بررسی اثرچای سبز بر روی حافظه و تعادل اکسیدان آنتی اکسیدان در مدل القا شده آلزایمر در موش صحرایی

بیماری آلزایمر (AD)  آلزایمر یک بیماری عصبی - ناتوانی است که باعث از دست دادن تدریجی حافظه، زبان و استدلال در طی سالهای 5 تا 20 سال در سالمندان می شود.(1). امروزه بیش از 48 میلیون نفر از زوال عقلی رنج میبرند و که میزان الزایمر در آنها 50-70 درصد است. در بیماران مبتلا به آلزایمر تغییرات  پاتولوژیک  مغزی شایع است: یکیپلاک های آمیلوئیدی خارج سلولی بوسیله تجمع و رسوب شدن بتا پپتید آمیلیید(2)(3)و دیگری انسداد و هایپرفسفریله شدن غیر طبیعی پروتیین های تاو[1] که منجر به تولید کلافه های رشته ای میشود (4). عوامل مختلف محیطی و ژنتیکی بسیاری با زوال عقلی و آلزایمر در اراتباط هستند که بساری از آنها پروتئین تاو را تحت تاثیر قرار  میدهند(5). از عوامل محیطی مرتبط با بیماری آلزایمر میتوان به فعالیت فیزیکی(6), چاقی و دیابت و رژیم غذایی فرد(7) و استرس اکسیداتیو (8)اشاره کرد.

همانطور که گفته شد افزایش سطح پلاک های آمیلوئیدی بتا (AB)[2]در مغز میتواند منجر به اختلالات حافظه در فرد شود. تجزیه پیش ساز پروتئین آمیلوئید [3] به دو واحد بتا و گاما منجر به تولید AB  میشود. پلاک های AB میتواند دایمر ,الیگومر و حتی به صورت فیبریل در بیایند که این اتصال ها منجر به توکسیک شدن این پلاک ها میشود(9). تجمع این پلاک ها در مغز منجر به ایجاد فرآیند های نورودژنرتیو از جمله شروع واکنش های زنجیره ای رادیکال های آزادمیشود(10).رادیکال های آزاد ایجاد شده منجر به افزایش استرس اکسیداتیو میشود که خود یکی از اولین نمودهای آلزایمر میباشد(11, 12).

در سال های اخیر، بر اساس این ارتباط احتمالی بین آسیب اکسیداتیو و کاهش شناختی، علاقه زیادی به مطالعه ترکیبات فعال بیولوژیکی رژیم وجود دارد که موجب تأخیر و یا جلوگیری از آسیب سلولی، تسکین علائم و بهبود کیفیت زندگی افراد می شود.(13).اگر چه کل پیچیدگی فرآیند پیری هنوز ناشناخته است، استفاده از کافئین برای درمان نقایص شناختی همراه با پیری طبیعی و کسانی که در بیماری آلزایمر پیش بینی شده است، امیدوار کننده است(14-16).

فرضیه آبشار آمیلوئید بیان می کند که مونومرهای Aβ به طور طبیعی از طریق یک مسیر وابسته به هسته زایی تشکیل می شوند تا فیبریل های نامحلول را تشکیل دهند، که به عنوان پلاک ها در مغز ذخیره می شوند. AD با تجمع فیبریل های آمیلوئید در یک شکل غیر قابل حل در مغز مشخص می شود. پلی فنول های چای سبز از جمله (-) - epigallocatechin gallate (EGCG)، - catechin (C)epicatechin، میریستین، کورستین و کامپرلول می توانند از تشکیل فیبریل های نامحلول جلوگیری کند(17). اصلی ترین ماده چای سبز با اهمیت بالینی، اپی هیالوکاتچین گالات(EGCG)است.که دارای  خواص ضد تومور، ضد آلزایمر و ضد پیری است(18).

هیپوکامپ محل انتخاب اطلاعات مهم و تقویت حافظه فضایی است. و محل دریافت ورودی های حسی(19).قرارگیری در معرض استرس موجب تغییرات ساختاری و کاهش تشکیلنورون های جدید در شکنج دندانه­ای (dentate gyrus) می­شود. شکنج دندانه ای تشکیلات هیپوکامپ نسبت به اثرات استرس و عملکرد داروهای ضد افسردگی مورد توجه قرار گرفته است(20).توانایی یک موجود زنده برای غلبه بر آسیب سلولی ناشی از گونه های اکسیژن واکنشی((ROSنقش مهمی در تعیین طول عمر حیوانات دارد (21).

