اثرات پیشگیرانه قهوه بر اختلال یادگیری و حافظه و ظرفیت کل انتی اکسیدانی و سطح سرمی مالون دی آلدئید در مدل رتهای آلزایمری شده پس از تزریق داخل بطنی استرپتوزوتوسین

یکی از ضروریات برای بقاء در انسانها، یادگیری و حافظه است. یادگیری، قدرت تغییر رفتار در نتیجه تجربیات است و حافظه به عنوان محصول نهایی یادگیری برای حفظ تجربیات یادگرفته شده ضروری است. بیماریهای مختلفی در انسان موجب آسیب پیشرونده این عملکردهای شناختی می گردند؛ یکی از این اختلالات، بیماری نورودژنراتیو آلزایمر است (1 و 2). بیماری آلزایمر یک بیماری نورودژنراتیو پیشرونده بوده که به عنوان یکی از 8 علت مرگ در افراد بالای 65 سال شناخته شده است (3). این بیماری با اختلال حافظه و شناخت همراه بوده که به تدریج باعث زمین گیر شدن و مرگ بیمار می شود. مسلماً بهبودی عوارض ناشی از این بیماری و به طور اهم بهبودی در حافظه بیماران خصوصاً در افراد سالمند باعث افزایش چشمگیری در کیفیت زندگی و رضایتمندی آنان از زندگی خواهد شد. با این وجود ترکیبات گیاهان دارویی اندکی جهت تاثیر بر روی این بیماری و یا علت زمینه ای آن وجود دارد (3).

تحقیقات نشان داده اند در نوع تک گیر (اسپورادیک) این بیماری همراه با اختلالات یاد گیری و حافظه، آسیب شدیدی نیز به صورت پیشرونده در متابولیسم گلوکز و انرژی مغز بوجود می آید(4) گلوکز سوخت اصلی تامین انرژی بیولوژیک در سیستم اعصاب مرکزی است (5)و مشاهده شده که هر اختلالی در متابولیسم انرژی وابسته به گلوکز منجر به آسیب یادگیری و حافظه می گردد (6) بین بیماری آلزایمر و مقاومت به پاسخ دهی به انسولین در مغز رابطه وجود دارد.(7) مشخص شده تزریق استرپتوزوسین، یک ماده دیابتوژنیک که جهت القای دیابت تیپ یک در حیوانات آزمایشگاهی استفاده می شود، به داخل بطنهای مغزی (icv^[1]-STZ^[2]) در رت بر یادگیری و حافظه و همچنین بر فرآیندهای متابولیکی در مغز این حیوانات اثراتی مشابه با بیماری آلزایمر نوع تک گیر دارد.            ( 8 و9)بنابراین icv-STZ مدل مناسبی برای مطالعه این بیماری می باشد (9)

icv-STZ با مهار گیرنده های انسولین مغز از طریق کاهش مصرف گلوکز، کاهش فعالیت آنزیم های گلیکولیتیک در مغز، کاهش تشکیل انرژی، کاهش فعالیت استیل کولین ترانسفراز و آسیب نورونهای آوران کولینرژیکی و همچنین کاهش فعالیت کاتکول آمینرژیک موجب پیدایش اختلالاتی در یادگیری و ظرفیت حافظه می گردد (4و10) علاوه بر این icv-STZ از طریق ایجاد استرس اکسیداتیو موجب تغییر فعالیت میکروگلیاها و اختلال در میلین سازی در نواحی درگیر در روندهای شناختی، یادگیری و حافظه می شود.(5)

اخیرا مشخص شده مصرف کافئین بعنوان یک عامل دارویی، بر تعدیل سازگاریهای CNS و بخصوص  هیپوکامپ که در یادگیری و حافظه نقش بسزایی دارد، تاثیر می گذارد(11). هم مطالعات بر روی انسان و هم حیوانات نشان داده اند که کافئین موجب بهبود عملکرد عقلانی (12و13)و به طور چشم گیری موجب افزایش یادگیری و حافظه می شود (13و14و15) مشاهده شده است که کافئین منجر به نوروژنز و بهبود عملکرد در تستهای رفتاری یادگیری وحافظه (MWM) و همچنین افزایش LTP در شکنج دندانه دار از تشکیلات هیپوکامپ  موشها  می گردد (7و16). LTP یک شکل از پلاستیسیته سیناپسی که در مناطق مختلف مغز القا می گردد و می تواند به عنوان یک ابزار الکتروفیزیولوژیکی مهم برای بررسی یادگیری و حافظه مورد استفاده قرار گیرد (17)

حال بنا بر آنچه که در مورد اثرات سودمند کافئین بر پارامترهای تقویت کننده عصبی تأثیر گذار بر عوامل شناختی به آنها اشاره شد، هدف این مطالعه بررسی اثرات ورزش بر یادگیری و حافظه در رتهای آلزایمری شده با تزریق داخل بطنهای مغزی استرپتوزوتوسین از طریق مطالعه رفتاری بوده است.

