بررسی میزان بیان پروتئین های E-cadherin و N-cadherin در پریودنتیت مزمن شدید

پریودنتیت یک بیماری التهابی و پلی میکروبیال است که بافت های حمایت کننده دندان را درگیر می کند و به واسطه فقدان اتصال اپی تلیالی و تحلیل استخوان آلوئولار مشخص می شود و در صورتی که به درستی درمان نشود می تواند منجر به از دست رفتن دندان شود (1).

اپی تلیوم جانکشنال و سالکولار اولین سدهای دفاعی در مقابل بیوفیلم های دندانی می باشند و به عنوان یک سد مکانیکی عمل می کنند،  همچنین با ترشح سایتوکین های التهابی و آنزیم ها، پاسخ ایمنی موضعی را فراهم می کنند. فقدان انسجام اپی تلیالی می تواند با تهاجم باکتری به بافت همبند زیرین همراه باشد و به طور بالقوه پاسخ التهابی و آسیب بافتی بعدی را افزایش دهد (2).

Epithelial–Mesenchymal Transition (EMT) یک فرایند سریع و اغلب برگشت پذیر از فنوتیپ سلولهای اپیتلیالی و ضروری برای تکامل صحیح در طی امبریوژنزیس از جمله مورفوژنز قلب، تشکیل مزودرم و ستیغ عصبی (3) و همچنین ترمیم زخم ها و شرایط پاتولوژیک نظیر فیبروز دژنراتیو و سرطان ها می باشد. در طی این فرایند فنوتیپ سلول ها از اپی تلیالی به شبه مزانشیم تغییر می یابد، این فرایند اساسا با از بین رفتن اتصالات سلولی، افزایش بروز مارکرهای مزانشیمال، کاهش بروز مارکرهای اپی تلیالی و افزایش توانایی مهاجرت سلول ها مشخص می شود (4).

 گزارش شده است که التهاب مزمن و پایدار حاصل از عفونت های میکروبیال می تواند در القاء EMT  در ارگان های مختلف دخیل باشد (5).  همچنین این احتمال وجود دارد کهEMT  در سلول های اپی تلیالی دهان  نیز در طی التهاب مزمن شروع شود و منجر به از دست رفتن انسجام اپی تلیالی و فانکشن سد اپی تلیالی و در نتیجه افزایش ارتشاح میکروبی در لثه و بافت های پری رادیکولار شود. ولی نقش بالقوه و دقیق EMT به عنوان یک مکانیسم درگیر در فانکشن سد اپی تلیالی و ارتشاح باکتری های دهان در بیماری های پریودنتال هنوز به طور کامل شناخته نشده است (6).

یکی ازکرایتریاها و نماهای خیلی برجسته در EMT، کاهش مولکول های مرتبط با اتصالات اپی تلیالی سلول-سلول نظیر E-کادهرین و اکتساب و افزایش بروز مارکر سلول های مزانشیمال نظیر N-کادهرین یا به عبارتی همان Cadherin Swiching از فنوتیپ اپی تلیالی به مزانشیمی می باشد. E-کادهرین یک گلیکوپروتئین متعلق به خانواده کادهرین از مولکول های اتصال دهنده سلول-سلول و وابسته به کلسیم می باشد و نقش مهمی در انسجام اپی تلیالی از طریق برقراری اتصال بین سلول های اپی تلیالی به عهده دارد. N-کادهرین نیز یک گلیکوپروتئین متعلق به خانواده کادهرین است که به طور نرمال در بافت های با منشا نورواکتودرمال و مزودرمال بروز می یابد و در برقراری اتصال سلولی در سلول های مزانشیمال اهمیت دارد (7).

Abdulkareem و همکارانش درسال 2018 نقش پاتوژن های پریودنتال در تخریب سد اپیتلیالی با القا EMT را بررسی کردند. کراتینوسیت های اولیه از موش های Wistar Han برداشته شدند و طی یک دوره 8  روزه در معرض Fusobacterium nucleatum،   P. gingivalis و E.coli  قرار گرفتند. بیان ژن های مارکر EMT با استفاده از RT-PCR تعیین شد. نهایتا با قرار گرفتن سلول های اپیتلیال اولیه در معرض پاتوژن های پریودنتال کاهش قابل توجهی در رونویسی از  E-cadherin و از طرفی تنظیم و تعدیل    N-cadherinمشاهده شد. بعلاوه توانایی مهاجرت سلول ها در پاسخ به تحریک باکتری ها به میزان قابل توجهی افزایش یافت (1).

