بررسی فراوانی ژن های SHV-VEB-TEM-PER- و الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی در سویه های آسینتو باکتر بومانی جدا شده از بیمارستان های آموزشی زاهدان در سال 98-97

میکروارگانیسم های عامل عفونت های بیمارستانی مشکلات فراوانی را از لحاظ عدم موفقیت در درمان و ایجاد مرگ  و میر در بیماران به وجود می آورند که این امر به ویژه به دلیل مقاومت آنتی بیوتیکی آن ها می باشد. از بین این باکتری ها آسینتو باکتر یک پاتوژن انسانی مهم بوده که در سال های اخیر به شدت مورد توجه قرار گرفته است(1-2)آسینتو باکتر ها یکی از چهار جنس خانواده نایسریاسیه که کوکوباسیل های کوتاه تقریبا گرد،گرم منفی،اکسیداز منفی،بدون تحرک،و هوازی اجباری و فرصت طلب ور در حال گسترش می باشداین باکتر ی انتشار وسیعی داشته و میتوانند از منابع گوناگون جدا شوند لیکن بیمارستان ها منشا سویه های بیماری زای می باشند(4-3)جنس آسینتو باکتر حاوی بیش از 32 گونه مختلف است و آسینتو باکتر بومانی گونه غالب می باشد (5)که عامل عفونت های مهمی چون باکتریمی ،پنومونی ، مننژیت ثانویه ،عفونت دستگاه ادراری و عفونت های سوختگی ،عفونت های گردش خون ،باکتریوری و اورتریت است.(6-7)آسینتو باکتر بومانی گروه های مختلفی از مردم به ویژه بیماران بستری در بخش  ICU(مراقبت های ویژه) را تحت تاثیر قرار می دهد.ریسک فاکتورهای متعدد ،مستعد کننده عفونت با این باکتری شامل (بستری طولانی مدت در بیمارستان،نقص ایمنی ،اعمال جراحی،تماس طولانی مدت با بیماران کلونیزه شده،سوختگی ،کهولت سن، مصرف آنتی بیوتیک های وسیع الطیف و وجود عوامل تهاجمی مثل کاتتر می باشد(8) یکی از خصوصیات خاص آسینتو باکتر بومانی علاوه بر مقاومت ذاتی در مقابل شرایط محیطی ،توانایی خارق العاده آن در کسب و بیان ژن های متعدد عامل مقاومت دارویی است به شکلی که امروزه این باکتری در برابر اکثر آنتی بیوتیک ها مقاوم بوده و درمان عفونت های ناشی از آن از مشکلات عمده جامعه پزشکی در دنیا می باشد(9) مقاومت آنتی بیوتیکی در این باکتری به واسطه مکانیسم های اکتسابی و ذاتی است که این مکانیسم ها شامل،موتاسیون در ژن های هدف،تغییر در نفوذ پذیری غشا خارجی و افزایش بیان پمپ های افلاکس می باشد(10-9)از جمله آنتی بیوتیک های مورد استفاده در درمان عفونت های ناشی از ایزوله های آسینتو باکتر بومانی آنتی بیوتیک های خانواده بتالاکتام مانند پنی سیلین ها،سفالوسپورین ها و کارباپنم ها هستند که در سال های اخیر این باکتری نسبت به اکثراین آنتی بیوتیک ها مقاوم شده است(9)این باکتری جهت حفاظت از اثرات کشنده آنتی بیوتیک های گروه بتالاکتام که در سنتز دیواره سلولی موثرند آنزیم های بتا لاکتاماز را تولید می کنند (11-12) بتالاکتامازها آنزیم های مسئول مقاومت به پنی سیلین ها، سفالوسپورین ها و ترکیبات بتالاکتام می باشند. این آنزیم ها حلقه بتالاکتام را در این آنتی بیوتیک ها هیدرولیز نموده و به این ترتیب باعث غیر فعال شدن دارو ها می شوند(13) کشف آنتی بیوتیک های جدید از قبیل سفالوسپورین وسیع الطیف و رواج استفاده از آن ها در درمان بیماری های عفونی باکتریایی منجر به بروز به دسته جدیدی از این آنزیم ها با عنوان بتالاکتامازهای وسیع الطیف (ٍ (ESBl در باکتری ها شده است(14) بتالاکتاماز های وسیع الطیف اولین بار در دهه 1980 در سویه های کلبسیلا پنومونیه و سپس در اشرشیا کلی ،پسودوموناس آئروژینوزا و سراشیا مارسنس وبعد ها در سایر باسیل های گرم منفی شناسایی شدند. ESBL  آنزیم های هستند