بررسی آزمایشگاهی اثر سایتوتوکسیک داروهای مختلف داخل کانال ریشه در غلظت های مختلف برکشت همزمان سلول های بنیادی مزانشیم دندانی به روش methylthiazole-diphenyl-tetrazolium(MTT)

یک شکل ایده آل درمان دندان های نابالغ ،درمان رژنراتیو است که درآن بافت پالپ ملتهب یا نکروزحذف و با بافت پالپ سالم جایگزین میشود.(1)

درمان رژنراتیو میتواند به عنوان روش طراحی شده براساس اصول بیولوژیک برای جایگزینی بافت های آسیب دیده از جمله عاج و ریشه و همچنین کمپلکس عاج_پالپ تعریف شود.(2)

معمولا آماده سازی کانال ریشه به صورت مکانیکی و شیمیایی با هیپوکلریت سدیم برای ضدعفونی کانال ریشه انجام میگیرد.(3)

در درمان هایregenerative دندان های نابالغ، به علت عدم تکامل ساختار دندان و نازک بودن دیواره های کانال ریشه آماده سازی مکانیکال دندان مقدور نبوده و بیشتر روی جنبه ی شیمیایی تمرکز میگردد.(4)

جهت آماده سازی شیمیایی کانال ریشه در endodontic regeneration و revascularization دارو های داخل کانال به طور گسترده استفاده میشوند. از جمله ی این داروها، ترکیبی از سیپروفلوکساسین-مترونیدازول و ماینوسایکلین به نام خمیرتریپل آنتی بیوتیک است.این ترکیب برعلیه باکتری های یافت شده در سیستم کانال ریشه عفونی براساس مطالعات invitroو invivoاثربخشی بالایی نشان داده است (5-6-7-8-9).اما ارتباط نزدیکی میان تغییر رنگ دندان و ماینوسیکلین وجود دارد(10)بنابراین Yassenو همکاران استفاده از خمیردوگانه(DAP)بدون ماینوسیکلین و یا تعویض ماینوسیکلین با آنتی بیوتیک دیگر - مدیفاید تریپل آنتی بیوتیک-(Amoxicillin,Cefaclor or Clindamycin)را پیشنهاد دادند.(11)

کلسیم هیدروکساید داروی داخل کانال دیگریست که به علت فعالیت ضدمیکروبی درکانال ریشه و ناحیه ی پری رادیکولار و همچنین خنثی کردن بقایای میکروبی درون کانال ریشه به طور رایج استفاده میشود.(12)

اکثر مطالعات در زمینه ی سایتوتوکسیسیتی مواد داخل کانال ریشه ، در کشت های تک سلولی انجام شده است.(13-14)در حالیکه در  co- cultureارتباط  متقابل بین سلولهای مختلف ایجاد میشود.این ارتباط بین سلولهای هتروتایپ برای تکامل بیولوژیک و ثبات عملکردی بافت ها و ارگانها لازم است و از طرفی تقسیم و تمایز سلولها را تحت تاثیر قرار میدهد.(15)در مطالعه ی کشت همزمان سلولهای بنیادی دندانی Suh و همکاران تمایز استئوژنیک،تقسیم سلولی و مینرالیزیشن در گروه co-culture   نسبت به گروه culture single بیشتربوده است. بنابراین در بررسی رفتار سلول های بنیادی در درمان رژنراتیو دندانی، بهتر است از روش کشت همزمان استفاده شود.(16)

تاکنون مطالعه ای که اثر سایتوتوکسیسیتی دارو های داخل کانال را در کشت همزمان سلولهای بنیادی دندانی بررسی کند ، در دسترس نمی باشد لذا هدف این مطالعه بررسی تاثیر این داروها روی بقای سلولهای بنیادی مزانشیمی در محیط کشت همزمان  به روش methylthiazole-diphenyl-tetrazolium(MTT) میباشد.

1_اثر سایتوتوکسیک کلسیم هیدروکساید/آب مقطر در غلظت های مختلف برکشت همزمان سلول های بنیادی اپیکال پاپیلا و پریودونتال لیگامنت چگونه است؟

2_اثر سایتوتوکسیک کلسیم هیدروکساید/کلرهگزیدین در غلظت های مختلف بر کشت همزمان سلول های بنیادی اپیکال پاپیلا و پریودونتال لیگامنت چگونه است؟

3_ اثر سایتوتوکسیک دابل آنتی بیوتیک/آب مقطر در غلظت های مختلف بر کشت همزمان سلول های بنیادی اپیکال پاپیلا و پریودونتال لیگامنت چگونه است؟

4_ اثر سایتوتوکسیک دابل آنتی بیوتیک/کلرهگزیدین در غلظت های مختلف بر کشت همزمان سلول های بنیادی اپیکال پاپیلا و پریودونتال لیگامنت چگونه است؟

5_بین اثر سایتوتوکسیک مواد مختلف داخل کانال بر کشت همزمان سلول های بنیادی اپیکال پاپیلا و پریودونتال لیگامنت تفاوت وجود دارد.

