تعیین ژنوتایپهای بلاستوسیستیس هومینیس در کودکان با استفاده از روش sequencing- PCR در زاهدان جنوب شرق ایران

بلاستوسیستیس، انگلی تک یاخته ای، بی هوازی و زئونوز است که در روده بزرگ انسان و بسیاری از مهره داران دیگر یافت می شود که به دفعات از نمونه های مدفوع در آزمایشگاه های انگل شناسی جدا می شود(1, 2). حدود یک قرن از تشخیص آن در نمونه ی مدفوع انسان می گذرد اما تا مدت ها آن را یک انگل غیر بیماریزا می شناختند تا این که در سال های اخیر این انگل به خصوص در بیماران خاص و دارای علائم بالینی مورد اهمیت قرار گرفته است (3, 4).

کیست یا عامل عفونت زا، نسبت به آب مقاوم بوده و به صورت مستقیم از طریق آب  یا مواد غذایی آلوده در میان میزبان های مختلف که خیلی هم اختصاصی نیستند، منتقل می گردد(5, 6). شیوع این انگل در دنیا بین 8/0-8/61 درصد متغیر است. گزارشات نشان می دهد که آلودگی به این انگل علاوه بر کشورهای گرمسیر و نیمه گرمسیر نیز شایع می باشد. در کشورهای در حال توسعه، افراد مهاجر و پناهندگان در مقایسه با افراد بالغ  بومی و بچه هایی که از زمان تولد در آن محیط بزرگ شده اند، میزان بالاتری از آلودگی به این انگل را نشان می دهند(3, 7, 8). شیوع در نقاط مختلف ایران 22/. تا 4/54 درصد گزارش شده است(9, 10). بسیاری از مطالعات بلاستوسیستیس را بیماریزا و علائمی مانند اسهال حاد و مزمن، درد و نفخ شکم، یبوست، تهوع، سندرم تحریک پذیری و التهاب روده ای را به آن نسبت می دهند. این شاخص ها و تغییرات پاتولوژی در حیوانات آزمایشگاهی و کشت سلولی هم به اثبات رسیده ولی از آنجا که مانند بعضی دیگر از انگل های گوارشی، این انگل در افراد فاقد علامت هم دیده می شود، بیماریزایی آن بحث برانگیز شده است(11, 12).

این انگل با داشتن سیر تکاملی متعدد و روش های متنوع تکثیری مانند تقسیم دوتایی، جوانه زدن، اندودیوژنی، اسپوروگونی، شیزوگونی و همچنین اشکال مختلف مرفولوژیکی مانند فرم های واکوئوله، گرانوله، آمبوئید و کیستی با ابعاد  nm 200- 2، انگلی مرموز و منحصر به فرد است و متاسفانه این شاخص ها، باعث کاهش در حساسیت و ویژگی میکروسکوپی شده اند(4, 13, 14).

برای تشخیص از روش های مستقیم، رنگ آمیزی، و کشت با حساسیت های به ترتیب 7/36 %، 50 %، 83 % نسبت به PCR  استفاده می شود ولی روش PCR   در مقایسه با سایر روش ها دارای ویژگی و حساسیت بالاتری است(14, 15). تشخیص تنوع گونه­ای انگل در مناطق مختلف جغرافیایی و تشخیص سویه­های مشترک بین انسان و حیوان می­تواند در ارائه راهکارهای پیشگیری کمک کننده باشد.

با توجه به تنوع ژنتیکی بلاستوسیستیس و احتمال انتقال گونه های حیوانی انگل به انسان و همچنین با توجه به اینکه تاکنون در شهر زاهدان مطالعه­ای در خصوص تعیین میزان شیوع این تک یاخته انگلی و ژنوتیپ های موجود و ارتباط گونه ها و این ژنوتیپ ها با نشانه های بالینی در بیماران صورت نپذیرفته است . هدف از انجام این مطالعه تعیین شیوع گونه های بلاستوسیستیس در کودکان زیر 10 سال شهر زاهدان با استفاده از روش PCR-sequencing می باشد.

