بررسی ایمنی زایی نانولیپوزوم DOTAP حاوی آنتی ژن محلول توکسوپلاسما گوندی در مدل موشی

توکسوپلاسما گوندی^[1] یک انگل متعلق به  شاخه اپی کمپلکسا با انتشار جهانی است و از آلوده کننده های مهم پزشکی تمام سلولهای هسته دار پستانداران است(1). توکسوپلاسما گوندی انگل داخلی سلولی اجباری و مشترک بین انسان وحیوانات است.گربه به عنوان میزبان اصلی و سایر پستانداران و پرندگان بعنوان میزبان واسط مورد هجوم این تک یاخته قرار می گیرند(2, 3). در افراد دارای ایمنی کامل ، توکسوپلاسموزیس معمولاً فاقد علامت است یا به صورت تظاهرات پوستی (بثورات جلدی) آدنوپاتی^[2] در نوزادانی که از طریق مادرزادی آلوده می شوند و بیماران با نقص ایمنی مانند مبتلایان به ایدز^[3](AIDS) و دریافت کنندگان عضو پیوندی ، توکسوپلاسموزیس^[4]، ممکن است تهدیدکننده زندگی آن ها باشد(4).

تخمین زده میشود که حدود یک سوم مردم جهان در سرم خون خود دارای آنتی بادی ضد توکسوپلاسما گوندی هستند ، بدین معنی که با انگل توکسوپلاسما آلوده شده اند  وتنها محلی که عاری از عفونت توکسوپلاسما در انسان و حیوانات است، جزیره ای عاری از گربه در اقیانوس آرام می باشد.  در ایران در یک مطالعه سرواپیدمیولوژی در 12 استان کشور با استفاده از روش ایمنوفلورسانس غیر مستقیم ( IFA ) مشخص گردید که به طور متوسط 8/51 درصد افراد دارای سرم مثبت در مقابل آنتی ژن توکسوپلاسما بودند (5).

توکسوپلاسما می تواند از طریق خوردن ااوسیستهای^[5] موجود درغذا یا آب وبا توسط مصرف کیستهای بافتی موجود در گوشت خام یا نپخته به اشخاص انتقال یابد که گوشت خوک مهمترین منبع گوشتی از نظر توکسوپلاسما گوندی در ایالت متحده وگوشت بره مهمترین منبع در سراسر جهان است(6). توکسوپلاسما قادر است در میزبان مهره دار گوناگونی دوره تکامل خود را طی کند اما میزبان نهایی آن گربه خانگی وانواع خاصی ازدیگر اعضای گربه سانان است(7). تفاوت های آشکار بین میزان شیوع توکسوپلاسموز در مناطق مختلف به دلیل پراکندگی جغرافیائی آب و هوا یا رژیم و عادات غذایی بر عامل بیماری است، چرا که توکسوپلاسموز در نواحی خشک کمترین شیوع و در نواحی گرم و مرطوب بالاترین شیوع را دارد(8).

در دو گروه از افراد جامعه احتمال بیماری وجود دارد:

الف) افرادی که مبتلا به بیماری های تضعیف کننده سیستم ایمنی هستند. در این گروه معمولا افرادی قرار دارند که مبتلا به ویروس HIV هستند. در این افراد به دلیل رشد زیاد انگل در بدن و عدم توانایی سیستم ایمنی در متوقف ساختن آن، علائم بالینی ظاهر می شود که میتوان به علائم عصبی شدید، تشنج، فلجی، کما و مرگ حتی با وجود اقدام به درمان، اشاره کرد. (9).

ب) توکسوپلاسموز مادرزادی ، با شیوع 5-1 در هر1000 حاملگی رخ می دهد و بر اساس سن جنین در زمان ابتلاء مادر و وجود یا عدم وجود آنتی بادی ضد توکسوپلاسما در بدن مادر ،عوارض گوناگونی را به دنبال دارد اکثریت نوزادان در حین تولد نشانه های بالینی را نشان نمی دهند و به مرور زمان این علائم شکل میگیرد. کودکانی که به صورت مادرزادی به این انگل آلوده شده اند دارای علائمی از جمله نابینایی، ناتوانی های ذهنی، ناشنوایی و در موارد شدید مرگ می باشند. به دلیل عدم وجود نشانه های بالینی تشخیص عفونت در دوران بارداری اغلب غیر ممکن است همچنین عدم وجود نشانه های اختصاصی بالینی در نوزادان آلوده تشخیص عفونت اغلب غیر ممکن یا با تاخیر زیاد صورت میگیرد در نتیجه پیشگیری از ابتلا مادر در دوران بارداری بهترین راه جلوگیری از سقط و عفونت دوران نوزادی است.(10,11).

