بررسی اثر ماری جوانا بر اختلالات شناختی و حرکتی و تغییرات مولکولی شکل پذیری سیناپسی در نواحی استریاتوم و هیپوکمپ در مدل تجربی بیماری پارکینسون در موشهای صحرایی نر

         بیماری پارکینسون بعد از بیماری آلزایمر دومین بیماری نرودژنراتیوی است که معمولا در 1-2 درصد از افراد بالای 60 سال ایجاد می شود. علایم بالینی آن شامل لرزش در حال استراحت، برادی کینزیا و آکینزیا، سفتی عضلات اسکلتی و ناهنجاریهای وضعیتی می باشد. همچنین معمولا برخی از علایم غیرحرکتی مثل اختلال در رفتارهای شناختی و افسردگی در بیماران دیده می شود(1). از نظر پاتولوژیکی مهمترین ویژگی این بیماری تخریب و دژنره شدن اعصاب دوپامینرژیکی می باشد که از ناحیه متراکم جسم سیاه (SNC) به طرف استریاتوم کشیده شده و مسیر نیگرواستریاتال را تشکیل می دهند(2).

        شواهد قطعی و آشکاری در مورد اتیولوژی بیماری پارکینسون وجود ندارد، ولی عوامل احتمالی دخیل در این بیماری را پیری و دخالت ژنتیک دانسته اند، بطوری که تقریباً 10 درصد افراد بیمار دارای سوابق فامیلی هستند (3). شواهد نشان می دهد که رابطه ژنتیکی احتمالی بین شدت پاسخ به استرس اکسیداتیو و میزان تخریب نورونی وابسته به سن افراد وجود دارد (4).

          علاوه بر اختلالات ژنتیکی در خصوص مکانیسم های پاتولوژیک و علت مرگ سلولهای دوپامینرژیک ناحیهSNC، فرضیات متعددی از قبیل: نقص کمپلکس I در زنجیره انتقال الکترون میتوکندری، تجمع آهن در سلول، اختلال عملکرد سیتوکروم P450 و افزایش تشکیل رادیکالهای آزاد مطرح می باشد (5, 6). بطور کلی همانند سایر اختلالات نورودژنراتیو آسیب ایجاد شده در این بیماری نتیجه سه عامل شناخته شده مخرب می باشدکه عبارتند از: استرس اکسیداتیو، آپوپتوز و سمیت سلولی(7).

         استریاتوم نقش مهمی را در تنظیم حرکات ارادی، کنترل رفتار، عملکردهای شناختی و مکانیسم های پاداش دارد. توافق عمومی بر این است که اختلال در پلاستیسیتی سیناپسی بعنوان مکانیسم سلولی بالقوه در عملکرد نقص یافته استریاتوم می باشد(8).

         95℅ سلولهای استریاتوم medium spiny neurons(MSNs) می باشند، اینها نورونهای پروجکشنی هستند که دارای درخت دندریتی و خارهای دندریتی فراوانی هستند، این خارها محل اتفاقات پلاستیستی سیناپسی هستند (9).  مطالعات نشان داده که در بیماری پارکینسون کاهش دوپامین باعث یک افزایش فعالیت سیستم گلوتامرژیک به صورت یک افزایش در فعالیت خودبخودی تحریکی MSNs می شود. این اثر منعکس کننده نقص فعالیت رسپتورهای D2 پره سیناپتیک است که در حالت طبیعی آزادسازی گلوتامات را کنترل می کنند. سطوح گلوتامات افزایش یافته در شکاف سیناپسی بدون کنترل دوپامین مسئول افزایش فعالیت رسپتورهایNMDA  و AMPA روی نورنهای MSN می باشد (9). در سطح پس سیناپسی، فعالیت کاهش یافته رسپتورهای D2 باعث عدم مهار کانال های یونی وابسته به ولتاژ و ورود افزایش یافته یون کلسیم میشود. این افزایش بیش از حد کلسیم به نظر می رسد که یک فاکتور کلیدی در دژنراسیون خارهای دندریتی در مدل و در بیماران پارکینسون می باشد(10).

          همچنین مطالعات انجام شده نشان داد که تخریب شدید نورونهای نیگرواستریاتال باعث اختلال در ایجاد LTP و LTD در برشهای کورتیکواستریاتال می شود. درجات متفاوت تخریب نورونهای دوپامینرژیک ممکن است به طور متفاوت تثبیت و القا LTP  در برش های کورتیکو استریاتال را تحت تاثیر قرار دهد (10). تعداد زیادی از تحقیقات اشاره داشته اند که مهمترین علت این اختلالات تغییراتی است که در سطوح سیناپسی در استریاتوم و هیپوکمپ اتفاق می افتد(11, 12).

         استریاتوم نقش مهمی را در تنظیم حرکات ارادی، کنترل رفتار، عملکردهای شناختی و مکانیسم های پاداش دارد. اخیراً توافق عمومی بر این است که اختلال در پلاستیسیتی سیناپسی بعنوان مکانیسم سلولی بالقوه در عملکرد نقص یافته استریاتوم می باشد (11). همانطور که اشاره شد استریاتوم پایانه های دوپامینرژیکی نیگرواستریاتال را دریافت می کند، علاوه بر آن نورونهای پروجکت شده از قشر به استریاتوم نیز دارای نوروترانسمیتر گلوتامات هستند که ورودیهای تحریکی عمده عقده های قاعده ای مغز محسوب می شوند. بنابراین استریاتوم محلی برای یکپارچه کردن ورودی ها و انتخاب اطلاعات خروجی است (13, 14). در واقع آبشار پیچیده ای از پروسه های بیوشیمیایی در اثر فعال شدن رسپتورهای پس سیناپسی دوپامینرژیک و گلوتاماترژیک و اینترکشن دو طرفه آنها در استریاتوم اتفاق می افتد. درگیری این دو سیستم نوروتراسمیتری ویژگی خاص پلاستیسیتی استریاتال می باشد (15, 16).  این مشاهدات پیشنهاد میکند که پلاستیسیتی استریاتال ممکن است به طور قوی در یادگیری موتور دخالت داشته باشد و اینکه تخریب آن ممکن است زمینه ساز بیماریهای حرکتی مثل پارکینسون باشد(17).

