مقایسه تعداد ماست سل ها در کیست های ادونتوژنیک به روش ایمونوهیستوشیمی

کیست های ادونتوژنیک ،احتمالا شایعترین ضایعات مخرب خوش خیم در فک و صورت هستند که رشد و گسترش غیر انفیلتراتیو مشخصه آنها می باشد. ^(1,2,3,4)این ضایعات می توانند از اجزای اپیتلیال جوانه های دندان ، اپیتلیوم کاهش یافته مینا، بقایای اپیتلیوم مالاسز، بقایای دنتال لامینا، یا لایه بازال اپیتلیوم دهان ایجاد شوند. ⁽⁵⁾رایج ترین کیست های ادنتوژنیک کیست رادیکولار ، کیست دنتیژروس و ادنتوژنیک کراتوسیست هستند.⁽²⁾

ادنتوژنیک کراتوسیست، از جمله کیست‏های رشدی تکاملی ادنتوژنیک می‏باشد که ممکن است رفتار کلینیکی مهاجمی را نشان داده و دارای میزان عود بالایی باشد؛ چنانکه در طبقه‏ بندی جدید سازمان بهداشت جهانی (WHO) تحت عنوان کراتوسیستیک ادنتوژنیک تومور نامگذاری شده است.^(7,6,4)

کیست دنتیژروس، کیست ادنتوژنیک پیشرفته مشتق شده از اپیتلیوم مینای دندان و شایعترین کیست ادنتوژنیک می باشد و با بخش کرونالی دندان نهفته در ارتباط است.^(7,6,4)

کیست رادیکولار یکی از شایع‌ترین کیست‌های ادنتوژنیک است که بر اثر التهاب یا نکروز پالپ دندان در نتیجه پوسیدگی دندان به‌وجود می‌آید. معمولاً کیست پری‌آپیکال بدون علامت است اما بروز التهاب ثانویه می‌تواند به احساس درد بینجامد. در رادیوگرافی از دندان آسیب‌دیده این کیست به‌صورت رادیولوسنسی در اطراف ریشه دندان مشاهده می‌شود.^(7,6,4)

مکانیسم دقیق رشد و گسترش این ضایعات هنوز مشخص نیست اما مشخص شده که چندین سلول مختلف ، از جمله ماست سل ها ، می توانند در این پدیده شرکت کنند.^(1,2,4) ماست سل ها سلول های گرد با هسته های کوچک و بسیاری از گرانول های سیتوپلاسمی هستند که غنی از پروتئوگلیکان ها ، پروتئاز ها و سایر مواد می باشند. ⁽¹⁾با توجه به چندین نقش ماست سل ها مانند مشارکت در التهاب، تخریب ماتریکس خارج سلولی و جذب استخوان ، این سلول ها می توانند در پاتوژنز کیست های فک و مکانیزم بزرگ شدن آن ها نقش داشته باشند.)1,2,4)

 در مطالعه ای که توسط نورونها و همکارانش به روش ایمونوهیستوشیمی انجام شد تعداد معناداری از ماست سل ها در کیست های دنتیژوس و ادنتوژنییک کراتوسیست مشاهده شد.¹

در مطالعه رجبی مقدم و همکارانش به روش ایمونوهیسشتوشیمی, هیچ تفاوت معناداری بین تعداد ماست سل ها در کیست های ادنتوژنیک وجود نداشت.⁴

در مطالعه آناندانی و همکارانش تعداد ماست سل ها در ادنتوژنیک کیست به روش هیستوشیمی و ایمونوهیستوشیمی بیشترین مقدار بود.²

داده های موجود نشان می دهد که ماست سل ها تمایل غشایی بالایی برای CD117دارند که می تواند در تشخیص اختلالات ماست سل ها مفید باشد.⁽²⁾ از آنجا که پاتوژنز دقیق ماست سل ها درکیست های ادونتوژنیک مشخص نمی باشد و تا کنون مطالعات کمی در زمینه ی ارزیابی ایمونوهیستوشیمی ماست سل ها با استفاده از CD117 در ضایعات پری اپیکال و کیست های ادنتوژنیک انجام شده است ^(2.3.4.5)مطالعه حاضر با هدف مقایسه حضور و توزیع ماست سل ها در کیست های ادنتوژنیک پایه ریزی شده است، شاید راهی باشد تا بتوان پاتوژنز ضایعات فوق را از این طریق پیدا نمود.

1- میانگین تعداد ماست سل های موجود در ادونتوژنیک کراتوسیست چقدر است؟

2- میانگین تعداد ماست سل های موجود در کیست دنتیژروس چقدر است؟

3- میانگین تعداد ماست سل های موجود در کیست رادیکولار چقدر است؟

4- میانگین تعداد ماست سل های موجود در ادونتوژنیک کراتوسیست، کیست های دنتیژروس و رادیکولار متفاوت است.

