بیماری کبد چرب غیر الکلی (NAFLD[1]) یکی از شایعترین انواع بیماری کبد در جهان است و به عنوان یک سندرم متابولیک کبدی در نظر گرفته شده است[1]. شیوع این بیماری در آسیا بر حسب سن، جنس، محل سکونت و نژاد افراد بین 12 تا 24 درصد و در جمعیت عمومی ایران بین 3 تا 7 درصد گزارش شده است. از نظر اتیولوژی، این بیماری چند بعدی بوده که مجموعه ای از عوامل مختلف مانند ژنتیک و سبک زندگی (شامل نوع تغذیه و میزان فعالیت بدنی فرد) در بروز آن دخالت دارند. کبد چرب غیر الکلی یک طیف وسیع آسیب های کبدی اعم از تجمع چربی ساده و سایر بیماری های شدید کبدی مانند استئاتوهپاتیت غیر استروییدی، فیبروز، سیروز و سرطان کبد را در بر میگیرد [1]. کبد چرب غیر الکلی در اثر تجمع تری گلیسریدها در سلول های کبدی شکل می گیرد، افزایش اسیدهای چرب آزاد در کبد عمدتا از طریق سه عامل: لیپولیز در بافت چربی، رژیم غذایی پرچرب و لیپوژنز مجدد حاصل می شود[2, 3]. افزایش نفوذ چربی در کبد، سبب کاهش تولید پیش سازهای انرژی در آن (کاهش گلوکونئوژنز و اثرات مختلف روی بتا اکسیداسیون چربی ها و کتوژنز) و افزایش لیپوژنز در این عضو می شود. در کبد چرب تغییرات عمیق در اعمال هپاتوسیت ها و آدیپوسیت ها اتفاق می افتد. از برجسته ترین اختلالاتی که مشاهده می شود وقفه گلوکونئوژنز و اوره وژنز و افزایش لیپولیز در بافت چربی می باشد. کبد چرب سبب تغییر حساسیت بافت چربی و پانکراس به هورمون ها می شود[3, 4]. تجمع چربی در کبد می تواند در اثر عواملی چون افزایش سنتز چربی ، کاهش دفع چربی و یا کاهش بتا اکسیداسیون آن به وجود می اید[5].

          بیماری کبد چرب در مردان شایع تر از زنان است و در زنان بعد از سن یائسگی  شیوع آن افزایش می یابد [6]. یکی از مهم ترین فرضیه هایی  که بیان کننده ی علت ایجاد بیماری است تئوری دو مرحله ای نام دارد که در آن مقاومت به انسولین به عنوان عامل استئاتوز و استئاتو هپاتیت و عوامل اکسیداتیو به عنوان عامل التهاب و پیشرفت بیماری بیان شده اند [7]. افزایش فعالیت آنزیم های شاخص عملکرد کبد از قبیل AST،ALT,ALP در سرم نشانگر آسیب کبدی می باشد. در بررسی آسیب کبد، سنجش سطوح سرمی آنزیم های AST،ALT،ALP به طور گسترده ای مورد استفاده قرار می گیرد. وقوع نکروز و آسیب غشای سلول باعث رها شدن این آنزیم ها به گردش خون می شود.ALT که باعث تبدیل آلانین به پیروات و گلوتامات می شود، اختصاصی تر بوده و شاخص مناسب تری برای تشخیص آسیب در بافت کبد می باشد. افزایش سطح سرمی آنزیم های فوق نشان دهنده نشت سلولی بوده که به دلیل آسیب ساختار غشای هپاتوسیت ها و اختلال در عملکرد آن می باشد .{Drotman, 1978 #49}.

           یافته هایی مبنی بر دخالت عوامل استرس اکسیداتیو در بروز کبد چرب وجود دارد. فرضیه ای در پاتوژنز استئاتو هپاتیت کبدی وجود دارد که تجمع تری گلیسریدها در کبد منجر به افزایش حساسیت کبد به آسیب های کبدی ناشی از سیتوکاین ها و لیپوکاین های التهابی، همچنین اختلال در عملکرد میتوکندری ها و استرس اکسیداتیو خواهد شد که در نهایت منجر به استئو هپاتیت و یا فیبروز می شود.