که توانایی هیدرولیز سفالوسپورین ها (به استثنا سفامایسین ها و کارباپنم ) و آزترونام را دارند سویه های تولید کننده ESBL توسط مهارکننده های بتالاکتاماز (مثل کلاولانیک اسید،سولباکتام و تازوباکتام )مهار می شوند(15-16) طبق تقسیم بندی Ambler بتالاکتاماز ها براساس ساختار اولیه شان به چهار دسته (A-D) تقسیم بندی می شوند. بتالاکتاماز های نوع A،C،وD سرین بتالاکتاماز بوده و نوع B متالوبتالاکتاماز است فراوانی انواع A,C بیشتر است (17)بتالاکتاماز ها براساس طیف سوبسترا و پاسخ به مهار کننده به گرو های عملکردی مختلفی دسته بندی می شوند(18)  بتالاکتاماز های نوع A  به بیشتر آنتی بیوتیک های بتا لاکتام نظیر پنی سیلین ها،سفالوسپورین های نسل دوم مانند سفورکسیم ،سفوکستین و سوم مانند  سفتازیدیم ،سفوتاکسیم ،سفتریاکسون و سفپیم ، مونوباکتام ها مثل آزترونام مقاومت نشان می دهند  اما به سفاماسین ها سفوکستین ، سفوتتان  و کارباپنم ها مروپنم . ایمی پنم حساس می باشند (19) تا به امروز بیش از 150 نوع ESBL متفاوت شناسایی شده است(20) بیشتر این ESBLها مشتقات بتالاکتاماز های TEM،SHV،PER،VEB، می باشند (21) ESBL  های تیپ TEM-1  و TEM_2 مشتقاتی از TEM   هستند اولین بار در سال 1965 از کشت خون بیماری به نام تمونیرا در آتن یونان از اشرشیا کلی ایزوله شد از این رو به آن TEM می گویند (22) TEM-1  معمول ترین فرم بتالاکتاماز باکتری های گرم منفی است که توانایی هیدرولیز پنی سیلین و سفالوسپورین های اولیه مثل سفالوتین را دارد (23) TEM-1   از اولین بتالاکتامازهای  بود که توسط پلاسمید در انتروباکتریاسیه کد شده ولی در سایر باکتری ها از جمله سودوموناس آئروژینوزا و ویبریو کلرا و نیز سویه های آسینتو باکتر و نایسریا نیز قا در به تولید آن می باشند(24)ٍ ESBL های تیپ SHV  در ایزوله های بالینی با فراوانی زیاد نسبت به انواع دیگر تیپ های ESBL  یافت می شوند.  SHV  به علت محل فعال متغییر سولفیدریل به این نام خوانده می شوند (22-23) بتالاکتاماز SHV-1  برای اولین بار توسط  pitton  در سال 1972 کشف و PLT-2  نام گذاری شد (25) با جایگزینی اسید های آمینه در جایگاه فعال آنزیم SHV  انواع مختلفی از بتالاکتاماز SHV  به وجود آمده به طوری که تاکنون بیش از 50 نوع از آنزیم SHV در جهان یافت شده است. اکثریت تیپ های SHV در سویه های کلبسیلا پنومونیه یافت شده اند با این حال این آنزیم ها در سیتروباکتر ،اشرشیا کلی و سودوموناس و نایسریا و سایر باکتری های گرم منفی شناسای شده اند.( 26) ESBL  های تیپ PER  این آنزیم هم بر روی کروموزوم و هم بر روی پلاسمید یافت شده است و به طور موثر پنی سیلین ها و سفالوسپورین ها را هیدرولیز نموده و فعالیت آن توسط کلاولانیک اسید مهار می شوند (27) PER-1  اولین بار در سویه سودوموناس آئروژینوزا از یک  بیمار ترکیه ای شناسایی شد و در 60 درصد سویه های مقاوم به سفتازیدیم آسینتو باکتر بومانی گزارش شده است. PER-2  ، 86 درصد با PER-1  همولوژی دارد و در سالمونلا انتریکا سرووار تایفی موریم ،اشرشیا کلی، کلبسیلا پنومونیه ، سودوموناس آئروژینوزا و ویبریو کلرا شناسایی شده است .(29-28) ژن VEB  اولین بار در اشرشیا کلی همراه یک ژن دیگر در بیماری از ویتنام گزارش شده بود و پس از آن در تایلند در سویه های سودوموناس نیزیافت شده است . VEB-1 همولوژی بالایی  حدود 38 درصد به PER-2  و PER-1  دارد این آنزیم سطح بالای از مقاومت را به سفتازیدیم ،سفوتاکسیم  و آزترونام را اعمال می کند.(30)