مقایسه تعداد ماست سل های موجود در کیست های ادونتوژنیک به روش ایمنوهیستوشیمی

1- تعیین تعداد ماست سل های موجود در ادونتوژنیک کراتوسیست

2- تعیین تعداد ماست سل های موجود در کیست دنتیژروس

3- تعیین تعداد ماست سل های موجود در کیست رادیکولار

4- مقایسه تعداد ماست سل های موجود در ادونتوژنیک کراتوسیست، کیست دنتیژروس و کیست رادیکولار

دانشگاه علوم پزشکی زاهدان-دانشکده دندانپزشکی زاهدان

ماست سل ها: سلول های ایمنی ساکن بافت ها هستند، که می توانند  سایتوکاین، کموکاین و آنزیم پروتئولیتیک ترشح کنند که از این طریق می توانند در شرایط آلرژیک و التهابی شرکت­کنند.ماست سل ها در فعالیت­های مختلف از جمله کنترل عروق جهت ترمیم بافت آسیب دیده، التهاب آلرژیک و دفاع میزبان نقش دارند.Mast cells دارای هسته گرد یا بیضی با سیتوپلاسم با دانه های متراکم قرمز و روشن هستند.⁽¹⁾

:CD117 CD117یک گیرنده  tyrosine kinase نوع 3 است که به عامل سلول های بنیادی برای تنظیم تمایز و تکثیر سلولی، کموتاکسی و آپوپتوز متصل می شود و بیان آن در نئوپلاسم های برخی از سلول های بنیادی hematopoietic و germ cell و ملانوسیت ها دیده می شود. یکی از hall mark های توسعه ماست سل ها CD117است که گیرنده Stem Cell Factor(SCF) می باشد و توسط ماست سل ها بیان می شود. ⁽²⁾

ایمونوهیستوشیمی (IHC):فرایندی برای مکان یابی پروتئین ها در سلول های یک بافت است.در این روش با استفاده از آنتی بادی های مونوکلونال، آنتی ژن های سلولها شناسایی می شود. این یک روش مکمل رایج در پاتولوژی جهت تشخیص مورفولوژی،تحقیقات پاتولوژی و مطالعه فرآیند پاتوژنز بیماریها می‌باشد.⁽⁴⁾

توصیفی-تحلیلی

نمونه ها شامل بلوک های پارافینی کیست های ادونتوژنیک که شامل ادونتوژنیک کراتوسیست، کیست دنتیژروس و کیست رادیکولار موجود در آرشیو بخش آسیب شناسی دانشکده دندانپزشکی زاهدان هستند که مورد بررسی قرار می گیرند.

معیار ورود به مطالعه:

1-بلوک های پارافینی کیست های ادنتوژنیک که قابلیت انجام رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی داشته باشند.

2- کیست هایی که نکروز نداشته باشند.

نمونه گیری به روش سرشماری می باشد در نتیجه تعداد نمونه ها بر اساس نمونه های موجود از هرکدام از کیست ها 30 عدد می باشد.

سرشماری

فرم اطلاعاتی (فرم ضمیمه شماره1)

تعداد90 نمونه شامل 30 عدد از هر کدام از کیست های ادنتوژنیک شامل کیست رادیکولار ،کیست دنتیژروس و ادنتوژنیک کراتوسیست که در آرشیو بخش آسیب شناسی دانشکده دندانپزشکی زاهدان موجود می باشد، طبق معیار های ورود و خروج انتخاب شده و مورد رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی قرار می گیرند.

مراحل رنگ آمیزی ایمنوهیستوشیمی به ترتیب به شرح زیر است:

1.ابتدا برش های 3 میکرونی از نمونه ها تهیه شد.

2. پارافین گیری نمونه ها در xelene وآبدهی نمونه ها با استفاده از الکل 100، 90، 80 انجام شد.

3. مرحله retrival با بافر Tris (Ph=7.6) به مدت 30 دقیقه انجام شد.

4. سپس سرد کردن غیر مستقیم جار حاوی نمونه ها با آب جاری انجام گرفت.

5. از H₂O₂(10%) به مدت 10 دقیقه استفاده شد.

6. شست و شوی لام با آب جاری به مدت 5 دقیقه صورت گرفت.

7. محصور کردن دور نمونه روی لام با قلم مخصوص انجام گرفت.

8. سرم بلوکین به مدت 5 دقیقه استفاده شد و سپس به منظور خارج کردن سرم بلوکین لام تکان داده شد.

10. از آنتی بادی اولیه CD117(BioGenex,Netherlands) به مدت 50 دقیقه استفاده شد و سپس شست وشو لام در بافر TBS صورت گرفت.

11. از آنتی بادی ثانویه به مدت 1 ساعت استفاده شد و سپس مجدد در بافر TBS شست و شو داده شد.

12. محلول دپ روی لام به مدت 10 دقیقه اضافه شد و سپس در آب مقطر شست و شو داده شد.

13. از هماتوکسیلین به مدت 5 دقیقه استفاده شد و سپس دوباره در آب مقطر  شست و شو داده شد.

14. لام در الکل 100 به مدت 1 دقیقه قرار داده شد.

15.  سپس لام در گزیلل به مدت 2 دقیقه قرار داده شد.