بیماری آلزایمر (AD)  آلزایمر یک بیماری عصبی - ناتوانی است که باعث از دست دادن تدریجی حافظه، زبان و استدلال در طی سالهای 5 تا 20 سال در سالمندان می شود.(1). امروزه بیش از 48 میلیون نفر از زوال عقلی رنج میبرند و که میزان الزایمر در آنها 50-70 درصد است. در بیماران مبتلا به الزایمر تغییر پاتولوژیک  مغزی شایع است: یکی پلاک های آمیلوئیدی خارج سلولی بوسیله تجمع و رسوب شدن بتا پپتید آمیلیید(2) (3)و دیگری انسداد و هایپرفسفریله شدن غیر طبیعی پروتیین های تاو[3] که منجر به تولید کلافه های رشته ای(4). عوامل مختلف محیطی و ژنتیکی بسیاری با زوال عقلی و آلزایمر در اراتباط هستند که بساری از آنها پروتئین تاو را تحت تاثیر قرار  میدهند(5). از عوامل محیطی مرتبط با بیماری آلزایمر میتوان به فعالیت فیزیکی(6), چاقی و دیابت و رژیم غذایی فرد(7) و استرس اکسیداتیو (8)اشاره کرد.

همانطور که گفته شد افزایش سطح پلاک های آمیلوئیدی بتا (AB)[4]در مغز میتواند منجر به اختلالات حافظه در فرد شود. تجزیه پیش ساز پروتئین آمیلوئید [5] به دو واحد بتا و گاما منجر به تولید AB  میشود. پلاک های AB میتواند دایمر ,الیگومر و حتی به صورت فیبریل در بیایند که این اتصال ها منجر به توکسیک شدن این پلاک ها میشود(9). تجمع این پلاک ها در مغز منجر به ایجاد فرایند های نورودژنرتیو از جمله شروع واکنش های زنجیره ای رادیکال های آزادمیشود(10).رادیکال های آزاد ایجاد شده منجر به افزایش استرس اکسیداتیو میشود که خود یکی از اولین نمودهای الزایمر میباشد(11, 12).

در سال های اخیر، بر اساس این ارتباط احتمالی بین آسیب اکسیداتیو و کاهش شناختی، علاقه زیادی به مطالعه ترکیبات فعال بیولوژیکی رژیم وجود دارد که موجب تأخیر و یا جلوگیری از آسیب سلولی، تسکین علائم و بهبود کیفیت زندگی افراد می شود.(13)کافئین موجود در قهوه  یک متیل گزانتین[6] است که به فراوانی در چایی و قهوه یافت میشود(14). یک مطالعه اپیدمیدمیولوژیک نشان داده است که افراد مبتلا به آلزایمر در 20 سال قبل در مقایسه با افراد سالم  میزان کمتری قهوه  مصرف کرده اند(15). به عنوان مثال،در  مطالعه 'عوامل خطر بیماری قلبی عروقی , پیری و التهاب' نشان داد که مصرف سه تا پنج فنجان قهوه روزانه در 65٪  از موارد همراه با خطر کمتر از تهدید زوال عقل در آینده(16). همچنین  مطالعات بلند مدت اخیر نشان داده اند که مصرف عادی  قهوه/کافئین از افراددر برابر بروز اختلالات شناختی محافظت میکند(17, 18).اگر چه کل پیچیدگی فرآیند پیری هنوز ناشناخته است، استفاده از قهوه برای درمان نقایص شناختی همراه با پیری طبیعی و کسانی که در بیماری آلزایمر پیش بینی شده است، امیدوار کننده است(19-21). مکانیسم قطعی برای اثر کافئین بر الزایمر هنوز پیدا نشده است اما اثر احتمالی کافئین را میتوان  اثر انتاگونیستی بر روی رسپتور های ادنوزین  سیستم عصبی نسبت داد که در نهایت  منجر به افزایش سطح هوشیاری در فرد میشود(22). حدود  800 تا 1000 ترکیب شیمیایی در قهوه  موجود است که علاوه بر آلکالوئیدها مانند کافئین، قهوه یک منبع غنی از پلی فنل ها، ملانوئیدیین ها و دیترپن ها است که می تواند بر سلامت انسان تأثیر بگذارد و اثرات بیولوژیکی متفاوتی از جمله اثرات آنتی اکسیدانی را ایفا کند.(23) به طوری که در مطالعات نشان داده شده است که موادی به غیر از کافئین موجود در قهوه مانند اسیدهای کلرژنیک، هیدروکسی هیدروکسی کویونون (hhQ) و لیگناها با اثراتی که بر سیگنالینگ انسولین دارند میتوانند نقش موثری در بروز پیری و زوال عقلی ایفا کنند.به طوری که در مطالعه ای که در موشهای تراسنژیک مبتلا به آلزایمر به جای کافئین خام به جای کافئین خالص میزان پلاک های بتا آمیلوئید و میزان زوال عقلی در آنها کمتر بود.

