مقایسه ی میزان بیان ایمونوهیستوشیمی مارکر CD34 در پریودنتیت مزمن و مهاجم

بیماری­های پریودنتال به شرایطی گفته می­شود که در آن لثه­ها و سایر ساختارهای نگهدارنده دندان‌ها مبتلا و درگیر می‌شوند. بیماری‌های پریودنتال دودسته‌اند:ژنژیویت و پریودنتیت.ژنژیویت یا التهاب لثه که خفیف‌ترین حالت بیماری پریودنتال است به حالتی گفته می‌شود که پلاک‌های دندانی در خط لثه تجمع پیدا می‌کند و باعث تحریک لثه و حساس شدن آن می‌شود.لثه‌ها متورم و قرمزرنگ می‌شوند که گاهی خونریزی هم می‌کنند.پریودنتیت عفونت جدی لثه است که به بافت‌های نرم آسیب می‌زند و استخوان حمایت‌کننده دندان را از بین می‌برد.^(1و2)پریودنتیت به انواع مزمن،مهاجم،پریودنتیت به‌عنوان تظاهری از بیماری سیستمیک و پریودنتیت نکروزان طبقه‌بندی می‌شود.پریودنتیت نکروزان شکلی از بیماری است که به‌سرعت پیشرفت می‌کند و شامل دو نوع زخمی (Necrotizing ulcerative gingivitis(Nug)) و نکروزه (Necrotizing ulcerative periodontitis(Nup) ) می‌باشد. پریودنتیت ناشی از شرایط سیستمیک بدن؛نشانه‌ای حاکی از وجود یک بیماری سیستمیک است. این نوع پریودنتیت بسته به نوع شرایط پزشکی بیمار در شکل‌های مختلف ظاهر می‌شود⁽³⁾. پریودنتیت مزمن شکل رایج بیماری پریودنتیت است که ریسک فاکتورها برای این بیماری عبارت‌اند از افزایش سن،سیگار کشیدن،عود کردن عفونت،دیابت و دیگر شرایط سیستمیک.⁽⁴⁾معمولا در افراد مبتلا به این بیماری لثه‌ها از دندان‌ها فاصله گرفته و حفره‌هایی به نام پاکت بین دندان‌ها و لثه‌ها شکل می‌گیرد و پلاک‌های دندانی در پاکت‌ها نیز تشکیل می‌شوند و سرانجام لیگامان­ها و استخوان آلوئول اطراف دندان‌ها تخریب می‌شوند و در موارد شدید دندان لق شده و می‌افتد.⁽⁵⁾پریودنتیت مهاجم که تحت عنوان پریودنتیت با شروع زودرس خوانده می‌شود شامل گروهی از پریودنتیت­های نادر، اغلب شدید و با پیشرفت سریع می‌باشد که معمولا در افراد سالم در زمان بلوغ یا پس از آن در دهه‌ی دوم و سوم دیده می‌شود و عمدتا باعث تخریب سریع بافت پریودنتال و استخوان آلوئولار در جوانان می‌شود.پریودنتیت مهاجم شامل برهم خوردن تعادل بین میکروارگانیسم‌های مختلف و سیستم ایمنی میزبان است.تشخیص زودهنگام برای درمان بیماری پریودنتیت مهاجم موفقیت‌آمیز خواهد بود. به‌عبارتی‌دیگر تأخیر در درمان باعث از دست دادن دندان می‌شود.⁽⁶⁾پریودنتیت مهاجم سریع‌تر از بیماری پریودنتیت مزمن پیشرفت می‌کند.این بیماری در اعضای خانواده دیده می‌شود و طی تحقیقات به‌عمل‌آمده این بیماری به‌صورت موروثی انتقال‌یافته و ژنتیک در بروز آن عامل خطر مهمی به‌حساب می‌آید.در مصرف‌کنندگان دخانیات هم بیشتر دیده می‌شود.درمان این بیماری همانند پریودنتیت مزمن بوده و نیاز به آنتی‌بیوتیک و جراحی دارد.در این بیماران باوجود درمان عارضه (پریودنتیت مهاجم) بهبود نمی‌یابد.⁽⁴⁾آنژیوژنز (تشکیل عروق خونی جدید) تحت شرایط فیزیولوژیکی و پاتولوژیک رخ می‌دهد و تحت تأثیر متقابل سیتوکین های متعدد و عوامل رشد قرار می‌گیرد.پریودونتیت یک بیماری التهابی مزمن با دوره‌های تخریب فعال و خفیف است.با این‌حال پاسخ افراد به التهاب مزمن لثه متفاوت است.بعضی از آن‌ها به‌شدت حساس به بیماری سریع پیشرونده هستند و برخی دیگر که دارای التهاب پریودنتال مشابه هستند، نسبت به بیماری مخرب مقاوم‌تر هستند.آنژیوژنز یکی از ویژگی‌های برجسته هم التهاب و هم بهبود است،اما نقش آنژیوژنز در ترویج پیشرفت یا بهبودی ضایعات پریودنتال مشخص نیست⁽⁷⁾.CD₃₄ یک گلیکوپروتئین تک‌واحدی داخل غشایی نوع 1 با وزن مولکولی حدود 110 کیلو دالتون است.⁽⁸⁾این مولکول در سلول‌های مختلفی ازجمله در پیش­ساز سلول‌های خونی و سلول‌های دیگر مثل سلول‌های اندوتلیال، ماست سل‌ها و برخی سلول‌های عصبی جنینی و بزرگسال، روده، بافت چربی و تومورها با منشأ اپیتلیال جنینی بیان می‌شود.⁽⁹⁾مارکر CD₃₄ فاکتوری برای ارزیابی عروقی و بررسی میزان آنژیوژنژ است و کاربرد آن شامل شناسایی سلول‌های اندوتلیال می‌باشد.⁽⁶⁾طبق تحقیقات انکوتا ⁽⁹⁾و همکارانش بر روی 61 نمونه خانم دارای بیماری سرطان دهانه رحم به این نتیجه رسیدند آنژیوژنز برای هدایت تکامل و پیش‌آگهی سرطان بخصوص در انواع تهاجمی ضروری است.⁽⁹⁾همچنین الدونا کاسپارزاک⁽⁶⁾و همکارانش با مطالعه روی 40 نفر با بیماری پریودنتیت مزمن و 15 نفر سالم از نظر بیماری های پریودنتال افزایش فاکتورهای تحریک‌کننده آنژیوژنز را در پریودنتیت مزمن نشان دادند. علاوه بر این دریافتند بیان بیش‌ازحد عوامل مرتبط با آنژیوژنز در پریودنتیت مزمن نشان‌دهنده اهمیت آنژیوِزنز در فرآیندهای التهابی و یا تشدیدهای دوره‌ای از روند تخریب پریودنشیوم است.⁽⁶⁾تحقیقات آرتز لوسیانو و همکارانش(12) روی 14 نفر بیمار پریودنتیت مزمن و 6 نفر پریودنتیت مهاجم و 7 نفر دارای سلامت بافت های پریودنتال بیان بالاتر نشانگرهای آنژیوژنز در پریودنتیت مهاجم نسبت به پریودنتیت مزمن و افراد سالم رانشان دادند.⁽¹²⁾حال با توجه به اهمیت میزان آنژیوژنژ در هدایت تکامل بدخیمی ⁽⁹⁾و با توجه به وجود مطالعات متناقض در مورد میزان آنژیوژنز در پریودنتیت مزمن و مهاجم ^(6,12) سعی بر آن داریم تا با تعیین میزان بیان مارکر CD₃₄ دردو بیماری فوق بتوانیم میزان آنژیوژنز ودر نتیجه احتمال پیشرفت به سمت بدخیمی هرکدام از ضایعات را بررسی کنیم.