          بیشتر مطالعات انجام شده نشان داد که اگر چه جسم سیاه و به دنبال آن استریاتوم در بیماری پارکینسون بیشترین آسیب پذیری را دارند و باعث علائم کلنیکی حرکتی می شوند، اما مناطق دیگری از مغز مانند لوکوس سرلئوس، هسته رافه، و مناطقی از مغز که مسئول شناخت هستند خصوصاً هیپوکمپ نیز تحت تاثیر قرار می گیرند (7).  بطوریکه که مطالعات انجام شده نشان داده که بیماران مبتلا به پارکینسون در مراحل اولیه بیماری و حتی قبل از بروز مشکلات حرکتی دچار نواقص شناختی می شوند که علت عمده این نواقص تغییراتی است که در هیپوکمپ این بیماران رخ می دهد و این نواقص باعث کاهش کیفیت زندگی آنها می شوند(14, 15). همچنین مطالعات انجام شده در بیماران پارکینسونی نشاندهنده هم نقص ساختاری و هم نقص عملکردی در هیپوکمپ می باشد(18). 

          در واقع چهار مسیر اصلی سیستم دوپامینرژیک وجود دارد که یکی از آنها مسیر مزولیمبیک است که تشکیل شده از نورونهای دوپامینرژیکی که بین منطقهVTA  (ventral tegmental area) و سیستم لیمبیک (شامل هیپوکمپ) ارتباط برقرار می کند(19). تحقیقات ثابت کرده که هیپوکمپ برای کد گذاری حافظه اپی زودیک و فضایی ضروری است. سیستم دوپامینرژیک یک کاندید قوی برای تنظیم پلاستی سیتی سیناپسی در منطقه CA1 هیپوکمپ می باشد. به طوریکه فقدان ورودیهای دوپامینرژیک به هیپوکمپ باعث نقص در LTP و در نتیجه نقص در حافظه افراد پارکینسونی می شود(18, 19).

           مطالعات انجام شده بر روی رت های آزمایشگاهی نشان میدهد که تخریب مسیر نیگرواستریاتال و در نتیجه کاهش دوپامین منجر به نواقص شدید شناختی و حرکتی میشود (17, 20) که این اختلالات حرکتی و شناختی به دلیل تغییرات منفی در پلاستیسیتی سیناپسی در جایگاه های مغزی مهم برای شناخت و حرکت است.

           پروتئین PSD-95 یک پروتئین اینتراسلولار است و به زیر واحدهای رسپتورهای NMDA در بخش داخل سلولی متصل است و اتصال همزمان دومین خارج سلولی نورولیگین به این پروتئین باعث قرارگیری کانالها و رسپتورهای نوروتراسمیتری در منطقه PSD می شود(20). مطالعات نشان داده است که سطوح PSD95   و نورکسین در استریاتوم فاقد دوپامین کاهش می یابد که بیانگر این موضوع است که سطوح PSD95   و نورکسین می تواند توسط تخریب نورونهای دوپامینی و کاهش دوپامین در استریاتوم تغییر یابد و این امر می تواند منجر به تخریب سیناپس و یا ازبین رفتن یکپارچگی سیناپس در استریاتوم گردد(21).

مصرف ماری جوانا امروزه در میان جوانان کشورهای مختلف جهان از جمله ایران افزایش پیدا کرده است. این ماده در  گیاه  cannabis sativa   وجود دارد که  محتوی 70 نوع کانابینوئید است که از بین آنها تترا هیدروکانابینول (THC)  بیشتر از همه مورد مطالعه قرار گرفته است (22). با مصرف ماری جوانا (علف هرز) ماده‌ای به نام دوپامین در بدن ترشح می‌شود. دو ماده‌ی اصلی موجود در گیاه ماری جوانا، کانابیدیول (CBD) و تتراهیدروکانابینول (THC) با تاثیر در سلول‌های مغز باعث ترشح دوپامین می‌شود. دوپامین بخشی از سیستم پاداش مغز است که بعد از مصرف این ماده‌ی مخدر باعث سرخوشی انسان می‌شود(23). برخی از تحقیقات نشان می‌دهد که استفاده‌ی آن علاوه بر تسکین دردها، اثرات مخربی روی بدن و مغز انسان دارد(24).

          علاوه بر این بدن انسان نیز کانابینوئیدهایی را تولید می کند که بسیار شبیه آن هایی هستند که در ماری جوانا وجود دارد و نواحی مغزی درگیر در حافظه، تفکر، تمرکز ، هماهنگی، حرکات و.. را تحت تاثیر قرار می دهند(25). گزارش شده است که اندوکانابینوئیدها در تکامل مغزی، نوروژنز و گلیوژنز دخالت دارد(26). همچنین اندوکانابینوئیدها نقش کلیدی در کنترل پلاستیسیتی سیناپسی دارند(27).

         امروزه مشخص شده است که  THC پردازش اطلاعات در هیپوکمپ را تغییر می دهد و موجب نقص در حافظه می شود. در مطالعه ای که اثرات متفاوت THC  در موش های نوجوان و بالغ را بررسی می کرد، نتایج بدست آمده نشان داد که تجویز حاد THC موجب مهار هر دو نوع یادگیری فضایی و غیر فضایی در آزمون water maze و با شدت بیشتر در موش های صحرایی نوجوان نسبت به بالغین شد، که این نشان دهنده حساسیت تکاملی به اثرات THC روی یادگیری است (28). دربررسی دیگری ثابت شد، تجویز حاد THC موجب اختلال یادگیری در ماده های نوجوان و بالغ و نرهای نوجوان می شود اما در موش های صحرایی نر بالغ این اتفاق نمی افتد، ولی  تجویز مزمن THC هیچ اثری روی یادگیری در هیچکدام از موش های صحرایی نر و ماده بالغ و نوجوان ایجاد نکرده است(29). هنوز مشخص نشده که چطور فاکتورهایی مثل سن، آغاز مصرف و مقدار مصرف کانابینوئید در نتایج عصبی شناختی وابسته به جنس مصرف کننده ها دخیل اند.

