بررسی اثر مهاری عصاره هیدروالکلی شیره درخت انجیر (Ficus carica) بر تکثیر رده سلولی کارسینومای سلول سنگفرشی دهان ( (C152 (KB)

سرطان دهان (Oral cancer) یک عبارت کلی است و تمام بدخیمی­ های متنوعی که در بافت دهان تظاهر می­ یابند را شامل می­شود. سرطان دهان هرچند دارای انواع و مراحل مختلفی می­ باشد اما همواره کیفیت زندگی بیمار را تحت تاثیر قرار می ­دهد.  در قاره آسیا سرطان دهان با وقوع 274300 مورد جدید در سال به عنوان ششمین بدخیمی شایع طبقه­ بندی می­ شود. با وجود این­ که نرخ وقوع سرطان دهان در این قاره 10 مورد به ازای هر 100000 نفر گزارش شده­ است اما وقوع آن در برخی مناطق مانند قسمت­ هایی از هند به 21/4 به ازای هر 100000 نفر نیز می­ رسد. در اکثر موارد سرطان دهان به صورت سرطان سلول­ های سنگفرشی دهان (Oral squamous cell carcinoma) تظاهر می­ یابد. مصرف الکل، تنباکو، آرکانات و فاکتور­های تغذیه ­ای از جمله ریسک فاکتور­های OSCC می­ باشند. ویروس های پاپیلومای انسانی شماره 16 و 18 (HPV-16  & HPV-18) نیز دارای ریسک بالایی در همراهی با تومورهای بدخیم می­باشند.(1)

شیره درخت انجیر (Ficus carica latex) از دیرباز در طب سنتی ایرانیان مورد استفاده بوده­ و در کتاب قانون در طب بوعلی سینا نیز به آن اشاره شده ­است.(2) در مطالعه ­ای که در سال 2010 توسط Oliveira و همکاران انجام شد 7  نوع فیتواسترول (Phytosterols)، 18 نوع اسید­چرب و 13 نوع آمینواسید آزاد در شیره انجیر مورد شناسایی قرار­گرفت. در انسان فیتواسترول­ها و برخی از اسید­های چرب چند­تایی اشباع نشده (Polyunsaturated fatty acids) به خاطر ویژگی­های ضد­سرطانی­ شان (Anticarcinogenic) شناخته­ می­ شوند و برخی آمینواسید­ها نیز به عنوان انتقال­ دهنده عصبی (Neurotransmitter) به­ حساب می­ آیند. بنابراین شیره درخت انجیر با دارا بودن طیف وسیعی از ترکیبات پتانسیل فارماکولوژیک بالایی خواهد­­داشت.(3)

مطالعاتی که تا کنون صورت گرفته است اثرات متعددی از شیره درخت انجیر از جمله کاربرد آن در درمان زگیل (Wart)(4) و اثرات مهاری در تکثیر (Multiplication) ویروس­ها و نقش احتمالی آن به عنوان یک داروی گیاهی در درمان بیماری­ های عفونی ناشی از هرپس ویروس (Herpes virus)، اکوویروس (Echovirus) و آدنوویروس (Adenovirus)(5) را نشان داده­ است. عصاره متانولی حاصل از برگ درخت انجیر نیز خاصیت ضدمیکروبی قوی علیه باکتری­های دهان و اثر سینرژیک با آمپی­سیلین و جنتامایسین را نشان داده ­است.(6)

در مطالعه ای که در سال 2018 توسط Ghandehari و Fatemi انجام شد اثر شیره انجیر در سرطان سینه ایجاد شده توسط 7,12-dimethylbenz (a) anthracene در موش مورد بررسی قرار گرفت. در گروه درمان­ شده توسط شیره انجیر سایز تومور به ­طور معناداری کاهش نشان داد در حالی که اثر سوئی بر فاکتور­های هماتولوژیک و هیستولوژیک گزارش نشد.(7)

