استفاده از خواص ادجوانتی نانولیپوزوم DOPE جهت افزایش پاسخ ایمنی درموش علیه عفونتهای ادراری

عفونت دستگاه ادراری یک عفونت رایج باکتریال هم در سطح جامعه و هم در سطح بیمارستان است، بطوریکه سالانه 150 میلیون نفر در سرتاسر جهان از این عفونت رنج می برند (1) و آنرا در ردیف دومین بیماری عفونی (بعد از عفونت دستگاه تنفسی) و نیز سومین عفونت معمول در بین عفونت های باکتریایی قرار می دهند (2, 3). از طرفی UTI معمولترین عفونت در بین بیماران با شرایط حاد و با مراقبت طولانی در بیمارستان است (4). عفونت دستگاه ادراری عامل حدود 40% تمام عفونت های کسب شده از بیمارستان و نیز عامل نیمی از موارد باکتریمی [1]است که با مرگ و میر بالا، دوره بستری طولانی و هزینه افزایش یافته درمانی همراه است (5). بر طبق آمار منتشر شده در آمریکا  UTIمنجر به حدود5/10میلیون مراجعه سالانه به پزشک و3-2 میلیون مراجعه به بخش اورژانس بیمارستانها می شود که منجربه  250 هزار مورد بستری در بیمارستان می شود (6, 7). همچنین طبق آمار منتشر شده، سپسیس[2] ناشی از این عفونت ها به عنوان دهمین عامل مرگ و میر در آمریکا محسوب می شود (8). بطور کلی تخمین زده می شود که نزدیک به 12% مردان و نیز 50% زنان حداقل یک عفونت  UTIرا در طول زندگی شان تجربه کرده اند و از هر 4 نفر مبتلا به UTI، 1 نفر حالت عودکنندگی را در عرض 6 ماه یا کمتر از آن نشان می دهد (9). عود عفونت ادراری یک مسئله رایج در بالین به شمار می­رود که همواره از موضوعات مورد بحث در درمان عفونت دستگاه ادراری بوده است.

 دندریتیک سل های نابالغ  از سلولهای مهم سیستم ایمنی هستند که در خط اول دفاعی بدن وظیفه شناسایی آنتی ژنها را دارند که این سلولها شناسایی و جذب آنتی ژن ها را طریق آندوسیتوز/فاگوسیتوز بواسطه رسپتورها  از جمله رسپتورهای مربوط به قند مانوز و مشتقات آن  انجام میدهند (32). گیرنده مانوز وظیفه شناسایی توالی های مانوزی بر روی پاتوژن ها و در نهایت ورود و عرضه آنتی ژن ها را به سلول های T را دارد (33). در همین راستا آنتی ژن رسانی هدفمند توسط گیرنده مانوز که بر روی APC های مختلف از جمله دندریتیک سل ها و ماکروفاژها وجود دارد به عنوان یک روش موثر و کارا در افزایش جذب و پردازش و عرضه آنتی ژن و درنهایت افزایش پاسخ سلول های T مورد توجه قرار گرفته است (34). به طوری که در مطالعات مختلف نشان داده شده است که مانوزیله کردن پروتئین می تواند 200 تا 10000 برابر توانایی تحریک کلون سلول های T را در مقایسه با زمانی که پروتئین غیر مانوزیله است افزایش دهد (35) به همین دلیل این گیرنده توسط انواعی از حمل کننده ها از قبیل لیپوزوم ها و نانو پارتیکل ها مورد هدف قرار گرفته است (36, 37).  

 هدف از این مطالعه این است که با استفاده  از نانولیپوزوم DOPE ، پروتئین فیوژن شده MrpH.FimH.FliC    را بصورت نانولیپوزوم تهیه کرده و پاسخ های ایمنی به خصوص ایمنی سلولی و همولار را برعلیه عفونت های ادراری ناشی از اشریشیا کلی و پروتئوس میرابیلیس در مدل موشی بررسی کنیم.