در سال 2017 در ترکیه از 519 نمونه فراوانی ژن TEM  55% فراوانی ژن SHV 7.7%  گزارش شده است . (31)

در مطالعه ای که در سال 2017  در عربستان سعودی از 503 نمونه فراوانی ژن TEM  %14 و فراوانی ژن PER 76.3 % گزارش شده است. (32)

طی مطالعه ای که در شهر تبریز در سال 2017 از 60 نمونه فراوانی ژن TEM   11.6 % و فراوانی ژن SHV 31.6 % گزارش شده است. (33)

طی مطالعه ای که در سال 2017 در ساری از 205 نمونه فراوانی ژن VEB 17.2 % و فراوانی ژن SHV 96.6 % گزارش شده است.(34)

افزایش موارد عفونت با آسینتو باکتر بومانی و مقاومت آن به چندین عامل ضد میکروبی (مانند بتالاکتام های وسیع الطیف ،کارباپنم ها ، آمینوگلیکوزید ها و فلورکینولون ها ) و عفونت های که در سیستم عصبی مرکزی ،پوست،بافت های نرم و استخوان ایجاد می کند.تمابل به شناسایی آسینتو باکتر بومانی را افزایش داده است. مکانیسم های دقیقی که نشان دهنده آغاز و پیشرفت شیوع عفونت های آسینتوباکتر بومانی باشد هنوز مشخص نشده است. دلایل فوق از جمله علل اساسی  در انجام مطالعه شناسایی آسینتو باکتر بومانی و بررسی الگوی مقاومت ضد میکروبی و بررسی فراوانی مولکولی بتالاکتاماز VEB،PER،TEM،SHV در ایزوله های بالینی آسینتو باکتر بومانی به روش مولکولی PCR  است.

1. توزیع فراوانی الگوی مقاومت و حساسیت آنتی بیوتیکی در سویه های آسینتو باکتر بومانی چگونه است؟

2. توزیع فراوانی ژن VEBدرایزوله های بالینی آسینتوباکتر بومانی چگونه  است؟

3. توزیع فراوانی ژن PERدرایزوله های بالینی آسینتوباکتر بومانی چگونه  است؟

4.توزیع فراوانی ژن TEMدرایزوله های بالینی آسینتوباکتر بومانی چگونه  است؟

5،توزیع فراوانی ژن SHV در ایزوله های آسینتوباکتر بومانی چگونه است؟

بررسی فراوانی ژن های PER -TEM-VEB -SHV و الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی در سویه های  آسینتو باکتر بومانی جدا شده از بیمارستان های آموزشی زاهدان در سال 98 - 97 .

