بررسی تداخل اثرماری جوانا و استروژن بر حافظه و یادگیری فضایی در موش های صحرایی ماده: نقش سن و گیرنده ی غشایی استروژن

FIG1-B: Summary of major interactions of the endocannabinoid  system with estrogens. Endocannabinoids suppress release of GnRH, LH, and FSH. Estrogens regulate functioning of FAAH, the principal catabolic enzyme for the endocannabinoid anandamide. Red arrows and boxes represent interactions in the primary feedback loop of androgens and the endocannabinoid system. Black arrows and blue boxes represent other interactions occurring beyond the primary feedback loop(12).

 

گزارش شده است که استرادیول می تواند تراکم گیرنده های کانابینوئیدی را تنظیم کنند وازسوی دیگر ثابت شده که در برخی نواحی مغزی جوندگان، عملکرد گیرنده های کانابینوئیدی(CB1) از نظر جنسی دی مورفیک است (14). در ناحیه ی لیمبیک مصرف استروژن باعث تغییر در اتصال کانابینوئیدها به گیرنده های کانابینوئیدی می شود که این موضوع درمورد نواحی مختلف مغز، بطور متفاوتی رخ می دهد. به عنوان مثال در هیپوتالاموس تراکم گیرنده های کانابینوئیدی در ماده ها کمتر از نرهاست، درحالیکه در آمیگدال تراکم این گیرنده ها در ماده ها بیشتر از نرهاست همچنین، در ماده های فاقد تخمدان(OVX)  افزایش در تراکم گیرنده های کانابینوئیدی نسبت به ماده های سالم و نیز درمان شده با استرادیول در هیپوکمپ دیده شد و این نتایج نشان داد که بیان گیرنده های کانابینوئیدی توسط استرادیول و به شیوه ی وابسته به ناحیه مغزی(هیپوکمپ ،آمیگدال و مغز جلویی) تنظیم می شود و نیز ثابت می کند که استرادیول یک اثر مهاری روی تراکم گیرنده های کانابینوئیدی(CB1) در هیپوکمپ دارد(15). نشان داده شده است که نقص های حافظه با واسطه فعال شدن گیرنده CB₁  توسط کانابینوئید هنگام درمان موش های صحرایی  OVX با استرادیول کاهش یافت (16). داده ها نشان داده اند که نرها و ماده های فاقد غدد جنسی مقدار بالاتری از گیرنده ی کانابینوئیدی در هیپوتالاموس و مقدار کمتری از گیرنده ی کانابینوئیدی در آمیگدال دارند. در هیپوکمپ نیز اوارکتومی موجب تنظیم افزایشی گیرنده ها ی کانابینوئیدی شد(15).

ارتباط BDNF با حافظه و یادگیری:

فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز(BDNF) در فرایندهای حافظه و یادگیری مغز دخیل است همBDNF و هم گیرنده ی آن (TrKB ) تراکم بالایی در هیپوکمپ دارند و در نتیجه نقش مهمی در یادگیری و تشکیل حافظه ازجمله در حافظه ی فضایی دارند(17). بطور جالب توجهی مقدار BDNF با افزایش سن کاهش پیدا می کند که ثابت می کند این کاهش می تواند یکی از فاکتورهای دخیل در نقص حافظه وابسته به سن در انسان باشد، همچنین مطالعات نشان داده اند که مقدار خونی و مغزی BDNF در بیماران آلزایمری کاهش می یابد(18). در مورد ارتباط BDNF  با کانابینوئیدها در یک مطالعه نشان داداه شد که تجویز حاد و مزمن THC موجب افزایش مقدار BDNF می شود. درواقع دراین مطالعه پیشنهاد شد که THC موجب افزایش عملکردهای حافظه و یادگیری همراه با افزایش بیان مارکرهای پلاستیسیتی(مانند BDNF) می شود(19). ازسوی دیگر، درمورد ارتباط استروژن با BDNF، احتمال می رود که اثرات آن روی سیناپس منحصرا توسط گیرنده هایش وساطت نشود و ممکن است بصورت غیر مستقیم از طریق فعال سازی فاکتورهای رشدی مانند BDNF اعمال اثر کند(20). شواهد مشابهی ثابت می کند که BDNF توسط سطوح استرادیول تنظیم می شود و ممکن است در تغییرات سیناپسی مشاهده شده در پاسخ به تغییرات سطوح استرادیول نقش داشته باشد(3). همچنین،  اوارکتومی موجب کاهش مقدار mRNAی  BDNF در هیپوکمپ می شود و جایگزینی استرادیول موجب جبران این کاهش می گردد(20).

