S اعمال می شود. در پایان کار پس از 2 دقیقه حیوان به قفس منتقل می گردد. 3- مرحله آزمون یا یادسپاری (Retention): این مرحله مشابه مرحله قبل بوده و با قرار دادن حیوان در محفظه روشن شروع می شود. با این تفاوت که زمان ورود حیوان به محفظه تاریک هیچگونه شوکی اعمال نمی شود. در این مرحله تأخیر حین عبور (STL) (Step Through Latency) اندازه گیری می گردد. منظور از STL مدت زمان حضور حیوان در محفظه روشن قبل از ورود به محفظه تاریک پس از باز شدن درب گیوتینی بین آنها می باشد. همچنین مدت زمان توقف در محفظه تاریک بدون شوک (پس از بازگشت به محفظه روشن) نیز اندازه گیری می شود. اندازه گیری حافظه 24 ساعت بعد از مرحله اکتساب صورت می گیرد. در این مراحل حد نهایی زمان 600 ثانیه می باشد (23).

آزمون ماز آبی موریس

به منظور ارزیابی یادگیری فضایی از دستگاه ماز آبی موریس استفاده شد. این دستگاه از یک حوضچه با قطر 150 و ارتفاع 60 سانتیمتر ساخته شده است که تا ارتفاع 25 سانتی متر  با آب 21±1 درجه سانتی گراد پر شد. یک سکو با قطر 10 سانتیمتر در مرکز ربع جنوب غربی قرار گرفت. از طریق یک دوربین مدار بسته حرکات موش به کامپیوتر و نرم افزار انتقال و پارامترهای مختلف از جمله مسافت طی شده ومدت زمان سپری شده در ماز ثبت  شد. در مرحله سازش با محیط هر موش 24 ساعت قبل از آموزش به مدت 3 دقیقه در ماز بدون سکو قرار داده شد. در مرحله آموزش هر موش به مدت 4روز و هر روز 4 بار در ماز قرار داده شد و مسیر حرکات حیوان به مدت 90 ثانیه ثبت شد. در این مرحله پارامترهای ذکر شده مربوط به کل مسافت طی شده و مدت زمان سپری شده تا یافتن سکوی پنهان در ماز ثبت شد. در مرحله ارزیابی 24 ساعت پس از آخرین روز مرحله آموزش، حافظه فضایی موش ها در ماز فاقد سکو مورد ارزیابی قرار گرفت. در این مرحله یک آزمون 60 ثانیه ای از هر حیوان ثبت شد و در طی این مدت، مسافت پیموده شده ومدت زمان حضور موش در محوطه ای که قبلا سکو وجود داشت به عنوان شاخص و ملاک حافظه ثبت و مورد تجزیه وتحلیل قرار گرفت (24).

پس از تصویب طرح، تعداد 32 سر موش صحرائی نژاد ویستار با محدوده وزنی (200 تا220 گرم) انتخاب و پس از یک هفته سازگاری، بصورت تصادفی در 4 گروه (هشت سر در هر گروه) در شرایط کنترل شده (دمای 2±23 درجه سانتیگراد، سیکل نوری دوازده ساعت روشنائی و تاریکی، میزان رطوبت 25 تا 30 درصد و دسترسی آزاد به آب و غذا) به شرح ذیل قرار خواهند گرفت (26) .

گروه بندی:

 گروه اول: (Sham)، گروه دوم: پاراکوات، گروه سوم: دیوسمین: در این گروه دیوسمین با دوز 100 mg/kg دریافت می کنند، گروه چهارم: دیوسمین و پاراکوات

اندازه گیری های رفتاری:

حافظه اجتنابی غیرفعال با کمک دستگاه شاتل باکس و حافظه فضائی با دستگاه ماز آبی موریس (27) ﭘﺲ از ﭘﺎﯾﺎن ﮐﺎر وکشتن حیوانات  ﺑـﺎ رعایت اﺻـﻮل اﺧﻼﻗـﯽ، ﺑﻠﻮک هیپوکامپ ﺟﺪا و پس از شستشو با محلول سالین سرد و خشک کردن آن، به سرعت توزین شده و سپس بافت به همراه بافر تریس به مدت 2 دقیقه با دستگاه هموژنایزر با دور 5000 دور در دقیقه هموژنیزه خواهد شد و محلول هموژنیزه شده، سانتریفوژ خواهد شد. برای جلوگیری از تخریب آنزیم ها و پروتئین ها تمامی مراحل گفته شده در دمای 4 درجه سانتی گراد انجام خواهد شد. پس از انجام سانتریفوژ، محلول رویی شفاف از بقیه محلول جدا شده و بخش زیرین رسوب کرده دور ریخته خواهد شد. از محلول شفاف رویی برای سنجش ظرفیت آنتی اکسیدانی تام وغلظت مالون دی الدئید هیپوکامپ استفاده خواهدشد (28).