گزارش شده است که پلی فنل ها در چای سبز می توانند رادیکال های آزاد را خنثی کنند و ممکن است باعث کاهش یا حتی کمک به جلوگیری از آسیب های ناشی از ROS شوند. از سوی دیگر، پلی فنول چای توانایی شرکت در بازیافت ویتامین E را دارد(22).

هیپوتالاموس[M1]  نسبت به استرس اکسیداتیو بسیار حساس میباشد. کاتچین موجود در چای ها نقش آنتی اکسیدان را در برابر رادیکال های آزاد ایفا میکند.

در میان انواع مختلف چای، چای سبز و پلی فنولهای موجود در آن، در رابطه بیشتری با  پیشگیری از بیماریهای نورودنژنتیک، به ویژه بیماری آلزایمر، دارد (23)و(19). همچنین نوشیدن چای می تواند شروع بیماری  آلزایمر را تاخیر دهد یا حتی از آن جلوگیری کند اما یک نتیجه قطعی در مورد اینکه آیا نوشیدن چای می تواند یک  اقدام پیشگیرانه برای AD باشد،باتوجه به  تاثیرات شیوه زندگی به تحقیقات بیشتر وطولانی مدت تر نیاز دارد(24).

از آنجا که اثر احتمالی پیشگیری از مصرف چای سبز در برابر زوال عقل در انسان، به دلیل کمبود مطالعات اپیدمیولوژیک، هنوز به طور مشخص معلوم نشده است.در این مطالعه به بررسی اثر محافظتی چای سبز بر موش های صحرایی نژاد ویستار میپردازیم.

1-در مطالعه ای که در سال 2015،توسط نجف زاده و همکاران انجام شد،36موش نر از نژاد ویستار، با داروی استرپتوزوتوسین (STZ)القای آلزایمر انجام شد،موش ها عصاره چای سبز را با دوز 100 mg/kgدریافت کردند. برای اندازه گیری حافظه در موش های صحرایی، از یک آزمون یادگیری اجتنابی منفعل استفاده شد. زمان ورود به اتاق تاریک و زمان اقامت در اتاق تاریک، مهمترین پارامترهای آزمون یادگیری اجتناب برای اندازه گیری حافظه بود پس از 3هفته مشاهده کردند در گروه تیمار شده با چای سبز،افزایش معنی داری در سرعت یادگیری و بهبود حافظه  و کاهش مرگ سلولی در رت های آلزایمری میشود(25).

2-در سال 2016،عرب و همکاران در  مطالعه ای مداخله آینده نگر،بر 30 بیمار مبتلا به AD شدید روزانه چهار قرص چای سبز به مدت 2 ماه (2 گرم در روز در 2 دوز جدا تقسیم شده) تجویز شد، نتایج آزمایشات نشان داد سطح مالون دی آلئید کاهش اما ظرفیت کل آنتی اکسیدانی افزایش میابد(26).

3-در مطالعه ای در سال 2017،توسط Schimidt و همکاران انجام شد، نقش سه نوع چای سبز،قرمز و سیاه را بر روی  موش صحرایی نر دو ماهه نژاد ویستار،در پیشگیری از آلزایمر بررسی کردند.موش ها 8 هفته قبل از القای آلزایمر مکمل یاری شدند. نتایج تحقیقات نشان داد،چای سبز و قرمز از نقص حافظه در موشهای AD جلوگیری می کند، همچنین چای سبز از استرس اکسیداتیو و آسیب هیپوکامپ نیز جلوگیری می کند.و چای سبز برای محافظت از عصب موثرتر از چای قرمز و سیاه می باشد(27).

1-سطح مالون دی آلدئید سرم با تجویز چای سبز   نسبت به گروه موش صحرایی مبتلا به آلزایمر  تغییر می یابد.

2-سطح ظرفیت تام آنتی اکسیدنی سرم با تجویز چای سبز  نسبت به گروه موش صحرایی مبتلا به آلزایمر  تغییر می یابد.