در مطالعه ای دیگر  Abdulkareemو همکاران در سال 2017  نقش پاتوژن های پریودنتال درالقا EMT  در oral squamous cell carcinoma(OSCC) را بررسی کردند. OSCC ها به صورت جداگانه با پاتوژن های پریودنتال  F. nucleatum یا P. gingivalis  یا   E. coli LPS به مدت 8  روز کشت داده شدند. داده های PCR  افزایش قابل توجهی در رونویسی نشانگرهای مزانشیمال و کاهش مارکر های اپی تلیال را در مقایسه با گروه کنترل  نشان داد. پاتوژن های پریودنتال همچنین باعث افزایش قابل توجهی در میزان القای EMT  شدند. نهایتا این نتایج نشان می دهد که EMT احتمالا در سلول های OSCC در پاسخ به تحریک با پاتوژن های پریودنتال القا می شود (5).

در سال 2017 Lee و همکارانش درمطالعه ای برای نخستین بار بیان فاکتور های نسخه برداری مرتبط با   EMT را در سلول های اپیتلیال دهانی اولیه (OECs) که در طول مدت طولانی در معرض عفونت gingivalis .p قرار گرفته بودند در محیط آزمایشگاهی بررسی کردند. نتایج نشان دهنده القا EMT و افزایش مهاجرت سلولی در طول دوره عفونت با P. gingivalis  بود) 8).

Sume و همکارانش در سال 2010 نیز نقش EMT را در لثه هایپرپلاستیک ناشی از دارو بررسی کردند. نتایج به دست امده نشان داد در بافت های لثه ای هایپرپلاستیک ناشی از فنی توئین بیان E-cadherin  اپیتلیال کاهش یافته است.  همچنین بافت های لثه ای با رشد بیش از حد ناشی از نیفیدیپین و سیکلوسپورین   A نیز به طور مشابه کاهش E-cadherin  را نشان می دهد (9).

با توجه به اینکه در زمینه تعیین نقش EMT در پاتوژنز بیماری پریودنتال مطالعات اندکی انجام شده است (1) و هنوز نقش این فرایند به طور کامل شناخته نشده است، در این مطالعه سعی بر این است که از طریق تعیین میزان بیان پروتئینهای E- cadherin و N- cadherin و Cadherin Swiching بتوان به تعیین نقش EMT  در این بیماری ها پرداخت.

1- میزان بروز پروتئین E-کادهرین در پریودنتیت مزمن شدید و لثه نرمال متفاوت است.

2- میزان بروز پروتئین N-کادهرین در پریودنتیت مزمن شدید و لثه نرمال متفاوت است.

3-بروز فرآیند  Cadherin-switching در پریودنتیت مزمن شدید چگونه است؟

تعیین میزان بیان پروتئین های E-cadherin و N-cadherin در پریودنتیت مزمن شدید

1. مقایسه میزان بروز پروتئین E-کادهرین در پریودنتیت مزمن شدید و لثه نرمال
2. مقایسه میزان بروز بیان پروتئین N-کادهرین در پریودنتیت مزمن شدید و لثه نرمال
3. تعیین بروز فرآیند  Cadherin-switching در پریودنتیت مزمن شدید

مرکز تحقیقات دندانپزشکی، دانشکده های دندانپزشکی

 :Epithelial–Mesenchymal Transition (EMT)فرایند تغییر فنوتیپ سلول ها از اپی تلیالی به شبه مزانشیمال (4)

Cadherin-switching: کاهش بروز E-کادهرین  و افزایش بروز N-کادهرین (7)

توصیفی- تحلیلی

نمونه های بافتی جمع آوری شده از بیماران مبتلا به پریودنتیت مزمن شدید در محدوده سنی 20 تا 40 سال و مراجعه کننده به بخش پریو دانشکده دندانپزشکی زاهدان که توسط معاینه بالینی و تحت نظر متخصص بیماری های لثه تایید شده اند، نمونه های لثه سالم نیز از بیمارانی که جهت جراحی افزایش طول تاج مراجعه می کنند و سابقه پریودنتال تراپی قبلی، سابقه بیماری خاص یا مصرف داروی خاصی ندارندجمع آوری می شوند.

