بررسی نقش حفاظتی اوژنول بر آسیب کلیوی ناشی از سندروم مقاومت به انسولین در مدل حیوانی موش صحرایی

سندروم مقاومت به انسولین شامل دسته ای از اختلالات (چاقی شکمی, هیپرگلیسمی, اختلال چربی خون (دیس لیپیدمی)  و افزایش فشارخون(هیپرتنشن)) وابسته به مقاومت به انسولین می باشد که اغلب با حالت افزایش وزن و چاقی همراه است.

افراد مبتلا به سندروم مقاومت به انسولین یا سندروم متابولیک در خطر ریسک افزایش یافته دیابت و بیماری قلبی عروقی قرار دارند(1,2) .

از مهم ترین عوامل ایجاد کننده آن می توان به  ژنتیک، پیری، رژیم غذایی به خصوص استفاده بی رویه از قند ها، کاهش فعالیت بدنی، خواب و تغییرات خلقی اشاره کرد(3-6). مطالعات نشان میدهد که مصرف فروکتوز به عنوان یک شیرین کننده تصفیه شده در تغذیه مدرن درسطح جهان رو به افزایش است به طوری که مصرف آن از روزانه 16 تا 20  گرم به 85 تا 100 گرم رسیده است (7,8). بالا رفتن مصرف کربوهیدراتها به ویژه قندهای تصفیه شده ای که فروکتوز بالایی دارند، یکی از عوامل بسیار مهم دخیل در ایجاد این سندرم می باشد.(7)

مطالعات نشان داده است که بین سندروم مقاومت به انسولین  و بروز بیماری مزمن کلیه  رابطه وجود دارد.در افراد مبتلا به سندروم مقاومت به انسولین ریسک ابتلا به دیابت تیپ دو را با مرور زمان افزایش داده است. مطالعات اپیدمیولوژیک همچنین افزایش ریسک  دفع آلبومین در ادرار (میکروآلبومینوری) به عنوان مارکر زودرس آسیب کلیوی را نشان میدهد(1,2).

 1) اصلی ترین تظاهر سندروم متابولیک, مقاومت به انسولین است. مقاومت به انسولین از طریق ایجاد شرایط اکسیدانت و پرو اکسیداتیو با ایجاد چاقی احشایی, موجب اختلال در عملکرد اندوتلیال و کاهش استراحت عروقی و اختلال در بازسازی عروق و اثرات بر کلیه و ایجاد هیپرتنشن میشود. مقاومت به انسولین به طور کلی موجب ازدیاد آتروژنز( تشکیل پلاک کلسترولی درون رگ ها) میشود.

2)چاقی و افزایش دور کمر: سلول های چربی(آدیپوسیت ها) شکمی(ویسرال) در امنتوم و مزانتر از طریق اتوکرین و پاراکرین, موجب اختلال سیستم رنین آنژیوتانسین(RAS) و سمپاتیک که موجب بازآرایی (ریمودلینگ) بیشتر عروق کوچک کلیه و سختی عروق و احتباس سدیم گردیده که خود موجب افزایش فشارخون میشود(2(.

مقاومت به انسولین و هیپرگلیسمی با ایجاد اختلال کلیوی, موجب فعال شدن سیستم RAS وافزایش آنژیوتانسین II و آلدوسترون میگردد که موجب فعال شدن مسیر انسولین – فاکتورشبه انسولینی میشود که با ایجاد استرس اکسیداتیو موجب تخریب اندوتلیال و ایجاد بیماری قلبی عروقی میشود. مقاومت به انسولین و هیپرگلیسمی با کاهش تولید نیتریک اکساید اندوتلیال و افزایش استرس اکسیداتیو همراهی دارند که در پیشرفت دیابتیک نفروپاتی نقش دارد. آلدوسترون موجب افزایش استرس اکسیداتیو در توبول ها و بافت بینابینی کلیه میگردد که فرآیند آسیب توبولوگلومرولی ناشی از افزایش نمک بدن را از طریق اثرات غیرژنومی اعمال می کند.