اسید کلروژنیک یکی از مهم ترین پلی فنول های موجود در قهوه است که میتواند با مسیر های مختلفی از جمله مانند التهاب و سیگنالینگ انسولین در بروز و یا بهبود آلزایمر موثر باشد.(24, 25)

یکی دیگر از ترکیبات موجود در دانه های قهوه که میتواند فعالیت ضد التهابی و آنتی اکسیدانی خود را در روند بیماری آلزایمر نشان دهد میتوان به دو دی ترپن  kahweol وcafestol و melanoidins اشاره کرد(26, 27).

در مطالعات بلند مدت انسانی نمیتوان اثر قهوه  را از دیگر انتخاب های رژیمی موثر متمایز کرد به همین دلیل برای بررسی اثر قهوه  و نه کافئین به تنهایی بر آلزایمر نیاز است که از نمونه های حیوانی استفاده کرد(19). در این راستا ما در این مطالعه به بررسی اثر محافظتی قهوه در پیشگیری از ابتلا به آلز ایمر در موشهای نزاد ویستارمیپردازیم.

Yi-FangChu و همکاران در سال 2012 در مطالعه ای بیان کردند که کافئین خام باعث کاهش حافظه و سطوح β1-42 آمیلوئید در مدل موش آلزایمر می شود و نشان دادند که کافئین خام اثرات محافظتی بهتری نسبت به کافئین خالص در موشهای مبتلا به آلزایمر دارد و همچنین کافئین خام و نه کافئین خالص منجر به کاهش سطح پلاک های آمیلوئیدی میشود(28).

Abreu و همکاران در سال 2011 به بررسی اثر مصرف مزمن قهوه و کافئین در رت های مبتلا به الزایمر پرداختند . در این مطالعه به طور متوسط موشها روزانه 20-40 میلی گرم به ازای وزن بدن خود کافئین دریافت میکردند. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که دریافت قهوه مشابه دریافت کافئین میتواند حافظه بلند مدت را در موشهای آلزایمری افزایش دهد و بیان کردند که مصرف قهوی میتواند با اثر آنتی اکسیدانی خود در کاهش سن ایجاد اختلالات شناختی موثر باشد(13)

1. سطح مالون دی آلدئید سرم با تجویز قهوه  نسبت به گروه موش صحرایی مبتلا به آلزایمر  تغییر می یابد.
2. سطح ظرفیت تام آنتی اکسیدنی سرم با تجویز قهوه  نسبت به گروه موش صحرایی مبتلا به آلزایمر  تغییر می یابد.

3- -مدت زمان سپری شده برای یافتن سکوی پنهان جهت تست حافظه فضایی در دستگاه ماز آبی موریس با تجویز قهوه  نسبت به گروه موش صحرایی مبتلا به آلزایمر  تغییر می یابد.

4-مسافت طی شده برای یافتن سکوی پنهان جهت آزمون یادگیری در دستگاه ماز آبی موریس با تجویز قهوه  نسبت به گروه موش صحرایی مبتلا به آلزایمر  تغییر می یابد.

5-تاخیر زمانی برای ورود به محفظه تاریک پس از شوک در دستگاه شاتل باکس با تجویز قهوه  نسبت به گروه موش صحرایی مبتلا به آلزایمر  تغییر می یابد.

اثرات پیشگیرانه  قهوه بریادگیری و حافظه و ظرفیت تام آنتی اکسیدانی و مالون دی الدئید سرم در رتها پس از تزریق داخل بطنی استرپتوزوتوسین

- تعیین و مقایسه مدت زمان سپری شده درماز آبی موریس به منظور یافتن سکوی پنهان در گروه های مورد مطالعه

2. تعیین  و مقایسه  اثر قهوه بر سطح مالون دی آلدئید سرم در گروه های مورد مطالعه

3-تعیین و مقایسه مسافت پیموده شده در ماز آبی موریس به منظور یافتن سکوی پنهان در گروه های مورد مطالعه

4-تعیین و مقایسه زمان تاخیر برای ورود به اتاق تاریک پس از اعمال شوک با دستگاه شاتل باکس در گروه های مورد مطالعه

5- تعیین  و مقایسه  اثر قهوه بر سطح ظرفیت تام آنتی اکسیدانی سرم در گروه های مورد مطالعه

دانشگاه ها-مراکز درمانی-

بیماری  آلزایمر: یک بیماری تخریب مغزی است که توسط ابتلا به زوال عقلی مشخص شده است. اختلال حافظه، قضاوت، طول عمر و مهارتهای حل مسئله همراه با APRAXIAS شدید و از دست دادن توانایی های شناختی جهانی است. این شرایط عمدتا بعد از 60 سالگی اتفاق می افتد و با آتروفی شدید قشر و سه گانه ای از موش های SENILE شناخته می شود؛

قهوه :یک نوشیدنی ساخته شده از لوبیای COFFEA زمین (SEEDS) در آب گرم حل می شود. به طور کلی حاوی کافئین و THEOFYYLLINE است، مگر اینکه  بدون کافئین باشد

تجربی

رت های نر نژاد ویستار با وزن تقریبی 220-180گرم

1-نر باشد.