3- -مدت زمان سپری شده برای یافتن سکوی پنهان جهت تست حافظه فضایی در دستگاه ماز آبی موریس با تجویز چایی سبز   نسبت به گروه موش صحرایی مبتلا به آلزایمر  تغییر می یابد.

4-مسافت طی شده برای یافتن سکوی پنهان جهت آزمون یادگیری در دستگاه ماز آبی موریس با تجویز چای سبز  نسبت به گروه موش صحرایی مبتلا به آلزایمر  تغییر می یابد.

5-تاخیر زمانی برای ورود به محفظه تاریک پس از شوک در دستگاه شاتل باکس با تجویزچای سبز   نسبت به گروه موش صحرایی مبتلا به آلزایمر  تغییر می یابد.

بررسی اثرچای سبز  بر روی حافظه و تعادل اکسیدان آنتی اکسیدان  در مدل القا شده آلزایمر در موش صحرایی

1- تعیین و مقایسه مدت زمان سپری شده درماز آبی موریس به منظور یافتن سکوی پنهان در گروه های مورد مطالعه

2-تعیین  و مقایسه  اثر چای سبز بر سطح مالون دی آلدئید سرم در گروه های مورد مطالعه

3-تعیین و مقایسه مسافت پیموده شده در ماز آبی موریس به منظور یافتن سکوی پنهان در گروه های مورد مطالعه

4-تعیین و مقایسه زمان تاخیر برای ورود به اتاق تاریک پس از اعمال شوک با دستگاه شاتل باکس در گروه های مورد مطالعه

5- تعیین  و مقایسه  اثر چای سبز بر سطح ظرفیت تام آنتی اکسیدانی سرم در گروه های مورد مطالعه

دانشگاه علوم پزشکی زاهدان

بیماری آلزایمر:یک بیماری تخریب مغزی است که توسط ابتلا به زوال عقلی مشخص شده است. اختلال حافظه، قضاوت، طول عمر و مهارتهای حل مسئله همراه با APRAXIAS شدید و از دست دادن توانایی های شناختی جهانی است. این شرایط عمدتا بعد از 60 سالگی اتفاق می افتد و با آتروفی شدید قشر و سه گانه ای از موش های SENILE شناخته می شود؛

چای سبز: چای سبز نوعی چای است که از جوانه‌ها و گلبرگهای تازه گیاه چای به دست می‌آید. در فرایند تولید این چای اکسایش بسیار کم صورت می‌پذیرد. چای سبز انواع مختلفی همچون چینی و ژاپنی دارد.

تجربی

رت های نر نژاد ویستار با وزن تقریبی 220-180گرم

1-نر باشد.

2-از نژاد ویستار باشد.

3- 10تا 12  هفته ای باشند.

4-وزن تقریبی   220-180گرم باشد.

معیارهای خروج از مطالعه:

1-مریض بودن

2-خون ریزی داشتن

3-کم وزنی

حجم نمونه بر اساس مطالعات مشابه،10 سر در هر گروه انتخاب میشود (28)

بر اساس حجم نمونه تعیین شده در هر گروه تغذیه موش ها انجام و بر اساس پروتکل تحقیق طی هر مرحله رت ها پایش و نسبت به  تزریق  STZ اخذ خون و ادامه ی تحقیق در مراحل بعدی با در نظر گرفتن تعداد کافی نمونه از نظر کمی و آنالیز آماری اقدام خواهد شد.لازم به ذکر است در شروع 32تحقیق 32 سر رت نر انتخاب،و پس از مداخله نسبت  به مراحل بعدی اقدام خواهد شد

40 سر رت نر  سفید نژاد ویستار(با میانگین وزن 220- 200گرم)  از مرکز تکثیر حیوانات آزمایشگاهی تهیه خواهد شد و در یک اتاق با دما و رطوبت کنترل شده،با 12 ساعت روشنایی 12- ساعت چرخه تاریکی،با دسترسی آزاد به آب و غذای ویژه حیوانات آزمایشگاهی نگهداری میشوند. پس از تطابق و سازگاری با محیط،موش ها را در 4 گروه قرار میدهیم.

.1-گروه کنترل سالم (رژیم غذایی معمولی دریافت میکنند).

 2-گروه کنترل آلزایمری( رژیم غذایی معمولی دریافت میکنند و نهایتا تحت القای آلزایمر قرار میگیرند)

.3-گروه چای سبز سالم (چای سبز دریافت میکنند ).