3) دیس لیپیدمی: دیس لیپیدمی از طریق ایجاد التهاب و افزایش استرس اکسیداتیو که موجب آسیب اندوتلیال و آترواسکلروز می گردد. اسیدهای چرب میتوانند وازوکانستریکشن(انقباض عروقی) نسبی ایجاد کنند.

4) هیپرتنشن: انسولین مکانیسم وازودیلاتوری دارد اما اثر کلیه بر روی بازجذب سدیم باقی می ماند. سندروم متابولیک موجب ایجاد هیپرتنشن حساس به سدیم می گردد. افزایش میزان سدیم بدن موجب بدتر شدن پروتئین اوری و اختلال فانکشن دیاستولیک قلب می شود.

نمک و آلدوسترون اثر سینرژیسم بر سیستم قلبی عروقی از طریق ایجاد استرس اکسیداتیو دارد. آلدوسترون, نقش بسیار مهمی در ایجاد هیپرتنشن حساس به نمک و آسیب کلیوی دارد.

مقاومت به انسولین  به علت کاهش نورآدرنالین(انقباض عروق وابران) منجر به افزایش فشار شریانچه وابران  و فیلتراسیون گلومرولی میشود. در افراد چاق, گلومرولواسکلروز کانونی و گلومرولومگالی(افزایش سایز گلومرول ها) شایع ترین آسیب مورفولوژیک در کلیه بوده است. هیپرتروفی گلومرولی از طریق2 IGF-1 and IGF- واسطه گری میشود. لپتین و آدیپونکتین بافت چربی نیز بر روی کلیه تاثیرگذار است. سطح افزایش یافته آلدوسترون در سندروم متابولیک از طریق مهار فعال کننده پلاسمینوژن, ¹TGF-β و ²ROS(گونه های فعال اکسیژن) موجب پیشرفت فیبروز و آسیب ارگان های هدف میشود.از بین رفتن پودوسیت ها و یکپارچگی غشاپایه کلیه و موجب پروتئین اوری میشود.التهاب توبول ها وبافت بینابینی کلیه از علل ایجاد آسیب کلیوی وابسته به نمک میباشد9,10)) .

براساس مطالعات اخیر سندروم مقاومت به انسولین با افزایش ریسک پیشرفت بیماری کلیوی مزمن و بروز³ESRD در طی ده سال آینده همراه است(11,12,13).

اوژنول (1آلیل-4هیدروکسی-3متوکسی بنزن) یک ترکیب فنولی که به عنوان طعم دهنده غذایی و خوشبوکننده استفاده میشود.این ماده ترکیب اصلی سازنده روغن میخک, دارچین و ریحان و جوزهندی می باشدو دارای اثرات آنتی اکسیدان و ضد درد و ضد تب و ضد التهاب میباشد (2 ,14,15,16).

طبق مطالعات انجام شده اوژنول در غلظت های5, 10, 100, 50  و 1000 M دارای خاصیت آنتی اکسیدانت و محافظت سلولی بوده است (17).

اوژنول به عنوان یک ماده ضد میکروبی علیه قارچ ها و باکتری ها عمل کرده و همچنین موجب مهار فعالیت و بیان ژن ها در مسیر سیکلواکسیژناز در ماکروفاژها میگردد و همچنین پراکسیداسیون لیپیدها و آنزیم گزانتین اکسیداز را مهار میکند((2,17,18.

اوژنول بیان ژن  NF-kBکه وظیفه ی تنظیم تکثیرسلولی و طول عمر سلول ها را دارد, را تنظیم نموده وبه همین دلیل دارای اثرات محافظتی )کموپروتکتیو( است.(19) همچنین اثرات محافظتی اوژنول بر استرس اکسیداتیو و نفروتوکسیسیته ناشی از جنتامایسین در مطالعات ثابت شده است (10).

خلاء مطالعاتی:

از این رو این مطالعه برای بررسی نقش محافظتی تجویز اوژنول در کم کردن آسیب کلیوی ناشی از سندروم مقاومت به انسولین طراحی شده است.

تصویر شماره 1: مکانیسم مقاومت انسولین و آسیب کلیوی ناشی از آن (20).