در مطالعه دیگری که در سال 2015 توسطTezcan و همکاران در ترکیه انجام شد، شیره انجیر سبب مرگ سلولی در سلوهای گلیوبلاستوما (Glioblastoma) شد که این اثر با تموزولاماید (Temozolomid)، داروی شیمی درمانی در بدخیمی­ های مغزی، دارای اثر سینرژیک بود. به­ علاوه در این مقاله برای نخستین بار اثر شیره درخت انجیر در تعدیل بیان let-7d (نوعی از Micro RNAs) گزارش شد که می­ تواند به عنوان مکانیزم مهمی در اثرات ضد­تکثیری شیره انجیر باشد.(8)

مطالعه دیگری که در سال 2013 توسط Hashemi و Abediankenari درباره اثر مهاری شیره درخت انجیر بر تکثیر سلولی سرطان مری انجام شد، نشان داد که این ماده می­تواند به عنوان یک عامل برای مهار تولید و پیشرفت سلول­ های سرطانی باشد.(9)

مطالعه ­ای که در سال 2011 توسط Hashemi و همکاران انجام شد، اثرات مهاری شیره درخت انجیر را بر تکثیر سلولی سرطان معده بدون ایجاد اثر سایتوتوکسیک بر سلول­های انسانی نرمال نشان داد.(10)

مطالعه مقایسه ­ای که در سال 2007 توسط Bohlooli و همکاران جهت مقایسه کارایی شیره درخت انجیر و کرایوتراپی (Cryotherapy) در درمان زگیل انجام شد نشان داد که شیره درخت انجیر در نواحی لبه ­ای در مقایسه با کرایوتراپی دارای تاثیر کم­تری است اما برخلاف کرایوتراپی فاقد عوارض جانبی می­ باشد.(11)

ضایعات حاصل از تکثیر سلولی (Proliferation) بخش زیادی از ضایعات حفره دهان را تشکیل می­ دهند. از طرفی ویروس ها نیز در این ضایعات نقش مهمی بر عهده دارند. به استناد مطالعات صورت گرفته شیره درخت انجیر دارای اثرات  ضدتکثیری (Anti-proliferative) و ضد­ویروسی (Antiviral) متعدد به ویژه در برابر ویروس پاپیلومای انسانی می­ باشد. بنابراین به نظر می­ رسد این ماده می ­تواند در درمان ضایعات دهان  نقش مهمی داشته ­باشد. با توجه به این­ که تا کنون هیچ مطالعه ­ای جهت کاربرد شیره انجیر در درمان ضایعات حفره دهان به خصوص کارسینوم سلول سنگفرشی انجام نشده­ است، این مطالعه سعی دارد به بررسی اثر مهاری شیره درخت انجیر در سرطان دهان بپردازد.

میزان درصد مرگ سلولی در یک الگوی وابسته به دوز (غلظت­های Mg/ml 0، Mg/ml 0/25، Mg/ml 0/5، Mg/ml 1، Mg/ml 2/5، Mg/ml 5، Mg/ml 10 عصاره هیدروالکلی شیره درخت انجیر) در رده سلولی کارسینومای سلول­ سنگفرشی دهان در سلول های تیمار شده و سلول های تیمار نشده متفاوت است.

تعیین اثر مهاری عصاره هیدروالکلی شیره درخت انجیر (Ficus carica) بر  تکثیر رده سلولی کارسینومای سلول سنگفرشی دهان ((C152 (KB).

مقایسه میزان درصد مرگ سلولی در یک الگوی وابسته به دوز (غلظت­های Mg/ml 0، Mg/ml 0/25، Mg/ml 0/5، Mg/ml 1، Mg/ml 2/5، Mg/ml 5، Mg/ml 10 عصاره هیدروالکلی شیره درخت انجیر) در رده سلولی کارسینومای سلول­ سنگفرشی دهان در سلول های تیمار شده با سلول های تیمار نشده.

دندان­پزشکان، متخصصین بیماری­ های فک و صورت، موسسات تحقیقاتی درمان سرطان.

سرطان سلول­ سنگفرشی دهان (Oral squamous cell carcinoma) شایعترین بدخیمی اپیتلیالی حفره دهان است. مصرف الکل، تنباکو، آرکانات و فاکتور­های تغذیه­ای از جمله ریسک فاکتور­های OSCC می­باشند.(1)

مطالعه تجربی (Experimental Study)

نمونه مورد مطالعه، رده سلولی قابل کشت سرطان دهان می­ باشد که از بانک سلولی ملی ایران (NCBI) با مشخصات NCBI=C152 (KB) تهیه خواهد­شد.