1. تعیین  توزیع فراوانی الگوی مقاومت و حساسیت آنتی بیوتیکی در سویه های آسینتوباکتر بومانی در بیمارستان های آموزشی شهر زاهدان

2.تعیین فراوانی ژن VEB های بالینی آسینتوباکتر بومانی در بیمارستان های آموزشی شهر زاهدان

3.تعیین فراوانی ژن PER درایزوله های بالینی آسینتوباکتر بومانی  در بیمارستان های آموزشی شهر زاهدان

4 .تعیین فراوانی ژن TEM در ایزوله های بالینی آسینتو باکتر بومانی در بیمارستان های آموزشی شهر زاهدان 

5،تعیین فراوانی ژن SHV در ایزوله های بالینی آسینتو باکتر بومانی در بیمارستان های آموزشی شهر زاهدان  

ندارد

آسینتوباکتر بومانی:گونه ای از باکتری های گرم منفی هوازی که عموما در آزمایشگاه بالینی یافت میشود و به طور معمول به آنتی بیوتیک ها مقاومت دارد.

مقطعی(توصیفی)

ایزوله های بالینی آسینتوباکتر بومانی جداشده از بیماران  بیمارستان های آموزشی شهر زاهدان

حجم نمونه با استفاده از فرمول کوکران با در نظر گرفتن α= 0.05  و d=0.05 از حداقل 70 و حداکثر 385 نمونه متغیر است که با توجه به محدودیت زمان جمع آوری نمونه ، 120 در نظر گرفته شد

با استفاده از روش نمونه گیری آسان یا در دسترس پس از تصویب طرح تا زمان رسیدن به حجم نمونه مورد نظر مطالعه ادامه خواهد داشت.

نمونه هایی که از بیماران بستری به آزمایشگاه ارسال میشود کشت و تعیین هویت شده سپس از نظر مقاومت دارویی و وجود ژن های TEM-PER-SHV-VEB مورد بررسی قرار میگیرند.

در این مطالعه از نمونه های مختلفی که از بیماران  بیمارستان های آموزشی شهر زاهدان به آزمایشگاه ارسال شده است استفاده می گردد. این نمونه ها در محیط های کشت اولیه شامل بلاد آگار و مکانکی آگار کشت داده می شوند بعد از انکوباسیون باکتری های جدا شده با استفاده از روش های استاندارد میکروب شناسی شامل رنگ آمیزی گرم ، تست اکسیداز ، کشت روی محیط TSI و SIM و OF و رشد در دمای 42 درجه سانتی گراد تعیین هویت می شوند و تست اختصاصی گونه به کمک ژن bla OXA-51  توسط واکنش PCR انجام خواهد گردید. پس از تعیین هویت به صورت کشت ذخیره در محیط کشت BHI   حاوی  15% گلیسرول وارد کرده وتا زمان استخراج DNA در دمای 70- فریز می گردند.

برای  توصیف داده ها از جداول توزیع فراوانی و نرم افزار SPSSو در صورت نیاز از سایر شاخص های آماری مرتبط استفاده خواهد شد .

راهنمای عمومی اخلاق در در پژوهشهای علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی در جمهوری اسلامی ایران

کد اخلاقی (1):هدف اصلی هر پژوهش‌باید ارتقای سلامت انسان‌ها توأم با رعایت کرامت و حقوق ایشان باشد.

کداخلاقی(4):مواردی از قبیل سرعت -سهولت کار-راحتی پژوهشگر به هیچ وجه نباید موجب قرار دادن آزمودنی در معرض خطر قرار گیرد

کد اخلاق(10):هر پژوهش باید براساس و منطبق بر یک طرح نامه (پروپوزال) به انجام رسد.

کد اخلاقی(25):پژوهشگر مسؤول رعایت اصل رازداری و حفظ اسرار آزمودنی‌ها و اتخاذ تدابیر مناسب برای جلوگیری از انتشار آن است.

کداخلاقی(28):پژوهشگر موظف است که نتایج پژوهش‌های خود را صادقانه ، دقیق، و کامل منتشر کنند.

کد اخلاقی (31):روش پژوهش نباید با ارزش‌های احتماعی، فرهنگی و دینی  جامعه در تناقض باشد.

محدودیت ها: تهیه مواد و ابزار مورد نیاز برای آزمایش

راه حل: افزایش زمان انجام طرح

آسینتوباکتر بومانی،بتالاکتاماز های وسیع الطیف،مقاومت چند دارویی،

• مراجع مورد استفاده براساس رفرانس نویسی ونکوورتنظیم گردد.

1. Curtis LT. Prevention of hospital-acquiredinfections: review of non-pharmacologicalinterventions. J Hosp Infect. 2008; 69: 204-19.

