بررسی همراهی بین پلی مورفیسم rs3753348 ژن GITR، با استعداد ابتلا به بیماری پریودنتیت مزمن

پریودنتیت مزمن یک بیماری عفونی که منجر به آماس در بافت های حمایت کننده دندان ، از دست رفتن اتصالات(Attachment loss) به صورت پیشرونده و تحلیل استخوان می گردد .

پریودنتیت به عنوان یک بیماری چند عاملی (Multifactorial) که در آن تعادل طبیعی  میان پلاک میکروبی و پاسخ میزبان به هم خورده، شناخته شده است. این اختلال  در تعادل از طریق  تغییر ترکیب پلاک، تغییر در پاسخ میزبان یا اثرات محیطی و رفتاری که می توانند بر پاسخ پلاک و میزبان تاثیر بگذارند ایجاد می شود.

اگر چه هیچ عامل تعیین کننده ژنتیکی مشخص در بیماران مبتلا پریودنتیت مزمن شناخته نشده است ولی استعداد ژنتیکی  برای تخریب شدیدتر پریودنتال در پاسخ  به تجمع پلاک و جرم ممکن است وجود داشته باشد. داده های اخیر، وجود تنوع ژنتیکی یا پلی مورفیسم را در ژن های کد کننده اینترلوکین α-1 واینترکولین β-1 در ارتباط با افزایش حساسیت نسبت به انواع مهاجم تر پریودنتیت مزمن در افراد ناحیه شمال اروپا نشان داده اند  (1).

wu B و همکاران طی بیان کردند که گیرنده GITR (Gluco corticoid – induced tumor  necrosis factor) که TNFRSF18 نیز نامیده می شود یک مولکول محرک کمکی است  که جزء خانواده بزرگ TNFR ها است.

GITR فعالیت و تمایز سلول های CD₄+teff را آغاز می کند  اما باعث تنظیم منفی  فعالیت بازدارندگی  سلول های  CD₄⁺treg می شود. بنابراین پاسخ ایمنی را تنظیم می کند.

میزان بیان اساسی GITR در سلول های CD4+treg بالاست و در سلول های CD4⁺teff  در حال استراحت (T عملکردی) میزان بیان GITRپایین است، اما تنظیم مثبت قدرتمندی بر روی فعالیت سلول های  Teff دارد.

بیان GITR همچنین  در سلول های غیرلیمفوئیدی مانند PMN ها و ماکروفاژها دیده می شود  که توسط استروئید ها القا می شود. این عمل همانند سایر محرک های فعالیت سلولی است که یک نمونه آن را در شرایط پیش التهاب می بینیم.

GITRL که لیگاند GITR میباشد  GITRرا فعال می کند. این لیگاند عمدتاً درون سلول های عرضه کننده آنتی ژن (APCs) همانند ماکروفاژ ها  و درون سلول های  اپی تلیایی بیان می شود (2).

Goode EL و همکاران طی تحقیقی که در این زمینه داشتند بیان کردند که مطالعاتی که بروی  انتی بادیGITR – ANTI انجام شده نشان دهنده توانایی GITR در افزایش پاسخ ایمنی و التهابی است . موتاسیون در rs3753348 می تواند بر اتصال بین DNA  وTFS  تاثیر گذارد و سبب پرولیفراسیون و تمایز سلول ها گردد.

rs3753348 در ناحیه ای بین ژن 1/5 کیلو باز بالا دست ژن TNFRS18 و تقریباً 3 کیلو باز  پایین دست ژن TNFRSF4 قرار دارد (3).

طی تحقیقی که Vu MD و همکارانش انجام دادند مطرح شد که ژن TNFRSF14 پروتئین OX40(CD134) را کد می کند  که یک مولکول  تحریک کننده کمکی مهم در   T-CELL  ها می باشد. سیگنالینگ پاسخ های ایمنی  که از طریق حد واسط OX40  انجام می شود، دامنه ی وسیعی  از مکانیسم های  پیشنهاد شده را شامل می شوند که کاهش عملکرد مهاری Treg یکی از این مکانیسم هاست (4). این سیگنالینگ از طریق افزایش بیان سایتوکاین های TH2(سلول های T کمکی) در مایع مفصلی باعث افزایش پیشروی  آرتریت روماتوئید می شود. محصولات CCL20باعث تنظیم مثبت  سیگنالینگ OX40 می شود وGITR   یک ارتباط منطقی با فعالیت بیماری  در بیماران(گرانولوماتوز ونگنر) داشت.