پلیت با 96 چاهک که در هر چاهک 5000 سلول از کارسینومای سلول­ های سنگفرشی دهان در حجم 200 میکرولیتر از محیط کشت قرار می­ گیرد.(9و 10)

ندارد.

فرم اطلاعاتی ثبت داده­ ها (پیوست شماره یک)

شیره درخت انجیر به صورت قطره-قطره از طریق جدا کردن برگ­های جوان درخت جمع ­آوری و می­ شود و سپس در دمای˚C20- نگه­داری می­ شود. در مرحله بعد شیره توسط دستگاه سوکسیله بصورت هیدروالکلی عصاره گیری شده و بعد از جمع اوری عصاره؛ تحت فرآیند خشک­ کردن انجمادی (Lyophilization) حلال استخراج و عصاره بصورت لیوفلیزه تهیه می شود  و سپس غلظت­های mg/ml 0، mg/ml 0/25، mg/ml 0/5، mg/ml 1، mg/ml 2/5، mg/ml 5، mg/ml 10 از آن تهیه می­ شود.

در این مطالعه دو گروه سلولی مورد مطالعه قرار می گیرند 1. سلول های تیمارنشده یعنی سلولهایی که در محیط کشت آن ها از عصاره هیدروالکلی شیره درخت انجیر استفاده نمی شود. این گروه سلولی بعنوان گروه کنترل در نظر گرفته می شود. 2. سلول های تیمارشده که شامل سلول هایی که در محیط کشت آن ها از عصاره هیدروالکلی شیره درخت انجیر در غلظت های mg/ml 0/25، mg/ml 0/5، mg/ml 1، mg/ml 2/5، mg/ml 5، mg/ml 10 استفاده خواهد شد. در این مطالعه نمونه سلولی قابل کشت سرطان دهان از بانک سلولی ملی ایران (National Cell Bank of Iran) با مشخصات NCBI꞊C152 (KB) تهیه خواهد­شد. 10⁴×3 سلول در محیط کشت مایع (RPMI 1640) حاویfetal calf serum 10% و  U/L10 پنی­ سیلین و µg/ml 10 استرپتومایسین کشت داده می­ شود. محیط کشت در دمای ˚C37، رطوبت 95 درصد و % CO₂5  نگه­داری می­شود. سلول‌های کشت شده از نظر رشد، تقسیم سلولی، تراکم، مرفولوژی و آلودگی هر روز کنترل شدند. برای تعویض محیط کشت، بدنبال ضدعفونی کردن اطراف فلاسک‌ها به زیر هود لامینار منتقل شده و سوسپانسیون سلولی به طریق استریل به لوله ­های فالکون استریل تخلیه شد و پس از سانتریفوژ کردن با دور RPM1500، محلول رویی دور ریخته شد. سپس سلول‌ها با بافر PBS شستشو شدند. پس از سانتریفوژ کردن، به رسوب سلولی حاصل، محیط کشت جدید اضافه گردید و پس از پی­پتاژ کردن به فلاسک سلولی جدید منتقل و در انکوباتور نگهداری  خواهد شد. سپس بعد از اینکه تراکم سلولی در فلاسک به  85درصد سطح فلاسک رسید  تست تریپان بلو (Trypan blue) انجام می شود . تست تعیین میزان سلول‌های زنده به کمک رنگ تریپان بلو به منظور تعیین تعداد سلول‌های زنده در شمارش تام سلول‌های فلاسک ضروری است. به این منظور از رنگ­ آمیزی با تریپان بلو استفاده شد. این رنگ جز رنگ‌هایی است که سلول‌های زنده قادر به مقاومت در برابر ورود رنگ بوده ولی در سلول‌های مرده رنگ به راحتی به درون سلول راه یافته و سیتوپلاسم رنگ می­ گیرد. جهت رنگ ­آمیزی سلول‌ها 20 میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی با همان حجم از رنگ تریپان بلو در یک میکروتیوپ مخلوط شد و به مدت 2 دقیقه انکوبه گردید. سپس درصد سلول‌های تریپان بلو مثبت (سلول‌های مرده) به شرح ذیل تعیین شد. تعداد کل سلول‌ها در 4 مربع خارجی شمرده شد و پس از محاسبه میانگین، تعداد سلول‌ها در میلی ­لیتر سوسپانسیون سلولی از طریق فرمول زیر بدست آمد.