اگرچه مطالعات زیادی درباره ی اثرات شناختی هورمون های جنسی زنانه خصوصا استروژن انجام شده است ، اما این موضوع که ایا فقدان استروژن شریک اصلی ازدست رفتن حافظه و یادگیری وابسته به سن است، هنوز مشخص نشده است، به علاوه، همان طور که در بالا بیان شد،  هنوز مشخص نشده که چطور فاکتورهایی مثل سن، مقدار و مدت زمان  مصرف کانابینوئید در نتایج عصبی شناختی وابسته به جنس مصرف کننده ها دخیل است. ازسوی دیگر گزارش شده است که توانایی استرادیول به بهبود شناخت که  با افزایش سن کاهش پیدا می کند ، همراه با بیان کاهش یافته ی گیرنده های استرادیول است. همچنین با توجه به مطالب فوق که اخیرا مشخص شده است گیرنده غشایی استروژن GPR30 در عملکرد مغزی استروژن نقش دارد اما واسطه گری آن در کاهش توانایی استروژن برای بهبود شناخت  با  افزایش سن و همچنین تداخل با کانابینوئیدها ازطریق گیرنده  مشخص نشده است. همچنین باتوجه به نتایج متناقضی که درمورد نقش کانابینوئیدها در فرایند حافظه و یادگیری و نیز نقش BDNF  در این فرایند وجود دارد، ازسویی دیگر همانطور که در بالا بیان شد تفاوت در تراکم گیرنده های کانابینوئیدی وابسته به جنس وجود دارد و همچنین استروژن بر روی BDNF اثر می گذارد و تغییرات وابسته به سن هم در کانابینوئیدها و هم در BDNF وجود دارد این احتمال مطرح هست که شاید تغییراتی که در حافظه و یادگیری در یائسگی یا در شرایط فقدان تخمدان صورت می گیرد در ارتباط با تداخل استروژن با متغیرهای فوق باشد و در مطالعه حاضر تداخل اثر این ترکیبات با استروژن بررسی می شود.  بنابراین در مطالعه حاضر اولا اثرات سن ، بر روی حافظه و یادگیری در حضور و عدم حضور استروژن بررسی می شود. ثانیا نقش گیرنده غشایی این هورمون در پیدایش این اثرات بررسی می شود. ثالثا بررسی تداخل بین استروژن و کانابینوئیدها در موش های صحرایی ماده با سنین مختلف در مورد یادگیری و حافظه فضایی با توجه به نقش گیرنده ی GPR30 انجام می شود.

1. مدت زمان سپری شده در ربع هدف(شاخص حافظه) در گروههای مختلف مورد مطالعه چقدر است؟
2. تعداد دفعات عبور کرده از ربع هدف(شاخص حافظه) در گروههای مختلف مورد مطالعه چقدر است؟

3. زمان تاخیر برای یافتن سکوی پنهان (شاخص یادگیری) در گروههای مختلف مورد مطالعه چقدر است؟

4. مسافت پیموده شده برای یافتن سکوی پنهان(شاخص یادگیری) در گروههای مختلف مورد مطالعه چقدر است؟
5. مقایسه شاخص های فوق در گروه های مختلف تحت مطالعه چه نتیجه ای خواهد داشت؟
6.  بیان گیرنده غشایی GPR30 در گروههای مختلف مورد مطالعه چقدر است؟
7. مقایسه بیان گیرنده غشاییGPR30 در گروه های مختلف تحت مطالعه چه نتیجه ای خواهد داشت؟

8. میزان سطح پروتئین BDNF  بافت هیپوکمپ در گروههای مختلف مورد مطالعه چقدر است؟
9.  مقایسه سطح پروتئین BDNF بافت هیپوکمپ در گروه های مختلف تحت مطالعه چه نتیجه ای خواهد داشت؟

بررسی تداخل اثرماری جوانا و استروژن بر حافظه و یادگیری فضایی در موش های صحرایی ماده: نقش سن و گیرنده ی غشایی استروژن

1. تعیین و مقایسه میانگین زمان سپری شده در ربع هدف(شاخص حافظه در water maze) در گروههای مختلف مورد مطالعه
2. تعیین و مقایسه میانگین تعداد دفعات عبور کرده از ربع هدف(شاخص حافظه در water maze) در گروههای مختلف مورد مطالعه

3. تعیین و مقایسه میانگین زمان تاخیری برای یافتن سکوی پنهان (شاخص یادگیری در water maze) در گروههای مختلف مورد مطالعه
4. تعیین و مقایسه میانگین مسافت پیموده شده برای یافتن سکوی پنهان(شاخص یادگیری در water maze) در گروههای مختلف مورد مطالعه
5.  تعیین و مقایسه میانگین درصد بیان گیرنده غشایی GPR30 در گروههای مختلف مورد مطالعه
6. تعیین و مقایسه سطح پروتئین BDNF بافت هیپوکمپ در گروههای مختلف مورد مطالعه

دانشگاهها و سایر مراکز تحقیقاتی

ماری جوانا، یادگیری، استروژن، موش صحرائی

تجربی Experimental

در این مطالعه از موشهای صحرائی موجود در مرکز تحقیقات حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه استفاده خواهد شد.