 4- گروه چای سبز آلزایمری (چای سبز دریافت میکنند و نهایتا تحت القای آلزایمر قرار میگیرند).

کل غلظت کاتچین ها درچای سبز 136.56 میلی گرم بر گرم است. که بین آن ها EGCGبه میزان 

76.29 میلی گرم بر گرم وجود دارد.  با توجه به این که به طور متوسط در هر فنجان چای ، 4   g/cupپودر چای وجود دارد. چای سبز به میزان   1 -2 /0g/kg  میتوان توصیه کرد. 

به همین منظور چای سبز از نژاد چینی تهیه کرده،روزانه با استفاده از آب مقطر در دمای (95-100)درجه تهیه و با استفاده از گاواژ به میزان mg/kg/ml/day   400و در دمای اتاق گاواژ میشود.برای تهیه ی چای،آب جوشانده میشود و سپس در حالت استراحت نگه داشته میشود تا دمای 90درجه سانتی گراد شود.سپس چای وزن شده را داخل آب میریزیم و به مدت 3 دقیقه صبر میکنیم.سرانجام با استفاده از کاغذ فیلتر چای را فیلتر میکنیم و به مدت 20 روز هر صبح ساعت 11تا 12 به موش گاواژ میکنیم(1)

روش اجرای طرح

روش جراحی :

حیوانات را با تزریق داخل صفاقی کتامین/ زایلازین با دوز mg/kg 400 بیهوش خواهیم کرد و برای ثابت نگه داشتندمایبدن رت (5/0±5/36 درجه سانتیگراد) ازتشک گرم کننده استفاده میشود. بعد از شیو shave کردن سر حیوان، سرآنها رادردستگاه استریوتاکسیک جراحی مغزثابت کرده وباایجادشکافی طولی دربخش خلفی سر، جمجمه نمایان می گردد. بعد از مشخص کردن مختصات استریوتاکس برای بطن های جانبی مغزی با استفاده از راهنمای اطلس مغز رت (18) و همچنین با استفاده از مختصات بدست آمده از مطالعه پایلوت (جلویی ـ عقبی  mm8/0-، جانبی mm 6/1± و پشتی ـ شکمی mm 2/4-)،باکمکدریلدوسوراخدرجمجمه طوری که به بافت مغز آسیب نرساند ایجاد کرده و کانول مخصوص تزریق به آرامی وارد بطن ها می شود و داروی استرپتوزوتوسین با دوز mg/kg 5/1 (وزن بدن در سالین) (4) را به وسیله سرنگ هامیلتون طی مدت 3 دقیقه داخل هر بطن تزریق خواهد شد و پس از اتمام تزریق، به مدت 5 دقیقه سوزن مورد استفاده در داخل بطن باقی خواهد ماند و پس از اتمام این مدت سوزن خارج و همه این مراحل در بطن طرف مقابل انجام  خواهدگرفت. گروه های شم نیز به همین روش تحت جراحی قرار گرفته ولی به جای STZ حجم مساوی از سالین دریافت می کنند. بعد از جراحی رت ها در قفس های جداگانه ای قرار گرفته و بدون هیچ محدودیتی به آب و غذا دسترسی خواهند داشتند.

آزمون رفتاری

2-3 آزمون رفتار یادگیری اجتنابی غیر فعال (Passive avoidance learning test)

بعدازاتمام دوره ورزش راتها تحت مطالعه رفتاری قرار خواهند گرفت. از روش یادگیری اجتنابی غیر فعال (passive avoidance) بمنظور بررسی یادگیری و حافظه استفاده میگردد. دستگاه یادگیری اجتنابی غیر فعال (shuttle box) شامل دو بخش تاریک و روشن است که توسط یک درب گیوتینی از هم جا می شوند. جهت اجرا مرحله یادگیری موش را در حالی که پشتش به سمت در گیوتینی باشد در داخل اتاق تاریک گذاشته می شود و 5 ثانیه بعد درب گیوتینی بالا کشیده خواهد شد. بعد از ورود موش به ناحیه تاریک در بسته خواهد شد و شوک الکتریکی با شدت 2/1 میلی آمپر به مدت 5 ثانیه به کف پای حیوان اعمال می گردد. پس از آن حیوان از اتاق تاریک خارج و در قفس قرار داده خواهد شد. به منظور ارزیابی حافظه، 24 ساعت و 1 هفته بعد از دریافت شوک الکتریکی حیوان دوباره در داخل اتاق روشن در حالی که دریچه بین دو اتاق باز بود، قرار داده خواهد شد و تأخیر زمانی برای اولین ورود به اتاق تاریک ثبت می گردد. سقف زمانی در این مرحله 300 ثانیه خواهد بود و کلیه آزمایشات بین ساعت 11-8 صبح انجام می گیرد. طولانی تر بودن تأخیر زمانی برای اولین ورود به اتاق تاریک نشانه یادگیری و حافظه بهتر می باشد.

