بررسی نقش پلی مورفیسم های ژنی (rs10491121) CCL4(rs1634507) و(rs2736100) hTERT(rs2736098) در پاتوژنز کارسینوم سلول سنگفرشی دهان

سرطان دهان یکی از سرطان های بدخیم شایع در ناحیه سر و گردن است که بیش از 90% آن از نوع سرطان سلول های سنگفرشی (SCC) میباشد (1). OSCC یک نئوپلاسم بدخیم با منشا اپیتلیوم مطبق سنگفرشی مخاط دهان است و دارای پاتوژنز مولتی فاکتوریال می باشد. عوامل اتیولوژیک و مستعد کننده زیادی برای وقوع این سرطان وجود دارد. مصرف تنباکو و الکل به عنوان ریسک فاکتورهای قوی در ایجاد سرطان دهان محسوب می­شود. سایر ریسک فاکتورهای احتمالی شامل بهداشت دهانی ضعیف، عفونت­های ویروسی و کاندیدا آلبیکانس می باشند (2). سرطان دهان  به دلیل بروز بالا، میزان بقا 5 ساله نامطلوب در بسیاری از نقاط جهان، نقص های شدید عملکردی و ظاهری که بدنبال درمان دارد ، بعنوان یک مشکل مهم تلقی می شود (3).

کارسینوژنزیس دهانی یک فرآیند چند مرحله ای شامل تغییرات ژنتیکی واضح می باشد. تعیین پلی مورفیسم های ژنتیکی در ایجاد استعداد یا مقاومت نسبت به سرطان ها نقش مهمی را بازی می کند (4).

Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)، شایعترین نوع تغییر در توالی DNA می باشد که روی بیان ژن، عملکرد پروتئین و مستعد شدن به بیماری ها در برخی افراد تاثیر می گذارد. در مطالعات قبلی گزارش شده است که SNP  در پیش بینی  خطر سرطان دهان دارای اهمیت می باشد (1).

این مطلب به خوبی مشخص شده است که ارتباط بین سلول های سرطانی و ریزمحیط تومور، پیشرفت تومور را تنظیم می کند. در واقع خصوصیات ریزمحیط تومور اثر مشخصی روی میزان پیشرفت تومور، پاسخ به درمان و پروگنوز بیماری دارد. در ریزمحیط تومور کموکاین ها نقش اساسی را بازی می کنند (4).

CCL4 (C-C chemokine ligand 4) که به عنوان پروتئین التهابی ماکروفاژ 1(MIP- 1β) نیز شناخته میشود متعلق به خانواده ی التهابی کموکاین CC است که روی کروموزوم 17(q11-q21) واقع شده است. این پروتئین بدنبال تحریکات آنتی ژنی یا سیگنالهای میتوژنیک از سلولهای خاصی ترشح شده و باعث جذب سلولهایی که در پاسخ ایمنی دخیل هستند میشود (1). بنابراین نقش مهمی را در التهاب، پاسخ ایمنی و همچنین پیشرفت تومورها بازی میکند (5). اخیرا در طی مطالعه ای گزارش شده است که پلی-مورفیسم های CCL4 ممکن است استعداد ابتلا به سرطان دهان را افزایش دهد. اما نقش آن بطور دقیق مشخص نشده است (1).

Lien  و همکارانش در سال 2017  در طی مطالعه ای گزارش کردند که CCL4 rs1634507 SNP دارای اهمیت پیش بینی بالقوه در سرطان دهان است و CCL4 rs10491121 ممکن است یک فاکتور در پیش بینی سایز تومور باشد، همچنین مشخص شد که بیماران مبتلا به سرطان دهان که هتروزیگوت های AIG ژن CCL4  را نشان می دهند، درمقایسه با افرادی که هموزیگوت های AA دارند ریسک کمتری برای تومورهای پیشرفته نشان می دهند (1).

در مطالعه ای  دیگری که توسط Wang و همکارانش در سال2017 انجام شد و سه پلی مورفیسم تک نوکلئوئیدی (SNP) از ژن  CCL4 در بیماران مبتلا به هپاتوسلولار کارسینوما (HCC) مورد بررسی قرار گرفت ، مشخص شد که هوموزیگوت  A / G از پلی مورفیسم CCL4 rs10491121 خطرات HCC را کاهش می دهد (4).