SNS: sympathetic nervous system, RAS: renin-angiotensin system, PPAR: peroxisome proliferator-activated receptors, ACEI: angiotensin converting enzyme inhibitor, ARB: angiotensin II receptor blocker, TZD: thiazolidinediones.

تصویر شماره 2:  نقش  fTGF-β در ایجاد نفروپاتی دیابتی(21).

(AGE: Advanced glycation end products, DAG: Diacylglycerol, GBM: Glomerular basement membrane, PKC: Protein kinase C, RAS: Renin–angiotensin system) (Arrows with solid lines represents activation while arrows with dotted lines represents inhibition)

تصویر شماره 3: مکانیسم های موثر در آسیب کلیوی ناشی از لیپیدها (21).

بررسی متون:

Garud-1 و همکاران,در مطالعه ای با عنوان اوژنول آسیب کلیوی ناشی از رات دیابتی ناشی از استرپتوزوسین را کاهش میدهد در 24 رات در سال 2016انجام شد, نتایج نشان داد که درمان نفروپاتی دیابتی با اوژنول, بافت شناسی کلیه را بهبود داده و بیان-β TGF را کاهش داده و موجب بهبود دیابتیک نفروپاتی میشود(21).

2- Said و همکاران در مطالعه ای با  عنوان اثرات محافظتی اوژنول بر نفروتوکسیسیته ناشی از جنتامایسین و آسیب اکسیداتیو کلیه در رات بر روی 36 رات نر  انجام دادند به این نتیجه رسیدند که اوژنول به عنوان یک ماده پاکسازی کننده رادیکال های فعال در بدن, میزان آسیب میتوکندری و ساختمان های غشادار با کاهش یپوکسی بافتی را کاهش میدهد. ایشان همچنین نشان دادند که اوژنول با واسطه عملکرد آنتی اکسیدانتی , زنجیره اکسیدانت را شکسته ومانع از پراکسیداسیون لیپیدها و افزایش فعالیت آنزیم های آنتی اکسیداتیو و افزایش سطح گلوتاتیون و کاهش هیپوکسی بافتی می شود(14).

3- Usta و همکاران در مطالعه ای با عنوان اثرات آزمایشگاهی اوژنول و دارچین بر غشا و کمپلکس های زنجیره تنفسی در میتوکندری جداشده از رات در سال2002 انجام دادند به این نتیجه رسیدند که میخک و دارچین با خواص لیپوفیلیک از غشا سلولی به داخل اندامک های سلولی مانند میتوکندری نفوذ کرده و اثرات مهاری بر روی کانال های سدیم پتاسیم ATPase در کلیه و روده دارد و در نهایت موجب تاثیر مثبت بر مکانیسم رشد سلولی و پیری دارد(22) .

4- Mnafgui و همکاران در مطالعه ای با عنوان اوژنول آنزیم کلیدی در دیابت و هیپرتنشن را دررات دیابتی ناشی از آلوکسان را در محیط آزمایشگاهی مهار میکند, که بر روی 4  گروه از  رات  ها ی نر  در سال 2013 انجام دادند به این نتیجه رسیدند که  اوژنول اثر آنتی دیابتیک از طریق مهار فعالیت آنزیم های پانکراس مثل آلفا آمیلاز و لیپاز شده و همچنین از ایجاد هیپرتنشن با مهار آنزیم ACE در دیابت میگردد(23).

 سئوالات :

میزان سرمی کراتینین در در گروه های مورد و شاهد چقدر است؟

میزان سطح سرمی  BUN در گروه های مورد و شاهد چقدر است؟

میزان آسیب دیدگی بافت کلیه (توبول ها  و سلول توبولی) در پایان مطالعه در گروه های مورد و شاهد چگونه است؟

میزانMDA سرم و بافت کلیه در گروه های مورد وشاهد چگونه است؟

میزان سطح سرمی نیتریت (متابولیت پایدار NO) در گروه های مورد و شاهد چگونه است؟

میزان سطح سرمی کراتینین در گروه رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 50mg/kg  با گروه  رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 100mg/kg  چه تفاوتی دارد؟