        در برخی مطالعات بر روی افرادی که از بیماری پارکینسون رنج می برند و حرکات آهسته به همراه لرزش دارند، دیده شده است که پس از مصرف ماری جوانا برای نخستین بار کاملا آرام می شوند و حرکات آهسته و لرزش آنها از بین می رود. همچنین صدای آنها قبل از مصرف ماری جوانا همراه با لرزش بسیاری بود که پس از مصرف آن کاملا یکنواخت شد(30). مطالعات در مورد اثرات ماری جوانا بر سیستم حرکتی بسیار متنوع و ضد ونقیض است. برخی از مطالعات از اثرات مفید ماری جوانا برسیستم حرکتی و بهبود لرزش های عضلانی صحبت می کنند(31)، درحالیکه برخی مطالعات نشان می دهند که ماری جوانا بویژه در مدل های بیماری مانند پارکینسون باعث بهبود علائم حرکتی مانند برادی کینزیا، آکینزیا ویا لرزش عضلانی نمی شود(32).

          بعضی از مطالعات اثرات مثبت ماری جوانا بر غلبه بر بیماری پارکینسون را مقطع و محدود به دفعات نخستین می دانند(33). عده ای نیز معتقدند ماری جوانا نوعی درمان دارویی است، مثلا ماری‌جوانا در برخی کشورهای دنیا به‌ عنوان یک درمان گیاهی با تجویز پزشکان مورد استفاده قرار می‌گیرد که به‌عنوان ماری‌جوانای طبی از آن یاد می‌شود و در برخی از این کشورها مصرف آن قانونی است(34). بنابراین نیاز به مطالعات بیشتر بر روی اثرات مثبت و یا منفی ماری جوانا بر بیماران پارکینسونی احساس می شود. در این مطالعه قصد داریم  اثرات ماری جوانا را در پلاستیسیتی سیناپسی در سطوح رفتاری و مولکولی در بیماری نرودژنراتیو پارکینسون مورد بررسی قرار دهیم.

1. القای پارکینسون سبب بروز اختلالات حرکتی می شود
2. القای پارکینسون سبب بروز اختلالات شناختی می شود
3. القای پارکینسون سبب بروز تغییرات مولکولی در ساختار سیناپس در استریاتوم و هیپوکمپ می شود
4. تجویز ماری جوانا سبب بهبوداختلالات حرکتی در رتهای پارکینسونیسم می شود
5. تجویز ماری جوانا سبب بهبوداختلالات شناختی در رتهای پارکینسونیسم می شود
6. تجویز ماری جوانا سبب بهبود تغییرات مولکولی در ساختار سیناپس در ناحیه هیپوکمپ رتهای پارکینسونیسم می شود
7. تجویز ماری جوانا سبب بهبود تغییرات مولکولی در ساختار سیناپس در ناحیه استریاتوم رتهای پارکینسونیسم می شود

مطالعه رفتارهای شناختی- حرکتی و بررسی شاخص های مولکولی پلاسیتیسیتی سیناپسی در استریاتوم و هایپوکمپ در اثر تجویز ماری جوانا به موش های صحرایی نر مدل شبه پارکینسون

الف) تعیین و مقایسه اختلالات حرکتی (آکنیزیا، برادی کینیزیا، تعادل و کاتالپسی) در گروههای مختلف مورد مطالعه

 ب) تعیین و مقایسه اختلالات شناختی (حافظه فضائی و اپی زودیک) در گروههای مختلف مورد مطالعه

ج) تعیین و مقایسه بیان پروتئین PSD95 در هیپوکمپ و استریاتوم گروههای مختلف مورد مطالعه

د) تعیین و مقایسه بیان ژن گیرنده دوپامینی در هیپوکمپ و استریاتوم گروههای مختلف مورد مطالعه

ه) تعیین و مقایسه بیان ژن گیرنده کانابینوئیدی در هیپوکمپ و استریاتوم گروههای مختلف مورد مطالعه

دانشگاهها و سایر مراکز تحقیقاتی

پارکینسون تجربی:  برای اطمینان از صحت ایجاد مدل پارکینسونی  بررسی رفتار چرخشی توسط تزریق زیر جلدی داروی آپومورفین هیدروکلراید (sigma) به میزان mg/kg 5/0  به شکل زیر جلدی توسط سرنگ انسولین انجام می گیرد. موشها 10 دقیقه قبل از شروع ارزیابی برای سازگاری پیدا کردن با محفظه استوانه ای به داخل محفظه منتقل می شوند. قطر استوانه 33 سانتی متر، ارتفاع آن 35 سانتی متر است. چند دقیقه بعد از تزریق دارو، موشها بر خلاف سمت ضایعه دیده شروع به چرخش کرده و تعداد چرخشهای کامل (360 درجه) آنها به مدت یک ساعت توسط شمارش گر دستی شمارش می شود. در این محاسبه تعداد چرخش Controlateral ( به سمت مخالف محل ضایعه) بعنوان عدد مثبت و چرخش Ipsilateral (به سمت محل ضایعه) بعنوان عدد منفی در نظر گرفته شد، تعداد خالص چرخش پس از تفاضل چرخشها در دو جهت محاسبه می گردد (35). این ارزیابی رفتاری قبل از تزریق نوروتوکسین جهت اطمینان از سالم بودن حیوانات تحت مطالعه و دو هفته بعد از آن جهت اطمینان از ایجاد صحیح مدل پارکینسون در حیوانات صورت می گیرد. همچنین در پایان دوره درمان ( هفته هشتم بعد از جراحی) نیز جهت بررسی اثرات درمانی این ارزیابی رفتاری صورت می گیرد.

تجربی

در این پژوهش از موش‏های صحرایی نر بالغ نژاد ویستار با محدوده وزنی 250-200 گرم استفاده می شود. به منظور اطمینان از سالم بودن موشهای صحرایی تحت آزمایش، از تزریق زیر جلدی آپومورفین حل شده در نرمال سالین 0/9 درصد به میزان 0/5   mg/kg استفاده می شود و موشهایی با چرخش کمتر از 30 دور کامل °360 در ساعت وارد آزمایش می شوند.