در سال 2016 توسط Rivera  و همکارانش نقش CCL4 در پیشرفت سرطان پروستات (PCa) با استفاده از مدل های in vitro و in vivo مورد بررسی قرار گرفت. مطالعات in vitro نشان داد که CCL4 تهاجم و مهاجرت سلول های PCa را افزایش می دهد و مطالعات in vivo نشان داد که CCL4 حجم تومور را افزایش می دهد و در نهایت گزارش شد که CCL4 در پیش بینی مواردی مثل متاستاز و عود سرطان پروستات مهم می باشد (6).

تلومراز آنزیمی است که برای حفظ یکپارچگی انتهای کروموزوم ضروری می باشد و نقش مهمی در تومورژنزیس و پیشرفت سرطانها بازی می کند. فعالیت این آنزیم توسط بیان ژن human telomerase reverse transcriptase (hTERT) مشخص می شود. این ژن کلید اصلی فعالیت کاتالیتیک تلومراز محسوب می شود و جزء ترانس کریپتاز معکوس از مجموعه تلومراز را کد میکند و ابنرمالیتی آن مرتبط با تومورژنزیس در نظر گرفته شده است (7).

پلی مورفیسم rs2736100 روی انترون 2 ژن hTERT و پلی مورفیسم rs2736098 روی اگزون 2 ژن hTERT قرار گرفته است و علیرغم نتایج غیرقطعی ارتباط بین این SNPs و ریسک سرطان گزارش شده است (8). همچنین مشخص شده است که موتاسیون hTERT با پروگنوز ضعیف برخی تومورها مانند گلیوما، کانسر تخمدان و ملانوما ارتباط داشته است(7).

مطالعات متعددی در مورد ارتباط بین پلی مورفیسم hTERT و ریسک سرطانهای مختلف انجام شده است ولی هنوز به نتایج قطعی دست نیافته اند.

Carkic  و همکارانش در سال 2016 در طی مطالعه ای که در مورد بیان hTERT و TERT-CLPTM1L در کارسینوم سلول سنگفرشی دهان انجام شد، ارتباط مشخصی بین CLPTM1L rs402710C/T and TERT rs2736100A/C
SNPs و ریسک سرطان دهان گزارش شد (9).

در مطالعه دیگری که توسط Jian و همکارانش در مورد ارتباط بین متیلاسیون DNA و پلی مورفیسم ژن hTERT با عود بیماران مبتلا به کارسینوم تیروئید انجام شد نیز مشخص شد که متیلاسیون DNA و پلی مورفیسم rs2736100 ژن hTERT احتمالا با عود بعد از درمان در بیماران مبتلا به کارسینوم تیروئید در ارتباط است (7).

همچنین در سال 2015، Choi و همکارانش پلی مورفیسم rs2736100 ژن hTERT را در 243 بیمار مبتلا به کارسینوم گاستریک و 246 فرد سالم بررسی کردند و گزارش شد که این پلی مورفیسم در تنظیم بیان ژن hTERT و طول تلومر دخیل می باشد ولی با ریسک ایجاد کانسر گاستریک ارتباطی ندارد (10).

با توجه به اینکه در زمینه تعیین نقش پلی مورفیسم ژنهای CCL4 و hTERT و ریسک ایجاد سرطان دهان مطالعات اندکی انجام شده است و در جمعیت ایرانی تاکنون بررسی نشده است هدف از مطالعه حاضر تعیین نقش پلی مورفیسم های  ژنی (rs10491121) CCL4(rs1634507) و h TERT(rs2736098)(rs2736100) در پاتوژنزکارسینوم سلول سنگفرشی دهان می باشد.

توزیع فراوانی پلی مورفیسم های ژنی (rs10491121) CCL4(rs1634507) در گروه کنترل و کارسینومای سلول سنگفرشی دهان باهم متفاوت است.

توزیع فراوانی پلی مورفیسم های ژنی hTERT (rs2736098) (rs2736100) در گروه کنترل و کارسینومای سلول سنگفرشی دهان باهم متفاوت است.