2-از نژاد ویستار باشد.

3- 10تا 12  هفته ای باشند.

4-وزن تقریبی   220-180گرم باشد

معیار های خروج:

1-مریض بودن

2-خون ریزی داشتن

3-کم وزنی

حجم نمونه بر اساس مطالعات مشابه،10 سر در هر گروه انتخاب میشود (ایرانی)

بر اساس حجم نمونه تعیین شده در هر گروه تغذیه موش ها انجام و بر اساس پروتکل تحقیق طی هر مرحله رت ها پایش و نسبت به  تزریق  STZ اخذ خون و ادامه ی تحقیق در مراحل بعدی با در نظر گرفتن تعداد کافی نمونه از نظر کمی و آنالیز آماری اقدام خواهد شد.لازم به ذکر است در شروع تحقیق 40 سر رت ماده انتخاب،و پس از جفت گیری نسبت به مراحل بعدی اقدام خواهد شد

40 سر رت نر  سفید نژاد ویستار(با میانگین وزن 220- 200گرم)  از مرکز تکثیر حیوانات آزمایشکاهی تهیه خواهد شد و در یک اتاق با دما و رطوبت کنترل شده،با 12 ساعت نور -12 ساعت چرخه تاریکی،با دسترسی آزاد به آب و غذای ویژه حیوانات آزمایشگاهی نگهداری میشوند. پس از تطابق و سازگاری با محیط،موش ها را در 4 گروه قرار میدهیم.1-گروه کنترل سالم (رژیم غذایی معمولی دریافت میکنند. 2-گروه کنترل آلزایمری( رژیم غذایی معمولی دریافت میکنند  و نهایتا تحت القای آلزایمر قرار میگیرند).3-گروه  قهوه سالم (قهوه دریافت میکنند ) 4- گروه قهوه آلزایمری (قهوه دریافت میکنند و نهایتا تحت القای آلزایمر قرار میگیرند)

در گروه های کنترل نیز روزانه نرمال سایلین گاواژ میشود.

نحوه آماده سازی:

10  گرم قهوه را در 100 میلی لیترآب معدنی با دمای 90 درجه به مدت 3-5 دقیقه دم میکنیم   و پس از عبور از کاغذ فیلتر در شیشه های تیره نگه داری میکنیم.سپس به مدت21 روز روزی یک بار مقدار 5.7 میلی لیتر / کیلوگرم محلول تهیه شده و به موشها گاواژ خواهد شد.پروسه تهیه محلول مورد نیاز به طور روزانه انجام خواهد شد.(29) 

در این صورت در یک موش 200 گرمی به ازای هر سی سی گاواز از محلولی که 10 گرم قهوه در 100 سیسی آب دم شده بود 0.1 گرم قهوه دریافت میکند. در واقع دوز دریافتی قهوه  با محاسبات انجام شده 0.57 گرم به ازای کیلوگرم وزن بدن موش است

14/1 میلی لیتر از محلول قهوه برای هر موش روزانه که برای کل موشها در روز 45.6 میلی لیتر میشود.

روش جراحی :

 حیوانات را با تزریق داخل صفاقی کتامین/ زایلازین با دوز mg/kg 400 بیهوش خواهیم کرد و برای ثابت نگه داشتن دمای بدن رت (5/0±5/36 درجه سانتیگراد) از تشک گرم کننده استفاده  میشود.  بعد از شیو shave کردن سر حیوان،  سر آنها را در دستگاه استریوتاکسیک جراحی مغز ثابت کرده و با ایجاد شکافی طولی در بخش خلفی سر، جمجمه نمایان می گردد. بعد از مشخص کردن مختصات استریوتاکس برای بطن های جانبی مغزی با استفاده از راهنمای اطلس مغز رت (18) و همچنین با استفاده از مختصات بدست آمده از مطالعه پایلوت (جلویی ـ عقبی  mm8/0-، جانبی mm 6/1± و پشتی ـ شکمی mm 2/4-)، با کمک دریل دو سوراخ در جمجمه  طوری که به بافت مغز آسیب نرساند ایجاد کرده و کانول مخصوص تزریق به آرامی وارد بطن ها می شود و داروی استرپتوزوتوسین با دوز mg/kg 5/1 (وزن بدن در سالین) (4) را به وسیله سرنگ هامیلتون طی مدت 3 دقیقه داخل هر بطن تزریق خواهد شد و پس از اتمام تزریق، به مدت 5 دقیقه سوزن مورد استفاده در داخل بطن باقی خواهد ماند و پس از اتمام این مدت سوزن خارج و همه این مراحل در بطن طرف مقابل انجام  خواهدگرفت. گروه های شم نیز به همین روش تحت جراحی قرار گرفته ولی به جای STZ حجم مساوی از سالین دریافت می کنند. بعد از جراحی رت ها در قفس های جداگانه ای قرار گرفته و بدون هیچ محدودیتی به آب و غذا دسترسی خواهند داشتند.