میزان سطح سرمی  BUN در گروه رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 50mg/kg  با گروه  رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 100mg/kg  چه تفاوتی دارد؟

میزان آسیب دیدگی بافت کلیه (توبول ها  و سلول توبولی) در پایان مطالعه در گروه رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 50mg/kg  با گروه  رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 100mg/kg  چه تفاوتی دارد؟

میزانMDA سرم و بافت کلیه در گروه رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 50mg/kg  با گروه  رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 100mg/kg  چه تفاوتی دارد؟

میزان سطح سرمی نیتریت (متابولیت پایدار NO) در گروه رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 50mg/kg  با گروه  رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 100mg/kg  چه تفاوتی دارد؟

فرضیات:

میزان سطح سرمی کراتینین در گروه های مورد و شاهد متفاوت است.

میزان سطح سرمی  BUN در گروه های مورد و شاهد متفاوت است.

میزان آسیب دیدگی بافت کلیه (توبول ها  و سلول توبولی) در پایان مطالعه در گروه های مورد و شاهد متفاوت است.

میزانMDA سرم و بافت کلیه در گروه های مورد وشاهد متفاوت است.

میزان سطح سرمی نیتریت (متابولیت پایدار NO) در گروه های مورد و شاهد متفاوت است.

میزان سطح سرمی کراتینین در گروه رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 50mg/kg  با گروه  رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 100mg/kg  متفاوت است.

میزان سطح سرمی  BUN در گروه رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 50mg/kg  با گروه  رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 100mg/kg  متفاوت است.

میزان آسیب دیدگی بافت کلیه (توبول ها  و سلول توبولی) در پایان مطالعه در گروه رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 50mg/kg  با گروه  رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 100mg/kg  متفاوت است.

میزانMDA سرم و بافت کلیه در گروه رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 50mg/kg  با گروه  رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 100mg/kg  متفاوت است.

میزان سطح سرمی نیتریت (متابولیت پایدار NO) در گروه رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 50mg/kg  با گروه  رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 100mg/kg  متفاوت است.

بررسی نقش حفاظتی اوژنول بر آسیب کلیوی ناشی از سندروم مقاومت به انسولین در مدل حیوانی موش صحرایی

1-تعیین و مقایسه سطح سرمی کراتینین در پایان مطالعه در گروه های مورد وشاهد

2-تعیین و مقایسه سطح سرمی BUN در پایان مطالعه در گروه های مورد وشاهد

3-تعیین و مقایسه میزان تغییرات بافتی کلیه (غشا گلومرول وتوبول ها) در پایان مطالعه در گروه های مورد وشاهد

4-تعیین و مقایسه میزانMDA سرم و بافت کلیه در پایان مطالعه در گروه های مورد وشاهد

5- تعیین ومقایسه میزان سطح سرمی نیتریت (متابولیت پایدار NO) در گروه های مورد و شاهد

6-تعیین و مقایسه سطح سرمی کراتینین در گروه رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 50mg/kg  با گروه  رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 100mg/kg  در پایان مطالعه

7-تعیین و مقایسه سطح سرمی  BUN در گروه رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 50mg/kg  با گروه  رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 100mg/kg  در پایان مطالعه

8-تعیین و مقایسه میزان آسیب دیدگی بافت کلیه (توبول ها  و سلول توبولی) در پایان مطالعه در گروه رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 50mg/kg  با گروه  رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 100mg/kg  در پایان مطالعه

9-تعیین و مقایسه میزانMDA سرم و بافت کلیه در گروه رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 50mg/kg  با گروه  رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 100mg/kg  در پایان مطالعه

10-تعیین و مقایسه میزان سطح سرمی نیتریت (متابولیت پایدار NO) در گروه رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 50mg/kg  با گروه  رات دریافت کننده فروکتوز و اوژنول با دوز 100mg/kg  در پایان مطالعه