• در سال 2008 ریورا در فیلیپین، با تعیین توالی ژن SSU rRNA، 4 زیرنوع1، 2، 3 و6 را در بلاستوسیستیس شناسایی کردند. این مطالعه نشان داد که بلاستوسیستیس می­تواند یک انگل مشترک بین انسان و حیوان باشد(5).
• در سال 2011 ملونیو همکاران در ایتالیا،  با بررسی ژنوتیپ­های گوناگون بلاستوسیستیس به روش تعیین توالی ژن SSU rRNA، شیوع زیرنوع­های انگل را تعیین نمودند و نشان دادند که اکثر ژنوتیپ­های شناسایی شده در ایتالیا انگل مشترک بین انسان و دام می­باشد(16).
• در سال 2011 موسوی و همکاران در تهران ، 100 نمونه مثبت از نظر بلاستوسیستیس را به روش آزمون میکروسکوپی و کشت شناسایی نمودند و در بیماران دارای علائم بالینی، شیوع زیر نوع 1 انگل را از سایر انواع بیشتر گزارش گردید(17).
• فورسال و همکاران در سال 2012، تنوع ژنتیکی انگل بلاستوسیسستیس را از 68 نمونه مدفوع بیمار مبتلا، به روش تعیین توالی انتهای ژن SSU rRNA در سودان بررسی کرده و 5 زیرنوع را شناسایی نمودند. در این بررسی زیرنوع 3 در مردان شایع­تر از زنان بود(18).
• در سال 2014 اساعیل فلاح و همکاران در تبریز، 558 نمونه مدفوع را به روش میکروسکوپی مورد بررسی قرار دادند که 146نمونه (17/26) آلوده به بلاستوسیستیس و دارای علائم بالینی، درد و نفخ شکم، تهوع، بی اشتهایی یودند(19).
• درمطالعه صورت گرفته توسط ابراهیم بادپروا و همکاران در سال 2012  در خرم آباد، 511 نمونه مدفوع را  پس از استخراج DNA با روش PCR مورد بررسی و مطالعه قرار دادند که نتایج نشان داد 33 نمونه(5/6 %) آلوده به بلاستوسیستیس بودند(20).
• در سال 2018 خادم وطن و همکاران در اهواز،  481 نمونه مدفوع با روش میکروسکوپی مورد بررسی قرار دادند که 50 نمونه بلاستوسیستیس هومینیس مثبت تشخیص داده شد. این در حالی است که با روش مولکولی این آمار به 69 مورد(35/14 %) مثبت رسید. ،  با تعیین توالی ژن SSU rDNA، 5 زیرنوع1، 2، 3 ،4 و5 را در بلاستوسیستیس شناسایی کردند. این مطالعه نشان داد که بیشترین ایزوله مربوط به زیرنوع3  (40 %) می باشد(21).

1. شایع ترین ژنوتیپ بلاستوسیتس هومینیس در کودکان بر حسب جنسکدام است؟
2.  شایع ترین ژنوتیپ بلاستوسیتس هومینیس در کودکان بر حسب جنسکدام است؟
3. توزیع فراوانی ژنوتایپ های بلاستوسیتس هومینیس افراد مبتلا به بلاستوسیتوزیس بر حسب جنس چقدر است؟
4. توزیع فراوانی ژنوتایپ های بلاستوسیتس هومینیس افراد مبتلا به بلاستوسیتوزیس بر حسب جنس چقدر است؟
5.  ژنوتیپ های مشترک انگل بلاستوسیتس هومینیس در افرادی که با حیوانات در تماس کدام است؟

تعیین ژنوتایپهای بلاستوسیستیس هومینیس در کودکان با استفاده از روش sequencing- PCR در زاهدان جنوب شرق ایران

1. تعیین شایع ترین ژنوتیپ بلاستوسیتس هومینیس در کودکان بر حسب جنس
2. تعیین شایع ترین ژنوتیپ بلاستوسیتس هومینیس در کودکان بر حسب جنس
3. توزیع فراوانی ژنوتایپ های بلاستوسیتس هومینیس افراد مبتلا به بلاستوسیتوزیس بر حسب جنس
4. توزیع فراوانی ژنوتایپ های بلاستوسیتس هومینیس افراد مبتلا به بلاستوسیتوزیس بر حسب جنس
5. تعیین ژنوتیپ های مشترک انگل بلاستوسیتس هومینیس در افرادی که با حیوانات در تماس