معیارهای ورود: جنس ماده، نژاد Wistar ، تعداد 91 سر حیوان مسن (22 تا 24 ماهه) و 161 سر حیوان جوان بالغ (3 تا 5 ماهه) (21).  

معیارهای خروج: به غیر از موارد فوق الذکر

بر اساس مطالعات قبلی مشابه (19)و بر اساس این که همه حیوانات از یک نژاد می باشند و تعداد حیوانات در هر گروه7 سر، می باشد .

موشهای صحرائی به تعداد مورد نیاز و بر اساس معیارهای ورود به مطالعه انتخاب شده (جوان و مسن) و سپس قرارگرفتن در گروهها بصورت تصادفی خواهد بود.  

برای بررسی شاخصهای یادگیری و حافظه در بخش رفتاری از ماز آبی موریس و نرم افزار مربوطه (اتوویژن) استفاده میشود.

برای بررسی بیان پروتئین ژن GPR30 از روش وسترن بلات استفاده می شود.

برای بررسی میزان سطح پروتئین  BDNF از کیت مخصوص و به روش الایزا استفاده می شود.

1. . در این مطالعه مداخله ای تجربی از 161 سر موش صحرایی ماده نژاد Wistar، با سن3-5  ماه (21)و نیز تعداد 91 سر موش صحرایی ماده با سن 24-22 ماه(21)، استفاده خواهد شد حیوانات در شرایط طبیعی 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی،  و رژیم غذایی استاندارد در دمای⁰C  25 حیوان خانه نگهداری می شوند و حیوانات به طور تصادفی به 36 گروه تقسیم می شوند، در هر گروه 7 سر موش در نظر گرفته خواهد شد. لازم به ذکر است که همزمان سازی سیکل جنسی موش ها با کنارهم قراردادنشان به مدت دوهفته قبل از شروع مطالعه صورت خواهد گرفت. بعلاوه، طول دوره آزمایشات بیست و هشت روز بوده و تزریقات بصورت درون صفاقی  و با حجم 1cc  در هربار تزریق می باشد. در گروههایی که تخمدان برداشته میشود، دو هفته برای بهبودی زخم فرصت داده شده و سپس تزریقات به مدت بیست و هشت روز انجام خواهد شد. گروه ها شامل:

1. Y C: موش های گروه کنترل با سن 5-3 ماه هستند که هیچ دارویی دریافت نمی کنند.
2. YM: موش های جوان دست نخورده ای هستند که  به صورت روزانه، ماری جوانا (60mg/kg/i.p.) دریافت می کنند(22).
3. Y G1: موش های جوان دست نخورده ای هستند که با توجه به دوره ی چهار روزه ی سیکل جنسی ماده ها، هر چهار روز یکبار آگونیست استروژن (G1, 50µg/kg/i.p.) دریافت می کنند(23).
4.  Y G15: موش های جوان دست نخورده ای هستند که با توجه به دوره ی چهار روزه ی سیکل جنسی ماده ها، هر چهار روز یکبار آنتاگونیست استروژن (G15, 50µg/kg/i.p.) دریافت می کنند(23).
5.  Y M + G1: موش های جوان دست نخورده ای هستند که با توجه به دوره ی چهار روزه ی سیکل جنسی ماده ها، هر چهار روز یکبار آگونیست استروژن (G1, 50µg/kg/i.p.)  و نیز بصوت روزانه ماری جوانا (60 mg/kg/i.p.) دریافت می کنند. لازم به ذکر است که در روز دریافت هر دو دارو، ابتدا اگونیست و سپس با فاصله 30 دقیقه، ماری جوانا تزریق خواهد شد.
6.  Y M + G15 : موش های جوان دست نخورده ای هستند که هر چهار روز یکبار آنتاگونیست استروژن (G15, 50µg/kg/i.p.)  و نیز بصوت روزانه ماری جوانا (60 mg/kg/i.p.) دریافت می کنند. لازم به ذکر است که در روز دریافت هر دو دارو، ابتدا آنتاگونیست و سپس با فاصله 30 دقیقه، ماری جوانا تزریق خواهد شد.
7. Y  Vehicle M/G1/G15: موش های جوان دست نخورده ای هستند که روزانه به میزان هم حجم با تیمار(ماری جوانا/ G1/ G15، حلال آنها را (DMSO) دریافت می کنند(24).
8. Y VehicleM+G1/G15: موش های جوان دست نخورده ای هستند که روزانه به میزان هم حجم با ماری جوانا، حلال آن (DMSO) و هر چهار روز یکبارG1, 50µg/kg/ i.p.    دریافت می کنند.
9. Y VehicleM + G15: موش های جوان دست نخورده ای هستند که روزانه به میزان هم حجم با ماری جوانا، حلال آن (DMSO) و هر چهر روز یکبار(G15, 50µg/kg/ i.p.) دریافت می کنند.
10. Y VEH/VEH: موش های جوان دست نخورده ای هستند که به میزان هم حجم با دو دارو، حلال (DMSO) آن ها را دریافت می کنند.
11. OVX C : موش های گروه کنترل جوان فاقد تخمدان با سن 5-3  ماه هستند که هیچ دارویی دریافت نمی کنند.