این یافته ها نشان می دهد که ممکن است مکانیزم های مختلفی  باعث همراهی بین rs3753348 و CWP شود. همچنین باید در نظر داشت  که SNP  بین ژنی rs3753348 هم از طریق GITR عمل می کند و هم از طریق  مکانیزم OX40  (5).

با توجه به مطالعاتی که همراهی این پلی مورفیسم ژنی را با بیماری های التهابی و فانکشن سلول های T نشان میدهد و ماهیت التهابی بیماری پریودنتال، به بررسی رابطه پلی مورفیسم ژنی GITR با بیماری پریودنتیت مزمن می پردازیم.

١.فراوانی پلی مورفیسم های rs3753348 ژن GITR در بیماران مبتلا به پریودنتیت مزمن چقدر است؟

٢.فراوانی پلی مورفیسم های rs3753348 ژن GITR در افراد سالم چقدر است؟

فرضیه: بین فراوانی پلی مورفیسم rs3753348 ژن GITR در افراد مبتلا به پریودنتیت مزمن و افراد سالم تفاوت وجود دارد.

بررسی همراهی پلی مورفیسم های rs3753348 ژن GITR با بیماری پریودنتیت مزمن

1. بررسی فراوانی پلی مورفیسم rs3753348 ژن GITR در بیماران مبتلا به پریودنتیت مزمن
2. بررسی فراوانی پلی مورفیسم rs3753348 ژن GITR در افراد سالم
3. مقایسه فراوانی پلی مورفیسم rs3753348 ژن GITRدر بیماران مبتلا به پریودنتیت و افراد سالم

سازمان های تولید کننده ی دارو، شرکت های دانش بنیان، مراکز علمی تحقیقاتی

ژن: بخشی از کروموزوم است که دارای اطلاعات ژنتیکی مربوط به یک صفت خاص می باشد و در صورت فعالیت سبب تولید محصول پروتئینی می گردد(6).

پلی مورفیسم: شکل های مختلف یک ژن که نتیجه ی آن تولید محصولات متفاوت است(6).

SNP(SINGLE NUCLEOTIDE PPLYMORPHISM): شکلهای مختلف یک ژن در اثر جابجای در یک نوکلئوتید(6)

موردی-شاهدی

بیماران مراجعه کننده به کلینیک دانشکده دندانپزشکی دانشگاه علوم پزشکی زاهدان.

معیارهای ورود:

گروه بیمار:

1-ابتلا به پریودنتیت مزمن شدید

2-عدم ابتلا به بیماری سیستمیک

3-عدم بارداری و شیردهی

4-عدم مصرف آنتی بیوتیک در 6 ماه گذشته

5-عدم مصرف دخانیات

6-عدم ابتلا به دیابت ملیتوس

7-داشتن رضایت جهت شرکت در مطالعه

گروه کنترل:

1-وجود شرایط سلامت لثه

2-عدم ابتلا به بیماری سیستمیک

3-عدم بارداری و شیردهی

4-عدم مصرف آنتی بیوتیک در 6 ماه گذشته

5-عدم مصرف دخانیات

6-عدم ابتلا به دیابت ملیتوس

7-داشتن رضایت جهت شرکت در مطالعه

معیارهای خروج:

1-عدم تمایل شرکت در مطالعه

*با توجه به معیار های ورود و اینکه اگر شخص معیار های ورود را دارا نباشد واجد شرایط شرکت در مطالعه نمیباشد متغییرهای مخدوش کننده واضح میباشند.

حجم نمونه لازم برای بررسی تایید همراهی پلی مورفیسم rs3753348 ژن GITR با بیماری پریودنتیت مزمن، 120 نفر برای هرکدام  از گروههای سالم و بیمار برآورد شد. بدین منظور توان مطالعه 90 درصد در نظر گرفته شد و  فرض شد نسبت شانس نسبتهای گروه 1/8 باشد. در واقع فرض کردیم پلی مورفیسم مورد نظر در ایجاد پریودنتیت نقش دارد. در مقابل، فرضیه H0 که بیانگر OR برابر 1 است یا نسبت وجود پلی مورفیسم برای گروه مورد و شاهد تحت فرضیه صفر 0/5 در نظر گرفته شد در حالیکه تحت فرض مقابل نسبت پلی مورفیسم ما در گروه بیماران 0/4 در نظر گرفته شد. این حجم نمونه برای اطمینان حصول اطمینان 95 درصدی، خطای 5 درصدی و آزمون های دوطرفه محاسبه شده است. بنابراین براورد نمونه با فرمول زیر به تعداد 120 میتواند باشد.