        با توجه به نقش استرس اکسیداتیو بر بیماری کبد چرب غیر الکلی و تغییر پروفایل های لیپیدی اخیرا مطالعاتی در مورد اثر آنتی اکسیدانی گیاهان صورت گرفته است . این ترکیبات به ویژه فلاونوئید ها اثر حفاظتی بر کبد در برابر آسیب های ناشی از سموم کبدی و رادیکال های آزاد دارند.{du Toit, 2001 #48}.            علاوه بر این MDAوSOD شاخص مهم استرس اکسیداتیو هستند. با این حال، MDAیک نوع آلدهید تولید شده از طریق چربی است که معرف مقدار پراکسیداسیون لیپیدهاست. به عبارتی دیگر افزایش میزان مالون دی آلدئید در کبد در اثر لیپدوز هپاتوسیت ها نشان دهنده افزایش پر اکسیداسیون لیپیدی است که منجر به آسیب بافت کبد و همچنین بی کفایتی مکانیسم های تدافعی آنتی اکسیدانی در ممانعت از تشکیل بی رویه رادیکال های آزاد می گردد. بر عکس SOD می تواند آنیون های سوپر اکسید را به H2O2  تبدیل کند. از این رو SOD عامل اصلی محافظت از بافت کبدی در برابر استرس اکسیداتیو مضر از داخل و خارج محیط ها است {Rotimi, 2015 #53}. سوپر اکسید  دیسموتاز ، کاتالاز ،گلوتاتیون پراکسیداز آنزیم های آنتی اکسیدانی هستند که یک سیستم تدافعی را علیه گونه های فعال اکسیژن (Reactive oxygen species)  تشکیل داده اند [8]. کاتالازآنزیمی آنتی اکسیدانی است که به طور گسترده در بافت های بدن وجود دارد و دارای بیشترین فعالیت در کبد و گویچه های قرمز است. کاتالاز پراکسید هیدروژن را تجزیه می کند و باعث محافظت بافت ها از رادیکال های بسیار فعال هیدروکسیل می شود [9]. گلوتاتیون ردوکتاز یک آنزیم سیتوزولی در سلول های کبدی است که در کاهش گلوتاتیون اکسید ،به عنوان محصول نهایی فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز بر گلوتاتیون احیاء دخالت دارد[10]

TNFα یک سیتوکین التهابی که با فعالیت فیزیولوژیکی و شرایط پاتولوژیکی از جمله سمیت سلولی، تحریک رشد و التهاب حاد همراه است. بدین ترتیب افزایش تولید TNFαبا سلول های کوپفر فعال ممکن است مسئول NAFLD باشد. بنابراین مطالعات نشان داده که مهار TNFα می تواند ذخایر چربی کبد را کاهش دهد[11]. IL-6 یک سیتوکین پلیوترروپیک است که طیف گسترده ای از فعالیت های بیولوژیکی را در تنظیمات ایمنی، خونریزی و التهاب را ایجاد می کند [12]. مطالعات نشان داده که کبد چرب غیر الکلی به شدت به التهاب مرتبط است . IL-6 وTNFα به عنوان سیتوکین ضد التهابی معرفی شده است [13, 14]. در مطالعاتی به بررسی اثرات تیمول پرداخته شده است از جمله:

 Cheng و همکاران در سال 2017 نشان دادند که استرس بی حرکتی مزمن موجب القای کبد چرب غبر الکلی در موش صحرائی میشود و طب سنتی چینی توانست علائم کبد چرب غیرالکلی را بهبود بخشد (Cheng et al, 2017).

zainul و همکاران در سال 2017 عصاره گیاه Dicranopteris  را در 6 گروه موش صحرایی با دوز های متفاوت آزمایش کردند و مشاهده شد که عصاره این گیاه منجر به افزایش سطح آنزیم های کبدی ALT,AST,ALP   میشود.{Zakaria, 2017 #206}