1. دانشگاه علوم پزشکی زاهدان

2. بیمارستان علی اصغر

3. بیمارستان امام علی (ع)

3. آزمایشگاه رفرانس دانشگاه علوم پزشکی زاهدان

بلاستوسیستیس هومینیس: انگلی تک یاخته ای، بی هوازی و زئونوز است که در روده بزرگ انسان و بسیاری از مهره داران دیگر یافت می شود

واکنش زنجیره پلی مراز(PCR):

واکنش زنجیره ای پلیمراز به واکنشی گفته می شود که برای تکثیر یک یا چند نسخه از یک قطعه مولکول DNA که موجب تولید میلیونها نسخه از یک توالی خواص DNA می گردد. این روش متکی بر چرخه حرارتی، شامل چرخه هایی از اعمال حرارت و سرد کردن واکنش برای ذوب و نسخه برداری آنزیمی مولکول DNA است.

PCR -sequencing:

در این روش، در ابتدا با انجام PCR ، قطعه مورد نظر در ژنوم تکثیر می شود. سپس محصول  PCRفرایند توالی یابی DNA با تشخیص ترتیب نوکلئوتیدهای یک قطعه در ناحیه مورد نظر ازکه مورد تکثیر قرار گرفته است صورت می پذیرد.

مقطعی توصیفی-تحلیلی

کودکان کمتر از 10 سال که به آزمایشگاه رفرانس استان  و بیمارستان کودکان علی اصغر مراجعه مینمایند.

معیار ورود:

کودکان کمتر از 10 سال

تکمیل فرم رضایت آگاهانه و تکمیل  فرم اطلاعاتی در غالب پرسشنامه

معیار خروج:

عدم رضایت آگاهانه والدین کودکان

 با توجه به نتایج بررسی های مشابه در ایران که شیوع این بیماری برابر با 20 تا 50 درصد می باشد و فرض اینکه شیوع بلاستوسیستوزیس در منطقه برابر با 30 تا 40 درصد باشد با در نظر گرفتن اطمینان 95 درصد و دقت نسبی 10 درصد، بر اساس نیاز به حداقل 30 مورد مثبت بلاستوسیستوزیس حجم نمونه بر اساس فرمول ذیل، برابر با 294  نفر تعیین می گردد.

تصادفی ساده از مراجعه کنندگان به ازمایشگاهها و بیمارستانهای تحت پوشش دانشگاه علوم پزشکی زاهدان

برای ثبت نتایج از فرم اطلاعاتی و چک لیست استفاده خواهد شد ( فرم تهیه شده ضمیمه می باشد) 

پس از هماهنگی با معاونت محترم تحقیقات و فناوری دانشگاه علوم پزشکی زاهدان و کسب مجوز رسمی جهت انجام نمونه گیری در آزمایشگاه رفرانس استان و بیمارستان علی اصغر زاهدان، تعداد 294 نمونه مدفوع از کودکان مراجعه کننده به بیمارستان علی اصغر و آزمایشگاه رفرانس استان پس از تکمیل فرم رضایت آگاهانه و تهیه فرم ثبت مشخصات مربوط به هر نمونه، جمع آوری خواهد گردید. جمع آوری نمونه بصورت روزانه انجام می گیرد و بررسی میکروسکوپی از نظر وجود بلاستوسیتیس انجام می گیرد. نمونه هایی که از نظر میکروسکوپی مثبت تشخیص داده شوند وارد مرحله تشخیص مولکولی خواهند شد.سپس نمونه های مثبت بعد از سکانس توسط نرم افزارMEGA6  یکی از نرم افزار های پرکاربرد بیوانفورماتیک مورد آنالیز فیلوژنتیکی و ترسیم درخت فیلوژنتیکی قرارخواهد گرفت.