پس از تصویب طرح، تعداد 32 سر موش صحرائی نژاد ویستار با محدوده وزنی (200 تا220 گرم) انتخاب و پس از یک هفته سازگاری، بصورت تصادفی در 4 گروه (هشت سر در هر گروه) در شرایط کنترل شده (دمای 2±23 درجه سانتیگراد، سیکل نوری دوازده ساعت روشنائی و تاریکی، میزان رطوبت 25 تا 30 درصد و دسترسی آزاد به آب و غذا) به شرح ذیل قرار خواهند گرفت (26) .

گروه بندی:

 گروه اول: (Sham)، گروه دوم: پاراکوات، گروه سوم: دیوسمین: در این گروه دیوسمین با دوز 100 mg/kg دریافت می کنند، گروه چهارم: دیوسمین و پاراکوات

اندازه گیری های رفتاری:

حافظه اجتنابی غیرفعال با کمک دستگاه شاتل باکس و حافظه فضائی با دستگاه ماز آبی موریس (27) ﭘﺲ از ﭘﺎﯾﺎن ﮐﺎر وکشتن حیوانات  ﺑـﺎ رعایت اﺻـﻮل اﺧﻼﻗـﯽ، ﺑﻠﻮک هیپوکامپ ﺟﺪا و پس از شستشو با محلول سالین سرد و خشک کردن آن، به سرعت توزین شده و سپس بافت به همراه بافر تریس به مدت 2 دقیقه با دستگاه هموژنایزر با دور 5000 دور در دقیقه هموژنیزه خواهد شد و محلول هموژنیزه شده، سانتریفوژ خواهد شد. برای جلوگیری از تخریب آنزیم ها و پروتئین ها تمامی مراحل گفته شده در دمای 4 درجه سانتی گراد انجام خواهد شد. پس از انجام سانتریفوژ، محلول رویی شفاف از بقیه محلول جدا شده و بخش زیرین رسوب کرده دور ریخته خواهد شد. از محلول شفاف رویی برای سنجش ظرفیت آنتی اکسیدانی تام وغلظت مالون دی الدئید هیپوکامپ استفاده خواهدشد (28).

برای بررسی داده ها از نرم افزار SPSS نسخه 19استفاده خواهد شد .از آنالیز واریانس تکراری و یک طرفه برای آنالیز مطالعات رفتاری استفاده خواهد شد. داده ها به صورت میانگین ± خطای استاندارد میانگین (Mean±SEM ) نشان داده خواهد شد(29)

1. تهیه و حمل و نقل حیوانات ; 2.روش نگهداری شامل شرایط قفس ها و تهویه فاضلاب نورپردازی  و...3. نیروهای اجرایی (آموزش لازم برای نگهداری حیوانات لباس و امکان حفاظتی آگاهی از وضعیت آبستنی و..) بر اساس پروتکل ها و دستورالعمل های توصیه شده توسط کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی انجام میشود.

تهیه کیت و مواد شیمیایی مورد نیاز

موریس واتر میز، شاتل باکس، حافظه و یادگیری

1.             Gawarammana IB, Buckley NA. Medical management of paraquat ingestion. British journal of clinical pharmacology. 2011;72(5):745-57.

2.             Davarpanah MA, Hosseinzadeh F, Mohammadi SS. Treatment following intoxication with lethal dose of paraquat: a case report and review of literature. Iranian Red Crescent Medical Journal. 2015;17(10).

3.             Afarnegan H, Shahraki A, Shahraki J. The hepatoprotective effects of aquatic extract of Levisticum officinale against paraquat hepatocyte toxicity. Pakistan journal of pharmaceutical sciences. 2017;30.

4.             Chen Q, Niu Y, Zhang R, Guo H, Gao Y, Li Y, et al. The toxic influence of paraquat on hippocampus of mice: involvement of oxidative stress. Neurotoxicology. 2010;31(3):310-6.

5.             Wang Q, Ren N, Cai Z, Lin Q, Wang Z, Zhang Q, et al. Paraquat and MPTP induce neurodegeneration and alteration in the expression profile of microRNAs: the role of transcription factor Nrf2. NPJ Parkinson's disease. 2017;3(1):31.

6.             Zhang X-f, Thompson M, Xu Y-h. Multifactorial theory applied to the neurotoxicity of paraquat and paraquat-induced mechanisms of developing Parkinson’s disease. Laboratory Investigation. 2016;96(5):496.

7.             Martínez MC, Villar ME, Ballarini F, Viola H. Retroactive interference of object‐in‐context long‐term memory: Role of dorsal hippocampus and medial prefrontal cortex. Hippocampus. 2014;24(12):1482-92.

8.             Lauber AH, Whalen RE. Muscarinic cholinergic modulation of hypothalamic estrogen binding sites. Brain research. 1988;443(1-2):21-6.

9.             Pike CJ, Nguyen T-VV, Ramsden M, Yao M, Murphy MP, Rosario ER. Androgen cell signaling pathways involved in neuroprotective actions. Hormones and behavior. 2008;53(5):693-705.