آزمون رفتاری

2-3 آزمون رفتار یادگیری اجتنابی غیر فعال (Passive avoidance learning test)

بعد از اتمام دوره ورزش راتها تحت مطالعه رفتاری قرار خواهند گرفت. از روش یادگیری اجتنابی غیر فعال (passive avoidance) بمنظور بررسی یادگیری و حافظه استفاده میگردد. دستگاه یادگیری اجتنابی غیر فعال (shuttle box) شامل دو بخش تاریک و روشن است که توسط یک درب گیوتینی از هم جا می شوند. جهت اجرا مرحله یادگیری موش را در حالی که پشتش به سمت در گیوتینی باشد در داخل اتاق تاریک گذاشته می شود و 5 ثانیه بعد درب گیوتینی بالا کشیده خواهد شد. بعد از ورود موش به ناحیه تاریک در بسته خواهد شد و شوک الکتریکی با شدت 2/1 میلی آمپر به مدت 5 ثانیه به کف پای حیوان اعمال می گردد. پس از آن حیوان از اتاق تاریک خارج و در قفس قرار داده خواهد شد. به منظور ارزیابی حافظه، 24 ساعت و 1 هفته بعد از دریافت شوک الکتریکی حیوان دوباره در داخل اتاق روشن در حالی که دریچه بین دو اتاق باز بود، قرار داده خواهد شد و تأخیر زمانی برای اولین ورود به اتاق تاریک ثبت می گردد. سقف زمانی در این مرحله 300 ثانیه خواهد بود و کلیه آزمایشات بین ساعت 11-8 صبح انجام می گیرد. طولانی تر بودن تأخیر زمانی برای اولین ورود به اتاق تاریک نشانه یادگیری و حافظه بهتر می باشد.

آزمون ماز آبی موریس

برای ارزیابی حافظه فضایی ، موشها در ماز آبی موریس آزمایش خواهند شد، که یک استخر دایره ای سیاه رنگ به قطر 150 سانتیمتر و ارتفاع 60 سانتی متر پر شده از آب با دمای 26-24 درجه سانتی گراد به عمق 30 سانتی متر خواهد بود و به چهار ربع شمال، جنوب، مغرب و مشرق تقسیم خواهد شد. در مرکز ربع جنوب شرقی یک سکوی گرد از جنس پلکسی گلاس (10 سانتی متر قطر و ارتفاع 28 سانتی متر) واقع خواهد شد که 2 سانتی متر زیر سطح آب پنهان خواهد داشت. قبل از شروع آزمایش هر موش روزانه به مدت 3 روز به کار گرفته خواهد شد و پس از آن موش ها در ماز آبی بدون سکو به مدت 30 ثانیه عادت خواهند کرد.

هر موش در 12 آزمایش شرکت داده خواهد شد که شامل 3 بلوک از 4 آزمایش (1 آزمایش/ شروع موقعیت در یک بلوک)خواهد بود. هر بلوک به عنوان یک جلسه آزمون جداگانه در نظر گرفته خواهد شد  و بلوک ها با فواصل 30 دقیق از هم جدا خواهند شد. موش در حالی که رو به دیواره مخزن قرار دارد، در یکی از چهار ربع استخر آزاد خواهد شد. در هر آزمایش، به موش ها اجازه شنا داده خواهد شد تا زمانی که سکو را پیدا کنند و به مدت 20 ثانیه روی آن باقی بمانند. اگر 60 ثانیه بگذرد و حیوان سکو را پیدا نکند، حیوان به سمت سکو هدایت خواهد شد و اجازه می دهیم به مدت 20 ثانیه روی سکو باقی بماند. در تمام این مراحل یک دوربین در بالای استخر برای تشخیص مسیر موش نصب خواهد شد و اطلاعات به کامپیوتر منتقل و ثبت خواهد شد. زمان تاخیر برای رسیدن به سکو و همچنین طول مسیر شنا در میان گرو ه ها مقایسه خواهد شد. در فاز حافظه(24 ساعت بعد)، سکو برداشته شده و یک تست حافظه 60 ثانیه ای برای بررسی اینکه چقدر موش ها محل دقیق سکو را یاد گرفته اند، انجام خواهد شد. سکو برداشته خواهد شد و به حیوانات اجازه داده خواهد شد تا به مدت 60 ثانیه شنا کنند. زمان ثبت شده در ربع هدف(Q1) در میان گروه ها مقایسه خواهد شد.

TAC , MDA نیز از طریق کیت های آزمایشگاهی اندازه گیری خواهند شد.