2.   Ardebili A, Azimi L, Mohammadi-Barzelighi H, Owlia P, Beheshti M, Talebi M, Jabbari M, Rastegar Lari A, Determination of Resistance pattern of Isolated Acinetobacter baumannii from Hospitalized Burned Patients in Motahari Hospital , Tehran .2012;83(20):112-119

3.   Howard A, O'Donoghue M, Feeney A, Sleator RD.Acinetobacter baumannii: an emerging opportunisticpathogen. Virulence. 2012;3(3):243-50.

4.   Abbas Nazari Monazam,Seyyed Reza Hosseini Doust, Reza Mirnejad. Prevalence PER and VEB beta-lactamase Genes among Acinetobacter baumannii Isolated from Patients in Tehran by PCR.2014;8(4):P 28-35

5.  Zarrilli R, Giannouli M,  Tomasone F, Triassi M, Tsakris A, Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii the molecular epidemic features of an emerging problem in health care facilities. The Journal of Infection in Developing Countries .2009;3(05):335-41

6.   Gordon Nc,  Wareham DW, Multidrug-resistant Acinetobacter  baumannii mechanisms of virulence and resistance. International journal of antimicrobial agents.2010;35(3):219-26

7. Safar faraginia,Nasrollah sohrabi,mohammad Taghi Akhi,Mohammad reza Nahaei,Amir peimani,Zohreh Amiri. Frequency of broad-spectrom beta -lactamases in Acinetobacter baumanii using methode phenotypic And genotype.1392;18(60):29-34

8.Fournier PE, Richet H, Weinstein RA. The epidemiology and control of Acinetobacter baumannii in health care facilities. Clinical infectious diseases. 2006;42(5):692-9.

9.Perez F, Hujer A, Hujer K, Decker B, Rather P, Bonomo R. Global challenge of multidrug-resistantAcinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother. 2007;51 (10): 3471-3484

10.Poirel L, Nordmann P. Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii: mechanisms and epidemiology. Clinical Microbiology and Infection. 2006;12(9):826-36.

11.Song JS,Lee J-H,Jeong BC ,Lee Wk,Lee SH.Removal of contaminating TEM-1a B-lactamase Gene  from  Commercial Taq DNA Polymerase ,,Journal of microbiology 2006;44(1):126-128

 12.Li Q,Lee,JY,Castillo R,Hixon MS,Pujol C,Doppalapudi VR, et al,A novel antibacterial agent With broad -Spectrum activity and enhanced Potency against beta-lactamases-producing strains.Antimicrob Agent Chemother .2002;46(5):1262-8

13. Singh R,Saxena A, Singh H, Identification of group specific motifs in Beta_lactamase family of Biomedical Science 2009,16:109

14.   Tenover Fc,Raney pm, Williams pp, Rasheed jk,Biddle Jw, Oliver A, et al.Evaluation of the nccls extended -Spectrum beta-lactamase confirmation method for Escherichia coli with isolates collected during project ICARE.J Clin Microbiol 2003;41(7):3142-6

15.  Garaza-Ramos  U, Martines _ Romero  E,Silva-Sanchez J, SHv-type Extended -Spectrum B_lactamase are encoded in related plasmis from entrobacteria clinical isolated from Mexico.Salud publica Mex 2007 ;49:415-421

16.  Bali. EB, Acik L, sultan N. Phenotypic and molecular characterization of SHV, TEM,CTX_M and extended _spectrum B_lactamase produce by Escherichia coli, Acinetobacter baumannii and Klebsiella isolated in a Turkish hospital African Juornal of Microbiology 2010;4(8):650_654

17.  Hall Bg, Barlow M. revised Ambler classification of  beta _lactamases. J Antimicrobial Chemother 2005;55(6):1050_1.

18.  bush K, jacoby GA, Medeiros AA. A functional  classification scheme for beta-lactamase and its correlation with molecular structure. Antimicrob Agent Chemother 1995;39(6):1211_33.