10.           Nakatomi H, Kuriu T, Okabe S, Yamamoto S-i, Hatano O, Kawahara N, et al. Regeneration of hippocampal pyramidal neurons after ischemic brain injury by recruitment of endogenous neural progenitors. Cell. 2002;110(4):429-41.

11.           Hulst HE, Schoonheim MM, Van Geest Q, Uitdehaag BM, Barkhof F, Geurts JJ. Memory impairment in multiple sclerosis: relevance of hippocampal activation and hippocampal connectivity. Multiple Sclerosis Journal. 2015;21(13):1705-12.

12.           Worthing CR, Walker SB. The pesticide manual: a world compendium: British crop protection council London; 1983.

13.           Kriscenski-Perry E, Durham HD, Sheu S-S, Figlewicz DA. Synergistic effects of low level stressors in an oxidative damage model of spinal motor neuron degeneration. Amyotrophic Lateral Sclerosis and Other Motor Neuron Disorders. 2002;3(3):151-7.

14.           Stelmashook EV, Isaev NK, Zorov DB. Paraquat potentiates glutamate toxicity in immature cultures of cerebellar granule neurons. Toxicology letters. 2007;174(1-3):82-8.

15.           Kang M-S, Gil H-W, Yang J-O, Lee E-Y, Hong S-Y. Comparison between kidney and hemoperfusion for paraquat elimination. Journal of Korean medical science. 2009;24(Suppl 1):S156-S60.

16.           Fei Q, McCormack AL, Di Monte DA, Ethell DW. Paraquat neurotoxicity is mediated by a Bak-dependent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 2008;283(6):3357-64.

17.           Melchiorri D, Del Duca C, Piccirilli S, Trombetta G, Bagetta G, Nisticò G. Intrahippocampal injection of paraquat produces apoptotic cell death which is prevented by the lazaroid U74389G, in rats. Life sciences. 1998;62(21):1927-32.

18.           Jayasinghe S, Seneviratne S. Neurotoxic effects of paraquat. Galle Medical Journal. 2016;21(2).

19.           Vornov JJ, Park J, Thomas AG. Regional vulnerability to endogenous and exogenous oxidative stress in organotypic hippocampal culture. Experimental neurology. 1998;149(1):109-22.

20.           Rathinam ML, Watts LT, Narasimhan M, Riar AK, Mahimainathan L, Henderson GI. Astrocyte mediated protection of fetal cerebral cortical neurons from rotenone and paraquat. Environmental toxicology and pharmacology. 2012;33(2):353-60.

21.           Srinivasan S, Pari L. Ameliorative effect of diosmin, a citrus flavonoid against streptozotocin-nicotinamide generated oxidative stress induced diabetic rats. Chemico-Biological Interactions. 2012;195(1):43-51.

22.           Silambarasan T, Raja B. Diosmin, a bioflavonoid reverses alterations in blood pressure, nitric oxide, lipid peroxides and antioxidant status in DOCA-salt induced hypertensive rats. European journal of pharmacology. 2012;679(1-3):81-9.

23.           Roghani M, Mojarad BN, Taheri S. The effect of oral feeding of aerial part of Vaccinium myrtillus on learning and memory in diabetic rats. Razi Journal of Medical Sciences. 2008;14(57):69-76.

24.           Haghpanah T, Sheibani V, Afarinesh MR, Hajzadeh MAR, Esmail Pour Bezenjani K, Pahlavan Y. The Role of NMDA Receptor on Spatial Learning and Memory Consolidation Rat Following Intra-Hippocampal Injection of Aqueous Extract of Leaves of Origanum (Origanum Vulgare L. ssp. viridis). Journal of Ardabil University of Medical Sciences. 2012;12(4):354-62.

25.           Marjani.Z R, Hatami H, AliHemmati.A. The investigation of the role of nitric oxide system in the spatial memory of

rats in experimental model of multiple sclerosis Razi Journal of Medical Sciences   Feb-Mar 2014 20:50-8.

26.           فیض‌اله, صلاح‌الدین, خضری, شیوا. اثر حفاظتی تستوسترون بر بهبود نقایص شناختی القا شده توسط اتیدیوم بروماید در مدل حیوانی مالتیپل اسکلروزیس. مجله دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران. 2015;73(8):561-8.

27.           Shabani S, Sarkaki A, Mard SA, Ahangarpour A, Khorsandi L, Yaghoob Farbood Central and peripheral administrations of levothyroxine improved

memory performance and amplified brain electrical activity in the rat

model of Alzheimer's disease. Neuropeptides. 2016;59:111-6.

28.           Baluchnejadmojarad T, Roghani  M. Protective effect of Co-enzyme Q10 on seizure, short term

spatial memory and oxidative stress in induced-epileptic rats

  Journal of Gorgan University of Medical Sciences. 7 December 2013 16(1):14-21.

29.           .Sallahadin F, Khezri S.

Protective effect of testosterone on cognitive deficits induced by

ethidium bromide in experimental model of multiple sclerosis Tehran University Medical Journal. 24 Aug. 2015   73:561-8

ضمیمه شده است