 16. درنهایت مانت کردن لام ها با استفاده از چسب سیتولوژی انجام شد.

پس از اتمام رنگ آمیزی ایمنوهیستوشیمی تعداد mast cellها در 10HpF (high power field) در جایی که بیش ترین تراکم سلول ها وجود دارد (hot spot)، زیر میکروسکوپ نوری Nikon(Japan) با بزرگنمایی 400 بررسی شد و در نهایت متوسط تعداد آن ها در هر گروه در فرم (ضمیمه شماره1) ثبت شد.

داده ها در نرم افزار SPSS.20 توصیف و تحلیل خواهد شد. برای توصیف داده ها از آمار توصیفی شامل جداول یا نمودارهای آماری و شاخص های مرکزی و پراکندگی استفاده خواهد شد. برای تحلیل داده ها و مقایسه میانگین ها بین گروه ها از آزمون ANOVA استفاده خواهد شد. نرمالیتی داده ها با استفاده از آزمون کولموگروف اسمیرنف بررسی خواهد شد. در صورت نرمال نبودن داده ها از آزمون کروسکال والیس استفاده خواهد شد. سطح معنی دار 0/05در نظر گرفته می شود.

کدهای 1 ، 2 ، 3 ،4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، 12 از قسمت راهنمای عمومی دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش بررسی عضو و بافت انسانی  و کدهای1، 2، 3، 4، 5 از فصل4زیست بانکها از دفترچه راهنمای اخلاقی پزوهش بررسی عضو و بافت انسانی

ندارد

کیست ادونتوژنیک، ماست سل، CD117

1. Noronha J, Pires FR, da Fonseca EC, Silva LE, de Queiroz S. Evaluation of mast cells in periapical cysts, dentigerous cysts, and keratocystic odontogenic tumors. J Oral Pathol Med. 2012; 1;41(8):630-6.

2. Anandani C, Astekar M, Metgud R, Ramesh G, Phull K, Singh K. Evaluation of mast cells in odontogenic cysts by toluidine blue & c-kit gene product (CD117). J Dent Specialities. 2017;5(1):40-5.

3. Kouhsoltani M, Khiavi MM, Jamali G, Farnia S. Immunohistochemical Assessment of Mast Cells and Small Blood Vessels in Dentigerous Cyst, Odontogenic Keratocyst, and Periapical Cyst. Adv Pharm Bull. 2015;5(1):637.

4. Rajabi-Moghaddam M, Abbaszadeh-Bidokhty H, Bijani A. Comparison of mast cells count in odontogenic cysts using histochemical staining. Iran J Pathol. 2015;10(2):105.

5. Kouhsoltani M, Halimi M, Dibazar S. A positive correlation between immunohistochemical expression of CD31 and mast cell tryptase in odontogenic tumors. Pol J Pathol. 2015; 1;66(2):170-5.

6. Modi TG, Chalishazar M, Kumar M. Expression of Ki-67 in odontogenic cysts: A comparative study between odontogenic keratocysts, radicular cysts and dentigerous cysts. J Oral Maxillofac Pathol. 2018 ;22(1):146.

7. Jaafari-Ashkavandi Z, Alipour Tuyeh A, Assar S. Immunohistochemical Expression of CDC7 in Dentigerous Cyst, Odontogenic Keratocyst and Radicular Cyst. Acta Medica . 2018;61(1):17-21.

نمونه ها شامل بلوک های پارافینی کیست های ادونتوژنیک که شامل ادونتوژنیک کراتوسیست، کیست دنتیژروس و کیست رادیکولار موجود در آرشیو بخش آسیب شناسی دانشکده دندانپزشکی زاهدان هستند که مورد بررسی قرار می گیرند.

ندارد

مقایسه حضور وتوزیع ماست سل ها در کیست های ادنتوژنیک که به تشخیص پاتوژنز کیست ها کمک می کند.

ندارد

ندارد

هزینه کلیه اقدامات انجام شده در این مطالعه به عهده مجری طرح خواهد بود و بیمار هزینه ای را پرداخت نخواهد کرد.

ندارد

نتایج آزمایشها در صورت تمایل بیمار به اطلاع وی خواهد رسید و این نتایج بصورت کاملاً محرمانه و صرفاً جهت مقاصد پژوهش به کار خواهد رفت و هویت بیماری وی در چارچوب قانون و جامعه و خانواده محرمانه خواهد ماند.

مجری موظف است پاسخگوی کلیه پرسش ها باشد. 

شرکت فرد در مطالعه کاملاً اختیاری است و در صورت عدم رضایت از مطالعه حذف می شود.

با توجه به اطلاعات موجود در این فرم و توضیحات حضوری مجری یا همکاران طرح موافقت خود را با شرکت در این مطالعه اعلان می نمایم. یک نسخه از این فرم به من داده شده و فرصت خواندن آن را داشته ام.

فرم اطلاعاتی (فرم ضمیمه شماره1)

گروه مورد مطالعه:

1-ادونتوژنیک کراتوسیست  o

2-کیست دنتیژروسo

3 -کیست رادیکولارo

میزان CD117 ..........................عدد