19.  Jacoby GA, Munoz-price Ls. The New beta-lactamase. new England Journal of Medicine 2005;352(4):380_91.

20.   Branford pa. extended _spectrum beta-lactamase in the 21st century :characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat.Cli Microbiol Rev 2001;14(4):933_51,table of contents.

21.  Weldhagen Gf, poirel L, Nordmann P, Ambler class A extended _spectrum beta-lactamase in pseudomonas aeruginosa :novel development and clinical impact Antimicrob Agent Chemother 2003;47(8):2385_92

22.  Paterson Dl, Bonomo Ra.Extended_spectrum beta-lactamase :a Clinical update. Clin. Microbiol Rev 2005;18(4):657_686

23.  Branford pa.Extended _spectrum beta-lactamase in the 21st Century :Characterization, Epidemiology,  and Detection of This Important Resistance Threat. Clin Microbiol Rev 2001;14(4):933_951

24.  Zamanzad B, Daiham B, Nafisi M, Karimi A. Study of frequency TEM_1 gene in E.coli, Klebsiella pneumonia and Entrobacter Strain producing extended spectrum _beta-lactamase in clinical sample shahrekord with Pcr Persian Hamedan med J2007;14(4):19_25

25.  Mobasher_kare _Jeddi AR, Nahaei Mr,Mobayyen H,pornour M,Sadeghij. molecular study of extended _spectrum beta-lactamase Shv type in Escherichia coli and Klebsiella pneumonia isolated from Medical centers of Tabriz Persian Iran med Microbiol 2008;2(3,4):9_17

26.   Imani fooladi AA.Rostami Z,shapour R.Antimicrobial resistance and ESBL prevalence in Pseudomonas aeruginosa strains Isolated from Clinical Specimen by phenotypic and genotypeic method Persian. 1389:10(3):189_198

27.   Eslami M,Najar Reerayeh S. phenotypic and molecular detection of TEM,Per,and Veb beta-lactamase in Clinical strain of Escherichia Coli Persian Arak Medical University Journal 2012;15(60):1_9

28.  Pasteran F.Rapoport M,petroni A,Faccone D,Cors A,Galas M,et al. Emergency of Per_2 and Veb_1a in Acinetobacter baumannii strain in the Americas.2006;50(9):3222_4

29.   Al_Hassan L,El mahallawy H,Amyes,SG first report of bla(per_3) in Acinetobacter baumannii Int J Antimicrob Agent. 2013;41(1)93_4

30.  Naas.T, Coignard B,carbonne A,Blanckaert K, Bajolet O, Bernet C. et al,VEB_1 Extended _spectrum beta-lactamase producing Acinetobacter baumannii, France Emerg Infect Dis.2006;12(8):1214_22

31.       Savari M, Ekrami A, Shoja S, Bahador A. Plasmid borne Carbapenem-Hydrolyzing Class D β-Lactamases (CHDLs) and AdeABC efflux pump conferring carbapenem-tigecycline resistance among Acinetobacter baumannii isolates harboring TnAbaRs. Microbial Pathogenesis. 2017;104:310-7.

32.       Angoti G, Bandehpour M, Goudarzi H, Hajizadeh M, Zarringhalam Moghaddam M, Kouchaki A. Detection of Efflux Pump Genes (adeA, adeB, adeC and abeM) in Acinetobacter baumannii Isolated from Hospitalize Patients, North-west of Iran. Infection, Epidemiology and Medicine. 2016;2(4):8-11.

ندارد

در این پژوهش بعد از بررسی فراوانی ژنهای ESBL(per-veb-tem-shv) الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی در مورد باکتری آسینتو باکتر بومانی  بررسی می شود جهت شناخت آنتی بیوتیک های مقاوم و حساس می باشد تا روند درمان با سهولت بیشتر صورت گیرد.

ندارد

ندارد

با توجه به اینکه از آرشیو نمونه ها استفاده می شود هزینه از بیماران گرفته نخواهد شد.

ندارد

اطلاعات هویتی بیماران محرمانه نگه داشته خواهد شد.

ندارد

ندارد

قبلا از بیماران رضایت کامل صورت گرفته  و برای دسترسی به آرشیو نمونه ها از کمیته اخلاق اجازه گرفته شده است.

ندارد