پاسخهای ایمنی اکتسابی علاوه بر دو نوع هومورال و سلولی ، به دو گروه Th1 و Th2 نیز تقسیم بندی می شوند . در موشها پاسخ هومورالIgG1 عمدتا توسط Th2 و آنتی بادیa  IgG2 توسط Th1 ایجاد می شود، سلولهای Th1 باعث ترشح IL-2 وIFN-g وTNF-α می شود،که در نهایت منجر به فعال شدن ماکروفاژها ،ایجاد ایمنی سلولی و مقاومت می شود. سلولهای Th2 باعث ترشح سیتوکین های IL-4 ، IL-5 ، IL-6 ، IL-10 ، تحریک سلول های B و در نهایت سرکوب پاسخ ایمنی سلولی و التهاب می شود . طی بررسی های اخیر Th1 نقش اصلی را در ایمنی محافظت کننده اولیه در برابر این عفونت در مدل موشی دارد  (12). تزریق IL-12 به موشهای با نقص سیستم ایمنی ، سلولهای NK وIFN-γ را زیاد می کند و به طور غیر مستقیم ایمنی ذاتی را در برابر عفونت حاد ایجاد می کند. به طور مشابه IL-12 ،IFN-γ و TNF- α و سلولهای NK در کنترل مراحل اولیه عفونت توکسوپلاسما گوندی در موشهای با ایمنی کارآمد مشارکت دارند .تکثیر اولیه سلولهای NK به تولید IL-2 از سلولهای TCD4⁺ وابسته است ،TNF- α مشتق شده از سلولهای NK باعث تمایز سلولهای T به TCD4⁺ و TCD8⁺ می شود که اینها برای ایمنی اکتسابی بر علیه توکسوپلاسما گوندی ضروری می باشند . سلولهای TCD4⁺ و TCD8⁺ در جلوگیری از فعال شدن مجدد کیستها در عفونتهای مزمن اثر سینرژیسم روی هم دارند(13). در اکثر موارد تشخیص و افتراق مرحله حاد از مزمن توکسوپلاسموز از طریق تعیین نوع و عیار ایمنوگلوبولین های اختصاصی به کمک روش های سرولوژی با استفاده از آنتی ژنهای غشایی – سیتوپلاسمی انگل صورت می گیرد که معمولا با نواقص و مشکلاتی همراه است . عمده این مسائل به آنتی ژنهای مورد استفاده نسبت می دهند. بنابراین بررسی های زیادی به منظور شناسایی آنتی ژنهای محافظت کننده و مارکرهای مناسب برای تشخیص و افتراق مرحله حاد از مزمن توکسوپلاسموز صورت گرفته است . نتایج این بررسی ها نشان می دهد که آنتی ژنهای دفعی-ترشحی (E/SA) تاکی زوءیتهای انگل در رابطه با هدف این مطالعات از اهمیت خاصی برخوردار می باشد (14). دکوستر و همکاران در سال 1988 نشان دادند که آنتی ژنهای دفعی-ترشحی توکسوپلاسما در عفونتهای انسانی شدیدا ایمنوژن هستند (15). همچنین دریانی و همکاران در سال 2003گزارش کردند که E/SA سبب محافظت موشهای سوری در برابر سویه کشنده RH توکسوپلاسما می شوند. همچنین با توجه به خصوصیات گزارش شده از E/SA این آنتی ژنها جانشین مناسبی برای آنتی ژنهای غشایی و سیتوپلاسمی در تستهای  سرولوژی طراحی شده به منظور تشخیص و افتراق فرم حاد از مزمن توکسوپلاسموز به نظر می رسند(16) . عوارض شدید و کشنده توکسوپلاسموزیس در انسان و حیوانات، محققین را بر آن داشته که مطالعات و تحقیقات گسترده ای را برای ساخت و توسعه واکسن های موثر روی این بیماری انجام دهند. یک واکسن موثر علیه توکسوپلاسما گوندی ، واکسنی است که بتواند از عوارض شدید و کشنده  در جنین و افراد مبتلا به ضعف سیستم ایمنی جلوگیری کرده و همچنین باعث کاهش ضررهای اقتصادی شود. مطالعات قبلی نشان داده است که ادجوانت ها نقش بسیار مهمی در کارایی یک واکسن، در افزایش توان پاسخ های ایمنی و همچنین تعیین نوع پاسخ ایمنی ایجاد شده دارند. با وجود تلاشهای انجام شده به دلیل فقدان وجود  یاور (ادجوانت) ایمنی مناسب هنوز واکسنی در برابر انگل توکسوپلاسما گوندی وجود ندارد . تعداد کمی از ایمونو ادجوانتها در انسان قابل استفاده هستند و متاسفانه بسیاری از این ادجوانتها ترجیحا ایمنی همورال را تحریک می نمایند.در صورتیکه مصونیت در توکسوپلاسما با تحریک پاسخ ایمنی سلولی ایجاد می شود. خاصیت ایمونولوژیکی ادجوانتهای مختلف مانند BCG،Alum،سایتوکاینها،پروتئوزومها،و لیپوزوم برای استفاده در انسان،ابتدا در مدل های موشی کار آزمایی شده است که همه آنها توانسته اند سیستم ایمنی را به صورت نسبی تحریک نمایند. در این مطالعه ما از ادجوانت Imiquimod  که یک ماده تنظیم کننده سیستم ایمنی بوده و دارای قدرت ضد توموری و ضد ویروسی می باشد استفاده میکنیم. این ادجوانت سبب تحریک اینترفرون آلفا ، اینترلوکین یک و فاکتور نکروز توموری آلفا در خون محیطی و کراتینوسیت های انسانی که در معرض آن قرار گرفته می شود(19-17).