آزمون ماز آبی موریس

برای ارزیابی حافظه فضایی ، موشها در ماز آبی موریس آزمایش خواهند شد، که یک استخر دایره ای سیاه رنگ به قطر 150 سانتیمتر و ارتفاع 60 سانتی متر پر شده از آب با دمای 26-24 درجه سانتی گراد به عمق 30 سانتی متر خواهد بود و به چهار ربع شمال، جنوب، مغرب و مشرق تقسیم خواهد شد. در مرکز ربع جنوب شرقی یک سکوی گرد از جنس پلکسی گلاس (10 سانتی متر قطر و ارتفاع 28 سانتی متر) واقع خواهد شد که 2 سانتی متر زیر سطح آب پنهان خواهد داشت. قبل از شروع آزمایش هر موش روزانه به مدت 3 روز به کار گرفته خواهد شد و پس از آن موش ها در ماز آبی بدون سکو به مدت 30 ثانیه عادت خواهند کرد.

هر موش در 12 آزمایش شرکت داده خواهد شد که شامل 3 بلوک از 4 آزمایش (1 آزمایش/ شروع موقعیت در یک بلوک)خواهد بود. هر بلوک به عنوان یک جلسه آزمون جداگانه در نظر گرفته خواهد شد  و بلوک ها با فواصل 30 دقیق از هم جدا خواهند شد. موش در حالی که رو به دیواره مخزن قرار دارد، در یکی از چهار ربع استخر آزاد خواهد شد. در هر آزمایش، به موش ها اجازه شنا داده خواهد شد تا زمانی که سکو را پیدا کنند و به مدت 20 ثانیه روی آن باقی بمانند. اگر 60 ثانیه بگذرد و حیوان سکو را پیدا نکند، حیوان به سمت سکو هدایت خواهد شد و اجازه می دهیم به مدت 20 ثانیه روی سکو باقی بماند. در تمام این مراحل یک دوربین در بالای استخر برای تشخیص مسیر موش نصب خواهد شد و اطلاعات به کامپیوتر منتقل و ثبت خواهد شد. زمان تاخیر برای رسیدن به سکو و همچنین طول مسیر شنا در میان گرو ه ها مقایسه خواهد شد. در فاز حافظه(24 ساعت بعد)، سکو برداشته شده و یک تست حافظه 60 ثانیه ای برای بررسی اینکه چقدر موش ها محل دقیق سکو را یاد گرفته اند، انجام خواهد شد. سکو برداشته خواهد شد و به حیوانات اجازه داده خواهد شد تا به مدت 60 ثانیه شنا کنند. زمان ثبت شده در ربع هدف(Q1) در میان گروه ها مقایسه خواهد شد.

برای اندازه گیری  بالانس اکسیدان- انتی اکسیدان ،   4 سی سی  خون از موشها از قلب  موشها اخذ می گردد. سرم آنها در فریزر       C · 20-  نگهداری می شود. اندازه گیری PAB ،  به  روش modified Pro-oxidants- Antioxidants  Balance(PAB).  انجام می شود . در این روش بطور همزمان تعادل اکسیدان- انتی اکسیدان  با استفاده از 3,3’5,5’   تترا متیل بنزیدین و دو نوع واکنش مختلف  شامل : یک و.اکنش انزیماتیک که TMB  رنگ زا  بوسیله پراکسیدها  به یک کاتیون رنگی اکسیده می شود،  و  یک واکنش شیمیایی که کاتیون TMB  بوسیله انتی اکسیدانها به یک ترکیب بی رنگ  احیا  می شود،  انجام می گیرد

تجزیه تحلیل داده ها با استفاده از نرم افزار SPSS  ورژن 21 انجام خواهد شد. برای مقایسه گروه ها ازآزمون Anova    از نوعBonferoni  استفاده خواهد شد. داده ها به صورت Mean ±SE بیان خواهند شد.