1-توزیع فراوانی بیان مارکر CD₃₄ در بیماری پریودنتیت مزمن چقدر است؟

2-توزیع فراوانی بیان مارکر CD₃₄ در بیماری پریودنتیت مهاجم چقدر است؟

3-توزیع فراوانی بیان مارکر CD34 در بیماری پریودنتیت مزمن و مهاجم متفاوت است.

مقایسه میزان بیان مارکر CD₃₄ در بیماری پریودنتیت مزمن و مهاجم

1-تعیین فراوانی بیان مارکر CD₃₄ در بیماری پریودنتیت مزمن

2-تعیین فراوانی بیان مارکر CD₃₄ در بیماری پریودنتیت مهاجم

3-مقایسه فراوانی بیان مارکر CD₃₄ در پریودنتیت مزمن و مهاجم

دانشکده دندانپزشکی، بخش پریودانتیکس و بیماری‌های دهان

ایمونوهیستوشیمی(IHC): فرایندی برای مکان‌یابی پروتئین‌ها در سلول‌های یک بافت  است.در این روش با استفاده از آنتی‌بادی‌های مونوکلونال،آنتی‌ژن‌های سلول‌ها شناسایی می‌شود.این یک روش مکمل رایج در پاتولوژی جهت تشخیص مورفولوژی،تحقیقات پاتولوژی و مطالعه فرایند پاتوژنز بیماری­ها می­باشد.(10)