1. آیا  فیوژن پروتئین MrpH.FimH.FliC می تواند وارد نانولیپوزوم DOPE مانوزیله شده وارد شود و ترکیب پروتئین- لیپوزوم را تشکیل دهد ؟
2. آیا نانولیپوزوم DOPE می تواند خواص ادجوانتی از خود نشان دهد؟
3. نانولیپوزوم پاسخ ایمنی را افزایش خواهد داد یا خیر . در صورت افزایش به کدام سمت سوق می دهد سلولار یا همولار؟

استفاده از  نانو لیپوزوم DOPE مانوزیله شده جهت افزایش پاسخ ایمنی ایجاد شده با  فیوژن پروتئین MrpH.FimH.FliC  در مدل حیوانی علیه عفونتهای ادراری ناشی از اشریشیا کلی و پروتئوس میرابیلیس

1. مقایسه سطح ایمنی سلولی و همولار فیوژن پروتئین تنها و انکپسوله شده با نانولیپوزوم
2. مقایسه سطح ایمنی نانولیپوزومDOPE تنها و نانولیپوزومDOPE مانوزیله شده
3. بررسی پاسخ ایمنی سلولار در موشهای ایمن شده با فرم کپسوله شده فیوژن پروتئین
4. بررسی پاسخ ایمنی همولار در موشهای ایمن شده با فرم کپسوله شده فیوژن پروتئین

دانشگاه علوم پزشکی زاهدان ، موسسه سرم سازی رازی و انستیتو پاستور

کلونینگ و بیان: وارد کردن کل یا قسمتی از ژن یک آنتی ژن درون وکتورهای مهندسی شده بیانی و بیان آن در یک باکتری میزبان

نانو لیپوزوم: تهیه ذرات لیپوزوم در مقیاس بسیار کوچک نانومتر

مطالعه مداخله ای - تجربی

موشهای آزمایشگاهی از نوع  BALB/C . در صورتیکه سن موشها خارج از این محدوده باشد یا اینکه از نظر وزنی نسبت به سایرین کمتر باشند در آزمایش وارد نمیشوند و اگر در حین آزمایش به هر دلیلی ازبین بروند از آزمایش خارج میشوند.

با توجه به ماهیت طرح نیاز به نمونه گیری نمی باشد. جامعه آماری موشهای آزمایشگاهی می باشند که توجه به امکانات آزمایشگاهی برای هر گروه تعریف شده تعداد 10 موش سوری در نظر می گیریم.

در این طرح نیاز به نمونه گیری نمی باشد.

روش جمع آوری داده ها بر اساس آزمایشاتی می باشد که بر روی نمونه سرم و خود موشها انجام می شود

1. کلونینگ و بیان پروتئین های نوترکیب:

 از سیستم بیانی مناسب مانند pET28a-BL21(DE3) برای بیان فیوژن پروتئینهای ساخته شده استفاده می شود. در ابتدا تکثیر ژنهای مورد نظر بر اساس پرایمرهای طراحی شده با دو جایگاه آنزیم محدود کننده  انجام شده و سپس این قطعات با کیت تخلیص از ژل از روی ژل آگاروز استخراج می شوند. در مرحله بعد، برش آنزیمی این قطعات با دو آنزیم مربوطه انجام می شود. بعد از آن برش آنزیمی وکتور بیانی نیز با آنزیمهای محدودکننده انجام شده و سپس مرحله لیگاسیون قطعات برش خورده به داخل وکتور با آنزیم T4 ligase انجام می شود. در مرحله بعد سلول صلاحیت دار (Competent) شده میزبان بیانی طبق روش کلرید کلسیم ساخته شده و ترانسفورماسیون محصول لیگاسیون به داخل میزبان صلاحیت دار شده طبق پروتکل آن انجام می شود. پس از کشت محصول ترانسفورماسیون روی محیطهای کشت دارای مارکر مقاومت به آنتی بیوتیک (مانند کانامیسین)، کلونهای مورد نظر در محیط LB مایع حاوی آنتی بیوتیک کشت داده شده و تایید کلونهای مثبت با الکتروفورز روی ژل آگاروز و انتخاب کلونهای سنگین، انجام PCR روی کلونهای سنگین، برش آنزیمی با دو آنزیم محدود کننده و در نهایت تعیین توالی آنها انجام می گیرد.

پس از انتخاب کلونهای حاوی ژنهای مورد نظر، این کلونها روی محیط LB مایع دارای آنتی بیوتیک مورد نظر کشت داده شده و القای بیان پروتئین های نوترکیب در آنها با افزودن القا کننده مانند IPTG و بهینه کردن شرایط بیان پروتئینها از جمله با تغییر زمان انکوباسیون، تغییر غلظت القاکننده، تغییر دمای انکوباسیون و تغییر حجم کشت صورت خواهد گرفت.