در طول مطالعه بر اساس پروتوکل کار با حیوانات آزمایشگاهی رفتار شده وانجام کار به تایید کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی زاهدان خواهد رسید. همچنین چک لیست کار با حیوانات آزمایشگاهی مصوب وزارت متبوعه تکمیل و پیوست می شود.

تهیه مواد و سایل مورد نیاز-از بین رفتن موش ها حین مطالعه

آلزایمر-چای سبز –استرپتوزوتوسین-حافظه -تعادل اکسیدان –آنتی اکسیدان

1.            Glenner G. Alzheimer's disease. The commonest form of amyloidosis. Archives of pathology & laboratory medicine. 1983;107(6):281.

2.            Funato H, Yoshimura M, Kusui K, Tamaoka A, Ishikawa K, Ohkoshi N, et al. Quantitation of amyloid beta-protein (A beta) in the cortex during aging and in Alzheimer's disease. The American journal of pathology. 1998;152(6):1633.

3.            Tam JH, Pasternak SH. Amyloid and Alzheimer's disease: inside and out. Canadian Journal of Neurological Sciences. 2012;39(3):286-98.

4.            Šimić G, Babić Leko M, Wray S, Harrington C, Delalle I, Jovanov-Milošević N, et al. Tau protein hyperphosphorylation and aggregation in Alzheimer’s disease and other tauopathies, and possible neuroprotective strategies. Biomolecules. 2016;6(1):6.

5.            Reitz C, Brayne C, Mayeux R. Epidemiology of Alzheimer disease. Nature Reviews Neurology. 2011;7(3):137.

6.            Belarbi K, Burnouf S, Fernandez-Gomez F-J, Laurent C, Lestavel S, Figeac M, et al. Beneficial effects of exercise in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease-like Tau pathology. Neurobiology of disease. 2011;43(2):486-94.

7.            Cheke LG, Bonnici HM, Clayton NS, Simons JS. Obesity and insulin resistance are associated with reduced activity in core memory regions of the brain. Neuropsychologia. 2017;96:137-49.

8.            Prasanthi JR, Dasari B, Marwarha G, Larson T, Chen X, Geiger JD, et al. Caffeine protects against oxidative stress and Alzheimer's disease-like pathology in rabbit hippocampus induced by cholesterol-enriched diet. Free Radical Biology and Medicine. 2010;49(7):1212-20.

9.            Tanzi RE, Bertram L. Twenty years of the Alzheimer’s disease amyloid hypothesis: a genetic perspective. Cell. 2005;120(4):545-55.

10.         Butterfield DA, Boyd-Kimball D. The critical role of methionine 35 in Alzheimer's amyloid β-peptide (1–42)-induced oxidative stress and neurotoxicity. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 2005;1703(2):149-56.

11.         Castellani RJ, Zhu X, Lee H-g, Moreira PI, Perry G, Smith MA. Neuropathology and treatment of Alzheimer disease: did welose the forest for the trees? Expert review of neurotherapeutics. 2007;7(5):473-85.

12.         Smith MA, Zhu X, Tabaton M, Liu G, McKeel Jr DW, Cohen ML, et al. Increased iron and free radical generation in preclinical Alzheimer disease and mild cognitive impairment. Journal of Alzheimer's Disease. 2010;19(1):363-72.

13.         Abreu RV, Silva-Oliveira EM, Moraes MFD, Pereira GS, Moraes-Santos T. Chronic coffee and caffeine ingestion effects on the cognitive function and antioxidant system of rat brains. PharmacologyBiochemistry and Behavior. 2011;99(4):659-64.

14.         Arendash G, Schleif W, Rezai-Zadeh K, Jackson E, Zacharia L, Cracchiolo J, et al. Caffeine protects Alzheimer’s mice against cognitive impairment and reduces brain β-amyloid production. Neuroscience. 2006;142(4):941-52.