مارکر CD34:یک گلیکوپروتئین تک‌واحدی داخل غشایی نوع 1 با وزن مولکولی حدود 110 کیلو دالتون است.⁽⁸⁾این مولکول در سلول‌های مختلفی ازجمله در پیش ساز سلول‌های خونی و سلول‌های دیگر مثل سلول‌های اندوتلیال، ماست سل‌ها و برخی سلول‌های عصبی جنینی و بزرگسال،روده،بافت چربی و تومورها با منشأ اپیتلیال جنینی بیان می‌شود.⁽⁹⁾ مارکر CD₃₄ فاکتوری برای ارزیابی عروقی و بررسی میزان آنژیوژنز است و کاربرد آن شامل شناسایی سلول‌های اندوتلیال می‌باشد.⁽⁶⁾

توصیفی تحلیلی

بیماران مراجعه‌کننده به بخش پریودانتیکس دانشکده‌ی دندان‌پزشکی زاهدان که در بین سال‌های 1397-98مبتلا به بیماری پریودنتیت مزمن و مهاجم می‌باشند و دارای معیارهای ورود و فاقد معیارهای خروج ⁽¹¹⁾باشند انتخاب خواهند شد.

معیارهای ورود به گروه مطالعه:

-همه افراد موافق شرکت در طرح مطالعه باشند.

-محدوده‌ی سنی بین 20 تا 50 سال

-تشخیص بالینی پریودنتیت مهاجم یا مزمن بیمار و تأیید توسط متخصص پریودنتیکس

-عدم ابتلا به سایر بیماری‌های پریودنتال

-عدم ابتلا به بیماری‌های سیستمیک مؤثر بر لثه، بزاق، بافت‌های پریودنتال یا زروستومیا

-نداشتن سابقه دریافت درمان‌های پریودنتال یا آنتی‌بیوتیک در 6 ماه گذشته

-وجود حداقل 20 دندان در سیستم دندانی

-عدم سابقه‌ی شیمی‌درمانی و رادیوتراپی

-خانم­هایی که در دوران بارداری، یائسگی، یا شیردهی نباشند.

-عدم وجود ضایعه  در حفره دهان و بافت کراتینیزه با عرض بیشتر از 4 میلی‌متر

معیارهای  ورود به گروه پریودنتیت مهاجم:

-سن زیر 35 سال

-حداقل یک دندان مولر اول و یک دندان دیگر با حداقل یک ناحیه با عمق پروب (PD)،به همراه از دست دادن اتصال کلیکی (CAL) بالای 5 میلی‌متر و خونریزی حین پروب (Bop)

-سابقه‌ی فامیلی (حداقل یکی دیگر از اعضای خانواده مبتلا به بیماری پریودنتال باشد یا سابقه بیماری پریودنتال داشته باشد)

معیارهای ورود به گروه پریودنتیت مزمن:

-سن بالای 35 سال

-حداقل 6 دندان به همراه حداقل یک ناحیه با  PD یا CAL بالای 5 میلی‌متر

-حداقل 30% نواحی با  PD یا  CAL بالای 4 میلی‌متر به همراه خونریزی حین پروب کردن

معیارهای ورود به گروه کنترل:

-سن بالای 18 سال

-هیچ ناحیه­ای با PD  یا CAL بالای 3 میلی‌متر نباشد.

-کمتر از 70% نواحی  خونریزی  لثه­ای داشته و یا خونریزی حین پروب کردن داشته باشد.

معیارهای خروج:

-سیگار کشیدن

-بیماری‌های سیستمیکی که می‌تواند بر روی پیشرفت بیماری پریودنتال اثر بگذارد(مثل دیابت،اختلالات سیستم ایمنی)

-مصرف طولانی‌مدت داروهای ضدالتهاب

-مصرف بیش‌ازحد الکل

-عدم رضایت افراد جهت شرکت در مطالعه

 با استفاده از مطالعات  Lucianoو همکارانش و همچنین فرمول زیر و با توجه به محدودیت در زمان و تعداد بیماران مراجعه‌کننده به تعداد 15 نفر برای پریودونتیت مزمن و 15 نفر برای بیماری پریودونتیت مهاجم و 15 نمونه از بیماران که جهت جراحی افزایش طول تاج کلینیکی مراجعه نموده‌اند نیز به‌عنوان سالم در نظر گرفته خواهند شد و موردبررسی قرار خواهند گرفت.⁽¹¹⁾

                ⁿ⁼  

      
             α = 0.05 è                                                                                             
              β = 0.05 è                                                                                           

n=15

از بین مراجعه‌کنندگان بخش پریودانتیکس کسانی که نیاز به جراحی جهت پریودنتیت مزمن و مهاجم و افزایش طول تاج کلینیکی داشتند،نمونه‌ها انتخاب‌شده تا نمونه‌ها تکمیل شوند.