بر اساس مطالعات قبلی مشابه و بر اساس این که همه حیوانات از یک نژاد می باشند و تعداد حیوانات در هر گروه7 سر، می باشد .

در این مطالعه بعد از اطمینان از سالم بودن موشهای صحرایی به طور تصادفی به  چند گروه تقسیم خواهند شد.

ارزیابی بروز کاتالپسی در حیوانات ازطریق تست میله (Bar test)

ارزیابی بروز آکینزیا، برادی کینزیا از طریق آزمون حرکت بر روی تخته (Beam walking test) 

ارزیابی تعادل وضعیتی با آمونهای میله گردان (Rotarod) و آزمون تعادلی (Balance Beam)

ارزیابی حافظه اپی زودیک (تست شناسایی شی جدید) از طریق Novel Object Recognition task

بررسی شاخص های مولکولی پلاستیسیتی سیناپسی از طریق انجام وسترن بلات و Real time-PCR از ناحیه استریاتوم و هیپوکمپ در مورد مولکولهای  PSD95.، رسپتورها ی دوپامینی D2, D1 و کانابینوئیدی CB1 و CB2

در این مطالعۀ تجربی از  موش های صحرایی نر نژاد ویستار با وزن 250- 200 گرم استفاده می شود. موشها تحت شرایط استاندارد با دوره روشنایی و تاریکی 12 ساعته و دمای 3 ± 21 درجه سانتی گراد نگهداری می شوند. حیوانات به آب آشامیدنی و غذای کافی دسترسی دارند.

تقسیم بندی حیوانات

حیوانات به طور تصادفی به پنج گروه زیر تقسیم می گردند:

1- گروه Control  گروه سالم

 2-گروه  Lesion گروهی که تخریب سلولهای دوپامینی جسم سیاه با نوروتوکسین صورت می گیرد (مدل پارکینسونیسم)

3- گروه Sham1  گروه حلال نوروتوکسین

4-گروه   Marijuana: گروهی که  به صورت روزانه، ماری جوانا (60mg/kg/i.p.) دریافت می کنند(22).

4-گروه Lesion+marijuana گروه پارکینسونیسم که ماری جوانا دریافت کردند

5-گروه  Sham2 گروه پارکینسونیسم که حلال ماری جوانا (DMSO) را دریافت می کند

روش جراحی  پارکینسونیسم:

          جهت ایجاد مدل تجربی بیماری پارکینسون، ابتدا حیوانات با تزریق داخل صفاقی مخلوطی از کتامین (mg/kg60) وگزیلازین (mg/kg10) بیهوش کرده . پس از بیهوش کردن حیوان، سر حیوان را در دستگاه استریوتاکس قرار می دهیم، موهای ناحیه جراحی تراشیده و پس از ضد عفونی کردن محل جراحی با بتادین، بوسیله تیغ جراحی شکافی موازی با سطح ساژیتال از محل فاصله بین چشمها تا ناحیه بین گوشها ایجاد میشود. سپس پوست سر کنار زده شده و  روی استخوان را با پنبه کاملاً از بافت نرم و پریوست جمجمه تمیز می کنیم تا محل برگما و درز سهمی آن مشخص شود. بعد از حذف بافت های سطحی و مشخص شدن نواحی برگما و لامبدا با استفاده از اطلس پاکسینوس (36) ناحیه متراکم جسم سیاه سمت راست حیوان  با مختصات (AP = 3.7, ML = 2.2, DV = 7.7)  تعیین و به کمک مته برقی استخوان جمجمه سوراخ می شود و سپس تزریق 5/2 میکرولیتر از محلول مورد نظر توسط سرنگ هامیلتون انجام می شود. پس از پایان تزریق، محل جراحی ضد عفونی شده و بخیه زده می شود و موش از دستگاه خارج می گردد. در ضمن در حین جراحی تا بهوش آمدن حیوان با استفاده از پارچه گرم در زیر و روی بدن، حیوان را گرم نگه داشته و پس از بهوش آمدن به قفس برگردانده و آب و غذا در اختیارش قرار می گیرد. در گروه هایی که تخریب سیستم دوپامینرژیک صورت میگیرد، 5/2 میکرولیتر محلول سالین 9/0 درصد حاوی 8 میکروگرم 6-OHDA و 2/0 درصد اسید اسکوربیک به داخل SN_PC تزریق میشود. در  گروه های شم نوروتوکسین (sham1) نیز به همان حجم و غلظت از محلول سالین- اسکوربات که حلال نوروتوکسین است تزریق می گردد. گروه های دریافت کننده ماری جوانا یک هفته بعد از تزریق 6-OHDA   به صورت روزانه، ماری جوانا (60mg/kg/i.p.)  را به مدت بیست و هشت روز دریافت می کنند . در گروه شم دارو(sham2) نیز به همان حجم و غلظت از محلولDMSO  که حلال ماری جوانا است تزریق می گردد.   در این مطالعه گروه کنترل شامل حیواناتی است که هیچگونه اقدام جراحی و درمانی روی آنها صورت نمی گیرد .

آزمونهای بررسی حرکتی:

1-           آزمون میله ( Bar test ):

این آزمون برای ارزیابی سفتی عضلات حرکتی (کاتالپسی) بکار میرود. گفتنی است کاتالپسی وضعیتی است که با سفتی عضلانی و ثابت شدن موقعیت بدنی مشخص می شود. بنابراین در موش های صحرایی پارکینسونی شده با 6-OHDA می توان این آزمون را برای ارزیابی کاتالپسی استفاده کرد.

وسیله مورد استفاده در این آزمون، یک میله بارفیکس می باشد، که دارای یک سکو است. در موش صحرایی ارتفاع بارفیکس از سکو 9 سانتی متر و قطر میله بارفیکس 9/0 سانتی متر خواهد بود.