در مطالعه ای که kuresh و همکاران در سال 2000 انجام دادند، اثر تیمول را بر فعالیت آنزیم آنتی اکسیدانی و ترکیب اسید چرب اسید  در مغز موش صحرایی اندازه گیری کردند و آزمایش کردند که آیا مکمل های غذایی با روغن تیمول می توانند اثرات مفید داشته باشد و مشاهده کردند که فعالیت آنزیم های انتی اکسیدانی  موش های صحرایی دریافت کننده روغن تیمول افزایش یافته و منجر به بهبود وضعیت آنتی اکسیدانی کل شده بود{Youdim, 2000 #202}

در مطالعه ای که    KRUK و همکاران  بر روی اثرات تیمول((TOH و تیمو کوینین(TQ) بر روی گونه های   های واکنش دهنده  اکسیژن مانند (,(ROSانجام دادند. نشان داده شد که تیمول منجر به تحریک ویژگی آنزیم های آنتی اکسیدانی از جمله  SOD میشود{Kruk, 2000 #203}

در مطالعه ای که Aeschbaach و همکاران در سال 1994 انجام دادند، مشاهده کردند تیمول، کارواکرول، 6-گینگرول و هیدروکسی تیروئول باعث کاهش پراکسیداسیون فسفولیپید لیپوزومها در حضور آهن (III) ) و آسکوربات شد، این ترکیبات به خوبی  رادیکال های پراکسیل را تجزیه کردند و نتایج مطالعات نشان داد که تیمول، کارواکرول و 6-گینرلول دارای خواص آنتی اکسیدانی مفید هستند و ممکن است جایگزینی 'طبیعی' برای مکمل های غذایی  و  آنتی اکسیدان های  'مصنوعی'  باشند{Aeschbach, 1994 #204}

          ایجاد مدل حیوانی کبد چرب غیر الکلی و مطالعه عوامل موثر بر آن یکی از راههای مهم بررسی اثرات داروهای مختلف بر این بیماری است. در مطالعات گذشته، برای ایجاد مدل حیوانی این بیماری، از استرس بی حرکتی طولانی مدت و یا مصرف رژیم غذائی پرچرب استفاده شده است. این احتمال وجود دارد که استرس مزمن به طور مستقیم و غیرمستقیم باعث پیشرفت بیماری مزمن کبدی می شود[15]. رژیم پرچرب نه تنها در انسانها بلکه در حیوانات آزمایشگاهی نیز می تواند باعث ایجاد چاقی، افزایش آنزیم های کبدی و اختلال در پروفایل های لیپیدی، ایجاد التهاب و استئاتوز بافت کبد شود. یکی از عوامل خطرساز اصلی همراه با کبد چرب غیر الکلی، چاقی و اضافه وزن است [16].

           با توجه به نقش استرس اکسیداتیو بر بیماری کبد چرب غیر الکلی و تغییر پروفایل های لیپیدی، امروزه مطالعاتی در مورد اثر آنتی اکسیدانی گیاهان و میوه ها بر شاخص های بیوشیمی این بیماری صورت گرفته است. ترکیب های پلی فنولی ار مهم ترین آنتی اکسیدان ها هستند . این ترکیبات بویژه فلاوونوئید ها اثر حفاظتی بر کبد در برابر آسیب های ناشی از سموم کبدی  و رادیکال آزاد دارند. تیمول یک مونوترپن فنولی است که دارای 3 گروه متیل، یک حلقه بنزنی و یک گروه هیدروکسیل با فرمول شیمیاییH14 C10 می باشد و خاصیت آنتی اکسیدانی دارد. تیمول عمدتاً در صنایع غذایی و در وسایل آرایشی به عنوان نگهدارنده و آنتی اکسیدان به کار می رود. با توجه به موارد فوق الذکر، در این مطالعه سعی خواهد شد اثرات تیمول بر بهبود علائم بیماری کبد چرب غیر الکلی ناشی از استرس مزمن بی حرکتی مورد مطالعه قرار گیرد[17].

1-میزان سطح سرمی و بافتی  MDA در گروهای مختلف مورد مطالعه متفاوت است.