2. ارزیابی Biological activity پروتئینهای فیوژن:

برای ارزیابی Biological activity پروتئین فیوژن MrpH.FimH.FliC ، از خاصیت فعال شدن TLR5 توسط پروتیین FliC موجود در این فیوژن ها و در نتیجه آن تولید اینترلوکین 8 در مسیر سیگنالینگ استفاده می شود. در این ارزیابی یک سلول دارای رسپتور TLR5 مانند HT29 از بخش بانک سلولی انستیتو پاستور تهیه شده و این سلول ها با دانسیته حدود 10⁵×4 سلول در پلیتهای کشت سلولی و در حجم 1 میلی لیتر از محیط DMEM غنی شده با FBS 10% (Biosera) و آنتی بیوتیک های پنی سیلین و استرپتومایسین (Biosera) کشت داده شده و بعد از انکوباسیون به مدت یک شبانه روز، سلول ها به مدت چندین ساعت با غلظتهای مختلف از پروتیین های فیوژن مورد نظر تخلیص و استریل شده انکوبه می شوند. سپس سوپ سلولی جمع آوری شده و بررسی سطح تولید اینترلوکین 8 (IL-8) این سلول ها با کیت مورد نظر و با روش الیزا انجام می شود.

 در تست Biological activity دیگر، ما از خاصیت هماگلوتیناسیونی مقاوم به مانوز پروتیین MrpH و خاصیت هماگلوتیناسیونی حساس به مانوز پروتیین FimH در این فیوژن پروتئینها استفاده خواهیم کرد که در این تست غلظتهای مختلف از پروتیینهای فیوژن به سوسپانسیون 3 تا 5 درصد گلبول قرمز اضافه شده و پروتیین MrpH و FimH موجود در این پروتیینهای فیوژن سبب هماگلوتیناسیون گلبول قرمز شده و در مورد فیوژنهای دارای پروتئین MrpH بعد از افزودن مانوز هماگلوتیناسیون مهار نشده ولی در فیوژنهای دارای تنها ملکول FimH هماگلوتیناسیون در حضور مانوز مهار می شود.

3.  ارزیابی خصوصیات پروتئینهای نوترکیب: در این مرحله بررسی بیان اولیه پروتئینهای تولید شده با روش SDS-PAGE طبق پروتکل آن با ژل آکریلامید در غلظتهای مختلف انجام شده و سپس تایید پروتئینهای مورد نظر با روش وسترن بلات و بر اساس آنتی بادی علیه His Tag موجود در انتهای پروتئینهای نوترکیب تولید شده طبق دستورالعمل آن انجام می شود.
4. تخلیص پروتیینهای بیان شده: پس از بدست آوردن بهترین شرایط بیان پروتینهای نوترکیب و تایید آنها با روشهای ذکر شده، تخلیص این پروتئینها با استفاده از رزین های نیکل دار و بر اساس واکنش His Tag موجود در انتهای پروتئینها با رزین های نیکل دار بر طبق پروتکل کیت مورد نظر انجام خواهد شد. پس از انجام تخلیص پروتیین ها، برای مشاهده کیفیت و غلظت پروتیین های تخلیص شده از روش SDS-PAGE و وسترن بلات استفاده می شود.
5. تهیه لیپوزوم مانوزیله:کلسترول به همراه مشتق مانوزی در کلروفرم و یا مخلوطی از کلروفرم/متانول حل میشوند و فیلم نازک لیپیدی از آنها تشکیل می شود. سپس از بافر فسفات برای هیدراته کردن و ساخت لیپوزوم ها استفاده می شود. با استفاده از فیلترهای پلی کربنات 200 نانومتری سایز آنها را به حدود 200 نانومتر رسانده شده و با استفاده از دستگاه زتاسایزر سایز لیپوزوم ها خوانده می شود. پتانسیل زتا هم تعیین می گردد.
6. تزریق به حیوان آزمایشگاهی (مرحله ایمنی زایی): برای انجام تست حیوانی، موشهای BALB/C ماده 6 تا 7 هفته ای تهیه می شود و آنها را به گروههای 4 گانه تقسیم بندی می کنیم (جدول شماره 1).

 تزریق از مسیر زیر جلدی و در سه دوز با فواصل دو هفته ای (روزهای 0، 14 و 28) انجام می شود.

جدول شماره 1:

بررسی پاسخهای ایمنی همورال و سلولی:

 در فاصله زمانی دو هفته بعد از تزریق سوم، تعداد 5 موش از هر گروه را انتخاب کرده و پس از معدوم کردن آنها کشت نمونه های طحال آنها در محیط کشت حاوی RPMI+FBS و آنتی بیوتیکهای پنی سیلین و استرپتومایسین انجام می شود. بعد از آن سوپ ها سلولی جمع آوری شده و ارزیابی پاسخ ایمنی سلولی روی سوپ سلولی جمع آوری شده با اندازه گیری سطح اینترلوکین 4 (IL-4) و اینترفرون گاما ( IFNg) با کیتهای الیزای موجود انجام می شود.