15.         Solfrizzi V, Panza F, Imbimbo BP, D’Introno A, Galluzzo L, Gandin C, et al. Coffee consumption habits and the risk of mild cognitive impairment: the Italian longitudinal study on aging. Journal of Alzheimer's Disease. 2015;47(4):889-99.

16.         Kolahdouzan M, Hamadeh MJ. The neuroprotective effects of caffeine in neurodegenerative diseases. CNS neuroscience & therapeutics. 2017;23(4):272-90.

17.         Polito CA, Cai Z-Y, Shi Y-L, Li X-M, Yang R, Shi M, et al. Association of Tea Consumption with Risk of Alzheimer’s Disease and Anti-Beta-Amyloid Effects of Tea. Nutrients. 2018;10(5):655.

18.         Afzal M, Safer A, Menon M. Green tea polyphenols and their potential role in health and disease. Inflammopharmacology. 2015;23(4):151-61.

19.         Hyung S-J, DeToma AS, Brender JR, Lee S, Vivekanandan S, Kochi A, et al. Insights into antiamyloidogenic properties of the green tea extract (−)-epigallocatechin-3-gallate toward metal-associated amyloid-β species. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2013:201220326.

20.         Alonso R, Griebel G, Pavone G, Stemmelin J, Le Fur G, Soubrie P. Blockade of CRF1 or V1b receptors reverses stress-induced suppression of neurogenesis in a mouse model of depression. Molecular psychiatry. 2004;9(3):278-86.

21.         Harman D. Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry. Science's SAGE KE. 2002;2002(37):14.

22.         Intra J, Kuo S-M. Physiological levels of tea catechins increase cellular lipid antioxidant activity of vitamin C and vitamin E in human intestinal caco-2 cells. Chemico-biological interactions. 2007;169(2):91-9.

23.         Mandel SA, Amit T, Weinreb O, Reznichenko L, Youdim MB. Simultaneous manipulation of multiple brain targets by green tea catechins: a potential neuroprotective strategy for Alzheimer and Parkinson diseases. CNS neuroscience & therapeutics. 2008;14(4):352-65.

24.         Feng L, Chong M, Lim W, Lee T, Kua E, Ng T. Tea for Alzheimer prevention. J Prev Alz Dis. 2015;2(2):136-41.

25.         Najafi Kakavand M, Oryan S, Nabiuni M, Ghafournian H. The effect of green tea extract memory impairment induced by injection of streptozotocin-induced brain in male Wistar rat. Pajoohandeh Journal. 2015;20(4):198-205.

26.         Arab H, Mahjoub S, Hajian-Tilaki K, Moghadasi M. The effect of green tea consumption on oxidative stress markers and cognitive function in patients with Alzheimer’s disease: A prospective intervention study. Caspian journal of internal medicine. 2016;7(3):188.

27.         Schimidt HL, Garcia A, Martins A, Mello-Carpes PB, Carpes FP. Green tea supplementation produces better neuroprotective effects than red and black tea in Alzheimer-like rat model. Food Research International. 2017;100:442-8.

28.         کاکاوند ن, عریان, شهربانو, نبیونی, غفوریان, حبیبه. بررسی اثر عصاره چای سبز بر آسیب حافظه ناشی از تزریق داخل مغزی استرپتوزوتوسین در رت نر ویستار. نشریه پژوهنده. 2015;20(4):198-205.

29.         Liang Y-R, Ma S-C, Luo X-Y, Xu J-Y, Wu M-Y, Luo Y-W, et al. Effects of green tea on blood pressure and hypertension-induced cardiovascular damage in spontaneously hypertensive rat. Food Science and Biotechnology. 2011;20(1):93-8.

30. Alamdari DH, Paletas K, Pegiou T, Sarigianni M, Befani C, Koliakos G. A novel assay for the evaluation of the prooxidant– antioxidant balance, before and after antioxidant vitamin administration in type II diabetes patients. Clin Biochem. 2007;40(3–4):248–54. doi:10.1016/j.clinbiochem.2006.10.017.

31. Tavana S, Amini S, Hakhamaneshi MS, Andalibi P, Hajir MS, Ardalan A, et al. Prooxidant–antioxidant balance in patients with phenylketonuria and its correlation to biochemical and hematological parameters. J Pediatr Endocrinol Metab. 2016;. doi:10. 1515/jpem-2015-0398.