در حال حاضر استفاده از سامانه های نانویی به عنوان ادجوانت و یا سیستم دارورسانی موثر جهت واکسیناسیون علیه توکسوپلاسما گوندی گزارش شده است. یکی از اهداف دراز مدت نانوتکنولوژی، تولید سامانه ای مناسب جهت دارورسانی هدفمند میباشد، به نحوی که دارو با بیشترین اثربخشی و کم ترین عارضه ی جانبی، بدون اثر بر بافت ها و ارگان های سالم به محل اثر خود برسد. همچنین سیستم های دارورسانی نانویی می توانند دارو را از تخریب حفظ کرده و از این طریق سبب پایداری بسیاری از ترکیبات دارویی از قبیل پپتیدها، پروتئین ها و الیگونوکلئوتیدها شوند. این سیستم ها می توانند سبب تغییر فارماکوکینتیک داروها شامل توزیع بافتی دارو و نفوذ و توزیع داخل سلولی و همچنین افرایش جذب دارو و حتی تسریع پخش دارو درون اپیتلیوم شوند. به علاوه می توانند حلالیت ترکیبات هیدروفوب را در محیط مایع بهبود بخشند. به دلایل فوق، ما در این مطالعه از لیپوزومها برای سیستم دارورسانی موثر جهت واکسیناسیون علیه توکسوپلاسما گوندی استفاده میکنیم (19).

لیپوزومها،وزیکولهای میکروسکوپی هستند که از دو لایه فسفولیپیدی تشکیل شده اند و حاوی فازهای آبی می باشند.داروها(هم محلول در آب و هم محلول در چربی )را می توان در لیپوزومها انکپسوله کرده و کارآیی و اختصاصی بودن آن را افزایش داد. علاوه بر این لیپوزومها ایمونوادجوانت های خیلی موثر برای آنتی ژنهای پروتئینی می باشند (20, 21). این وزیکول ها قادر به تحریک انتخابی پاسخ ایمنی همورال و یا تحریک پاسخ ایمنی سلولی می باشند (22, 23). یکی از مهمترین ویژگی های لیپوزوم ها به عنوان ایمونو ادجوانت،توانایی آنها در تحریک سیستم ایمنی سلولی به صورت اختصاصی می باشد (24).تحریک پاسخ ایمنی سلولی به وسیله روشهای مختلف مثل انتخاب فسفولیپید مناسب(25, 23) ،انتخاب بار مناسب بر روی سطح لیپوزومها (26-28)، پوشش دادن لیپوزوم ها با ترکیبات قندی حاوی الیگو مانوز نظیر مانان (30, 29, 26)و تهیه لیپوزوم ها طوری که آنتی ژن  در  سطح لیپوزوم ها یا در قسمت دو لایه لیپوزوم ها قرار گیرد،قابل دستیابی است(31) .علاوه بر این لیپوزوم ها به عنوان ادجوانت مورد تایید اداره دارو و غذای آمریکا است و در مطالعات  کلینیکی کاملا بی خطر بوده و توسط افرا د داوطلب به خوبی تحمل شده است (32). در مطالعه حاضر از لیپوزوم DOTAP  که هم دارای بار مثبت میباشد و هم خاصیت ادجوانتی دارد استفاده میشود.

با توجه به تحقیقات انجام شده، ادجوانت Imiquimod اثرات مناسبی بر افزایش دفاع ایمنی بدن در مقابل عوامل بیگانه ای که اساس مصونیت در مقابل آنها مبتنی برپاسخهای سلولی است، نشان داده است، لذا به نظر می رسد احتمال کاربرد آن به عنوان ادجوان به صورت انکپسوله شده داخل لیپوزوم همراه با آنتی ژن اشکال تاکی زوئیتی توکسوپلاسما گوندی بتواند سطح ایمنی حاصل از واکسیناسیون را تا حد قابل قبولی افزایش دهد.