دانشگاه ها و مراکز تحقیقاتی

TGF-β: transforming growth factor β

ROS: reactive oxygen species

ESRD: endstage renal disease

Glomerular basement membrane

Thin basement membrane

هیپرتنشن: افزایش فشار خون

گلومرولومگالی: افزایش سایز گلومرول ها

دیس لیپیدمی: اختلال چربی خون

میکروآلبومینوری: دفع آلبومین در ادرار

آتروژنز: تشکیل پلاک کلسترولی درون رگ ها

آدیپوسیت ها: سلول های چربی

ویسرال: شکمی

:RAS سیستم رنین آنژیوتانسین

ریمودلینگ: بازآرایی

وازوکانستریکشن: انقباض عروقی

مطالعه مداخله ای و تجربی

موش صحرایی نر

سن10-11  هفته

نر ها در محدوده وزنی 180-210 از نژاد:   ویستار

5  گروه  موش صحرایی 6 تایی بر اساس مطالعات قبلی

انتخاب 30  سر حیوان با توجه به ملاک های مورد مطالعه صورت گرفته و قرار گرفتن حیوانات در 5 گروه به صورت تصادفی می باشد.

با استفاده از فرم اطلاعاتی

تعداد30 رات از نژاد ویستار جنس نر(در محدوده وزنی210-180 گرم) به طور تصادفی انتخاب می شوند. و حیوانات یک هفته قبل از شروع آزمایش ،در اتاق کنترل با دمای 2± 22 درجه سانتی گراد با تهویه مناسب و رطوبت 50-65 درصد وسیکل نوری 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی با دسترس آزاد به آب وغذا در قفسه مناسب نگه داری خواهند شد(21).

معیار پایانی قسمت آزمایش طرح زمانی قلمداد می شود که در پنج گروه آزمایش که توضیح داده خواهد شد حداقل در هر گروه  شش آزمایش موفق انجام شده باشد.

حیوانات به شرح زیر در 5 گروه  6 تایی تحت آزمایش قرار خواهند گرفت:

گروه1: رات های نر دریافت کننده آب اشامیدنی

گروه2: رات های دریافت کننده فروکتوز تا پایان آزمایش برای هشت هفته

گروه3: رات های دریافت کننده اوژنول و روغن بادام تا پایان آزمایش

 گروه4:  رات های دریافت کننده فروکتوز و اوژنول 50 mg/kg برای 4 هفته به صورت گاواژ(17).

گروه5:  رات های دریافت کننده فروکتوز و اوژنول100 mg/kg برای 4 هفته به صورت گاواژ(17,21)

ب: روش تهیه محلول فروکتوز:

آب غنی از فروکتوز به صورت 10% وزنی- حجمی و به صورت روزانه تهیه خواهدشد. 10 گرم فروکتوز را با آب اشامیدنی به حجم 100 سی سی رسانیده و روزانه به مدت 8 هفته به حیوانات داده خواهد شد.24,25)) برطبق مطالعات قبلی مدل حیوانی سندروم متابولیک با 8 هفته دادن فروکتوز به رات در حیوان القا می گردد(,26,2725).

ج: مداخلات داروئی: 

پس از مداخلات داروئی ( تزریق  روزانه داروها) و پایان هشت هفته حیوانات  با کتامین بیهوش و نمونه خونی جهت اندازه گیری های پارامتر های مورد نظر جمع آوری خواهد شد. سپس حیوانات با دوز زیاد بیهوشی(زیلوزین و کتامین)  کشته شده و کلیه چپ آن ها جهت اندازه گیری پارامترهای مورد نظر هموژنیزه و کلیه راست جهت ارزیابی آسیب کلیوی از بدن خارج و در فرمالین قرار می گیرد(28).

سطح سرمی  BUN  -  Crوسطح سرمی و بافتی MDA و نیتریت  با استفاده از روش های آزمایشگاهی اندازه گیری خواهد شد.

برای ارزیابی پاتولوژی برای بافت کلیه رنگ آمیزی اختصاصی  برای رویت آسیب بافتی در غشاء گلومرول (GBM^[1]) و توبول های کلیوی (شامل سلول و TBM^[2]) انجام می شود. آسیب بافتی کلیوی به شرح زیر  نمره دهی می شود که بصورت دو سو کور توسط پاتولوژیست انجام می گردد.