برای انجام آزمون حیوان بر روی سکو قرار داده می شود و دو دست آن به آرامی بر روی میله بارفیکس قرار داده می شود، مدت زمانی که حیوان در این وضعیت قرار می گیرد ثبت می شود.  زمان قطع آزمون موقعی خواهد بود که حیوان یکی و یا هر دو دست خود را از روی میله بردارد و یا اینکه سر خود را به طور جستجوگرایانه حرکت دهد.

بدیهی است هرچه کاتالپسی حیوان شدیدتر باشد، مدت زمان بیشتری را در وضعیت اعمال شده سپری می کند. این آزمون در جوندگانی مثل موش و موش صحرایی برای ارزیابی تاثیر داروهائی با اثرات ضد پارکینسونی به کار میرود. به طوریکه اگر داروئی بتواند زمان کاتالپسی را کاهش دهد، احتمال داده می شود که بتواند دارای اثرات ضد پارکینسونی باشد(37).

 2-          آزمون حرکت بر روی تخته ( Beam walking test )  :

کندی حرکات (برادی کینزیا) ، عدم شروع حرکات (آکینزیا) و عدم تعادل وضعیتی از عوارض بیماری پارکینسون محسوب می شوند. با استفاده  از این آزمون می توان هم آکینزیا و هم عدم تعادل وضعیتی را مورد ارزیابی قرار داد.

وسیله مورد استفاده در این آزمون یک تخته چوبی نازک می باشد. گاهی به این تخته نازک میله تعادلی هم گفته می شود. طول این تخته 105، عرض آن 4 و ضخامت آن 3 سانتی متر است. در هر دو انتهای تخته هم دو عدد پایه قرار دارد و باعث می شود تا میله در ارتفاع 80 سانتی متری سطح زمین قرار گیرد. یک خط با فاصله 20 سانتی متری از یک انتهای تخته کشیده می شودو این خط به عنوان خط شروع محسوب میشود. در انتهای دیگر تخته که مقابل خط شروع می باشد یک جعبه سیاه قرار داده می شود تا حیوان بعد از طی طول تخته به داخل جعبه وارد شود.

روش انجام آزمایش: برای انجام آزمایش موش صحرایی در پشت خط شروع و رو به انتهای تخته که منتهی به جعبه می باشد قرار داده می شود. در همین حال حیوان با دست آزمایش کننده در جای خود نگهداشته می شود. سپس فرد موش صحرایی را رها می کند و در این زمان کورنومتر زده می شود . مدت زمانی که طول می کشد تا حیوان به طور کامل یک قدم بر روی خط شروع بگذارد و بر روی این قدم وزن گیری کند به عنوان مدت زمان شروع حرکت یا مدت زمان شروع آزمون (Latency to begin the task) توسط حیوان محسوب می شود. سپس در ادامه اگر حیوان بتواند طول تخته را بپماید با رسیدن حیوان به داخل جعبه و قرار گرفتن هر 4 دست و پای حیوان در داخل جعبه، کورنومتر قطع می شود و این مدت زمان که از لحظه حرکت حیوان شروع شده است به عنوان مدت زمان پیمودن میله توسط حیوان محسوب می شود. در این آزمون مدت زمانی که طول می کشد تا حیوان حرکت خود را شروع کند به عنوان مشخصه ای برای آکینزیا محسوب می شود. یعنی هر چه شروع حرکت حیوان کندتر باشد این امر نشاندهنده وجود آکینزیا در آن است. مدت زمان لازم برای عبور از تخته هم مشخصه ای برای ارزیابی برادی کینزیا بوده، چرا که وجود تعادل و یا عدم تعادل در حین عبور از تخته نشانه هائی از وضعیت حرکتی حیوان سالم و یا حیوان دارای نقص حرکتی می باشد(38).

 نکات مورد توجه در این آزمون:

1-         حداکثر زمانی که برای انجام آزمون توسط یک حیوان در نظر گرفته می شود، دو دقیقه است.

2-         در مواردی که حیوان نتواند از روی تخته عبور کند و یا از روی میله بیفتد زمان دو دقیقه بعنوان مدت زمان عبور از روی تخته برای حیوان ثبت می شود.

3-         حیوانی که در پشت خط شروع قرار می گیرد باید حداکثر در عرض 1 دقیقه از خط شروع عبور کند، در غیر این صورت آزمون مربوط به این حیوان لغو می شود.

4-           معمولاً در هر گروه هر حیوان پنج بار مورد آزمون قرار می گیرد و میانگین هر پنج آزمون برای هر حیوان محاسبه می شود

سنجش تعادل حرکتی

1-آزمون میله گردان (Rotarod)  :

قدرت حفظ تعادل و مقاومت حرکتی با استفاده از دستگاه روتارود مورد بررسی قرار می گیرد. این دستگاه شامل یک گردونه است که به یک موتور الکتریکی متصل می باشد. در هنگام تست حیوان به مدت 5 دقیقه روی گردونه قرار می گیرد که سرعت چرخیدن گردونه در این مدت rpm  40-0  می باشد که توسط دستگاه تنظیم می شود. مدت زمانی که حیوان می تواند تعادل خود را حفظ کند و از روی میله نیفتد به عنوان زمان مقاومت حیوان ثبت می شود و این عمل برای هر حیوان 3 مرتبه تکرار و میانگین آن محاسبه می شود(38).

2-آزمون حفظ تعادل Balance Beam:

با استفاده از این آزمون عدم تعادل وضعیتی مورد ارزیابی قرار می گیرد. وسیله مورد استفاده در این آزمون یک میله چوبی به قطر 1.5 و طول 105 سانتیمتر است که دوانتهای آن بر روی سکوهایی با ارتفاع 1متر از سطح زمین قرار می گیرد. در زیر این میله یک اسفنج سیاه به عرض 1متر و ضخامت 12سانتیمتر گذاشته می شود تا درصورت سقوط حیوان آسیبی به آن وارد نشود.  مدت زمانی که حیوان بر روی این میله باقی می ماند به عنوان زمان تعادل ثبت می شود.این آزمون سه بار تکرار می شود و میانگین آن محاسبه می گردد(39).