40 سر رت نر  سفید نژاد ویستار(با میانگین وزن 220- 200گرم)  از مرکز تکثیر حیوانات آزمایشکاهی تهیه خواهد شد و در یک اتاق با دما و رطوبت کنترل شده،با 12 ساعت نور -12 ساعت چرخه تاریکی،با دسترسی آزاد به آب و غذای ویژه حیوانات آزمایشگاهی نگهداری میشوند. پس از تطابق و سازگاری با محیط،موش ها را در 4 گروه قرار میدهیم.1-گروه کنترل سالم (رژیم غذایی معمولی دریافت میکنند. 2-گروه کنترل آلزایمری( رژیم غذایی معمولی دریافت میکنند و نهایتا تحت القای آلزایمر قرار میگیرند).3-گروه  قهوه سالم (قهوه دریافت میکنند ) 4- گروه قهوه آلزایمری (قهوه دریافت میکنند و نهایتا تحت القای آلزایمر قرار میگیرند)

نحوه آماده سازی:

10  گرم قهوه را در 100 میلی لیترآب معدنی با دمای 90 درجه دم میکنیم و پس از عبور از کاغذ فیلتر در شیشه های تیره نگه داری میکنیم.سپس به مدت 14 روز روزی یک بار مقدار 5.7 میلی لیتر / کیلوگرم محلول تهیه شده و به موشها گاواژ خواهد شد.پروسه تهیه محلول مورد نیاز به طور روزانه انجام خواهد شد.(29)

14/1 میلی لیتر از محلول قهوه برای هر موش روزانه که برای کل موشها در روز 45.6 میلی لیتر میشود.

روش جراحی :

 حیوانات را با تزریق داخل صفاقی کتامین/ زایلازین با دوز mg/kg 400 بیهوش خواهیم کرد و برای ثابت نگه داشتن دمای بدن رت (5/0±5/36 درجه سانتیگراد) از تشک گرم کننده استفاده  میشود.  بعد از شیو shave کردن سر حیوان،  سر آنها را در دستگاه استریوتاکسیک جراحی مغز ثابت کرده و با ایجاد شکافی طولی در بخش خلفی سر، جمجمه نمایان می گردد. بعد از مشخص کردن مختصات استریوتاکس برای بطن های جانبی مغزی با استفاده از راهنمای اطلس مغز رت (18) و همچنین با استفاده از مختصات بدست آمده از مطالعه پایلوت (جلویی ـ عقبی  mm8/0-، جانبی mm 6/1± و پشتی ـ شکمی mm 2/4-)، با کمک دریل دو سوراخ در جمجمه  طوری که به بافت مغز آسیب نرساند ایجاد کرده و کانول مخصوص تزریق به آرامی وارد بطن ها می شود و داروی استرپتوزوتوسین با دوز mg/kg 5/1 (وزن بدن در سالین) (4) را به وسیله سرنگ هامیلتون طی مدت 3 دقیقه داخل هر بطن تزریق خواهد شد و پس از اتمام تزریق، به مدت 5 دقیقه سوزن مورد استفاده در داخل بطن باقی خواهد ماند و پس از اتمام این مدت سوزن خارج و همه این مراحل در بطن طرف مقابل انجام  خواهدگرفت. گروه های شم نیز به همین روش تحت جراحی قرار گرفته ولی به جای STZ حجم مساوی از سالین دریافت می کنند. بعد از جراحی رت ها در قفس های جداگانه ای قرار گرفته و بدون هیچ محدودیتی به آب و غذا دسترسی خواهند داشتند.

آزمون رفتاری

2-3 آزمون رفتار یادگیری اجتنابی غیر فعال (Passive avoidance learning test)

بعد از اتمام دوره ورزش راتها تحت مطالعه رفتاری قرار خواهند گرفت. از روش یادگیری اجتنابی غیر فعال (passive avoidance) بمنظور بررسی یادگیری و حافظه استفاده میگردد. دستگاه یادگیری اجتنابی غیر فعال (shuttle box) شامل دو بخش تاریک و روشن است که توسط یک درب گیوتینی از هم جا می شوند. جهت اجرا مرحله یادگیری موش را در حالی که پشتش به سمت در گیوتینی باشد در داخل اتاق تاریک گذاشته می شود و 5 ثانیه بعد درب گیوتینی بالا کشیده خواهد شد. بعد از ورود موش به ناحیه تاریک در بسته خواهد شد و شوک الکتریکی با شدت 2/1 میلی آمپر به مدت 5 ثانیه به کف پای حیوان اعمال می گردد. پس از آن حیوان از اتاق تاریک خارج و در قفس قرار داده خواهد شد. به منظور ارزیابی حافظه، 24 ساعت و 1 هفته بعد از دریافت شوک الکتریکی حیوان دوباره در داخل اتاق روشن در حالی که دریچه بین دو اتاق باز بود، قرار داده خواهد شد و تأخیر زمانی برای اولین ورود به اتاق تاریک ثبت می گردد. سقف زمانی در این مرحله 300 ثانیه خواهد بود و کلیه آزمایشات بین ساعت 11-8 صبح انجام می گیرد. طولانی تر بودن تأخیر زمانی برای اولین ورود به اتاق تاریک نشانه یادگیری و حافظه بهتر می باشد.