نمره صفر : بدون آسیب

نمره یک: آسیب خفیف که قسمت  بسیارکمی از بافت گرفتار باشد (تا 20% سطح بافت )

نمره دو: آسیب کم که قسمت کمی از بافت گرفتار باشد (تا 40% سطح بافت )

نمره سه: آسیب متوسط که قسمت زیادی از بافت گرفتار باشد (تا60% سطح بافت )

نمره چهار: آسیب  زیاد که قسمت اعظم بافت گرفتار باشد (تا 80%  سطح بافت)

نمره پنج: آسیب بسیار زیاد که تمامی بافت گرفتار باشد (تا  100%  سطح بافت)

داده ها توسط نرم افزار SPSS  ورژن 17   مورد بررسی قرار خواهد گرفت. برای آنالیز داده های مربوط به MDA ، BUN  -  Cr و نیتریت مقایسه بین گروه ها از آنالیز واریانس یک طرفه با تست تعقیبی توکی و برای مقایسه نتایج آسیب شناسی از آزمون کروسکال والیس و من - ویتنی استفاده خواهد شد.

در طول مطالعه بر اساس پروتوکل کار با حیوانات آزمایشگاهی رفتار شده وانجام کار به تایید کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی زاهدان خواهد رسید،وهمچنین چک لیست کار با حیوانات آزمایشگاهی معدب وزارت متبوعه تکمیل وپیوست می شود.کداخلاق :1,2,3,4

ندارد.

Eugenol, insulin resistance syndrome, kidney injury

1.Kurella M, Lo JC, Chertow GM. Metabolic syndrome and the risk for chronic kidney disease among nondiabetic adults. Journal of the American Society of Nephrology. 2005 Jul 1;16(7):2134-40.

2.Mollazadeh H, Hosseinzadeh H. Cinnamon effects on metabolic syndrome: a review based on its mechanisms. Iranian journal of basic medical sciences. 2016 Dec;19(12):1258.

3.Malik, V.S., et al., Sugar-sweetened beverages and risk of metabolic syndrome and type 2 diabetes A meta-analysis. Diabetes care, 2010. 33(11): p. 2477-2483.

4.Edwardson, C.L., et al., Association of sedentary behaviour with metabolic syndrome: a meta-analysis. PloS one, 2012. 7(4): p. e34916.

5.Katzmarzyk, P.T., et al., Targeting the metabolic syndrome with exercise: evidence from the HERITAGE Family Study. Medicine and science in sports and exercise, 2003. 35(10): p. 1703-1709.

6.He, D., et al., Association between leisure time physical activity and metabolic syndrome: a meta-analysis of prospective cohort studies. Endocrine, 2014. 46(2): p. 231-240.

7.Basciano, H., L. Federico, and K. Adeli, Fructose, insulin resistance, and metabolic dyslipidemia. Nutrition & metabolism, 2005. 2(1): p. 5.

8.Sleder, J., et al., Hyperinsulinemia in fructose-induced hypertriglyceridemia in the rat. Metabolism, 1980. 29(4): p. 303-305.

9.LaGuardia HA, Hamm LL, Chen J. The metabolic syndrome and risk of chronic kidney disease: Pathophysiology and intervention strategies. Journal of nutrition and metabolism. 2012 Feb 22;2012.

10.Sheen YJ, Sheu WH. Metabolic syndrome and renal injury. Cardiology Research and Practice. 2011;2011.

11.Tanaka H, Shiohira Y, Uezu Y, Higa A, Iseki K. Metabolic syndrome and chronic kidney disease in Okinawa, Japan. Kidney international. 2006 Jan 2;69(2):369-74.

12.Fox CS, Larson MG, Leip EP, Culleton B, Wilson PW, Levy D. Predictors of new-onset kidney disease in a community-based population. Jama. 2004 Feb 18;291(7):844-50.

13.Chen J, Muntner P, Hamm LL, Jones DW, Batuman V, Fonseca V, Whelton PK, He J. The metabolic syndrome and chronic kidney disease in US adults. Annals of internal medicine. 2004 Feb 3;140(3):167-74.