2-میزان سطح سرمی و بافتی  GPX در گروهای مختلف مورد مطالعه متفاوت است .

3- میزان سطح سرمی و بافتی کاتالاز در گروهای مختلف متفاوت است.

4-میزان سطح سرمی و بافتی SOD در گروهای مختلف مورد مطالعه متفاوت است.

5-میزان سطح سرمی و بافتی ALT در گروهای مختلف مورد مطالعه متفاوت است.

6-میزان سطح سرمی و بافتی  AST در گروهای مختلف مورد مطالعه متفاوت است.

7- میزان سطح سرمی و بافتی IL-6 در گروهای مختلف مورد مطالعه متفاوت است.

8- میزان سطح سرمی و بافتی TNFαدر گروهای مختلف مورد مطالعه متفاوت است.

9-میزان سطح سرمی و بافتی  TACدر گروهای مختلف مورد مطالعه متفاوت است.

10- میزان سطح سرمی و بافتی LDL در گروهای مختلف مورد مطالعه متفاوت است.

11-میزان سطح سرمی و بافتی HDLدر گروهای مختلف مورد مطالعه متفاوت است.

12-میزان سطح سرمی و بافتی TGدر گروهای مختلف مورد مطالعه متفاوت است.

13-میزان سطح سرمی و بافتی chol در گروهای مختلف مورد مطالعه متفاوت است.

           14-میزان سطح آسیب دیدگی بافت کبد در گروهای مختلف مورد مطالعه متفاوت است.

بررسی اثر تیمول بر کبد چرب غیر الکلی ناشی از استرس بی حرکتی مزمن

1-تعیین و مقایسه میانگین MDAدر گروهای مختلف مورد مطالعه

2-تعییین و مقایسه میانگین GPXدر گروهای مختلف مورد مطالعه

3- تعییین و مقایسه SODدر گروهای مختلف مورد مطالعه

4- تعیین و مقایسه کاتالاز در گروهای مختلف مورد مطالعه

5- تعیین و مقایسه TAC در گروهای مختلف مورد مطالعه

6- تعیین و مقایسه IL-6 در گروهای مختلف مورد مطالعه

 7-تعیین و مقایسه TNFα در گروهای مختلف مورد مطالعه

8- تعیین و مقایسه ALTدر گروهای مختلف مورد مطالعه

9-تعیین و مقایسه ASTدر گروهای مختلف مورد مطالعه

10-تعیین و مقایسه LDLدر گروهای مختلف مورد مطالعه

11- تعیین و مقایسه TGدر گروهای مختلف مورد مطالعه

12- تعیین و مقایسه chol  در گروهای مختلف مورد مطالعه

13-  تعیین و مقایسه HDL در گروهای مختلف مورد مطالعه

14-تعیین و مقایسه آسیب دیدگی بافت کبد در گروهای مختلف مورد مطالعه

 بیمارستان ها و مراکز درمانی

ندارد

تجربی

موش صحرایی نر نژاد ویستار 12 الی 14 هفته  با وزن 130 الی 150 گرم  

3 گروه موش صحرایی10تایی بر اساس مطالعات قبلی ((Dhibi, 2011

 انتخاب 30سر موش صحرایی با توجه به ملاک های مورد مطالعه و قرار گرفتن حیوانات در سه گروه به طور تصادفی می باشد.

در پایان آزمایشات، نمونه های بافت و سرم جمع آوری و در دمای مناسب (70-) تا زمان انجام آزمایشات نگهداری خواهد شد. شاخصهای استرس اکسیداتیو و اینترلوکین 6 و TNF آلفا با کیتهای مخصوص و به روش الایزا اندازه گیری خواهند شد. تغییرات بافتی نیز به روشهای معمول هیستولوژی و پاتولوژی مورد مطالعه قرار خواهد گرفت.