• آیا لیپوزوم کانیونی  DOTAPحاوی آنتی ژن محلول (Soluble Antigen)SA و ادجوانت Imiquimod در ایجاد نوع پاسخ ایمنی (هومورال وسلولار ومیکس)در مدل موشی توکسوپلاسموز تاثیر دارد؟
• آیا لیپوزوم کاتیونی DOTAP  حاوی آنتی ژن محلول SA  در نوع پاسخ ایمنی (هومورال وسلولار ومیکس) ایجاد شده در مدل موشی توکسوپلاسموز تاثیر دارد ؟
• آیا ادجوانت Imiquimod همراه با  آنتی ژن محلول SA در ایجاد نوع پاسخ ایمنی (هومورال وسلولار ومیکس)در مدل موشی توکسوپلاسموز تاثیر دارد؟

بررسی پاسخ ایمنی ایجاد شده توسط نانولیپوزوم DOTAP حاوی آنتی ژن محلول توکسوپلاسما گوندی در مدل  موشی

1.  تهیه و تعیین خصوصیات فیزیکوشیمیایی لیپوزوم کاتیونی  DOTAPحاوی آنتی ژن  محلول SA و ادجوانت Imiquimod
2. بررسی نانوذرات لیپوزوم حاوی ادجوانت Imiquimod  و آنتی ژن SA در نوع پاسخ ایمنی ایجاد شده در مدل موشی توکسوپلاسموز
3. بررسی نانوذرات لیپوزوم حاوی آنتی ژن محلول  SA در نوع پاسخ ایمنی ایجاد شده در مدل موشی توکسوپلاسموز
4. بررسی تاثیر آنتی ژن محلول SA  همراه با ادجوانت Imiquimod  بر روی نوع پاسخ ایمنی ایجاد شده در مدل موشی توکسوپلاسموز

دانشگاه علوم پزشکی زاهدان. مراکز تحقیقاتی و سرم سازی رازی و انستیتو پاستور

لیپوزوم:  لیپوزوم‌ به یک وزیکول‌میکروسکوپی شامل دولایه‌ی فسفولیپیدی گفته میشودکه یک فضای مائی را احاطه نموده است. و میتوانند قطری بین 50 نانومتر تا 50 میکرومتر داشته باشند.

SA: به آنتی ژن های محلول گفتـه می شـود کـه حاصـل ترشـحات سـه ارگانـل میکـرونم، راپتری و گرانول های متراکم انگل می باشـند. این پـروتئین هـا در اتصـال، نفـوذ و حتـی تکثیـر انگل در سـلول میزبـان نقـش دارنـد.

بنیادی-کاربردی

آزمایش روی 50 سر موش‌ BALB/c ماده 6-8 هفته‌ای انجام میشود. در صورتیکه سن موشها خارج از این محدوده باشد یا اینکه از نظر وزنی نسبت به سایرین کمتر باشند در آزمایش وارد نمیشوند و اگر در حین آزمایش به هر دلیلی ازبین بروند از آزمایش خارج میشوند.

با توجه به مطالعات گذشته تعداد موش در هر گروه فرمولاسیونی 10عدد در نظر گرفته میشود .

با توجه به اینکه تعداد کل موش در این طرح به تعداد 50 سرموش میباشد با شماره گذاری به طور بلوک تصادفی در هر گروه تقسیم میشوند.

انجام آزمایش بر روی خون موشها برای بررسی تیتر آنتی بادی و میزان ترشح سایتوکاین ها و همچنین میزان بقا و طول عمر موش های مورد آزمایش