(فرم اطلاعاتی ضمیمه شماره 1)

از تمام بیماران مراجعه‌کننده به بخش پریودانتیکس بین سال‌های 98-1397 پس از دریافت رضایت آگاهانه (فرم ضمیمه شماره 2)،بیماران توسط دانشجوی دندانپزشکی سال آخر تحت معاینه پریودنتال قرارخواهندگرفت عمق پاکت توسط پروب ویلیامز در 6 ناحیه هر دندان اندازه‌گیری خواهد شد و در چارت پریودنتال(فرم ضمیمه شماره 1)ثبت خواهد گردید.بیماران بر اساس تشخیص متخصص پریودانتیکس در دو گروه پریودنتیت مهاجم و مزمن تقسیم‌شده و سپس نمونه‌های بافتی حین جراحی پریودنتال بیماران به بخش پاتولوژی ارسال خواهد شد و نمونه‌های بیمارانی که جهت جراحی افزایش طول تاج کلینیکی مراجعه نموده‌اند نیز به‌عنوان نمونه کنترل وارد مطالعه خواهد شد و به بخش پاتولوژی ارجاع داده خواهد شد و پس از فیکساسیون برش‌های 4-5 میکرونی تهیه‌شده و نمونه‌ها برای مارکر CD₃₄ با تکنیک ایمونوهیستوشیمی رنگ‌آمیزی خواهند شد. سپس نمونه‌ها توسط میکروسکوپ نوری بازبینی‌شده و در 10HPF تعداد سلول‌های اندوتلیال رنگ گرفته‌شده شمرده خواهند شد و به شرح زیر ارزیابی می‌شوند.

1-منفی:تعداد سلول‌های اندوتلیال رنگ گرفته‌شده کمتر از 5%

2-مثبت:تعداد سلول‌های اندوتلیال رنگ گرفته بین 5-10%

3- ++:تعداد سلول‌های اندوتلیال رنگ گرفته بالاتر از 10%

در این مطالعه ابتدا داده‌ها وارد نرم‌افزار SPSS شماره 20 می‌شوند سپس جهت مقایسه بیان CD₃₄ در دو گروه پریودنتیت مزمن و پریودنتیت مهاجم از آزمون کای_ دو استفاده خواهد شد

_ جدول (2) توزیع فراوانی CD₃₄ در گروه‌های موردمطالعه

کدهای 11، 13، 14، 15، 16، 18، 25، 27، 28، 30 از دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش‌های علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی.

کدهای 1، 2، 3، 5، 6، 7، 8، 12 از قسمت راهنمای عمومی دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش بررسی عضو و بافت انسانی و کدهای 1، 2، 3، 4، 5 از فصل 4 زیست بانک‌ها از دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش بررسی عضو و بافت انسانی.

محدودیت در تعداد نمونه‌ها و یکی از مشکلات انجام پایان‌نامه می‌باشد که با کمک گرفتن از سایر همکاران بخش پریودانتیکس سعی در رفع آن داریم.

پریودنتیت مهاجم، پریودنتیت مزمن، CD₃₄،chronic periodontitis،aggressive periodontitis