         حیوانات مورد آزمایش – در این مطالعه تجربی ؛ 24  سر موش صحرایی نر نژاد ویستار با وزن 130الی150  گرم به طور تصادفی انتخاب می شوند . و حیوانات یک هفته قبل از شروع آزمایش ، در اتاق حیوانات با دمای1±24 درجه سانتی گراد با تهویه مناسب و رطوبت 15±45 درصد و سیکل نوری 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی با دسترسی آزاد به آب و غذا در قفس هایی از جنس پلکسی با درهای توری نگه داری خواهند شد و پس از سازگاری با محیط آزمایشگاه  جهت انجام آزمایشات مورد مطالعه قرار خواهند گرفت.

گروه بندی حیوانات :  موش ها به طور تصادفی به 3 گروه 8 تایی به شرح ذیل تقسیم می شوند.

1-گروه کنترل: گروهی که مداخله انجام نشده.

2-گروه استرس: گروهی که تحت استرس بی حرکتی خواهند بود.

3-گروه استرس +تیمول: حیواناتی که علاوه بر اینکه تحت استرس بی حرکتی بودند، تیمول را با دوز  mg/kg100 و با حجم تزریق ml/kg 3 به صورت داخل صفاقی دریافت می کردند.

تیمول به صورت پودر سفید رنگ که در آب نا محلول است می باشد. برای تهیه تیمول جهت تزریق، پس از توزین آن به مقدار لازم، نخست دارو در توئین حل و سپس در آب مقطر رقیق شده تا غلظت نهایی توئین به 3درصد رسید. در این مطالعه از تیمول با دوزهای mg/kg100 استفاده می شود.

موش های صحرایی تحت استرس بی حرکتی روزانه به مدت 6ساعت در یک REST RAINER   به مدت 60 روز قرار خواهند گرفت. بعد از 60 روز یا 9 هفته موش ها با کتامین و زایلازین بیهوش شده و خونگیری از قلب  انجام می شود و کل کبد برای بررسی های بافت شناسی برداشته خواهد شد و قسمتی از آن ثابت شده در 10 درصد فرمالین و برای تعبیه پارافین پردازش میشود . بقیه کبد در دمای 80- درجه سانتی گراد برای تحلیل و بررسی بیوشیمی بیشتر  ذخیره خواهد شد..

نمونه کبد در فرمالین فیکس می شود و نمونه بافتی کبد در فرمالین 10 درصد به نسبت یک به بیست قرار می گیرد (یعنی نسبت حجم بافت به حجم فرمالین) و پس از 48 ساعت نمونه ها به بخش پاتولوژی ارسال شده و در بخش پاتولوژی برش های 2 میکرونی تهیه و با رنگ های هماتوکسیلین انوزین و تری کروم رنگ آمیزی شده و توسط پاتولوژیست شدت تغییرات کبدی scoring می شود که این scoring بر اساس جدول Mendler می باشد:

Mendler  et al.

Portal Fibrosis:

0              No  fibrosis.

1           Fibrous expansion of some portal areas, with or without short fibrous septa.

2           Fibrous expansion of most portal areas, with or without short fibrous septa.

3           Fibrous expansion of most portal areas, with occasional portal to portal (P-P) and/or portal to central (P-C) bridging.

4            Fibrous expansion of portal areas with marked bridging (P-P as well as P-C).

5           Marked bridging (P-P and/or P-C) with occasional nodules (incomplete cirrhosis).

6            Cirrhosis, probable or definite

Lobular Inflammation and Necrosis

Mallory Bodies each scored individually 0-3:

Hepatocyte Ballooning

0               Absent.

1           Focal involvement of some lobules.

2           Focal involvement of most lobules.

3           Focal involvement of most or all lobules, with diffuse involvement of some or most of the lobules.

Perisinusoidal Fibrosis:

0           Absent.

1            Perivenular and/or periportal involvement of some lobules.

2            Perivenular and/or periportal involvement of most lobules, without diffuse interstitial sinusoidal collagen deposition

3            Perivenular and/or  periportal  involvement of most or all lobules, with diffuse interstitial fibrosis involving some or most

of the lobules.

Fatty Change:

1         < 5% liver cells involved.

2         5-33% liver cells involved.

3         34-66% liver cells involved.

4         >66% liver cells involved.