10⁴× ضریب رقت (2)× میانگین سلول‌های شمرده شده = تعداد سلول‌ها در میلی لیتر

برای محاسبه درصد سلول‌های مرده از فرمول زیر استفاده شد.

از رابطه زیر درصد سلول‌های زنده محاسبه شد.

(Viability) درصد سلول‌های زنده = درصد سلول‌های مرده – 100

یا

 سپس مشابه مطالعات انجام شده توسط دکتر هاشمی و عابدیان کناری(9 و 10) نمونه ها در پلیت کشت سلولی 96 خانه­ ای (96-well plates) قرار می­ گیرند و در دمای ˚C37، رطوبت %5 و CO₂ اتمسفر انکوباسیون انجام می­شود. سپس به گروه سلولی تیمار نشده (کنترل) محیط کشت ساده معمولی و به گروه سلولی تیمار شده محیط کشتهای حاوی عصاره هیدروالکلی شیره درخت انجیر در غلظت های mg/ml 0/25، mg/ml 0/5، mg/ml 1، mg/ml 2/5، mg/ml 5، mg/ml 10 افزوده خواهد شد. در پایان جهت ارزیابی درصد کاهش رشد سلولی از آزمون ارزیابی متیل تیازولیل تترازولیوم (Methyl thiazolyl tetrazolium assay) استفاده می­شود. در آزمون MTT assay از 3-[4,5-dimethylthiazolyl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide به عنوان معرف جهت سنجش میزان فعالیت سلولی استفاده می­شود. سلول‌ها سرطانی به تعداد 10⁵ سلول در هر میلی لیتر در هر یک از چاهک‌های پلیت 96 خانه­ ای با غلظت‌های مختلف عصاره mg/ml 0/25، mg/ml 0/5، mg/ml 1، mg/ml 2/5، mg/ml 5، mg/ml 10  در حجم نهایی 200 میکرولیتر در هر چاهک تیمار می شوند. یک چاهک به عنوان کنترل (بدون عصاره) و چاهک‌های کنترل حلال DMSO (مرک) نیز به عنوان چاهک کنترل حلال در نظر گرفته می شوند. در چاهک کنترل حلال به میزان چاهک متناظر خود، تنها DMSO اضافه خواهد شد . در تمام آزمایشات هیچگاه غلظت DMSO فراتر از 0/1 درصد حجمی/حجمی نخواهد بود. پس از تیمار  تست MTT به شرح زیر انجام می گردد:

 1 - 20میکرولیتر محلول MTT به هر یک از چاهک‌ها اضافه می شود و برای مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه می شود تا کریستالهای فورمازون تشکیل شوند.

2-محلول رویی دور ریخته می شود. 200 میکرولیتر حلال DMSO به هر چاهک اضافه و 2 ساعت در انکوباتور انکوبه می گردد (حل شدن کریستال‌های فورمازون)

3- OD  چاهک‌ها در طول موج 570 نانومتر توسط دستگاه Elisa reader قرائت می شود.

4-از طریق رابطه زیر درصد Viability محاسبه گردید.

تمام آزمایشات به صورت 3 تایی انجام گردیدند و سپس میانگین محاسبه گردید. آزمایش MTT  یک روش رنگ سنجی است که اساس آن احیاء شدن و شکسته شدن کریستالهای زرد رنگ تترازولیوم بوسیله آنزیم سوکسینات دهیدروژناز و تشکیل کریستالهای آبی رنگ نامحلول می باشد. در این روش، بر خلاف سایر روش ها، مراحل شستشو و جمع آوری سلول که اغلب باعث از دست رفتن تعدادی از سلول ها و افزایش خطای کار می شوند، حذف شده اند و تمام مراحل آزمایش از ابتدای کشت سلولی تا قرائت نتایج با الایزا ریدر، در یک میکروپلیت انجام می شود لذا تکرارپذیری، دقت و حساسیت آزمایش بالاست. در نهایت نتایج حاصل مورد تفسیر قرار می­ گیرند.