تعیین نقش پلی مورفیسم های  ژنی (rs10491121) CCL4(rs1634507) و   hTERT(rs2736100) (rs2736098) در پاتوژنزکارسینوم سلول سنگفرشی دهان

• مقایسه توزیع فراوانی پلی مورفیسم های ژنی (rs10491121) CCL4(rs1634507) در گروه کنترل و کارسینومای سلول سنگفرشی دهان
• مقایسه توزیع فراوانی پلی مورفیسم های hTERT (rs2736098) (rs2736100) در گروه کنترل و کارسینومای سلول سنگفرشی دهان

مرکز تحقیقات دندانپزشکی، مرکز تحقیقات ژنتیکی کانسرها

-

  توصیفی تحلیلی، مورد شاهدی

بلوکهای پارافینی کارسینوم سلول سنگفرشی موجود در آرشیو دانشکده دندانپزشکی زاهدان

معیارهای ورود و خروج:

1- تمام بلوکها دارای میزان کافی از ضایعه بمنظور رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی باشند. در حقیقت نمونه بیوپسی شده باید لبه تهاجم را در بر گیرد.

 2- نمونه ها فیکساسیون مطلوب داشته باشند.

3- نمونه ها فاقد نکروز در لام مورد نظر باشند.

4- نمونه هایی که از لحاظ تشخیص میکروسکوپی مورد اتفاق نظر پاتولوژیستهای طرح باشد.

5- نمونه هایی که دارای شرایط فوق نبودند از مطالعه خارج می شوند.

با توجه به موارد موجود در آرشیو دانشکده دندانپزشکی در طی سالهای 95-1385، 50 مورد کارسینوم سلول سنگفرشی و 50 مورد نمونه نرمال وارد مطالعه خواهد شد ( نمونه های بافتی که فاقد تشخیص OSCC باشند).

سرشماری

فرم ثبت اطلاعات (ضمیمه شماره۱)

در این مطالعه50 نمونه از بلوکهای کارسینوم سلول سنگفرشی موجود در آرشیو دانشکده دندانپزشکی استخراج می شود، بعد از بررسی لامهای مورد نظر توسط پاتولوژیست و تایید آنها طبق معیارهای ورود و خروج، ابتدا grading ، در هر نمونه تعیین میشود. برای بررسی پلی مورفیسم ژنی از نمونه های OSCC یعنوان گروه مورد و از  DNA خون افرادیکه فاقد اختلال سرطانی SCC باشند و از لحاظ سن وجنس با افراد مبتلا به OSCC همسان سازی شده اند بعنوان گروه کنترل استفاده می شود. از بلوک پارافینی مربوط به هر نمونه سه برش جداگانه تهیه خواهد شد و در میکروتیوب های 5/1 میلی لیتری جهت استخراج DNA به آزمایشگاه فرستاده خواهد شد. DNA نمونه ها با روش ست آپ شده در طی ۴ مرحله Deparafinization،Protein Digestion precipitation ، Nucleic Acid Isolation استخراج شده و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی پلی مورفیسم های ژنی  CCL4(rs1634507) (rs10491121) و hTERT (rs2736098) (rs2736100)  با روش PCR-RFLP مورد ارزیابی کیفی قرار خواهند گرفت.

تمامی اطلاعات استخراج شده با استفاده از نرم افزار SPSS 21 و آزمون chi square و لوجستیک رگرسیون مورد تحلیل قرار خواهد گرفت.

جدول- توزیع فراوانی پلی مورفیسم ژن CCL4 در گروه های مورد مطالعه

بر اساس راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی  دارای آزمودنی انسانی  در جمهوری اسلامی ایران در این مطالعه کدهای 1و2و3و10و11و12و13و14و15و16و17و18و20و24و25و26و27و28و29و30و31 رعایت خواهند شد.

همچنین بر اساس راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو بافت انسانی در جمهوری اسلامی ایران کدهای 1و2و3و4و5و6و7و8و9و10و11و12رعایت خواهند شد.

کمبود احتمالی نمونه ها که راه حل آن تهیه نمونه از سایر مراکز می باشد.

CCL4، hTERT ، کارسینوم سلول سنگفرشی دهان

CCL4, hTERT, Oral Squamous Cell Carcinoma

1              Lien M-Y, Lin C-W, Tsai H-C, Chen Y-T, Tsai M-H, Hua C-H, et al. Impact of CCL4 gene polymorphisms and environmental factors on oral cancer development and clinical characteristics. Oncotarget. 2017;8(19):31424.

2.            Pires FR, Ramos AB, Oliveira JBCd, Tavares AS, Luz PSRd, Santos TCRBd. Oral squamous cell carcinoma: clinicopathological features from 346 cases from a single oral pathology service during an 8-year period. Journal of Applied Oral Science. 2013;21(5):460-7.