11. OVX + M: موش های جوان فاقد تخمدانی هستند که بصورت روزانه ماری جوانا (60mg/kg/I.P.) دریافت می کنند.

12.OVX + E2: موش های جوان فاقد تخمدانی هستند که با توجه به دوره ی چهار روزه ی سیکل جنسی ماده ها، هر چهار روز یکبار استروژن (1mg/kg/i.p. ) دریافت می کنند(25).

13.OVX +M+E2: موش های جوان فاقد تخمدانی هستند که بصورت روزانه ماری جوانا (60 mg/kg/ i.p.) و  هر چهار روز یکبار(با فاصله زمانی 30 دقیقه) استروژن (1 mg/kg/ i.p.) دریافت می کنند.

14.OVX+G1: موش های جوان  فاقد تخمدانی هستند که با توجه به دوره ی چهار روزه ی سیکل جنسی ماده ها، هر چهار روز یکبار آگونیست استروژن (G1 50µg/kg/ i.p.) دریافت می کنند.

15.OVX+E2+G15: موش های جوان فاقد تخمدانی هستند که هر چهار روز یکبار استرادیول (1 mg/kg, i.p.) و آنتاگونیست آن (G15 50µg/kg, i.p.)  دریافت می کنند.

16.OVX +G1+M: : موش های جوان فاقد تخمدانی هستند که بصورت روزانه ماری جوانا (60mg/kg/i.p.)  و هر چهار روز یکبار آنتاگونیست استروژن (G15, 50µg/kg/4days, i.p.) دریافت می کنند. روز دریافت هر دو دارو ابتدا آنتاگونیست و سپس با فاصله زمانی 30دقیقه ماری جوانا دریافت خواد شد.

17.OVX+M+G15+E2: موش های جوان فاقد تخمدانی هستند که بصورت روزانه ماری جوانا (60mg/kg/i.p.) ، و  هرچهار روز یکبار استرادیول (1mg/kg/ i.p.) و نیز آنتاگونیست آن (G15 50µg/kg/4 days, i.p.)  دریافت می کنند. روز دریافت مشترک داروها،ابتدا آنتاگونیست و استرادیول و سپس با فاصله زمانی 30 دقیقه ماری جوانا تزریق خواهد شد.

 18.OVX Vehicle M/E2/G1/G15 : موش های جوان فاقد تخمدانی هستند که روزانه حلال ماری جوانا/ E2/G1/G15 (DMSO) به مقدار هم حجم با آن ها دریافت می کنند.

19. OVX Vehicle M+E2 /G1: موش های جوان فاقد تخمدانی هستند که روزانه حلال ماری جوانا(DMSO) به مقدار هم حجم با ماری جوانا دریافت می کنند و نیز هر چهار روز یکبار(G1 50µg/kg/i.p.) دریافت می کنند.

20 .OVX Vehicle E2+ G15: موش های جوان فاقد تخمدانی هستند که هر چهر روز یکبار حلال استروژن (DMSO) به مقدار هم حجم با استروژن دریافت می کنند و نیز هر چها روز یکبار(G15 50µg/kg/i.p) دریافت می کنند.

12. Vehicle M+G15+E2 OVX: موش های جوان فاقد تخمدانی هستند که روزانه حلال ماری جوانا(DMSO) به مقدار هم حجم با ماری جوانا دریافت می کنند و نیز هر چهار روز یکبار استرادیول (1 mg/kg, i.p.) و G15(50µg/kg) دریافت می کنند.

22. VEH/VEH: موش های جوان فاقد تخمدانی هستند که به میزان هم حجم با دو دارو، حلال (DMSO) آن ها را دریافت می کنند.

  23 .  Aged C : موش های گروه کنترل  مسن24-20  ماه هستند که هیچ دارویی دریافت نمی کنند.

24. Aged + M: موش های مسن هستند که بصورت روزانه ماری جوانا (60 mg/kg/i.p.) دریافت می کنند.

25.  Aged + E2 : موش های مسن هستند که  هر چهار روز یکبار استروژن (1mg/kg/i.p.) دریافت می کنند.(23)

26.Aged +M+E2 : موش های مسن هستند که روزانه ماری جوانا (60 mg/kg/i.p.) و هر چار روز یکبار استروژن (1 mg/kg/i.p.) دریافت می کنند.

27.Aged +G1 : موش های مسن هستند که هر چهار روز یکبار آگونیست استروژن (G1, 50µg/kg/i.p.) دریافت می کنند.