داده ها توسط نرم افزار SPSS  نسخه 17 مورد بررسی قرار خواهد گرفت . برای آنالیز داده های مربوط به مقایسه بین گروها از آنالیز واریانس One way ANOVA  و Tukey test  و یا در صورت لزوم از کروسکال والیس و من ویتنی  استفاده خواهد شد و مقدار P<0.05 معنی دار در نظر گرفته خواهد شد.

در طول مطالعه براساس پروتکل کار با حیوانات آزمایشگاهی رفتار شده و انجام کار به تایید کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی زاهدان خواهد رسید، و همچنین چک لیست کار با حیوانات آزمایشگاهی وزارت متبوعه تکمیل و پیوست می شود.

محدودیت زمانی – با توجه به شرایط تحریم ایجاد مشکل در تهیه کیت یا مواد خارجی احتمالی مورد نیاز

کبد چرب غیر الکلی- تیمول – استرس بی حرکتی مزمن

1.            Marchesini, G., et al., Nonalcoholic fatty liver disease: a feature of the metabolic syndrome. Diabetes, 2001. 50(8): p. 1844-1850.

2.            Atrashi, M., et al., Effect of ultrasound on the production of Carvone as a secondary metabolite in callus derived from Bunium persicum Boiss. Journal of Herbal Drugs (An International Journal on Medicinal Herbs), 2011. 2(2): p. 129-135.

3.            Shahbazi, A., et al., A survey on the starting age of complementary feeding and some of its associated factors in the breast-feeding infants (Semnan, Iran). Koomesh, 2007: p. 59-66.

4.            Mojab, F., et al., Essential oil of Lippia citriodora HBK (Verbenaceae). Journal of Medicinal Plants, 2002. 4(4): p. 41-46.

5.            پور, م., et al., بررسی تاثیر شرایط محیطی بر میزان و ترکیبات شیمیایی روغن اسانسی گیاه پونه آبی، Mentha aquatica L. از رویشگاه های مختلف استان مازندران. مجله پژوهشهای گیاهی, 2017. 30(2): p. 432-443.

6.            Hamaguchi, M., et al., Aging is a risk factor of nonalcoholic fatty liver disease in premenopausal women. World journal of gastroenterology: WJG, 2012. 18(3): p. 237.

7.            Marchesini, G., et al., Association of nonalcoholic fatty liver disease with insulin resistance. The American journal of medicine, 1999. 107(5): p. 450-455.

8.            Ji, L.L., F.W. Stratman, and H.A. Lardy, Antioxidant enzyme systems in rat liver and skeletal muscle: influences of selenium deficiency, chronic training, and acute exercise. Archives of biochemistry and biophysics, 1988. 263(1): p. 150-160.

9.            Chance, B., D. Greenstein, and F. Roughton, The mechanism of catalase action. I. Steady-state analysis. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1952. 37(2): p. 301-321.

10.          Naik, S., Antioxidants and their role in biological functions: An overview. Indian drugs, 2003. 40(9): p. 501-516.

11.          Gao, H.-y., et al., Protective effect of Zhuyeqing liquor, a Chinese traditional health liquor, on acute alcohol-induced liver injury in mice. Journal of Inflammation, 2013. 10(1): p. 30.

12.          Kishimoto, T., Interleukin-6: from basic science to medicine—40 years in immunology. Annu. Rev. Immunol., 2005. 23: p. 1-21.

13.          Kishimoto, T., IL-6: from its discovery to clinical applications. International immunology, 2010. 22(5): p. 347-352.

14.          Lesmana, C.R.A., et al., Diagnostic value of a group of biochemical markers of liver fibrosis in patients with non‐alcoholic steatohepatitis. Journal of digestive diseases, 2009. 10(3): p. 201-206.

15.          Han, Y., et al., Basis of aggravated hepatic lipid metabolism by chronic stress in high-fat diet-fed rat. Endocrine, 2015. 48(2): p. 483-492.

16.          Toshimitsu, K., et al., Dietary habits and nutrient intake in non-alcoholic steatohepatitis. Nutrition, 2007. 23(1): p. 46-52.

ندارد