تعیین اثر سایتوتوکسیک دارو های مختلف داخل کانال ریشه در غلظت های مختلف برکشت همزمان سلول های بنیادی مزانشیم دندانی به روش methylthiazole-diphenyl-tetrazolium(MTT)

1_تعیین اثر سایتوتوکسیک کلسیم هیدروکساید/آب مقطر در غلظت های مختلف برکشت همزمان سلول های بنیادی اپیکال پاپیلا و پریودونتال لیگامنت

2_تعیین اثر سایتوتوکسیک کلسیم هیدروکساید/کلرهگزیدین در غلظت های مختلف بر کشت همزمان سلول های بنیادی اپیکال پاپیلا و پریودونتال لیگامنت

3_تعیین اثر سایتوتوکسیک دابل آنتی بیوتیک/آب مقطر در غلظت های مختلف بر کشت همزمان سلول های بنیادی اپیکال پاپیلا و پریودونتال لیگامنت

4_ تعیین اثر سایتوتوکسیک دابل آنتی بیوتیک/کلرهگزیدین در غلظت های مختلف بر کشت همزمان سلول های بنیادی اپیکال پاپیلا و پریودونتال لیگامنت

5_تعیین اثر سایتوتوکسیک مواد مختلف داخل کانال بر کشت همزمان سلول های بنیادی اپیکال پاپیلا و پریودونتال لیگامنت

دندانپزشکان_دانشجویان دندانپزشکی_دانشکده های دندانپزشکی

مدیفاید تریپل آنتی بیوتیک :ترکیبی از سه آنتی بیوتیک مترونیدازول _سیپرو فلوکساسین و سفاکلوراست.(5-6-7-8-9)

 تجربی

سلول های بنیادی استخراج شده از مولر سوم با ریشه نابالغ

معیار های ورود:

1) دندان اندیکاسیون کشیدن داشته باشد.

2) فاقد پوسیدگی یا ترمیم باشد.

3) سن بیمار 16_24 سال باشد و حداقل دو سوم ریشه تشکیل شده باشد.

4) بیمار سابقه ی بیماری سیستمیک نداشته باشد.

متغیر های مخدوش کننده:

1)مرگ سلول ناشی از تماس مستقیم دارو ( با تهیه ی شیرآبه و تیمار کردن سلول ها با آن از بروز این مشکل جلوگیری میشود.)

2)مرگ سلول ناشی از بی غذایی ( با اضافه کردن مواد غذایی به صورت روزانه به محیط کشت این مشکل حل میشود.)

     N = (z_{1- α/2} + z_{1- β}) ² ( s₁² + s₂² ) /  (x₁- x₂)²

با توجه  به مقاله های مشابه میزان تکرار برای هر غلظت 3 دفعه میباشد.(17)

α=0/05

β=0/05                                        

x1- x2=5

s = 5

بنابراین : n= 3

به روش آسان و در دسترس

جدول ثبت داده ها در گروه های مختلف با غلظت های مختلف رسم شده و اطلاعات را درآن مینویسیم.(جدول ضمیمه میشود)

دندان مولر سوم توسط دانشجو سال ششم کشیده میشود.کشت سلولی SCAP و PDL از ناحیه ی پری اپیکال دندان مولر سوم اهدا کننده جوان 16-24ساله که حداقل دو سوم ریشه تشکیل شده باشد به روش جدا سازی آنزیمی ,توسط مسوول آزمایشگاه انجام میشود  . از تمامی اهدا کنندگان رضایت نامه آگاهانه کتبی  و شفاهی گرفته میشود. دندان های کشیده شده بلافاصله با محلول استریل سالین فسفاته بافری (PBS) شسته شده و از ناحیه یCEJ قطع شده و لیگامنت پریودنتال و ناحیه ی پاپیلای اپیکال آنها خارج میشود.بافت به قطعات کوچکی تقسیم میشود و درمحلول 5 mg/ml از کلاژناز نوعI (Invitrogen ,Karlsruhe ,Germany) به مدت یک ساعت در دمای 37درجه سانتی گراد قرار داده میشود.محلول تک سلولی توسط عبور دادن محلولها از صافی سلولی 70میکرومتر(BD Biosciences, Heidelberg, Germany) به دست می آید.سلول ها در داخل فلاسک 25 به همراه محیط کشت DMEM حاوی FBS 15%و pen/strep 1% در داخل انکوباتور CO2 5%/ O2 95% قرار میگیرند. هر دو روز یکبار refreshمیشنود و بعد از اینکه 80% کف فلاسک از سلول پر شد پاساژ داده میشوند و محتویات یک فلاسک بین سه فلاسک تقسیم میگردد. برای انجام آزمایشات از سلولهای پاساژ سوم به بعد استفاده میگردد.