28.Aged +E2+G15 : موش های مسن هستند که هر چهار روز یکبار استرادیول (1mg/kg/i.p.) و نیز آنتاگونیست آن (G15, 50µg/kg/i.p.)  دریافت می کنند.

29.Aged +G1+M : : موش های مسن هستند که روزانه ماری جوانا (60mg/kg/i.p.)  و هر چار روز یکبار آگونیست استروژن (G1, 50µg/kg/i.p.) دریافت می کنند.

30.Aged +M+G15+E2: موش های مسن هستند که روزانه ماری جوانا (60mg/kg/i.p.)، و  هر چهار روز یکبار استرادیول (1mg/kg/i.p.) و نیز آنتاگونیست آن (G15, 50µg/kg/i.p.)  دریافت می کنند.

31.Aged Vehicle M/G1/G15/E2: موش های مسن هستند که روزانه حلال ماری جوانا/ G1/G15/E2 (DMSO) به مقدار هم حجم با آن ها دریافت می کنند.

32. Aged Vehicle M+ G1: موش های مسن هستند که روزانه حلال ماری جوانا(DMSO) به مقدار هم حجم با ماری جوانا دریافت می کنند و نیز هر چهار روز یکبار(G1 50µg/kg/i.p.) دریافت می کنند.

33.Aged Vehicle M+ G15: موش های مسن هستند که روزانه حلال ماری جوانا(DMSO) به مقدار هم حجم با ماری جوانا دریافت می کنند و نیز هر چهار روز یکبار (G15 50µg/kg/i.p) دریافت می کنند.

34. Vehicle M+E2 Aged: موش های جوان مسن هستند که روزانه حلال ماری جوانا(DMSO) به مقدار هم حجم با ماری جوانا دریافت می کنند و نیز هر چهار روز یکبار استرادیول (1 mg/kg, i.p.) دریافت می کنند.

35. Aged vehicle M+E2+G15: موش های مسن هستند که روزانه حلال ماری جوانا(DMSO) به مقدار هم حجم با ماری جوانا دریافت می کنند و نیز هر چهار روز یکبار استرادیول (1 mg/kg, i.p.) و G15(50µg/kg) دریافت می کنند.

36. VEH/VEH: موش های مسن هستند که به میزان هم حجم با دو دارو، حلال (DMSO) آن ها را دریافت می کنند.

روش بر داشتن تخمدان(Ovarectomy):

 جهت ایجاد بی هوشی، مخلوطی از داروهای کتامین(mg/kg50) و گزیلوزین (mg/kg5/4) به روش داخل صفاقی به حیوان تزریق می گردد. موهای قسمت تحتانی شکم تراشیده شده و برش افقی به طول 3-2 سانتی متر ایجاد می شود. سپس پوست، فاشیا و عضلات شکم را باز کرده و چربی ها و روده را کنار می زنیم تا رحم و لوله های آن دیده شوند. لوله رحم و پایه عروقی تخمدان با نخ کاتگوت 0/4 در ناحیه پروگزیمال مسدود شده و از ناحیه دیستال قطع می شوند. همین عمل در مورد تخمدان دیگر نیز تکرار می شود. در انتها 2-1میلی لیتر محلول سرم فیزیولوژیک داخل شکم ریخته و عضلات و پوست به ترتیب با نخ های کاتگوت و سیلک 0/2 به روش پیوسته بخیه می گردند. محل زخم را با بتادین ضد عفونی می کنیم و حیوانات تا دو ساعت تحت مراقبت ویژه قرار می گیرند. با برداشتن تخمدان حالت مشابه با یائسگی در انسان ایجاد می کنیم. به منظور اطمینان از حذف اثرات استروژن و پروژسترون با منشأ داخلی، حیوانات در تمام گروه های ذکر شده، دو هفته بعد از اوارکتومی مورد آزمایش قرار می گیرند (26)

1.   سنجش حافظه و یادگیری فضایی با استفاده از تست WATER MAZE:

ماز آبی موریس: این تست معمولا به نام ماز آبی موریس شناخته می شود. چون ریچارد موریس این تست را برای ترسیم جهت گیری فضایی در  موشهای صحرایی توسعه داد(15).

ماز آبی موریس حوضچه دایره ای شکل تیره رنگی به قطر 160 سانتی متر و ارتفاع 60 سانتی متر است که تا ارتفاع 35 سانتی متر  با آب با دمای 2±25 پر می شود. این حوضچه به لحاظ جغرافیایی به 4 ربع دایره مساوی شمال، جنوب، غرب و شرق تقسیم می شود و در هر ربع دایره یک نقطه برای رها کردن حیوان در آب در نظر گرفته شده است. یک سکو به قطر 10 سانتی متر در مرکز ربع دایره چهار، 1.5 سانتی متر در زیر سطح آب و بصورت غیر قابل روئیت قرار دارد. بر روی دیوارهای اتاق در اطراف ماز سرنخهای فضایی (Spatial cues) که اشکال هندسی متفاوت هستند، نصب می شود. عملکرد حیوان از طریق یک دوربین مداربسته که متصل به سقف بالای ماز است به کامپیوتر و نرم افزار مربوطه منتقل شده تا پارامترهای لازم ازجمله زمان و مسافت طی شده تا یافتن سکو و همچنین سرعت حرکت حیوان ثبت شود(14).