استخراج DNA و تعیین ژنوتیپ در جایگاه­های شناسایی توالی­های ژن خاص بلاستوسیستیس (SSU rRNA ) با استفاده از کیت استخراج (AccuPrep® stool DNA extraction kit Bioneer, Daejeon, South Korea)  طبق دستورالعمل شرکت سازنده کیت صورت خواهد گرفت. قبل از کاربرد کیت، ابتدا پروسه منجمد کردن و فریز کردن متناوب جهت شکستن دیواره انگل بر روی نمونه ها انجام خواهد پذیرفت. DNA  استخراج شده تا زمان انجام واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR)  در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری خواهد شد. انجام واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR) با استفاده از پرایمرهای اختصاصی

 Blast 505 - 532 (5′ GGA GGT AGT GAC AAT AAATC 3) forward

Blast 998 - 1017 (5′ TGC TTT CGC ACT TGT TCATC 3′; reverse

در دماها و زمان­های مناسب طبق مطالعات گذشته صورت خواهد گرفت. باندهای مورد نظر در ژل الکتروفورز بررسی و تفسیر خواهد شد. سپس نمونه های مثبت جهت تعیین توالی در دانشگاه علوم پزشکی زاهدان انجام خواهند شد.

با استفاده از روش های آمار توصیفی: (تنظیم جدول توزیع فراوانی، رسم نمودار، تعیین شاخص های آماری) و روش های آمار تحلیلی:  ( استفاده از آزمون کای اسکوئر برای ارتباط بین متغییر های کیفی) داده ها با نرم افزار 24SPSS تجزیه و تحلیل خواهد شد.

در طرح فعلی کلیه کدهای اخلاقی مورد نظر طبق دستورالعمل کمیته اخلاق مسوب وزارت بهداشت و درمان و آموزش پزشکی رعایت می شود. و همچنین با اخذ رضایت کامل از والدین کودک، فرم رضایت آگاهانه اخذ خواهد گردید و تعهد داده می شود که نام و مشخصات افراد در هیچ گزارشی قید نشود، همچنین انجام این کار هیچگونه هزینه ای برای افراد نخواهد داشت.کد های مصوب کمیته کشوری اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی از دفترچه آزمودنی انسانی از کدهای (15،16،18،19،20،25،27،28،29،30،31،،1،4،5،7،10،11،13،14) استفاده خواهد شد و همچنین کد های مصوب کمیته کشوری اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی از دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش بر گروههای آسیب پذیر از کد های فصل اول: 1،2،3،4،5،7،8 و فصل دوم: 1،2،3،4،5،6،7،8،13،16،17،18،19،20،21  استفاده خواهد شد.

• هزینه بالای کیت  استخراج DNA و مواد مصرفی

راه حل: افزایش هزینه مربوط به طرح ورایزنی در مورد تامین مواد وسایل قبل از شرع کار

بلاستوسیستیس هومینیس،کودکان، روشهای مولکولی

Blastocystis hominis, children, PCR-sequencing

1.         Jones MS, Whipps CM, Ganac RD, Hudson NR, Boroom K. Association of Blastocystis subtype 3 and 1 with patients from an Oregon community presenting with chronic gastrointestinal illness. Parasitology research. 2009;104(2):341.

2.         Javaherizadeh H, Khademvatan S, Soltani S, Torabizadeh M, Yousefi E. Distribution of haematological indices among subjects with Blastocystis hominis infection compared to controls. Przeglad gastroenterologiczny. 2014;9(1):38.

3.         Souppart L, Sanciu G, Cian A, Wawrzyniak I, Delbac F, Capron M, et al. Molecular epidemiology of human Blastocystis isolates in France. Parasitology research. 2009;105(2):413.

4.         Zhang X, Qiao J, Zhou X, Yao F, Wei Z. Morphology and reproductive mode of Blastocystis hominis in diarrhea and in vitro. Parasitology research. 2007;101(1):43-51.

5.         Rivera WL. Phylogenetic analysis of Blastocystis isolates from animal and human hosts in the Philippines. Veterinary parasitology. 2008;156(3-4):178-82.