آزمونهای شناختی:

Novel Object Recognition task

یک نوع تست شناختی است که به طور ویژه حافظه اپی زودیک ، فضایی و افتراقی را در موش صحرایی در بیماریهای سیستم عصبی را ارزیابی می کند. این تست بر پایه توانایی شناسایی خودبخودی حیوان در هنگامی که یک شیء جابجا می شود می باشد. تست در یک میدان باز صورت می گیرد ، حافظه را ارزیابی می کند. در مرحله اول این آزمون موش صحرایی در معرض دو شیء  قرار داده می شود. موش صحرایی هر دو شیء را مورد شناسایی قرار می دهد. در مرحله بعد ، بعد از یک  فاصله زمانی ( 1-48 ساعت، بستگی به نوع آزمایش دارد)، حیوانات در معرض دو شیء قرار می گیرند که یکی از آنها همان شیء استفاده شده در مرحله قبلی است و شیء دیگر جدید است. حافظه باز شناسایی به عنوان یک ایندکس بازشناسایی تعریف می شود بعنوان نسبت زمان صرف شده برای شناسایی شیء جدید به کل زمانی که صرف شناسایی هر دو شیء می شود(40).

 سنجش یادگیری و حافظه فضایی

ماز آبی موریس morris water maze:

در این پژوهش جهت سنجش یادگیری و حافظه فضایی از ماز آبی موریس استفاده می گردد .

ماز آبی موریس حوضچه دایره ای شکل تیره رنگی به قطر 180 سانتی متر و ارتفاع 60 سانتیمتر است که تا ارتفاع 25 سانتی متر با آب با دمای 2±20 پر می شود. این حوضچه به چهار ربع مساوی تقسیم می شود و در هر ربع دایره یک نقطه برای رها کردن حیوان در آب در نظر گرفته شده است. یک سکو فلزی به قطر 10 سانتیمتر در مرکز ربع دایره چهار، 5/1 سانتیمتر در زیر سطح آب و بصورت غیر قابل روئیت قرار دارد. در این مطالعه، از پروتکل یک روزه جهت سنجش یادگیری و حافظه فضایی استفاده خواهد شد. این آزمایش شامل سه مرحله یادگیری و یک مرحله تست(prob)  است. درمراحل یادگیری  که فاصله زمانی بین آنها 30 دقیقه است حیوان از یکی از ربع دایره های چهارگانه که دستگاه به طور تصادفی انتخاب می کند به داخل آب رها شده و حداکثر 60 ثانیه فرصت دارد تا با استفاده از سرنخ های فضایی اطراف، سکوی پنهان در زیر سطح آب را پیدا نموده و بر روی آن استراحت کند. حیوان پس از قرار گرفتن بر روی سکو 30 ثانیه  بر روی آن استراحت کند. حیوان از 4 ربع مختلف دایره به داخل آب رها میشود. در این آزمایش مدت زمان سپری شده (escape latency) و مسافت پیموده شده تا یافتن سکوی پنهان به عنوان معیاری از یادگیری فضایی محاسبه  می شود. 24 ساعت پس از اتمام آخرین آزمایش ، آزمون پروب (Probe test) به منظور بررسی حافظه فضایی حیوانات انجام می گیرد. این آزمون شامل یک کارآزمایی منفرد است که در آن سکوی پنهان از داخل ماز برداشته شده و حیوان از ربع مخالف ربع دایره هدف به داخل آب رها شده و به مدت 60 ثانیه آزادانه در آب شنا می کند. متغیرهای مورد بررسی در این آزمون مدت زمان حضور و مسافت پیموده شده در ربع هدف می باشد(41).

 جدا سازی و آماده سازی بافت ها :

          حیوانات  با استفاده از گاز CO2 بیهوش و سر حیوان توسط گیوتین جدا و هیپوکامپ و استریاتوم آن بعد از جداسازی در نیتروژن مایع فریز می گردد و تا زمان استفاده در فریزر -70ºC نگهداری  میشوند.

بررسیهای مولکولی پلاستیسیتی سیناپسی:

در بررسی شاخص های مولکولی پلاستیسیتی سیناپسی با استفاده از تکنیک های وسترن بلات و Real time-PCR میزان بیان mRNA و پروتئین هر کدام از مولکولهای  های زیر که در ناحیه سیناپس اهمیت ویژه ای دارند مورد بررسی قرار میگیرد:

•              پروتئین PSD-95   (وسترن بلات)

•          رسپتورهای دوپامینیD1, D2 ((Real time-PCR)

•          رسپتورهای کانابینوئیدی CB2, CB1  (Real time _PCR)

وسترن بلات:

این روش آزمایشگاهی دارای ۳ مرحله کلی است: اول انتقال به ژل الکتروفورز دوم انتقال به غشاء نیتروسلولز و یا  PVDF و سوم شناسایی پروتیین اختصاصی.

برای آزمایش ایمیونوبلات ابتدا بافت استریاتوم و هیپوکمپ تازه از مغز حیوان در کمترین زمان ممکن خارج می شود و هموژن می گردد. هموژناسیون در بافر سرد و روی یخ انجام می گیرد. بافت هموژن شده سانتریفیوژ می شود (14000 دور در دقیقه در 4 درجه سانتی گراد به مدت  15 دقیقه). برای اندازه گیری غلظت کل پروتئین در نمونه های بافت مربوطه از روش Brad ford استفاده می شود .μg 40 از هر نمونه برای انجام آزمایش وسترن بلات مورد استفاده قرار می گیرد. نمونه های بافتی در ژل 12 درصد SDS-PAGE لود و الکتروفورز می شوند. بعد از اتمام الکتروفورز، پروتئین های تفکیک شده در ژل به کاغذ نیتروسلولز منتقل می شوند. انتقال از ژل به غشاء به کمک نیروی الکتریکی انجام می‌شود (200 میلی آمپر به مدت یک ساعت). مرحله بعدی فرایند بلوکه‌سازی می‌باشد.در نهایت، کمپلکس آنتی بادی-آنتی ژن با استفاده از سیستم  Enhanced Chemiluminescence(ECL) و با محلول های ظهور و ثبوت بر روی فیلم رادیوگرافی ظاهر می شوند بعد از دیجیتالیزه کردن تصاویر، دانسیته باندها با کمک نرم افزار Lab works سنجیده می شود. در مرحله آخر کاغذ PVDF در محلول Striping و در دمای 55 درجه و به مدت نیم ساعت قرار می گیرد و بعد از شستشو با TBS.T مجددا برای بتا اکتین بلوکه می شود(42).