پروسه رفتاری:

          1-خو گرفتن:  قبل از تمرین جهت یابی،حیوانات،به محیط استخر شنا عادت داده می شوند. آنها را بصورت تک تک بر روی یک سکو به مدت 20 ثانیه و به مدت 180 ثانیه در استخر قرار میدهند و اجازه می دهند که شنا کنند.

2-کارآزمایی آموزشی:در تمرین جهت یابی،موش ها آموزش داده می شوند که به وسیله بالا رفتن از سکوی پنهان،از غرق شدنشان جلوگیری کنند.به آنها اجازه داده می شود که حداکثر مدت زمان کارازمایی یعنی 90 ثانیه را شنا کنند و به مدت 30 ثانیه بر روی سکو قرار بگیرند(تقویت)،اگر که خودشان قادر به پیدا کردن آن نباشند.

به موشها،4 کارآزمایی در هر روزبه مدت 4 روز متوالی داده می شود.در هر کارازمایی،موش به آرامی بر روی ماز آبی موریس،در وسط لبه مدور یکی از ربع هایی که بصورت تصادفی انتخاب شده است قرار می گیرد به نحوی که پوزه موش به سمت دیوار باشد. هر دوره آموزش شامل 4 کارآزمایی با یک وقفه 60 ثانیه ای بین هر کارآزمایی می باشد و به طور معمول، بین ساعت 10 صبح تا 5 بعد از ظهرانجام میشود. وقفه بین هر دوره 2 ساعت میباشد.

میانگین Escape latency (مدت زمانی که موش برای پیدا کردن و رفتن به روی سکو نیاز دارد) برای هر کارآزمایی ثبت می شود.

4 کارآزمایی در هر آموزش روزانه نیز ثبت می شود. اگر موش در مدت زمان تست قادر به پیدا کردن سکو نباشد یا کمتر از 3 ثانیه بر روی سکو بایستد، نمره لتنسی 120 ثانیه را به آن می دهیم.پس از اتمام آموزش،حیوانات به قفس برگردانده می شوند تا زمان تست یادسپاری یا کارازمایی پروب که 24 ساعت بعد است.

3-تست یادسپاری یا کارآزمایی پروب:تست پروب 24 ساعت بعد از آخرین کارآزمایی روز چهارم انجام میشود.در تست پروب، سکو از داخل استخر برداشته می شود و هر موش از ربع مخالف به داخل استخر رها میشود.کارآزمایی پروب شامل دوره 60 ثانیه ای شنای آزاد بدون سکو و مدت زمانی که موش در ربع هدف شنا میکند و ثبت می شود، می باشد.میزان رفت و آمد به trigger zone   و سرعت شنای موش ها نیز ثبت می شود(15). لازم به ذکر است که در مطالعه حاضر ما این آزمون را در دونوبت انجام خواهیم داد، نوبت اول قبل از شروع تزریق دارو و نوبت دوم بعد از 28 روز تزریق دارو انجام خواهد شد.

 اندازه گیری میزان پروتئین GPR30: در ابتدا نمونه های هیپوکمپی که برداشت شده است، در بافر هموژن (500μL Hcl-Tris ،PH=8 ، 0.003گرم EDTA،0.08 گرم Nacl، 0.025 گرمsodium Deoxycholate، 0.01گرم SDS) هموژنیزه می شوند. برای هموژن کردن بافت، به اندازه چهار الی پنج برابر وزن نمونه ها بافر لیزکننده ریخته  می شود و با هموژنایزر  با دور 3000rpm به مدت دو زمان 30 ثانیه ای با فاصله زمانی 5 دقیقه ای بین دفعات برای جلوگیری از گرم شدن و دناتوره شدن پروتئین، هموژن می شود. سپس بافت هموژن شده به مدت 10 دقیقه در دمای 4 +درجه سانتی گراد و در دور rpm 3600 سانتریفیوژ می گردد. سوپرناتانت محلول، جدا و در فریزر 80º نگهداری می شود. جهت تعیین غلظت پروتئین از روش برد فورد استفاده و با استفاده از منحنی استاندارد، غلظت مناسب پروتئین نمونه محاسبه می گردد. μg20 از هر نمونه برای انجام آزمایش وسترن بلات مورد استفاده قرار می گیرد. برای انجام تست وسترن بلات مقادیر مساوی از پروتئین توسط ژل پلی آکربل آمید –SDS PAGE %جداسازی می شود. بعد از مرحله الکتروفورز، مدت یک ساعت و نیم در محلول بلاکینگ قرار می گیرد. پروتئین های ژل به کاغذ PVDF منتقل شده و کاغذ به سپس کاغذ یک شب در آنتی بادی اولیه شرکت abcam (در 4 درجه سانتی گراد قرار داده می شود و در روز دوم 3 بار با محلول TBST شستشو داده شد و کاغذ به مدت یک ساعت و نیم با آنتی بادی ثانویه انکوبه می شود. بعد از این مرحله بلاتها را با کیت ECL پوشانده و با استفاده از فیلم رادیولوژی ظاهر می شوند. سپس بلاتها را در بافر استریپینگ شستشو داده و آنتی بادی اولیه ساخت شرکت abcam (را به روی کاغذ گذاشته و دوباره با آنتی بادی ثانویه انکوبه و پروتئین مورد نظر در فیلم رادیولوژی ظاهر می شود. سپس بلاتها را دوباره در بافر استریپینگ شستشو داده و آنتی بادی بتا اکتین را به روی کاغذ گذاشته و دوباره با آنتی بادی ثانویه انکوبه و بتااکتین نیز در فیلم رادیولوژی ظاهر می شود. توسط برنامه  J Imageباندهای بدست آمده دانسیتومتری می شوند. (27).