به منظور تجزیه و تحلیل داده ها از آزمون واریانس دو طرفه نان پارامتریکANOVA  وPost Hoc Tukey استفاده خواهد شد. نتایج به صورت Mean ± SD گزارش می شود و p<0.05 معنی دار در نظر گرفته می شود.

کدهای راهنمای عمومی اخلاق در پژوهشهای علوم پزشکی  دارای آزمودنی انسانی: کدهای 1، 3، 8، 10، 11،  13، 18،  25، 28، 29، 30، 31 

تاخیر در دریافت لوازم کشت و کیت ها که ممکن است مدت زمان انجام طرح را افزایش دهد.

شیره درخت انجیر، کارسینومای سلول سنگفرشی دهان، تکثیر سلولی

Fig tree latex, Oral squamous cell carcinoma, Cell proliferation

1.         Glick M. Burket’s oral medicine. 12th edition ed: People’s Medical Publishing House—USA; 2015:173-200.

2.         Avicenna.Canon of Medicine [CD-ROM], 2nd edn. Tehran:Iran Ministry of Health, 1998.

3.         Oliveira AP, Silva LR, Andrade PB, Valentao P, Silva BM, Goncalves RF, et al. Further insight into the latex metabolite profile of Ficus carica. J Agric Food Chem. 2010;58(20):10855-63.

4.         Hashemi SA, Abediankenari S. Successful treatment of common warts (Verruca vulgaris) with application of fig tree latex.  Journal of Scientific and Innovative Research. 2013;2(6):981-2.

5.         Lazreg Aref H, Gaaliche B, Fekih A, Mars M, Aouni M, Pierre Chaumon J, et al. In vitro cytotoxic and antiviral activities of Ficus carica latex extracts. Nat Prod Res. 2011;25(3):310-9.

6.         Jeong MR, Kim HY, Cha JD. Antimicrobial activity of methanol extract from Ficus carica leaves against oral bacteria. J Bacteriol Virol. 2009;39(2):97-102.

7.         Ghandehari F, Fatemi M. The effect of Ficus carica latex on 7, 12-dimethylbenz (a) anthracene-induced breast cancer in rats. Avicenna J Phytomed. 2018;8(4):286-95.

8.         Tezcan G, Tunca B, Bekar A, Yalcin M, Sahin S, Budak F, et al. Ficus carica latex prevents invasion through induction of let-7d expression in GBM cell lines. Cell Mol Neurobiol. 2015;35(2):175-87.

9.         Hashemi SA, Abediankenari S. Suppressive effect of Fig (Ficus Carica) latex on esophageal cancer cell proliferation. Acta Facultatis Medicae Naissensis. 2013;30(2):93-6.

10.       Hashemi SA, Abediankenari S, Ghasemi M, Azadbakht M, Yousefzadeh Y, Dehpour AA. The effect of Fig tree latex (Ficus carica) on stomach cancer line. Iran Red Crescent Med J. 2011;13(4):272-5.

11.       Bohlooli S, Mohebipoor A, Mohammadi S, Kouhnavard M, Pashapoor S. Comparative study of fig tree efficacy in the treatment of common warts (Verruca vulgaris) vs. cryotherapy. Int J Dermatol. 2007;46(5):524-6.

....

...

.....

....

....

....

....

....

....

...

...

پیوست شماره یک

فرم اطلاعاتی ثبت داده ­ها

عنوان طرح : بررسی اثر مهاری عصاره هیدروالکلی شیره درخت انجیر بر تکثیر رده سلولی کارسینومای سلول سنگفرشی دهان 

غلظت  عصاره هیدروالکلی شیره  درخت انجیر در محیط کشت سلولی:            

                                                                           0mg/ml       0/25mg/ml

                                                                                           1mg/ml          0/5mg/ml

                                                                                           2/5mg/ml            5mg/ml

                                                                                                                    10mg/ml

درصد مرگ سلولی: ...................