Real time _PCR

کلیات روش RT-PCR

-           جدا سازی RNA از بافت

-           ساخت C-DNA به کمک آنزیم reverse transcriptase با استفاده از mRNA بعنوان الگو

-              ساخت  DNA دورشته ای از C-DNA تک رشته ای اولیه و تکثیر قطعه مورد نظر به روش PCR

واکنش های Real-Time PCR در حجم کلی ۱۰ میکرولیتر آماده سازی میشوند. به این منظور ابتدا به میزان ۵ میکرولیتر از SYBR® Green Master درون ویال ۱/۰ میلی لیتری RNase free ریخته شد و سپس، ۱ میکرولیتر از پرایمرهای بالادست و پایین دست ویژه هر ژن با غلظت نهایی ۳۰۰ نانومولار به آن اضافه میگردد. در انتها، ۴ میکرولیتر از cDNA که با آب RNase free و DNase free رقیق شده است به هر میکروتیوب اضافه شده. ویال ها به دستگاه  Real-Time analyzer منتقل میگردد. واکنش های PCR در شرایط دمایی و زمانی خاص بر اساس نوع ژن و در طی ۴0 سیکل انجام می شود(43).

برای آنالیز همه داده ها از نرم افزار SPSS نسخه 20 استفاده می شود. زمان و مسافت طی شده برای یافتن سکو در MWM بر اساس آزمون واریانس دوطرفه و   اختلاف بین گروه ها (گروه و بلوک به عنوان فاکتورها) بر اساس آزمون Repeated measurement  آنالیز می گیرد. سرعت شنا کردن حیوانات و تست   پروب برای بررسی حافظه (زمان و مسافت طی شده و تعداد ورود به نیم‌دایره هدف) در MWM نیز بر اساس آنالیز واریانس یک طرفه و تست تعقیبی توکی آنالیز می شود. در تستهای شناسایی شیء و موقعیت جدید و تمامی آزمونهای رفتار حرکتی و همچنین نتایج بررسی های مولکولی از آزمون آنالیز یک طرفه برای بررسی اختلاف بین گروه ها استفاده می شود.

تحقیق حاضر بر اساس پروتکل های رعایت موازین اخلاق پزشکی و اخلاق در پژوهش مصوب کمیته اخلاق پزشکی وزارت بهداشت ایران انجام می شود. چک لیست مربوط به مطالعات حیوانی نیز تکمیل شده است.

تصویب بموقع طرح  و اجرای مراحل بعدی و تامین به موقع هزینه های جاری و نیز در صورت تهیه مواد لازم و کارایی مطلوب دستگاههای آزمایشگاهی مورد نیاز تصور می شود که طرح در زمان پیش بینی شده به پایان خواهد رسید. به دلیل احتمال مرگ و میر ،تعداد حیوانات بیشتری جهت انجام این مطالعه در نظر گرفته می شود.

پارکینسون، ماری جوانا، شکل پذیری سیناپسی

1.         Albin RL, Young AB, Penney JB. The functional anatomy of basal ganglia disorders. Trends in neurosciences. 1989;12(10):366-75.

2.         Dauer W, Przedborski S. Parkinson's disease: mechanisms and models. neuron. 2003;39(6):889-909.

3.         Maraganore D, Harding A, Marsden C. A clinical and genetic study of familial Parkinson's disease. Movement disorders: official journal of the Movement Disorder Society. 1991;6(3):205-11.

4.         Gilad GM, Gilad VH. Strain, stress, neurodegeneration and longevity. Mechanisms of ageing and development. 1995;78(2):75-83.

5.         Armstrong M, Daly A, Cholerton S, Idle J, Bateman D. Mutant debrisoquine hydroxylation genes in Parkinson's disease. The Lancet. 1992;339(8800):1017-8.

6.         Barneoud P, Mazadier M, Miquet J-M, Parmentier S, Dubedat P, Doble A, et al. Neuroprotective effects of riluzole on a model of Parkinson's disease in the rat. Neuroscience. 1996;74(4):971-83.

7.         Logroscino G, Marder K, Cote L, Tang MX, Shea S, Mayeux R. Dietary lipids and antioxidants in Parkinson's disease: a population‐based, case‐control study. Annals of neurology. 1996;39(1):89-94.

8.         Lee J, Zhu W-M, Stanic D, Finkelstein DI, Horne MH, Henderson J, et al. Sprouting of dopamine terminals and altered dopamine release and uptake in Parkinsonian dyskinaesia. Brain. 2008;131(6):1574-87.

9.         Jellinger KA. The pathomechanisms underlying Parkinson's disease. Expert review of neurotherapeutics. 2014;14(2):199-215.

10.       Graybiel AM. Neurotransmitters and neuromodulators in the basal ganglia. Trends in neurosciences. 1990;13(7):244-54.

11.       Groves PM. A theory of the functional organization of the neostriatum and the neostriatal control of voluntary movement. Brain Research Reviews. 1983;5(2):109-32.

12.       Calabresi P, Pisani A, Mercuri NB, Bernardi G. Post-receptor mechanisms underlying striatal long-term depression. Journal of Neuroscience. 1994;14(8):4871-81.

13.       Centonze D, Picconi B, Gubellini P, Bernardi G, Calabresi P. Dopaminergic control of synaptic plasticity in the dorsal striatum. European journal of neuroscience. 2001;13(6):1071-7.

14.       Sriraksa N, Wattanathorn J, Muchimapura S, Tiamkao S, Brown K, Chaisiwamongkol K. Cognitive-enhancing effect of quercetin in a rat model of Parkinson's disease induced by 6-hydroxydopamine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2012;2012.