 نمونه گیری آسان   ( Convenient Sampling)

پرسشنامه اطلاعات دموگرافیک و لوله های آزمایش حاوی خون مخلوط با ضدانعقاد

از میان مراجعه کنندگان که بخش پریو دانشکده دندانپزشکی زاهدان مراجعه کرده اند ، پیش از شروع مطالعه با آگاه کردن بیماران رضایت نامه کتبی از آنان اخذ خواهد شد.معیار های ورود مطالعه به این شرح است:

ابتلا به پریودنتیت مزمن شدید ،عدم ابتلا به بیماری سیستمیک ،عدم بارداری و شیردهی ، عدم مصرف آنتی بیوتیک در 6 ماه گذشته ، عدم مصرف دخانیات ، عدم ابتلا به دیابت ملیتوس ، داشتن رضایت جهت شرکت در مطالعه .

جهت بررسی وضعیت پریودنتال بیماران به وسیله پروب ویلیامز تحت معاینه قرار میگیرند ، هر دندان در 6 ناحیه پروب شده و عمق پروبینگ ثبت می شود و بیماران در صورتی وارد مطالعه خواهند شد که CAL بیشتر از 5 میلیمتر باشد.

وضعیت پریودنتال افراد توسط پروب ویلیامز و بررسی ایندکس لثه(قوام ، رنگ ،کانتور و ....) ارزیابی می شود و از افراد دارای بیماری پریودنتیت مزمن شدید و سالم نمونه خون تهیه می شود.

نمونه ی خون بیماران و گروه کنترل، در لوله های CBC حاوی ضد انعقاد EDTA اخذ خواهد گردید. تمامی لوله ها پس از اخذ,در کول باکس حاوی یخ قرار خواهد گرفت و پس از انتقال به آزمایشگاه, در دمای 20- درجه سانتی گراد نگه داری خواهد شد. هر کدام از نمونه ها جهت جداسازی اسید نوکـلیک DNA مورد آزمایش قرار خواهد گرفت. DNA ی خون توسط کیت ستونی استخراج DNA شرکت تکاپوزیست طبق پروتوکل شرکت سازنده مورد استخراج قرار خواهد گرفت و در دمای 20- درجه سانتی گراد جهت مراحل بعدی نگه داری خواهد شد. پرایمر  های مستقیم و معکوس مربوط به پلی مورفیسم مورد نظر ژن GITR با استفاده از بانک اطلاعاتی NCBI طراحی و توسط شرکت ماکروژن کره جنوبی سنتز خواهد گردید. DNA ی استخراج شده با استفاده از الکتروفورز بر روی ژل آگارز مورد ارزیابی کیفی قرار خواهد گرفت. جهت بررسی نسبت نوکلیک اسید به پروتین نیز ، نسبت جذب نوری 260 به 280 نانومتر نیز بر روی DNA استخراج شده توسط دستگاه نانودراپ خوانده و محاسبه خواهد گردید. پس از ارزشیابی کمی و کیفی نوکلیک اسید استخراج شده، با استفاده از روش RFLP جهت بررسی پلی مورفیسم مورد نظر ، DNA به منظور تکثیر قطعه ی مورد نظر از ژن، تحت روش PCR قرار خواهد گرفت. سپس تولید محصول توسط الکتروفورز بر روی ژل آگارز تایید خواهد شد. محصول فوق به مدت 12 ساعت تحت اثر آنزیم محدودکننده قرار خواهد گرفت. پس از اثر آنزیم ، نتایج با الکتروزفورز بر روی ژل آگارز مورد بررسی قرار خواهد گفت. پس از بررسی باندهای حاصل شده، نتایج توسط نرم افزارهای آماری مورد آنالیز قرار خواهد گرفت.

آنالیز آماری داده ها با نرم افزار spss انجام خواهد شد. اطلاعات دموگرافیک فیزیولوژیک بین گروه ها با تست Independent sample T-test برای داده های پیوسته و تست X² برای داده های طبقه بندی شده استفاده خواهد شد. همراهی پلی مورفیسم مورد نظر با بیماری پریودنتیت مزمن با محاسبه OR و فاصله اطمینان 95 درصد بررسی خواهد شد. همبستگس بین پارامترها نیز با استفاده از تست Pearson مورد آزمایش قرار خواهد گرفت و سطح معنا داری نیز کمتر از 0/05 در نظر گرفته خواهد شد.