برای تیمار سلولها از پلیت های  insert 0/4میکرومتر (SPL Life Science, Gyeonggi-do ,South Korea ) استفاده می شود.بعداز کشت سلولها به تعداد مناسب در هر چاهک پلیت های 24 خانه این insert ها برروی چاهک قرارداده شده و درلایه بالایی سلولهای SCAP و در کف پلیت ها سلولهای PDL قرار میگیرند )25000 سلول در هرچاهک(.

خمیر دابل آنتی بیوتیک که شامل سیپروفلوکساسین(سیگما ـ فرانسه)  و مترونیدازول( سیگما ـ فرانسه) است با نسبت وزنی 1و1 حل شده در آب مقطر, حل  شده در کلرهگزیدین 2% (DENTSCARE LTDA Brasile) در غلظت های 0/125,0/25,1میلی گرم تهیه میگردد. پودر کلسیم هیدروکساید (سیگما ـ فرانسه) نیز در آب مقطر و کلرهگزیدین 2% حل شده و همانند دابل آنتی بیوتیک در غلظت های فوق آماده میگردد. سپس سلول های بنیادی با این غلظت ها مورد آزمایش تیمار شده و بعد از گذشت سه روز insert برداشته شده و نمک MTT اضافه میگردد .تمام مراحل کشت و تیمار سلول ها توسط دانشجو و با همکاری مسوول آزمایشگاه انجام  میشود.

درنهایت سمیت سلولی از طریق جذب نوری سلول های زنده با اسپکتروفوتومتر بررسی میگردد و توسط دانشجو اطلاعات جمع آوری میشود.برای هر غلظت 3بار تکرار خواهد شد.

داده ها به کمک آنالیز واریانس تجزیه و تحلیل و ازآزمون توکی برای مقایسه اثر سایتوتوکسیسته مواد در یک غلظت ثابت استفاده میگردد. سطح معنی داری p<0/05 در نظر گرفته میشود.

جدول-مقایسه ی سلولهای زنده در 4نوع ترکیب و 3 غلظت در روشMTT

طرح نیاز به بررسی در کمیته اخلاق  پژوهشهای پزشکی دارد.

(کدهای اخلاقی منطبق با کدهای مصوب حفاظت از آزمودنی در پژوهشهای علوم پزشکی الزامی است.)

کد های 1و5و9و10و11و12و13و14و15 از دفترچه ی راهنمای اخلاقی پژوهش با سلولهای بنیادی در جمهوری اسلامی ایران

کدهای 1و2و3و4و5و6و7و8و9و10و11و12 از کدهای راهنمای عمومی دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش برروی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی ایران

کدهای 1و2و3و4و5و7و8و9و10و11و12و13و14و15و16و17و18و19و20و21و22و23و24و25و26و27و28و29و30و31 از دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی در جمهوری اسلامی ایران رعایت میگردد.

1)استخراج سلولهای بنیادی و بررسی سایتوتوکسیسته مواد پرهزینه است لذا تعداد متغیر ها کم شد.

2)ایزوله کردن سلولها کاری دقیق و دشوار است بنابراین از آزمایشگاهی با سابقه کار زیاد همکاری خواستیم.

3)احتمال آلودگی محیط کشت وجود دارد که با در دست داشتن تعداد زیادی سلول, میتوانیم در صورت آلودگی ,سلول های جدید را جایگزین کنیم. 

کشت همزمان/دارو های داخل کانال/سلول های بنیادی

Co-culture/intracanal medicaments/stem cells

1.Huang AHC, Chen YK, Lin LM, Shieh TY, Chan AWS. Isolation and characterization of dental pulp stem cells from a supernumerary tooth. Journal of oral pathology & medicine. 2008; 37(9):571-4.

2.         Murray PE, Garcia-Godoy F, Hargreaves KM. Regenerative endodontics: a review of current status and a call for action. Journal of endodontics. 2007; (4): 377-90.

3.         Windley W, Teixeira F, Levin L, Sigurdsson A, Trope M.

Disinfection  of immature teeth with a triple antibiotic paste. Journal of endodontics. 2005; 31(6): 439-43.

4.         Found A. The microbial challenge to pulp regeneration. Advances in dental research. 2011; 23(3): 285-9.

5.         Hoshino E, Kurihara-Ando N, Sato I, Uematsu H, Sato M, Kota K, et al. In-vitro antibacterial susceptibility of bacteria taken from infected root dentine to a mixture of ciprofloxacin,metronidazole and minocycline. International endodontic journal. 1996; 29(2): 125-30.