1. تهیه آنتی ژن انگل- تـاکی زوئیـتهـای  (  (Tachyzoitesانگـل توکـسوپلاسما گوندی (سویه RH (از آزمایشگاه انگلشناسی دانشگاه علوم پزشکی تهران تهیه میشود.  نگهداری تاکیزوئیتهـا بـه وسـیله آلـوده کـردن مکـرر و سریالی موشهای BALB/c به صورت داخل صفاقی میسر میشود؛ بدین ترتیب که بعد از چند روز از آلوده کـردن مـوشهـا (3-5 روز)، تاکیزوئیتهای فعال و تازه از مایع صفاقی موش کشیده شده و به موشهای جدید تزریق میشود. بــرای تهیــه آنتــی ژنهــای مــورد نیــاز بــرای روش الایــزا و) Enzyme Linked Immunosorbent assay: ELISA) اندازهگیری سیتوکینها (Cytokines بدین ترتیب اقدام میشود که ابتـدا تـاکیزوئیـتهــای انگـل از صـفاق مـوش اســتخراج و ســانتریفوژ شــده ســپس رســوب در فــسفات بــافر ســالین (PBS: Saline Bufferd Phosphate (حـل شـده و مجـدداً سانتریفوژ میشوند (شستشو با PBS دو تا سه بار صورت مپـذیرد بعــد از شستــشو، عمــل انجمــاد (Freezing )و ذوب کــردن (Thawing)برای آزادسازی آنتی ژنهای انگل صورت می پذیرد و این عمل حدود 10-12 بار تکرار میشود. در نهایت بعد از انجام سانتریفوژ، مایع رویی به دست آمـده توسـط فیلتـر 2/0 میکـرو میلـیمتـر (USA, company Nalge )فیلتـره شـده و غلظـت پروتئین حاصل که همان آنتـی ژن انگلـی اسـت، توسـط روش لوری (Lowry )مشخص میشود.
2. حیوان : موش‌های BALB/c ماده 6-8 هفته‌ای از مرکز تحقیقات حیوانات دانشگاه علوم پزشکی زاهدان ابتیاع می گردد. موشها در دمای25-22 درجه سانتی‌گراد و شرایط نوری 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی و بر طبق استاندارد های کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی زاهدان نگهداری می شوند.
3.  روش تهیه Liposome: لیپوزوم به روش Lipid Film Hydration تهیه میگردد. در این روش در یک بالن ته گرد مقادیر مورد نیاز از لیپید،کلسترول و توسط حلال آلی (کلروفرم: متانول  به نسبت مولی 2 به 1) حل می‌گردد. سپس در دستگاه خلاء چرخان حلال آلی تبخیر می‌شود تا فیلم لیپیدی نازکی برروی جداره بالن تشکیل شود سپس بالن ته گرد را به دستگاه Freeze Drier برای مدت زمان کوتاهی وصل کرده تا مقادیر ناچیز باقی مانده حلال آلی خارج شود. به فیلم لیپیدی حاصله در دمای بالاتر از T_m(Transition temperature) مقادیر مناسبی از آب مقطر استریل اضافه می‌شود و توسط ورتکس همزده تا لایه‌های لیپیدی در فاز آبی پخش شده و  تشکیل  MLV (Multilamellar Vesicle) اولیه را بدهد. سپس مقدار معینی آنتی ژن به لیپوزومهای حاصل افزوده و مخلوط سونیکیت و در نهایت بوسیله دستگاه Extruder از فیلتر 400 سپس 200 نانومتر عبور داده می‌شود تا لیپوزومهای حاوی آنتی ژن با اندازه ذره ای حدود 200  نانومتر حاصل شود.
4. جدا سازی آنتی ژن محصور نشده احتمالی در لیپوزومها: برای جداسازی آنتی ژنهای دفعی ترشحی انگل توکسوپلاسما گوندی انکپسوله نشده در لیپوزوم ، از روش دیالیز استفاده می گردد. در صورت عدم جداسازی مناسب به روش فوق، از روش ژل کروماتوگرافی با ستون سفاروز   CL-4B استفاده خواهد شد.
5.   تعیین کیفی و کمی آنتی ژن:  تعیین کیفی آنتی ژن به کمک روش SDS-PAGE، تعیین مقدار پروتئین با روش لوری، تعیین مقدار لیپید با روش Bartlett خواهد بود.
6. بررسی مورفولوژی، اندازه و پتانسیل زتا لیپوزومهای تهیه شده: برای بررسی شکل، اندازه، Lamellarity و پتانسیل زتا ایسکوم های بدست آمده از میکروسکوپ الکترونی و Particle Size Analyzer استفاده خواهد شد.
7. ایمن سازی و چالش:  50 عدد موش BALB/C ماده (6–8 هفتـه ای) بـه صـورت تصادفی در 5 گروه تقسیم شـدند (10 مـوش در هـر گـروه) . تزریق موشهای هر گروه بدین صورت انجام میشود که ابتدا بـرای هر تزریق مقدار 100 میکرولیتر از ماده تزریقی (کـه متـشکل از 50 میکروگرم از آنتی ژن  در 100 میکرولیتر PBS استریل بود( درون سرنگ کشیده شده و سـپس محـل تلقـیح بـا الکـل ضـد عفونی شده و تزریق به آرامی در هر دو ران راست و چپ پـای موش (هر عضله حداکثر 50 میکرولیتر) در عضله چهار سر ران (Quadriceps) انجام میشود.  ایمن سازی در 3 نوبت و به فاصله سه هفته در روزهـای صفر و 21 و 42 به همان ترتیبـی کـه در بـالا شـرح داده شـد، صورت می پذیرد.  برای جمع آوری سرم موشها به منظـور انـدازه گیـری تیتـر آنتی بادی کل از 5 سر از موشهای هر گروه به صورت تصادفی در روزهای 42) قبل ایمن سازی سوم) و 63 خـونگیری انجـام میشود. بدین ترتیب که خونگیری از گوشه چشم با استفاده از پیپت پاستور استریل انجام شده و خونها به مدت 30 دقیقـه در دمـای اتاق نگهداری و بعد بـه مـدت 10 دقیقـه در دور 5000 دور در دقیقه سانتریفوژ و در نهایت سرم خون موشهـا جمـع آوری و در فریزر 20 -درجه سانتیگراد نگهداری میشوند 4 هفته بعد از آخرین ایمن سازی (در روز 70 (5 مـوش از هر گـروه بـه طـور تـصادفی انتخـاب شـده و عمـل اسـتخراج لنفوسیت از طحال آنهـا تحـت شـرایط کـاملاً اسـتریل انجـام میگیرد. عمــل چــالش نیــز بعــد از روز 70 روی 5 مــوش باقیمانده از هر گروه توسط10⁴  تاکی زوئیت سویه RH انگل توکسوپلاسما گوندی تاکیزوئیت به صورت داخل صفاقی انجام و متعاقـب آن میزان بقای موشهای هر گروه (برحسب روز) ثبت میشود.
8. انــدازه گیــری ســطح آنتــی بــادی IgG(IgG1,IgG2a,IgG Total) : از تمامی موشهای هر گروه از چشم خونگیری به عمل می آیدو برای اندازه‌گیری IgG ها از روش ELISA  غیرمستقیم استفاده می‌شود ودر این روش ابتدا چاهک‌های پلیت 96 خانه‌ای با آنتی ژن پوشش داده می‌شود. متعاقب آن چاهک های حاوی آنتی ژن با نمونه سرمی حاوی آنتی بادی (مجهول یا استاندارد) انکوبه می‌شود. سپس آنتی بادی‌های باند نشده جدا و شسته می‌شوند. در نهایت یک آنتیIgG  کونژوگه به یک آنزیم برای ردیابی افزوده می‌شود. اندازه‌گیری تیتر آنتی بادی‌ها در زمان های مشخص صورت می‌گیرد. و میـزان OD در طـول مـوج  450 نانومتر با دستگاه قرائتگـر (ELISA Reader) خوانده میشود.
9. اندازه گیری سایتوکاین‌های  IL-4 و IFN-g:

4 هفته بعد از  آخرین تلقیح (در روز 70 (5 موش از هر گروه به طور تـصادفی انتخـاب و عمـل اسـتخراج لنفوسـیت از طحـال آنهـا تحـت شرایط کـاملاً اسـتریل انجـام میشود. بعـد از تهیـه سوسپانـسیون لنفوسیتی از هر موش، 500 میکرولیتر از آن در 2 چاهـک از پلیت 24 خانه کـشت داده میشود. سـپس سـلولهـای هـر دو چاهک توسط آنتی ژن انگل تحریک می شونـد. پس از 48  ساعت انکوباسیون، سوپ رویی سلولها به آرامی جمع آوری و در ویـال اپنـدورف جمـع می شـوند و بـه مـدت 10 دقیقـه در دور 3000 دور در دقیقـه ســـانتریفوژ شـــده و در نهایـــت از محلـــول رویـــی بـرای اندازه گیری سیتوکینهای استفاده خواهد شد . برای بررسی وجود سیتوکینهای 4 IL- و IFN- γ در سوپ سلولی لنفوسیتهـای طحـالی مـوشهـای هـر گـروه از کیـت   ( R8D) Duoset ELISA Development Kit

استفاده خواهد شد و در ضـمن همـه نمونـه هـا به صورت سه تایی آزمایش خواهند شد تـا از مقـادیر بـه دسـت آمـده از سنجش سیتوکینها اطمینان حاصل شود.

 ارزیابی آماری نتایج حاصل از آزمـایش چالش با سویه RH و ایمنی همورال و سلولی:  برای ارزیابی نتایج حاصـل از زمـان بقـای مـوشهـا بعـد از چـالش و همچنـین نتـایج حاصـل از سـنجش IgG کـل و IL-4 و IFN- γ از روش آمــاری غیرپارامتریــک (Kruskal-wallis)  و( Mann-whiteny) استفاده خواهد شد (نرم افزار   (GraphPad Prism5و گـروههـای کنتـرل و مورد با هم مقایسه  میشوند..

در توصیف داده ها از شاخص های آماری میانگین، انحراف معیار و جداول فراوانی و نمودار استفاده می شود. در تحلیل داده ها از آنالیز واریانس یک طرفه و متعاقب آن برای مقایسه دو به دو گروهها از آزمون Tukey-Kramer نره افزار GraphPad Prism5استفاده میشود.

 بر اساس پروتکل کار با حیوانات آزمایشگاهی مصوب وزارت بهداشت و درمان و آموزش پزشکی،  کلیه کدهای  دستورالعمل دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش بر حیوانات  رعایت خواهند شد.

با توجه به اینکه هزینه انجام این پایانامه بسیار بیشتر از سقف پایانامه کارشناسی ارشد دانشکده پزشکی میباشد لذا مابقی هزینه یا از محل تصویب طرحی مشابه در مرکز تحقیقات عفونی گرمسیری و همچنین  با کمک مرکز تحقیقات نانوفناوری دانشگاه علوم پزشکی مشهد  و گروه انگل شناسی دانشگاه علوم پزشکی تهران حاصل میشود

توکسو پلاسماگوندی-واکسن – ادجوانت Imiquuimod- لیپوزوم کاتیونی – آنتی ژن محلول

• مراجع مورد استفاده براساس رفرانس نویسی ونکوورتنظیم گردد.