 بررسی عملکرد حفاظتی پروتئینهای تزریق شده در مدل موشی:

در مرحله بعدی، بررسی عملکرد پاسخهای ایمنی ایجاد شده در موشها در حفاظت از مثانه و کلیه آنها در برابر عفونت ادراری ایجاد شده مورد ارزیابی قرار می گیرد. در این مرحله ما نیازمند یک مدل چالش مثانه ای بهینه شده هستیم تا با تزریق دوز بهینه شده از سویه اشریشیاکلی یوروپاتوژنیک و پروتئوس میرابیلیس به مثانه موشها مراحل چالش انجام شود. در این مدل از روش تزریق دوز مورد نظر باکتری با استفاده از کاتترهای مخصوص به داخل مثانه استفاده می شود. ما بر طبق مقالات و مطالعات قبلی انجام شده در زمینه مدل چالش مثانه ای از دوز cfu 10⁸ باکتری برای تلقیح به داخل مثانه استفاده خواهیم کرد. برای ساختن مدل چالش مثانه ای، سویه اشریشیاکلی یوروپاتوژنیک و پروتئوس میرابیلیسی که برای ساخت فیوژن mrpH.fimH.fliC از ژنهای fimH و mrpH آن استفاده شده بود را به کار می بریم . برای آماده سازی دوز cfu 10⁸×1از باکتری جهت تلقیح، در ابتدا سویه باکتری مورد نظر در محیط LB مایع کشت داده شده و سپس از این کشت 18 تا 24 ساعته رسوب گرفته و با PBS شستشو داده شده و رسوب گرفته شده را با PBS 1% استریل تا حدی رقیق کرده که جذب آن در طول موج 600 نانومتر به حدود 1/0 برسد که این مقدار معادل cfu/ml 10⁸×1باکتری را در خود دارد (محلول نیم مک فارلند در طول موج 600 نانومتر و در جذب معادل 1/0 تعداد cfu/ml 10⁸×1 باکتری را در خود دارد). برای اطمینان از این غلظت باکتری در سوسپانسیون، چند رقت مختلف از این سوسپانسیون آماده و با روش Pour plate در روی محیط LB آگار کشت داده شده و پس از انکوباسیون 18 تا 24 ساعته شمارش کلنی آنها انجام می شود تا cfu/ml بدست آمده تایید شود. سپس 10 میلی لیتر از این رقت باکتریایی سانتریفوژ و رسوب به دست آمده در 1 میلی لیتر از PBS استریل حل می شود که این سوسپانسیون معادل cfu/ml 10¹⁰×1 باکتری را در خود دارد که همانند مرحله قبلی با روش کشت رقتهای مختلف و شمارش کلنی ها تایید CFU بدست آمده انجام می شود. حال اگر میزان 10 میکرولیتر از این سوسپانسیون باکتری برای تلقیح به مثانه هر موش برداشته شود آنگاه معادل CFU 10⁸ به هر موش تلقیح شده است. سپس مراحل بهینه کردن چالش مثانه در موشهای naive انجام می شود که در یک محیط کاری تمیز موشها از طریق داروهای بیهوشی کتامین و گزایلازین از مسیر داخل صفاقی (IP) بیهوش می شوند. سپس دوز مورد نظر از باکتری از طریق کاتترهای ریز مخصوص به داخل مثانه موشها تزریق می شود. بعد از به هوش آمدن موشها آنها را به چند دسته تقسیم کرده و در زمانهای 6، 12، 24، 48 و 72 ساعت ( 5 موش برای هر زمان) بعد از تلقیح باکتری آنها را کشته و شمارش باکتری در مثانه و کلیه این موشها انجام می شود به طوریکه موشها را از طریق نخاعی معدوم کرده و در زیر هود شکم آنها باز و مثانه و کلیه های آنها درآورده شده و در داخل اپندورف استریل به صورت جداگانه قرار داده می شود. سپس به خوبی این بافتها به صورت هموژن در آمده و کشت این بافتهای هموژن شده در سه رقت 10/1، 100/1 و 1000/1 انجام و پس از مخلوط شدن به صورت pour plate به صورت جداگانه در پلیت کشت داده می شود. پس از انکوباسیون  کشت ها، شمارش کلنی هر پلیت به صورت جداگانه انجام شد و عدد بدست آمده را در عکس ضریب رقت ضرب کرده تا میزان CFU/ml برای هر کدام به دست آید. پس از بهینه کردن مدل چالش مثانه ای این مدل روی موشهای گروههای اصلی انجام می شود که پس از طی زمان مورد نظر پس از چالش، موشها را معدوم کرده و در شرایط استریل مثانه و کلیه آنها را در آورده و پس از هموژن کردن و کشت شمارش کلنی آنها انجام شده تا بر اساس تعداد کلنی بدست آمده، میزان حفاظت دستگاه ادراری در برابر عفونت ادراری ایجاد شده در هر گروه موشی بر اساس عملکرد پاسخهای ایمنی ایجاد شده بدست آید.