6.         Sato I, Ando-Kurihara N, Kota K,Iwaku M, Hoshino E. Sterilization of infected root-canal dentine by topical application of a mixture of ciprofloxacin, metronidazole and minocycline in situ. International endodontic Journal. 1996;29(2):118-24

.7         Banchs F, Trope M. Revascularization of immature permanent teeth with apical periodontitis: new treatment protocol? Journal of endodontics. 2004; 30(4): 196-200.

8.         Jung I-Y, Lee S-J, Hargreaves KM. Biologically based treatment of immature permanent teeth with pulpal necrosis :a case series. Journal of endodontics.

2008;34(7):876-87.

9.         Reynolds K, Johnson JD,Cohenca N. Pulp revascularization of necrotic bilateral bicuspids International endodontic Journal. 2009:84-92.

10.Lenherr P, Allgayer N ,Weiger R ,Filippi A , Attin T, Krastl G. Tooth discoloration induced by endodontic materials: a laboratory study. International endodontic journal.2012;45(10):942-9.

11.Yassen GH, Al-Angari SS, Platt JA. The use of traditional and novel techniques to determine the hardness and indentation properties of immature radicular dentin treated with antibiotic medicaments followed by Ethylenediaminetetraacetic acid.

12 .Barnett F, Trope M, Rooney J, Tronstad L. In-vivo sealing ability of calcium hydroxide-containing root canal sealers. Dental Traumatology. 1989;5(1):23-6.

13 .   Lovelace TW, Henry MA, Hargreaves KM, Diogenes A. Evaluation of the delivery of mesenchymal stem cells into the root canal space of necrotic immature teeth after clinical regenerative endodontic procedure. Journal of endodontics. 2011;37(2):133-8.

14.  Park M, Pang N-S, Jung I-Y. Effect of dentin treatment on proliferation and differentiation of human dental pulp stem cells.Restorative dentistry & endodontics. 2015; 40(4):290-8.

15 . Mohammadi Z. Chlorhexidin  gluconate, its properties and applications in endodontics. Iranian  endodontic journal. 2008;2(4):113.

16. Suh J-D, Lim KT, Jin H, Kim J, Choung P-H, Chung JH.Effects of co-culture of dental pulp stem  cells and periodontal ligament stem cells on assembled dual disc scaffolds. Tissue Engineering and Regenerative Medicine.2014; 11(1):47-58.

17. Saberi A , Karkeabadi H ,Farhad Mollashahi N.Cytotoxicity of Various Endodontic of Materials on Stem cells of Human Apical Papilla.Iranian Endodontic Journal. 2016; 11(1):2.

جهت یافتن بهترین دوز دارو برای درمان دندان های نابالغ ، سلول های بنیادی از دندان کشیده شده استخراج میشود و تحت تاثیر داروهای مختلف قرار میگیرد .

ندارد

کمک به یافتن بهترین دوز دارو برای درمان ریشه ی دندان های نابالغ در کودکان و نوجوانان

ندارد

ندارد

هزینه پژوهش به عهده دانشکده دندانپزشکی و پژوهشگر مربوطه میباشد و بیمار هیچ هزینه ای پرداخت نمیکند.

ندارد

 نتایج آزمایشها و روشهای به کار رفته به اطلاع بیمار خواهد رسید و این نتایج بصورت کاملاً محرمانه و صرفاً جهت مقاصد پژوهش به کار خواهد رفت و هویت بیماری وی در چارچوب قانون و جامعه و خانواده محرمانه خواهد ماند.

آدرس و شماره تلفن تماس مجری طرح در اختیار بیمارقرار داده میشود تا وی در هر زمانی که مایل بود بتواند پرسشهای خود را در مورد پژوهش بپرسد.

شرکت من در مطالعه کاملاً اختیاری است و آزاد خواهم بود که از شرکت در مطالعه امتناع نموده یا هر زمان  که مایل بودم بدون آنکه تغییری در نحوه رفتار پزشک درمانگر یا نحوه درمان و مراقبت از بیماری اینجانب ایجاد شود از پژوهش مذکور خارج شوم.

با توجه به اطلاعات موجود در این فرم و توضیحات حضوری مجری یا همکاران طرح موافقت خود را با شرکت در این مطالعه اعلان می نمایم. یک نسخه از این فرم به من داده شده و فرصت خواندن آن را داشته ام.

جدول ثبت داده ها در گروه های مختلف با غلظت های مختلف 

مثلا در گروه دابل آنتی بیوتیک/آب مقطر در غلظت....