آزمون ماز آبی موریس

برای ارزیابی حافظه فضایی ، موشها در ماز آبی موریس آزمایش خواهند شد، که یک استخر دایره ای سیاه رنگ به قطر 150 سانتیمتر و ارتفاع 60 سانتی متر پر شده از آب با دمای 26-24 درجه سانتی گراد به عمق 30 سانتی متر خواهد بود و به چهار ربع شمال، جنوب، مغرب و مشرق تقسیم خواهد شد. در مرکز ربع جنوب شرقی یک سکوی گرد از جنس پلکسی گلاس (10 سانتی متر قطر و ارتفاع 28 سانتی متر) واقع خواهد شد که 2 سانتی متر زیر سطح آب پنهان خواهد داشت. قبل از شروع آزمایش هر موش روزانه به مدت 3 روز به کار گرفته خواهد شد و پس از آن موش ها در ماز آبی بدون سکو به مدت 30 ثانیه عادت خواهند کرد.

هر موش در 12 آزمایش شرکت داده خواهد شد که شامل 3 بلوک از 4 آزمایش (1 آزمایش/ شروع موقعیت در یک بلوک)خواهد بود. هر بلوک به عنوان یک جلسه آزمون جداگانه در نظر گرفته خواهد شد  و بلوک ها با فواصل 30 دقیق از هم جدا خواهند شد. موش در حالی که رو به دیواره مخزن قرار دارد، در یکی از چهار ربع استخر آزاد خواهد شد. در هر آزمایش، به موش ها اجازه شنا داده خواهد شد تا زمانی که سکو را پیدا کنند و به مدت 20 ثانیه روی آن باقی بمانند. اگر 60 ثانیه بگذرد و حیوان سکو را پیدا نکند، حیوان به سمت سکو هدایت خواهد شد و اجازه می دهیم به مدت 20 ثانیه روی سکو باقی بماند. در تمام این مراحل یک دوربین در بالای استخر برای تشخیص مسیر موش نصب خواهد شد و اطلاعات به کامپیوتر منتقل و ثبت خواهد شد. زمان تاخیر برای رسیدن به سکو و همچنین طول مسیر شنا در میان گرو ه ها مقایسه خواهد شد. در فاز حافظه(24 ساعت بعد)، سکو برداشته شده و یک تست حافظه 60 ثانیه ای برای بررسی اینکه چقدر موش ها محل دقیق سکو را یاد گرفته اند، انجام خواهد شد. سکو برداشته خواهد شد و به حیوانات اجازه داده خواهد شد تا به مدت 60 ثانیه شنا کنند. زمان ثبت شده در ربع هدف(Q1) در میان گروه ها مقایسه خواهد شد.

TAC , MDA نیز از طریق کیت های آزمایشگاهی اندازه گیری خواهند شد.

تجزیه تحلیل داده ها با استفاده از نرم افزار SPSS  ورژن 21 انجام خواهد شد. برای مقایسه گروه ها از روش Anova  یکطرفه و تست متعاقب Bonferoni  استفاده خواهد شد.بیان داده ها به صورت Mean ±SE خواهد بود.

در طول مطالعه بر اساس پروتوکل کار با حیوانات آزمایشگاهی رفتار شده وانجام کار به تایید کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی زاهدان خواهد رسید. همچنین چک لیست کار با حیوانات آزمایشگاهی مصوب وزارت متبوعه تکمیل و پیوست می شود.

ه مواد و سایل مورد نیاز-از بین رفتن موش ها حین مطالعه

قهوه یادگیری - استرپتوزوتوسین

1.            Glenner G. Alzheimer's disease. The commonest form of amyloidosis. Archives of pathology & laboratory medicine. 1983;107(6):281.

2.            Funato H, Yoshimura M, Kusui K, Tamaoka A, Ishikawa K, Ohkoshi N, et al. Quantitation of amyloid beta-protein (A beta) in the cortex during aging and in Alzheimer's disease. The American journal of pathology. 1998;152(6):1633.

3.            Tam JH, Pasternak SH. Amyloid and Alzheimer's disease: inside and out. Canadian Journal of Neurological Sciences. 2012;39(3):286-98.

4.            Šimić G, Babić Leko M, Wray S, Harrington C, Delalle I, Jovanov-Milošević N, et al. Tau protein hyperphosphorylation and aggregation in Alzheimer’s disease and other tauopathies, and possible neuroprotective strategies. Biomolecules. 2016;6(1):6.

5.            Reitz C, Brayne C, Mayeux R. Epidemiology of Alzheimer disease. Nature Reviews Neurology. 2011;7(3):137.

6.            Belarbi K, Burnouf S, Fernandez-Gomez F-J, Laurent C, Lestavel S, Figeac M, et al. Beneficial effects of exercise in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease-like Tau pathology. Neurobiology of disease. 2011;43(2):486-94.

7.            Cheke LG, Bonnici HM, Clayton NS, Simons JS. Obesity and insulin resistance are associated with reduced activity in core memory regions of the brain. Neuropsychologia. 2017;96:137-49.