2.  اندازه گیری مقدارBDNF:

برای اندازه گیری شاخص های فوق در مغز، ابتدا بافت هیپوکمپ هموژن می گردد. هموژناسیون در بافر سرد و روی یخ انجام می گیرد. بافت هموژن شده سانتریفیوژ می شود و سپس سوپرناتانت برداشته می شود با استفاده از کیت های مربوطه به روش الایزا اندازه گیری ها انجام می شود.(28)

همچنین مقدار هورمون استروژن خون همه گروهها نیز اندازه گیری خواهد شد.

جهت محاسبات آماری از نرم افزار SPSS نسخه 18 استفاده خواهد شد. با توجه به تعدد اهداف ویژه، جهت مقایسه متغیرها بسته به نوع مقایسه از آزمون تحلیل واریانس(یک سویهone-way، دو سویهTwo-Way و یا بعد بالاتر ) ,آنالیز واریانس برای داده های تکراری (و یا در صورت لزوم معادل ناپارامتری آنها) استفاده خواهد شد. سطح معنی داری p<0.05 در نظر گرفته خواهدشد.

به منظور رعایت ملاحظات اخلاقی و جلوگیری از زجر حیوان، تمامی آنها قبل از انجام اعمال جراحی بیهوش خواهند شد و سعی می شود در حین کار با حیوانات همه اصول مطرح شده راجع به اخلاق پژوهش های حیوانی رعایت شود و مجوز کمیته اخلاق پزشکی دانشگاه برای کار روی حیوان ها اخذ می گردد.

تصویب بموقع طرح  و اجرای مراحل بعدی و تامین به موقع هزینه های جاری و نیز در صورت تهیه مواد لازم و کارایی مطلوب دستگاههای آزمایشگاهی مورد نیاز تصور می شود که طرح در زمان پیش بینی شده به پایان خواهد رسید. به دلیل احتمال مرگ و میر ،تعداد حیوانات بیشتری جهت انجام این مطالعه در نظر گرفته می شود.

ماری جوانا- استروژن- سن- حافظه و یادگیری- BDNF-GPR30

1.         Wimo A, Jonsson L, Winblad B. An estimate of the worldwide prevalence and direct costs of dementia in 2003. Dementia and geriatric cognitive disorders. 2006;21(3):175-81.

2.         Jahn H. Memory loss in Alzheimer's disease. Dialogues in Clinical Neuroscien. 2013;15(4):445-54.

3.         Srivastava D, Woolfrey K, Evans P. Mechanisms underlying the interactions between rapid estrogenic and BDNF control of synaptic connectivity. Neuroscience. 2013;239:17-33.

4.         Luine VN. Estradiol and cognitive function: past, present and future. Hormones and behavior. 2014;66(4):602-18.

5.         Crane NA, Schuster RM, Fusar-Poli P, Gonzalez R. Effects of cannabis on neurocognitive functioning: recent advances, neurodevelopmental influences, and sex differences. Neuropsychology review. 2013;23(2):117-37.

6.         Trezza V, Campolongo P, Cassano T, Macheda T, Dipasquale P, Carratu MR, et al. Effects of perinatal exposure to delta-9-tetrahydrocannabinol on the emotional reactivity of the offspring: a longitudinal behavioral study in Wistar rats. Psychopharmacology (Berl). 2008;198(4):529-37.

7.         Lichtman AH, Dimen KR, Martin BR. Systemic or intrahippocampal cannabinoid administration impairs spatial memory in rats. Psychopharmacology. 1995;119(3):282-90.