1.            Mesquita RT, Ziegler AP, Hiramoto RM, Vidal JE, Pereira-Chioccola VL. Real-time quantitative PCR in cerebral toxoplasmosis diagnosis of Brazilian human immunodeficiency virus-infected patients. Journal of medical microbiology. 2010 Jun;59(Pt 6):641-7. PubMed PMID: 20150319.

2.            Dubey JP. Strategies to reduce transmission of Toxoplasma gondii to animals and humans. Veterinary parasitology. 1996 Aug;64(1-2):65-70. PubMed PMID: 8893464.

3.           Dubey JP, Frenkel JK. Toxoplasmosis of rats: a review, with considerations of their value as an animal model and their possible role in epidemiology. Veterinary parasitology. 1998 May;77(1):1-32. PubMed PMID: 9652380.

4.            Lin MH, Chen TC, Kuo TT, Tseng CC, Tseng CP. Real-time PCR for quantitative detection of Toxoplasma gondii. Journal of clinical microbiology. 2000 Nov;38(11):4121-5. PubMed PMID: 11060078. Pubmed Central PMCID: 87551.

5.      Assmar M, Amirkhani A, Piazak N, et al. Toxoplasmosis in Iran, results of a seroepidemiological investigation. Bulletin de la Societe de Pathologie Exotique 1997; 90:19-21.

6.            Jauregui LH, Higgins J, Zarlenga D, Dubey JP, Lunney JK. Development of a real-time PCR assay for detection of Toxoplasma gondii in pig and mouse tissues. Journal of clinical microbiology. 2001 Jun;39(6):2065-71. PubMed PMID: 11376036. Pubmed Central PMCID: 88090.

7.            Black MW, Boothroyd JC. Lytic cycle of Toxoplasma gondii. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 2000 Sep;64(3):607-23. PubMed PMID: 10974128. Pubmed Central PMCID: 99006.

8.            Swierzy IJ, Muhammad M, Kroll J, Abelmann A, Tenter AM, Luder CG. Toxoplasma gondii within skeletal muscle cells: a critical interplay for food-borne parasite transmission. International journal for parasitology. 2014 Feb;44(2):91-8. PubMed PMID: 24184158.

9.            Ueno N, Lodoen MB, Hickey GL, Robey EA, Coombes JL. Toxoplasma gondii-infected natural killer cells display a hypermotility phenotype in vivo. Immunology and cell biology. 2015 May-Jun;93(5):508-13. PubMed PMID: 25533287. Pubmed Central PMCID: 4446200.

10.    Remington JS, Mcilod R, Desmonts G. Toxoplasmosis. Remington - Kelin infectious diseases of fetus and newborn infant. 4thed. Saunders: USA; 1995; 140-264.

11.    Peter G. Toxoplasma gondii infection in red book report of the committee on infectious diseases. 14thed. Saunders: USA; 1997; 531-5.

12.       Abbas, A.K., Two distinct mechanisms of B-lymphocyte tolerance. Cellular immunology, 1979. 46(1): p. 178-183.

13.       Abbas, A.K., K.M. Murphy, and A. Sher, Functional diversity of helper T lymphocytes. Nature, 1996. 383(6603): p. 787-793.

14.  Daryani A, Kalani H, Sharif M, Ziaei H, Sarvi S, Ahmadpour S. Toxoplasma Gondii: A Review of Excretory Secretory Antigens. J Mazand Univ Med Sci 2013; 23(suppn-2): 220-232 (Persian).

15. Decoster A¹, Darcy F, Capron A. Recognition of Toxoplasma gondii excreted and secreted antigens by human sera from acquired and congenital toxoplasmosis: identification of markers of acute and chronic infection. Clin Exp Immunol. 1988 Sep;73(3):376-82.

16. Daryani A, Hosseini AZ, Dalimi A. Immune responses against excreted/secreted antigens of Toxoplasma gondii tachyzoites in the murine model. Vet Parasitol 2003; 113(2):123-134.

17.         O'Hagan DT, MacKichan ML, Singh M. Recent developments in adjuvants for vaccines against infectious diseases. Biomolecular engineering. 2001;18(3):69-85.

18.         McMillan A. The management of difficult anogenital warts. Sexually transmitted infections. 1999;75(3):192.

19.         Beutner KR, Spruance SL, Hougham AJ, Fox TL, Owens ML, Douglas JM. Treatment of genital warts with an immune-response modifier (imiquimod). Journal of the American Academy of Dermatology. 1998;38(2):230-9.

20.         O’Hagan DT, Singh M. Microparticles as vaccine adjuvants and delivery systems. Expert review of vaccines. 2003;2(2):269-83.

21.         Lasic D. Applications of liposomes. Handbook of biological physics. 1995;1:491-519.

22.         Antimisiaris SG, Jayasekera P, Gregoriadis G. Liposomes as vaccine carriers: incorporation of soluble and particulate antigens in giant vesicles. Journal of immunological methods. 1993;166(2):271-80.