جدول شماره1- درصد فراوانی پلی مورفیسم rs3753348 ژن GITR

براساس دفترچه آزمودنی انسان در فصل اول (کلیات) کدهای اخلاقی به شماره های 1,2,3,4,5,10,11,12,13,14,15,16,28,29 براساس فصل راهنمای عمومی دفترچه عضو و بافت کدهای شماره 1,2,4,5,6 از کدهای مصوب کمیته اخلاق در سال 1392 به شرح ذیل اقدام خواهد شد.

ندارد

Glucocorticoid-Induced Tumour Necrosis Factor Receptor, Chronic Periodontitis, GITR gene polymorphisms

1.            Michael Newman  HT, Perry Klokkevold, Fermin Carranza. Carranza's Clinical Periodontology2015.

2.            Wu B, Ji X, Han R, Han L, Wang T, Yang J, et al. GITR promoter polymorphism contributes to risk of coal workers' pneumoconiosis: a case-control study from China. Immunol Lett. 2014;162(2 Pt B):210-6.

3.            Goode EL, DeRycke M, Kalli KR, Oberg AL, Cunningham JM, Maurer MJ, et al. Inherited variants in regulatory T cell genes and outcome of ovarian cancer. PLoS One. 2013;8(1):e53903.

4.            Vu MD, Xiao X, Gao W, Degauque N, Chen M, Kroemer A, et al. OX40 costimulation turns off Foxp3+ Tregs. Blood. 2007;110(7):2501-10.

5.            Marazuela M, Garcia-Lopez MA, Figueroa-Vega N, de la Fuente H, Alvarado-Sanchez B, Monsivais-Urenda A, et al. Regulatory T cells in human autoimmune thyroid disease. J Clin Endocrinol Metab. 2006;91(9):3639-46.

6.   ژنتیک پزشکی کانر, ترجمه: لیلا یوسفیان و همکاران, ویرایش ششم, انتشارات ابن سینا, صفحه 610                                    

بررسی همراهی بین پلی مورفیسم rs3753348 ژن GITR، با بیماری پریودنتیت مزمن

دارد

علاوه بر شرکت در امر تحقیقاتی و کمک به رشد ارتقا علمی,مشاوره و معاینه و طرح درمان نیز به بیماران دارای پریودنتیت مزمن داده میشود.

ندارد

ندارد

هزینه به عهده مجری یا مجریان طرح خواهد بود و بیمار هزینه ای پرداخت نخواهد کرد.

ندارد

نتایج آزمایشها و روشهای به کار رفته به اطلاع بیمار خواهد رسید و این نتایج بصورت کاملا محرمانه و صرفا جهت مقاصد پژوهش به کار خواهد رفت و هویت بیماری وی در چارچوب قانون و جامعه و خانواده محرمانه خواهد ماند.

مجری موظف است پاسخگوی کلیه پرسش ها باشد. 

شرکت من در مطالعه کاملاً اختیاری است و آزاد خواهم بود که از شرکت در مطالعه امتناع نموده یا هر
زمان که مایل بودم بدون آنکه تغییری در نحوه رفتار پزشک درمانگر یا نحوه درمان و مراقبت از بیماری
اینجانب ایجاد شود از پژوهش مذکور خارج شوم.

با توجه به اطلاعات موجود در این فرم و توضیحات حضوری مجری یا همکاران طرح موافقت خود را با
شرکت در این مطالعه اعلان می نمایم. یک نسخه از این فرم به من داده شده و فرصت خواندن آن را
داشته ام.

پرسشنامه جمع آوری اطلاعات- طرح پژوهشی                                                               شماره نمونه:

1. شماره پرونده:
2. نوع داوطلب:     بیمار مبتلا به پریودنتیت مزمن□                 کنترل سالم□
3. سن:
4. جنسیت: زن□     مرد□             
5. مصرف دخانیات: بلی□      خیر□
6. مصرف آنتی بیوتیک در 6 ماهه گذشته: بلی□   خیر□
7. داشتن بیماری های مزمن      ( لوپوس □      دیابت□         فشار خون مزمن□         بیماریهای کلیوی□       سایر بیماریها□)
8. بارداری : بلی□    خیر□                
9.  شیردهی: بلی□     خیر□