8.         Cha YM, White AM, Kuhn CM, Wilson WA, Swartzwelder H. Differential effects of delta9-THC on learning in adolescent and adult rats. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 2006;83(3):448-55.

9.         Luine VN, Frankfurt M. Estrogens facilitate memory processing through membrane mediated mechanisms and alterations in spine density. Frontiers in neuroendocrinology. 2012;33(4):388-402.

10.       Alexander A, Irving AJ, Harvey J. Emerging roles for the novel estrogen-sensing receptor GPER1 in the CNS. Neuropharmacology. 2017;113:652-60.

11.       Bean LA, Ianov L, Foster TC. Estrogen receptors, the hippocampus, and memory. The Neuroscientist. 2014;20(5):534-45.

12.       Gorzalka BB, Dang SS. Minireview: Endocannabinoids and gonadal hormones: bidirectional interactions in physiology and behavior. Endocrinology.     2012;153(3):1016-24.

13.       Marsicano G, Lafenêtre P. Roles of the endocannabinoid system in learning and memory.  Behavioral Neurobiology of the Endocannabinoid System: Springer; 2009. p. 201-30.

14.       Fattore L, Fratta W. How important are sex differences in cannabinoid action? British journal of pharmacology. 2010;160(3):544-8.

15.       Riebe CJ, Hill MN, Lee TT, Hillard CJ, Gorzalka BB. Estrogenic regulation of limbic cannabinoid receptor binding. Psychoneuroendocrinology. 2010;35(8):1265-9.

16.       Daniel JM, Winsauer PJ, Brauner IN, Moerschbaecher JM. Estrogen improves response accuracy and attenuates the disruptive effects of Δ⁹-THC in ovariectomized rats responding under a multiple schedule of repeated acquisition and performance. Behavioral neuroscience. 2002;116(6):989.

17.       Phillips C. Brain-derived neurotrophic factor, depression, and physical activity: making the neuroplastic connection. Neural plasticity. 2017;20:1-17.

18.       Petzold A, Psotta L, Brigadski T, Endres T, Lessmann V. Chronic BDNF deficiency leads to an age-dependent impairment in spatial learning. Neurobiology of learning and memory. 2015;120:52-60.

19.       Suliman NA, Taib CNM, Moklas MAM, Basir R. Delta-9-Tetrahydrocannabinol (∆ 9-THC) Induce Neurogenesis and Improve Cognitive Performances of Male Sprague Dawley Rats. Neurotoxicity research. 2018;33(2):402-11.

20.       Hill R. Interaction of Sex Steroid Hormones and Brain‐Derived Neurotrophic Factor‐Tyrosine Kinase B Signalling: Relevance to Schizophrenia and Depression. Journal of neuroendocrinology. 2012;24(12):1553-61.

21.       Barrientos RM, Kitt MM, D'Angelo HM, Watkins LR, Rudy JW, Maier SF. Stable, long-term, spatial memory in young and aged rats achieved with a one day Morris water maze training protocol. Learning & Memory. 2016;23(12):699-702.

22.       Schoeler T, Bhattacharyya S. The effect of cannabis use on memory function: an update. Substance abuse and rehabilitation. 2013;4:11.

23.       Kang S, Liu Y, Sun D, Zhou C, Liu A, Xu C, et al. Chronic activation of the G protein-coupled receptor 30 with agonist G-1 attenuates heart failure. PLoS One. 2012;7(10):e48185.

24.       Zgair A, Lee JB, Wong JC, Taha DA, Aram J, Di Virgilio D, et al. Oral administration of cannabis with lipids leads to high levels of cannabinoids in the intestinal lymphatic system and prominent immunomodulation. Scientific Reports. 2017;7(1):14542.

25.       Khaksari M SZ, Shahrokhi N, Moshtaghi G, Asadikaram G. The role of estrogen and progesterone, administered alone and in combination, in modulating cytokine concentration following traumatic brain injury. . Canadian journal of physiology and pharmacology. 2010;89(1):31-40.

26.       Davis AM, Ellersieck MR, Grimm KM, Rosenfeld CS. The effects of the selective estrogen receptor modulators, methyl‐piperidino‐pyrazole (MPP), and raloxifene in normal and cancerous endometrial cell lines and in the murine uterus. Molecular reproduction and development. 2006;73(8):1034-44.

27.       Kitazawa T, Tsujimoto T, Kawaratani H, Fujimoto M, Fukui H. Expression of Toll‐like receptor 4 in various organs in rats with d‐galactosamine‐induced acute hepatic failure. Journal of gastroenterology and hepatology. 2008;23(8pt2).

28.       De Azua SR, Matute C, Stertz L, Mosquera F, Palomino A, De la Rosa I, et al. Plasma brain-derived neurotrophic factor levels, learning capacity and cognition in patients with first episode psychosis. BMC psychiatry. 2013;13(1):27.

ندارد.