14.Said MM. The protective effect of eugenol against gentamicin‐induced nephrotoxicity and oxidative damage in rat kidney. Fundamental & clinical pharmacology. 2011 Dec 1;25(6):708-16.

15.Mahapatra SK, Chakraborty SP, Majumdar S, Bag BG, Roy S. Eugenol protects nicotine-induced superoxide mediated oxidative damage in murine peritoneal macrophages in vitro. European Journal of Pharmacology. 2009 Nov 25;623(1-3):132-40.

16.Goulet F, Vachon P, Helie P. Evaluation of the toxicity of eugenol at anesthetic doses in African clawed frogs (Xenopus laevis). Toxicologic pathology. 2011 Apr;39(3):471-7.

17.Slamenova D, Horváthová E, Wsólová L, Šramková M, Navarová J. Investigation of anti-oxidative, cytotoxic, DNA-damaging and DNA-protective effects of plant volatiles eugenol and borneol in human-derived HepG2, Caco-2 and VH10 cell lines. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 2009 Jul 31;677(1):46-52.

18.Al-Okbi SY, Mohamed DA, Hamed TE, Edris AE. Protective effect of clove oil and eugenol microemulsions on fatty liver and dyslipidemia as components of metabolic syndrome. Journal of medicinal food. 2014 Jul 1;17(7):764-71.

19.Mohammadi Nejad S, ÖZGÜNEŞ H, BAŞARAN N. Pharmacological and Toxicological Properties of Eugenol. Turkish Journal of Pharmaceutical Sciences. 2017 Aug 1;14(2).

20.Appel G. Lipid abnormalities in renal disease. Kidney international. 1991 Jan 1;39(1):169-83.

21.Garud MS, Kulkarni YA. Eugenol ameliorates renal damage in streptozotocin‐induced diabetic rats. Flavour and Fragrance Journal. 2017 Jan 1;32(1):54-62.

22.Usta J, Kreydiyyeh S, Bajakian K, Nakkash-Chmaisse H. In vitro effect of eugenol and cinnamaldehyde on membrane potential and respiratory chain complexes in isolated rat liver mitochondria. Food and chemical toxicology. 2002 Jul 1;40(7):935-40.

23.Mnafgui K, Kaanich F, Derbali A, Hamden K, Derbali F, Slama S, Allouche N, Elfeki A. Inhibition of key enzymes related to diabetes and hypertension by Eugenol in vitro and in alloxan-induced diabetic rats. Archives of physiology and biochemistry. 2013 Dec 1;119(5):225-33.

24.Ahangarpour A, Mohammadian M, Dianat M. Antidiabetic effect of hydroalcholic Urtica dioica leaf extract in male rats with fructose-induced insulin resistance. Iranian journal of medical sciences. 2012 Sep;37(3):181.

.25Sánchez-Lozada LG, Tapia E, Jiménez A, Bautista P, Cristóbal M, Nepomuceno T, Soto V, Ávila-Casado C, Nakagawa T, Johnson RJ, Herrera-Acosta J. Fructose-induced metabolic syndrome is associated with glomerular hypertension and renal microvascular damage in rats. American journal of physiology-renal physiology. 2007 Jan;292(1):F423-9.

.26Wong SK, Chin KY, Suhaimi FH, Fairus A, Ima-Nirwana S. Animal models of metabolic syndrome: a review. Nutrition & metabolism. 2016 Dec;13(1):65.

.27Thirunavukkarasu V, Nandhini AA, Anuradha CV. Lipoic acid attenuates hypertension and improves insulin sensitivity, kallikrein activity and nitrite levels in high fructose-fed rats. Journal of Comparative Physiology B. 2004 Nov 1;174(8):587-92.

28.Razmjoo F, Soltani N, Nematbakhsh M, Talebi A, Eshraghi-Jazi F, Ghayyomi M. The Role of Losartan and Oral Magnesium Sulfate in Cisplatin Induced Nephrotoxicity in Female Rats. British Journal of Pharmaceutical Research. 2014;4(15):1886.