6.         Valido EM, Rivera WL. Colony growth of Philippine isolates of Blastocystis hominis in simplified, soft agar medium. Parasitology research. 2007;101(1):213-7.

7.         Hussein EM, Hussein AM, Eida MM, Atwa MM. Pathophysiological variability of different genotypes of human Blastocystis hominis Egyptian isolates in experimentally infected rats. Parasitology research. 2008;102(5):853-60.

8.         Lee I, Tan T, Tan P, Nanthiney D, Biraj M, Surendra K, et al. Predominance of Blastocystis sp. subtype 4 in rural communities, Nepal. Parasitology research. 2012;110(4):1553-62.

9.         Akhlaghi L SJ, Meamar AR, Razmjou E, Oormazdi H 4:. Frequency ofintestinal parasites in Tehran. Iran J Parasitol. 2009:44–7.

10.       Jafari R, Sharifi F, Bagherpour B, Safari M. Prevalence of intestinal parasites in Isfahan city, central Iran, 2014. Journal of Parasitic Diseases. 2016;40(3):679-82.

11.       Khademvatan S, Masjedizadeh R, Rahim F, Mahbodfar H, Salehi R, Yousefi-Razin E, et al. Blastocystis and irritable bowel syndrome: Frequency and subtypes from Iranian patients. Parasitology international. 2017;66(2):142-5.

12.       Elwakil HS, Hewedi IH. Pathogenic potential of Blastocystis hominis in laboratory mice. Parasitology research. 2010;107(3):685-9.

13.       Li LH, Zhang XP, Lv S, Zhang L, Yoshikawa H, Wu Z, et al. Cross-sectional surveys and subtype classification of human Blastocystis isolates from four epidemiological settings in China. Parasitology research. 2007;102(1):83-90.

14.       Stensvold R, Brillowska-Dabrowska A, Nielsen HV, Arendrup MC. Detection of Blastocystis hominis in unpreserved stool specimens by using polymerase chain reaction. Journal of Parasitology. 2006;92(5):1081-7.

15.       Dogruman-Al F, Simsek Z, Boorom K, Ekici E, Sahin M, Tuncer C, et al. Comparison of methods for detection of Blastocystis infection in routinely submitted stool samples, and also in IBS/IBD Patients in Ankara, Turkey. PloS one. 2010;5(11):e15484.

16.       Meloni D, Sanciu G, Poirier P, El Alaoui H, Chabé M, Delhaes L, et al. Molecular subtyping of Blastocystis sp. isolates from symptomatic patients in Italy. Parasitology research. 2011;109(3):613-9.

17.       Moosavi A, Haghighi A, Mojarad EN, Zayeri F, Alebouyeh M, Khazan H, et al. Genetic variability of Blastocystis sp. isolated from symptomatic and asymptomatic individuals in Iran. Parasitology research. 2012;111(6):2311-5.

18.       Forsell J, Granlund M, Stensvold CR, Clark G, Evengård B. Subtype analysis of Blastocystis isolates in Swedish patients. European journal of clinical microbiology & infectious diseases. 2012;31(7):1689-96.

19.       Fallah E, Mahami Oskouei L, Mahami Oskouei M, Safaiyan AR. Prevalence of blastocystis hominis infection in tabriz in 2009-2010. The Journal of Urmia University of Medical Sciences. 2014;25(2):113-8.

20.       Badparva e, Sadraei j, Frozandeh m, Khirandish f. A molecular prevalence of Blastocystis hominis in patients referred to medical diagnosis laboratories in Khorramabad city. scientific magazine yafte. 2012;14(4):107-12.

21.       Khademvatan S, Masjedizadeh R, Yousefi-Razin E, Mahbodfar H, Rahim F, Yousefi E, et al. PCR-based molecular characterization of Blastocystis hominis subtypes in southwest of Iran. Journal of infection and public health. 2018;11(1):43-7.