15.       Schrag A, Jahanshahi M, Quinn N. What contributes to quality of life in patients with Parkinson's disease? Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 2000;69(3):308-12.

16.       Martinez-Martin P. Impact of the cognitive impairment on the quality of life in patients with Parkinson's disease. Revista de neurologia. 2006;43(3):168-72.

17.       Lisman JE, Grace AA. The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory. Neuron. 2005;46(5):703-13.

18.       Swanson L. The projections of the ventral tegmental area and adjacent regions: a combined fluorescent retrograde tracer and immunofluorescence study in the rat. Brain research bulletin. 1982;9(1-6):321-53.

19.       Ryan L, Lin CY, Ketcham K, Nadel L. The role of medial temporal lobe in retrieving spatial and nonspatial relations from episodic and semantic memory. Hippocampus. 2010;20(1):11-8.

20.       Yabuki Y, Ohizumi Y, Yokosuka A, Mimaki Y, Fukunaga K. Nobiletin treatment improves motor and cognitive deficits seen in MPTP-induced Parkinson model mice. Neuroscience. 2014;259:126-41.

21.       Irie M, Hata Y, Takeuchi M, Ichtchenko K, Toyoda A, Hirao K, et al. Binding of neuroligins to PSD-95. Science. 1997;277(5331):1511-5.

22.       Crane NA, Schuster RM, Fusar-Poli P, Gonzalez R. Effects of cannabis on neurocognitive functioning: recent advances, neurodevelopmental influences, and sex differences. Neuropsychology review. 2013;23(2):117-37.

23.       Trezza V, Campolongo P, Cassano T, Macheda T, Dipasquale P, Carratù MR, et al. Effects of perinatal exposure to delta-9-tetrahydrocannabinol on the emotional reactivity of the offspring: a longitudinal behavioral study in Wistar rats. Psychopharmacology. 2008;198(4):529-37.

24.       Lichtman AH, Dimen KR, Martin BR. Systemic or intrahippocampal cannabinoid administration impairs spatial memory in rats. Psychopharmacology. 1995;119(3):282-90.

25.       Cha YM, White AM, Kuhn CM, Wilson WA, Swartzwelder H. Differential effects of delta9-THC on learning in adolescent and adult rats. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 2006;83(3):448-55.

26.       Marsicano G, Lafenêtre P. Roles of the endocannabinoid system in learning and memory.  Behavioral Neurobiology of the Endocannabinoid System: Springer; 2009. p. 201-30.

27.       Fattore L, Fratta W. How important are sex differences in cannabinoid action? British journal of pharmacology. 2010;160(3):544-8.

28.       Suliman NA, Taib CNM, Moklas MAM, Basir R. Delta-9-Tetrahydrocannabinol (∆ 9-THC) Induce Neurogenesis and Improve Cognitive Performances of Male Sprague Dawley Rats. Neurotoxicity research. 2018;33(2):402-11.

29.       Renard J, Rushlow WJ, Laviolette SR. What can rats tell us about adolescent cannabis exposure? Insights from preclinical research. The Canadian Journal of Psychiatry. 2016;61(6):328-34.

30.       Shohet A, Khlebtovsky A, Roizen N, Roditi Y, Djaldetti R. Effect of medical cannabis on thermal quantitative measurements of pain in patients with Parkinson's disease. European Journal of Pain. 2017;21(3):486-93.

31.       Szutorisz H, Hurd YL. Epigenetic effects of cannabis exposure. Biological psychiatry. 2016;79(7):586-94.

32.       Kluger B, Triolo P, Jones W, Jankovic J. The therapeutic potential of cannabinoids for movement disorders. Movement disorders. 2015;30(3):313-27.

33.       Lotan I, Treves TA, Roditi Y, Djaldetti R. Cannabis (medical marijuana) treatment for motor and non–motor symptoms of Parkinson disease: An open-label observational study. Clinical neuropharmacology. 2014;37(2):41-4.

34.       Mandelbaum DE, Suzanne M. Adverse structural and functional effects of marijuana on the brain: evidence reviewed. Pediatric neurology. 2017;66:12-20.

35.       Antoniou K, Kafetzopoulos E. A comparative study of the behavioral effects of d-amphetamine and apomorphine in the rat. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 1991;39(1):61-70.

36.       Paxinos G, Watson C. Atlas of the rat brain in stereotaxic coordinates. Academic, New York. 1986.

37.       Nayebi AM, Rad SR, Saberian M, Azimzadeh S, Samini M. Buspirone improves 6-hydroxydopamine-induced catalepsy through stimulation of nigral 5-HT1A receptors in rats. Pharmacological reports. 2010;62(2):258-64.

38.       Aghaei I, Nazeri M, Shabani M, Mossavinasab M, Mirhosseini FK, Nayebpour M, et al. Erythropoietin ameliorates the motor and cognitive function impairments in a rat model of hepatic cirrhosis. Metabolic brain disease. 2015;30(1):197-204.

39.       Chao Y-H. Investigation on Alternative Treatment Approaches in the Unilateral 6-OHDA Lesion Rat Model of Parkinson's Disease 2014.

40.       Hajali V, Sheibani V, Ghazvini H, Ghadiri T, Valizadeh T, Saadati H, et al. Effect of castration on the susceptibility of male rats to the sleep deprivation-induced impairment of behavioral and synaptic plasticity. Neurobiology of learning and memory. 2015;123:140-8.

41.       Morris R, Garrud P, Rawlins Ja, O'Keefe J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 1982;297(5868):681.

42.       Kamat PK, Kalani A, Tyagi N. Method and validation of synaptosomal preparation for isolation of synaptic membrane proteins from rat brain. MethodsX. 2014;1:102-7.

43.       Deumens R, Blokland A, Prickaerts J. Modeling Parkinson's disease in rats: an evaluation of 6-OHDA lesions of the nigrostriatal pathway. Experimental neurology. 2002;175(2):303-17.

چک لیست کار با حیوان آزمایشگاهی پیوست می باشد.