معیارهای ورود:

1- تمام بلوکها دارای میزان کافی از ضایعه بمنظور رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی باشند.

2- نمونه ها فیکساسیون مطلوب داشته باشند.

3- نمونه ها فاقد نکروز در لام مورد نظر باشند.

4-نمونه های کنترل نیز فاقد هر گونه بیماری سیستمیک باشند

با توجه به فرمول آماری زیر و با استناد به مقاله ی Sume و همکاران (9) و با در نظر گرفتن α=0.05  تعداد افراد مورد مطالعه در هر گروه 12 نفر به دست آمد که جهت افزایش دقت مطالعه، در هر گروه 15 نفر و در مجموع 30 نفر مورد مطالعه قرار خواهند گرفت.

 تصادفی طبقاتی جهت نمونه های پریودنتیت مزمن و کنترل

بر طبق مشاهده و گزارش توسط پاتولوژیست و همچنین اطلاعات ثبت شده در پرونده بیماران.

در این مطالعه ابتدا نمونه های بافتی مورد نظر از بیماران مبتلا به پریودنتیت مزمن شدید که توسط معاینه بالینی و تحت نظر متخصص بیماریهای لثه تایید شده اند جمع آوری خواهند شد، نمونه های لثه سالم نیز از بیمارانی که جهت جراحی افزایش طول تاج مراجعه کرده و سابقه پریودنتال تراپی قبلی، سابقه بیماری خاص یا مصرف داروی خاصی ندارند تهیه می شود. سپس از نمونه های مورد نظر در بخش پاتولوژی برش های 5 میکرونی تهیه شده و لامهای هماتوکسیلین- ائوزین آنها بررسی خواهند شد، در صورتیکه نمونه ها فیکساسیون مطلوب داشته و فاقد نکروز باشند، همچنین نمونه های کنترل نیز فاقد هر گونه بیماری سیستمیک باشند، مطابق با  دفترچه راهنمای موجود در کیت  رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی، نمونه ها رنگ آمیزی خواهد شد. از مارکرهای (آنتی بادیهای مونوکلونال) E-cadherin  و N-cadherin  ساخت شرکت Novocastra  استفاده می شود و از محلول Diluent  جهت رقیق نمودن آنتی بادیها استفاده می شود. جهت اطمینان از صحت رنگ آمیزی برای همه نمونه ها از شاهد مثبت و منفی نیز استفاده می شود. در نهایت لامها زیر میکروسکوپ نوری تحت نظر پاتولوژیست، توسط دانشجوی آموزش دیده از لحاظ رنگ آمیزی دو مارکر فوق بر اساس درصد سلولهای رنگ گرفته بررسی می شوند.

  داده های بدست آمده از مطالعه توسط جداول توزیع فراوانی و آزمونهای آماری من ویتنی و کای اسکوئر مورد تحلیل قرار خواهد گرفت. در این راستا از نرم افزار آماری SPSS نسخه 21 استفاده می شود.

جدول میزان بیان E- cadherin در نمونه های پریودنتیت مزمن شدید و لثه سالم

کدهای اخلاقی مصوب شورای پژوهشی که در این مطالعه رعایت می شود به شرح ذیل می باشد:

بر اساس راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی  دارای آزمودنی انسانی  در جمهوری اسلامی ایران در این مطالعه کدهای 1و2و3و10و11و12و13و14و15و16و17و18و20و24و25و26و27و28و29و30و31 رعایت خواهد شد.

همچنین بر اساس راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو بافت انسانی در جمهوری اسلامی ایران کدهای 1و2و3و4و5و6و7و8و9و10و11و12رعایت خواهد شد.

جمع آوری نمونه: کم بودن احتمالی تعداد نمونه ها که راه حل آن تهیه نمونه ها از مراکز درمانی مختلف یا افزایش مدت زمان طرح می باشد.