8.            Prasanthi JR, Dasari B, Marwarha G, Larson T, Chen X, Geiger JD, et al. Caffeine protects against oxidative stress and Alzheimer's disease-like pathology in rabbit hippocampus induced by cholesterol-enriched diet. Free Radical Biology and Medicine. 2010;49(7):1212-20.

9.            Tanzi RE, Bertram L. Twenty years of the Alzheimer’s disease amyloid hypothesis: a genetic perspective. Cell. 2005;120(4):545-55.

10.         Butterfield DA, Boyd-Kimball D. The critical role of methionine 35 in Alzheimer's amyloid β-peptide (1–42)-induced oxidative stress and neurotoxicity. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 2005;1703(2):149-56.

11.         Castellani RJ, Zhu X, Lee H-g, Moreira PI, Perry G, Smith MA. Neuropathology and treatment of Alzheimer disease: did we lose the forest for the trees? Expert review of neurotherapeutics. 2007;7(5):473-85.

12.         Smith MA, Zhu X, Tabaton M, Liu G, McKeel Jr DW, Cohen ML, et al. Increased iron and free radical generation in preclinical Alzheimer disease and mild cognitive impairment. Journal of Alzheimer's Disease. 2010;19(1):363-72.

13.         Abreu RV, Silva-Oliveira EM, Moraes MFD, Pereira GS, Moraes-Santos T. Chronic coffee and caffeine ingestion effects on the cognitive function and antioxidant system of rat brains. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 2011;99(4):659-64.

14.         Fisone G, Borgkvist A, Usiello A. Caffeine as a psychomotor stimulant: mechanism of action. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 2004;61(7-8):857-72.

15.         Maia L, De Mendonça A. Does caffeine intake protect from Alzheimer's disease? European Journal of Neurology. 2002;9(4):377-82.

16.         Eskelinen MH, Kivipelto M. Caffeine as a protective factor in dementia and Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 2010;20(s1):S167-S74.

17.         Ritchie K, Carrière I, De Mendonca A, Portet F, Dartigues J-F, Rouaud O, et al. The neuroprotective effects of caffeine A prospective population study (the Three City Study). Neurology. 2007;69(6):536-45.

18.         Van Gelder B, Buijsse B, Tijhuis M, Kalmijn S, Giampaoli S, Nissinen A, et al. Coffee consumption is inversely associated with cognitive decline in elderly European men: the FINE Study. European journal of clinical nutrition. 2007;61(2):226.

19.         Arendash G, Schleif W, Rezai-Zadeh K, Jackson E, Zacharia L, Cracchiolo J, et al. Caffeine protects Alzheimer’s mice against cognitive impairment and reduces brain β-amyloid production. Neuroscience. 2006;142(4):941-52.

20.         Solfrizzi V, Panza F, Imbimbo BP, D’Introno A, Galluzzo L, Gandin C, et al. Coffee consumption habits and the risk of mild cognitive impairment: the Italian longitudinal study on aging. Journal of Alzheimer's Disease. 2015;47(4):889-99.

21.         Kolahdouzan M, Hamadeh MJ. The neuroprotective effects of caffeine in neurodegenerative diseases. CNS neuroscience & therapeutics. 2017;23(4):272-90.

22.         Daly J. Caffeine analogs: biomedical impact. Cellular and molecular life sciences. 2007;64(16):2153-69.

23.         Carman A, Dacks P, Lane R, Shineman D, Fillit H. Current evidence for the use of coffee and caffeine to prevent age-related cognitive decline and Alzheimer’s disease. The journal of nutrition, health & aging. 2014;18(4):383-92.

24.         Zhao Y, Wang J, Ballevre O, Luo H, Zhang W. Antihypertensive effects and mechanisms of chlorogenic acids. Hypertension Research. 2012;35(4):370.

25.         Van Dijk AE, Olthof MR, Meeuse JC, Seebus E, Heine RJ, Van Dam RM. Acute effects of decaffeinated coffee and the major coffee components chlorogenic acid and trigonelline on glucose tolerance. Diabetes Care. 2009;32(6):1023-5.

26.         Goya L, Delgado‐Andrade C, Rufián‐Henares JA, Bravo L, Morales FJ. Effect of coffee melanoidin on human hepatoma HepG2 cells. Protection against oxidative stress induced by tert‐butylhydroperoxide. Molecular Nutrition & Food Research. 2007;51(5):536-45.

27.         Cárdenas C, Quesada AR, Medina MA. Anti-angiogenic and anti-inflammatory properties of kahweol, a coffee diterpene. PloS one. 2011;6(8):e23407.

28.         Chu Y-F, Chang W-H, Black RM, Liu J-R, Sompol P, Chen Y, et al. Crude caffeine reduces memory impairment and amyloid β1–42 levels in an Alzheimer’s mouse model. Food chemistry. 2012;135(3):2095-102.

29.         Lima AR, Pereira RG, Abrahão SA, Zangeronimo MG, Paula F, Duarte S. Effect of decaffeination of green and roasted coffees on the in vivo antioxidant activity and prevention of liver injury in rats. Revista Brasileira de Farmacognosia. 2013;23(3):506-12.