فرم اطلاعاتی طرح تحقیقاتی تعیین  شیوع

 شناسایی مولکولی و ژنوتایپینگ گونه های بلاستوسیستیس هومینیس در کودکان دارای علائم بالینی در جنوب شرق ایران با استفاده از روش  sequencing- PCR

مشخصات فردی:                                                                              تاریخ:

                                                                            کد بیمار:

1. نام و نام خانوادگی: .........

2. جنسیت: مذکر            مونث

3. سن بر حسب سال؟  .........

4. محل سکونت: شهر:           حاشیه شهر:                   روستا:

5. میزان تحصیلات: ............

6. آیا از آب تصفیه شده مصرف می کنید؟  بلی             خیر

7. آیا در کودک در تماس با حیوانات می باشد : بلی             خیر

8. نتیجه آزمایش مستقیم میکروسکوپی : مثبت             منفی

9. نتیجه PCR : مثبت                         منفی 

10. علائم بالینی گوارشی (اسهال-دل درد-دل پیچه- تهوع- نفخ و...)

بلاستوسیستیس یک عفونت انگلی می باشد دستگاه گوارش را درگیر کند و در گذشته آنرا غیر بیماریزا می دانستند ولی اخیرا برخی متخصصین معتقدند که می تواند سبب اسهال، درد و نفخ شکم، یبوست، تهوع و التهاب روده می گردد. تشخیص این بیماری براساس آزمایش مدفوع می باشد ولی جهت تایید در افراد مشکوک نیازمند آزمایشات دقیق تر و حساستری می باشد. این پژوهش می تواند در زمینه تشخیص و انتقال و پیشگیری از این عفونت که از طریق خوردن آب یا مواد غذایی آلوده و انواعی از آن که از راه حیوانات به انسان منتقل می شود، کمک کننده باشد. روش آزمایش بدون عارضه بوده و پس از اخذ نمونه مدفوع از شما بدون هیچ هزینه ای و رایگان انجام خواهد شد و در صورت تایید و یافتن ارتباط این آلودگی با علائم گوارشی درمان مناسب برای شما تجویز خواهد گردید.

برای انجام این پژوهش نیاز به خونگیری نمی باشد.

1- ویزیت رایگان و خارج از نوبت توسط متخصص

2-  انجام آزمایشات تخصصی بصورت رایگان

3- امکان دسترسی به پزشک معالج در صورت بروز هر گونه سوال بصورت شبانه روزی

خطری متوجه بیماران نیست. آزمایشات فقط نمونه بر روی نمونه مدفوع انجام خواهد شد و برای بیمار هیچگونه هزینه و خطری ایجاد نمی شود

هیچ گونه خطری متوجه بیماران نیست. آزمایشات بر روی نمونه مدفوع انجام خواهد شد.

در این آزمایشات تشخیصی هزینه به عهده مجری طرح خواهد بود و بیمار هزینه ای را پرداخت نخواهد کرد و برای بیماران کاملا رایگان خواهد بود.

تشخیص بیماری در این طرح بر اساس نمونه مدفوع تهیه شده از بیماران خواهد بود و سایر روشهای جایگزین هم اگر استفاده گردد دارای حساسیت و ویژگی پایین تری هستند که در آنها هم از نمونه مدفوع جهت تشخیص استفاده می گردد.

هویت واطلاعات بدست آمده از این مطالعه کاملا محرمانه بوده و فقط برای مقاصد پژوهشی بکار خواهد رفت. نتایج آزمایشهای به کار رفته به اطلاع بیمار خواهد رسید و این نتایج بصورت کاملاً محرمانه خواهد ماند.

شماره تماس به آزمودنی داده شد.

شرکت من درمطالعه کاملاً اختیاری است وآزاد خواهم بود که از شرکت درمطالعه امتناع نموده یا هرزمان مایل بودم بدون آنکه تغییری درنحوه رفتار پزشک درمانگر یا نحوه درمان ومراقبت ازبیماری اینجانب ایجاد شود ازپژوهش مذکور خارج شوم.

با توجه به اطلاعات موجود در این فرم و توضیحات حضوری مجری یا همکاران طرح موافقت خود را با شرکت در این مطالعه اعلان می نمایم. یک نسخه از این فرم به من داده شده و فرصت خواندن آن را داشته ام.