 پریودنتیت مزمن،e-کادهرین، N- کادهرین

E-cadherin ،N- cadherin, chronic periodontitis 

1. Abdulkareem AA, Shelton RM, Landini G, Cooper PR, Milward MR. Potential role of periodontal pathogens in compromising epithelial barrier function by inducing epithelial‐mesenchymal transition. J Periodontal Res 2018;53(4):565-574.
2. Ji S, Choi YS, Choi Y. Bacterial invasion and persistence: critical events in the pathogenesis of periodontitis? J Periodontal Res 2015;50(5):570-85.
3. Savagner P. The epithelial–mesenchymal transition (EMT) phenomenon. Ann Oncol 2010;21(suppl_7):vii89-92.
4. Sisto M, Lisi S, Ribatti D. The role of the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) in diseases of the salivary glands. Histochem Cell Biol 2018;150(2):133-147.
5. Abdulkareem AA, Shelton RM, Landini G, Cooper PR, Milward MR. Periodontal pathogens promote epithelial-mesenchymal transition in oral squamous carcinoma cells in vitro. Cell Adh Migr 2017;12(2):127-37
6. Mehrazarin S. Molecular Mechanisms Regulating Epithelial Barrier Function and Inflammatory Response (Doctoral dissertation, UCLA).
7. Pal M, Bhattacharya S, Kalyan G, Hazra S. Cadherin profiling for therapeutic interventions in Epithelial Mesenchymal Transition (EMT) and tumorigenesis. Exp Cell Res 2018;368(2):137-146.
8. Lee J, Roberts JS, Atanasova KR, Chowdhury N, Han K, Yilmaz Ö. Human Primary Epithelial Cells Acquire an Epithelial-Mesenchymal-Transition Phenotype during Long-Term Infection by the Oral Opportunistic Pathogen, Porphyromonas gingivalis. Front Cell Infect Microbiol 2017;7:493.
9. Sume SS, Kantarci A, Lee A, Hasturk H, Trackman PC. Epithelial to mesenchymal transition in gingival overgrowth. Am J Pathol 2010;177(1):208-18.

مطالعه حاضر به بررسی ایمونوهیستوشیمی بیان E-Cadherin و N-Cadherin در بافت های دهانی مبتلایان به پریودنتیت می پردازد.

ندارد.

در این مطالعه با بررسی میزان بیان  E-Cadherin و N-Cadherin نقش این مارکرها در تکامل و پیشرفت پریودنتیت تا حدودی مشخص می گردد.

ندارد.

ندارم.

هزینه به عهده مجری یا مجریان طرح خواهد بود و بیمار هزینه ای را پرداخت نخواهد کرد

ندارد.

اطلاعات شخصی مربوط به هر یک از شرکت کنندگان به صورت محرمانه نگهداری خواهد شد.

مجری موظف است پاسخگوی کلیه پرسش ها باشد. 

شرکت من در مطالعه کاملاً اختیاری است و آزاد خواهم بود که از شرکت در مطالعه امتناع نموده یا هر زمان  که مایل بودم بدون آنکه تغییری در نحوه رفتار پزشک درمانگر یا نحوه درمان و مراقبت از بیماری اینجانب ایجاد شود از پژوهش مذکور خارج شوم.

با توجه به اطلاعات موجود در این فرم و توضیحات حضوری مجری یا همکاران طرح موافقت خود را با شرکت در این مطالعه اعلان می نمایم. یک نسخه از این فرم به من داده شده و فرصت خواندن آن را داشته ام.

ضمیمه شماره 1

بررسی میزان بیان پروتئین های E-cadherin و N-cadherin در پریودنتیت مزمن شدید

کد...........

سن : ...........  سال

جنس :            مرد □              زن □

گروه مورد مطالعه  :        مبتلا به پریودنتیت□                               افراد سالم□

میزان بیان E- Cadherin:                     Absent□        20%> □   50- 20%□    50%<□

میزان بیانN- Cadherin :             Absent□   10%>□  20-10%□    20-50%□   50%<□

Cadhering swiching:                             دارد/ندارد