3.            Lo W-L, Kao S-Y, Chi L-Y, Wong Y-K, Chang RC-S. Outcomes of oral squamous cell carcinoma in Taiwan after surgical therapy: factors affecting survival. Journal of oral and maxillofacial surgery. 2003;61(7):751-8.

4.            Wang B, Chou Y-E, Lien M-Y, Su C-M, Yang S-F, Tang C-H. Impacts of CCL4 gene polymorphisms on hepatocellular carcinoma susceptibility and development. International journal of medical sciences. 2017;14(9):880.

5.            Lien M-Y, Tsai H-C, Chang A-C, Tsai M-H, Hua C-H, Wang S-W, et al. Chemokine CCL4 Induces Vascular Endothelial Growth Factor C Expression and Lymphangiogenesis by miR-195-3p in Oral Squamous Cell Carcinoma. Frontiers in immunology. 2018;9:412.

6.            Rohena-Rivera K, Sánchez-Vázquez MM, Aponte-Colón DA, Forestier-Román IS, Quintero-Aguiló ME, Martínez-Ferrer M. CCL-4 enhances prostate cancer migration and invasion by modulating integrin expression. Int J Clin Exp Med. 2016;9(3):5426-38.

7.            Li J-J, Zheng PCJ-R, Wang Y-Z. The correlations between DNA methylation and polymorphisms in the promoter region of the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene with postoperative recurrence in patients with thyroid carcinoma (TC). World journal of surgical oncology. 2017;15(1):114.

8.            Schoemaker MJ, Robertson L, Wigertz A, Jones ME, Hosking FJ, Feychting M, et al. Interaction between 5 genetic variants and allergy in glioma risk. American journal of epidemiology. 2010;171(11):1165-73.

9.            Carkic J, Nikolic N, Radojevic-Skodric S, Kuzmanovic-Pficer J, Brajovic G, Antunovic M, et al. The role of TERT-CLPTM1L SNPs, hTERT expression and telomere length in the pathogenesis of oral squamous cell carcinoma. Journal of oral science. 2016;58(4):449-58.

10.          Choi BJ, Yoon JH, Kim O, Choi WS, Nam SW, Lee JY, et al. Influence of the hTERT rs2736100 polymorphism on telomere length in gastric cancer. World Journal of Gastroenterology: WJG. 2015;21(31):9328.

مطالعه حاضر به تعیین نقش پلی مورفیسم های  ژنی (rs10491121) CCL4(rs1634507) و  hTERT(rs2736098)(rs2736100) در پاتوژنزکارسینوم سلول سنگفرشی دهان می پردازد.

ندارد.

در این مطالعه با بررسی نقش پلی مورفیسم های  ژنی (rs10491121) CCL4(rs1634507) و  hTERT(rs2736098)(rs2736100) در کارسینومای سلول سنگفرشی دهان در مقایسه با گروه کنترل تاثیر احتمالی این پلی مورفیسم ها در ایجاد OSCC مشخص می شود.

ندارد.

عوارضی ندارد.

هزینه به عهده مجری یا مجریان طرح خواهد بود و بیمار هزینه ای را پرداخت نخواهد کرد.

ندارد.

اطلاعات شخصی مربوط به هر یک از شرکت کنندگان به صورت محرمانه نگهداری خواهد شد.

مجری موظف است پاسخگوی کلیه پرسش ها باشد. 

شرکت من در مطالعه کاملاً اختیاری است و آزاد خواهم بود که از شرکت در مطالعه امتناع نموده یا هر زمان  که مایل بودم بدون آنکه تغییری در نحوه رفتار پزشک درمانگر یا نحوه درمان و مراقبت از بیماری اینجانب ایجاد شود از پژوهش مذکور خارج شوم.

با توجه به اطلاعات موجود در این فرم و توضیحات حضوری مجری یا همکاران طرح موافقت خود را با شرکت در این مطالعه اعلان می نمایم. یک نسخه از این فرم به من داده شده و فرصت خواندن آن را داشته ام.

تعیین نقش پلی مورفیسم های  ژنی (rs10491121) CCL4(rs1634507) و  hTERT(rs2736098)

 (rs2736100) در پاتوژنزکارسینوم سلول سنگفرشی دهان

گروه مورد مطالعه :                         گروه OSCC □                           گروه کنترل □

سن : ...  سال              

جنس :        مرد □            زن □                   

پلی مورفیسم CCL4(rs1634507) (rs10491121)   :

hTERT(rs2736098) (rs2736100) :