23.         Reddy R, Zhou F, Nair S, Huang L, Rouse BT. In vivo cytotoxic T lymphocyte induction with soluble proteins administered in liposomes. The Journal of Immunology. 1992;148(5):1585-9.

24.         Galdiero F, Carratelli CR, Nuzzo I, Bentivoglio C, De Martino L, Folgore A, et al. Enhanced cellular response in mice treated with a Brucella antigen-liposome mixture. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 1995;10(3-4):235-43.

25.         Phillips NC, Gagné L, Ivanoff N, Riveau G. Influence of phospholipid composition on antibody responses to liposome encapsulated protein and peptide antigens. Vaccine. 1996;14(9):898-904.

26.         Sharma A, Sharma US. Liposomes in drug delivery: progress and limitations. International journal of pharmaceutics. 1997;154(2):123-40.

27.         McSorley SJ, Xu D, Liew F. Vaccine efficacy of Salmonella strains expressing glycoprotein 63 with different promoters. Infection and immunity. 1997;65(1):171-8.

28.         Nakanishi T, Kunisawa J, Hayashi A, Tsutsumi Y, Kubo K, Nakagawa S, et al. Positively charged liposome functions as an efficient immunoadjuvant in inducing immune responses to soluble proteins. Biochemical and biophysical research communications. 1997;240(3):793-7.

29.         Sugimoto M, Ohishi K, Fukasawa M, Shikata K, Kawai H, Itakura H, et al. Oligomannose‐coated liposomes as an adjuvant for the induction of cell‐mediated immunity. FEBS letters. 1995;363(1-2):53-6.

30.         Toda S, Ishii N, Okada E, KUSAKABE KI, Arai H, Hamajima K, et al. HIV‐1‐specific cell‐mediated immune responses induced by DNA vaccination were enhanced by mannan‐coated liposomes and inhibited by anti‐interferon‐γ antibody. Immunology. 1997;92(1):111-7.

31.         Fortin A, Shahum E, Krzystyniak K, Thérien H-M. Differential activation of cell-mediated immune functions by encapsulated and surface-linked liposomal antigens. Cellular immunology. 1996;169(2):208-17.

32.         Fries LF, Gordon DM, Richards RL, Egan JE, Hollingdale MR, Gross M, et al. Liposomal malaria vaccine in humans: a safe and potent adjuvant strategy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1992;89(1):358-62.

33.         Phillips NC, Gagné L, Ivanoff N, Riveau G. Influence of phospholipid composition on antibody responses to liposome encapsulated protein and peptide antigens. Vaccine. 1996;14(9):898-904.

34.         Sharma A, Sharma US. Liposomes in drug delivery: progress and limitations. International journal of pharmaceutics. 1997;154(2):123-40.

35. Tachibana H, Yoshihara E, Kaneda Y, Nakae T. Protection of Toxoplasma gondii-infected mice by stearylamine-bearing liposomes. J Parasitol. 1990 Jun;76(3):352-5.

      36. Elsaid M, Vitor RW, Frézard F, Martins MS. Protection against Toxoplasmosis in Mice                                 Immunized with Different Antigens of Toxoplasma gondii Incorporated into Liposomes. Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro,1999. 94(4): 485-490. 

37. بهزاد عزت پور، علیرضاعندلیب ، زهرا غیور ، سید حسین حجازی، بهزاد حق پناه . بررسی ایجاد مقاومت علیه توکسو پلاسموزیس در مدل حیوانی با استفاده از آنتی ژنهای سطحی تاکی زوئیت توکسو پلاسما گوندیی. فصلنامه علمی ـ پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی لرستان. دوره دهم / شماره 4 / زمستان 1387

38.  Rui CHEN, Shao-hong LU , Qun-bo TONG , Di LOU , Dong-yan SHI , Bing-bing JIA , Guo-ping HUANG , Jin-fu WANG. Protective effect of DNA-mediated immunization with liposome-encapsulated GRA4 against infection of Toxoplasma gondii. J Zhejiang Univ Sci B. 2009: 10(7):512-521

39. Hiszczynska-Sawicka E, Li H , Boyu J , Ole G˛ dzka b , Kur J , Bickerstaffe R , Stankiewicz M. Comparison of immune response in sheep immunized with DNA vaccine encoding Toxoplasma gondii GRA7 antigen in different adjuvant formulations. Experimental Parasitology 124 (2010) 365–372.

40. Azzouz S. Maache M. Osuna A. Lawton P.  FrançoisePétavy A. Toxoplasma gondii: Identification and immune response against a group of proteins involved in cellular invasion. Experimental Parasitology. 130(1);  2012: 63-68.

41. Lobna A. El-Zawawya, Doaa El-Saida, Shereen F. Mossallama, Heba S. Ramadanb, Salwa S. Younis a . Preventive prospective of triclosan and triclosan-liposomal nanoparticles against experimental infection with a cystogenic ME49 strain of Toxoplasma gondii. Acta Tropica 141 (2015) 103–111

ندارد