1. Shaddox LM,Mullersman AF,Huang H,Wallet SM,Langaee T,Aukhil I. Epigenetic regulation of inflammation in localized aggressive periodontitis.J Clin Epigenet.2017 Dec;9(1):94.
2. Ali J,Pramod K,Tahir MA,Ansari SH.Autoimmune responses in periodontal diseases.Autoimmun Rev.2011 May 1;10(7):426-31.
3. Wiebe CB,Putnins EE.The periodontal disease classification system of the American Academy of Periodontology-an update.J Can Dent Assoc.2000 Dec; 66(11):594-9.
4. Kaneko K,Matsuda S,Muraoka R,Nakano K,Iwasaki T,Tomida M,et al. Histological evaluation of periodontal ligament in response to orthodontic mechanical stress in mice.Int  J  Med Sci.2015;12(9):689.
5. Sadeghi R.Prevalence of aggressive periodontitis in 15-18 year old school-children in Tehran,Iran.Community Dent Health.2010 Mar;27(1):57-9.
6. Kasprzak A,Surdacka A,Tomczak M,Przybyszewska W,Seraszek-Jaros A, Malkowska-Lanzafame A,Siodla E,Kaczmarek E.Expression of angiogenesis-stimulating factors (VEGF,CD31,CD105) and angiogenetic index in gingivae of patients with chronic periodontitis.Folia Histochem Cytobiol.2012; 50(4):554-64.
7. Booth V,Young S,Cruchley A,Taichman NS, Paleolog E.Vascular endothelial growth factor in human periodontal disease.J Periodontal Res.1998 Nov; 33(8):491-9.
8. Pisacane AM,Picciotto F,Risio M.CD31 and CD34 expression as immunohistochemical markers of endothelial transdifferentiation in human cutaneous melanoma. Anal Cell Pathol.2007;29(1):59-66.
9. Ancuţa CO,Ancuţa E,Zugun-Eloae F,Carasevici E.Neoangiogenesis in cervical cancer:focus on CD34 assessment.Rom J Morphol Embryol.2010; 51(2):289-94.
10. Rajabi-Moghaddam M,Abbaszadeh-Bidokhty H, Bijani A.Comparison of mast cell count in odontogenic cysts using histochemical staining.Iran J Pathol. 2015;10(2):105
11. Luciano A,Maciej J,Adriano P,Daniel S,Marccelo F,Tatiana O,et    al. Immunohistochemical analysis of inflammatory infiltrate in aggressive and chronic periodontitis:a comparative study.Clin Oral Invest.2011;(15):233-240.     
12. Artese L,Piattelli A,de Gouveia Cardoso LA,Ferrari DS,Onuma T,Piccirilli M,et al.Immunoexpression of angiogenesis,nitric oxide synthase,and proliferation markers in gingival samples of patients with aggressive and chronic periodontitis. Journal of periodontology. 2010;81(5):718-26.

در این مطالعه با جمع‌آوری نمونه‌ی بیوپسی از بیماران پریودنتیت مزمن و پریودنتیت مهاجم و تهیه‌ی لام ایمونوهیستوشیمی سعی در بررسی پدیده‌ی آنژیوژنز در این بیماران از طریق شمارش مارکر CD₃₄ داریم.

ندارد.

آنژیوژنز (تشکیل عروق خونی جدید) تحت شرایط فیزیولوژیکی و پاتولوژیک رخ می‌دهد و تحت تأثیر متقابل سیتوکین های متعدد و عوامل رشد قرار می‌گیرد. ازآنجایی‌که نقش آنژیوژنز در ترویج پیشرفت یا بهبودی ضایعات پریودنتال مشخص نیست در این مطالعه با بررسی میزان بیان CD₃₄ در دو گروه بیماری پریودنتیت مزمن و مهاجم سعی در بررسی میزان آنژیوژنز ضایعات فوق داریم.

ندارد.

ندارد.

در این طرح هزینه کلیه اقدامات شخصی بیماران بر عهده مجری طرح خواهد بود و بیمار هزینه‌ای را پرداخت نخواهد کرد.

ندارد.

نتایج آزمایش‌ها و روش‌های به‌کاررفته به اطلاع بیمار خواهد رسید و این نتایج به‌صورت کاملاً محرمانه و صرفاً جهت مقاصد پژوهش به کار خواهد رفت و هویت بیماری وی در چارچوب قانون و جامعه و خانواده محرمانه خواهد ماند.

مجری موظف است پاسخگوی کلیه پرسش ها باشد. 

شرکت من در مطالعه کاملاً اختیاری است و آزاد خواهم بود که از شرکت در مطالعه امتناع نموده یا هر زمان که مایل بودم بدون آنکه تغییری در نحوه رفتار پزشک درمانگر یا نحوه درمان و مراقبت از بیماری اینجانب ایجاد شود از پژوهش مذکور خارج شوم.

با توجه به اطلاعات موجود در این فرم و توضیحات حضوری مجری یا همکاران طرح موافقت خود را با شرکت در این مطالعه اعلان می‌نمایم. یک نسخه از این فرم به من داده‌شده و فرصت خواندن آن را داشته‌ام.

فرم اطلاعاتی ضمیمه شماره 1

                                                            فرم اطلاعاتی

عنوان طرح: مقایسه میزان بیان مارکر CD₃₄ در پریودنتیت مزمن و مهاجم

کد داوطلب.....................                                                                      تاریخ................

گروه: کنترل                       پریودنتیت مزمن                           پریودنتیت مهاجم  

بیان مارکر CD₃₄: منفی            + مثبت                                   ++ مثبت  

توضیحات: ........................................................................................................