Excell, SPSS

بر اساس پروتکل کار با حیوانات آزمایشگاهی مصوب وزارت بهداشت و درمان وآموزش پزشکی، کلیه کدهای  دستورالعمل دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش بر حیوانات رعایت خواهند شد.

1. تهیه وکتور بیانی Pet28a که با توجه به رایزنی های انجام شده در انستیتو پاستور ایران امکان فراهم شدن این وکتور وجود دارد.
2. بیان نشدن فیوژن پروتئین که در صورت وجود این مشکل مجبوریم از وکتورهای بیانی دیگری استفاده کنیم.
3. افزایش قیمت ارز و درنتیجه درخواست افزایش اعتبار پژوهشی

مدل حیوانی ( Animal study) ، اشریشیا کلی (Escherichia coli)، پروتئوس میرابیلیس (Proteus mirabilis )،  فیوژن پروتئین (Fusion Protein)

1.           Stamm WE, Norrby SR. Urinary tract infections: disease panorama and challenges. The Journal of infectious diseases. 2001;183(Supplement_1):S1-S4.

2.           Wright KJ, Seed PC, Hultgren SJ. Uropathogenic Escherichia coli flagella aid in efficient urinary tract colonization. Infection and immunity. 2005;73(11):7657-68.

3.           Klumpp DJ, Rycyk MT, Chen MC, Thumbikat P, Sengupta S, Schaeffer AJ. Uropathogenic Escherichia coli induces extrinsic and intrinsic cascades to initiate urothelial apoptosis. Infection and immunity. 2006;74(9):5106-13.

4.           Farrell D, Morrissey I, De Rubeis D, Robbins M, Felmingham D. A UK multicentre study of the antimicrobial susceptibility of bacterial pathogens causing urinary tract infection. Journal of Infection. 2003;46(2):94-100.

5.           Mathai D, Jones R, Pfaller M, America TSPGN. Epidemiology and frequency of resistance among pathogens causing urinary tract infections in 1,510 hospitalized patients: a report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (North America). Diagnostic microbiology and infectious disease. 2001;40(3):129-36.

6.           Schappert S, Rechtsteiner E. Ambulatory medical care utilization estimates for 2007. Vital and Health Statistics Series 13, Data from the National Health Survey. 2011(169):1-38.

7.           Foxman B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 2010;7(12):653.

8.           Durant L, Metais A, Soulama-Mouze C, Genevard J-M, Nassif X, Escaich S. Identification of candidates for a subunit vaccine against extraintestinal pathogenic Escherichia coli. Infection and immunity. 2007;75(4):1916-25.

9.           Walters MS, Mobley HL. Identification of uropathogenic Escherichia coli surface proteins by shotgun proteomics. Journal of microbiological methods. 2009;78(2):131-5.

10.         Welch RA, Burland V, Plunkett G, Redford P, Roesch P, Rasko D, et al. Extensive mosaic structure revealed by the complete genome sequence of uropathogenic Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2002;99(26):17020-4.

11.         Dhakal B, Kulesus R, Mulvey M. Mechanisms and consequences of bladder cell invasion by uropathogenic Escherichia coli. European journal of clinical investigation. 2008;38(s2):2-11.

12.         Edén CS, Jodal U, Hanson L, Lindberg U, Åkerlund AS. Variable adherence to normal human urinary-tract epithelial cells of Escherichia coli strains associated with various forms of urinary-tract infection. The Lancet. 1976;308(7984):490-2.

13.         Linder H, Engberg I, Baltzer IM, Jann K, Svanborg-Eden C. Induction of inflammation by Escherichia coli on the mucosal level: requirement for adherence and endotoxin. Infection and immunity. 1988;56(5):1309-13.

14.         Schembri MA, Kjaergaard K, Sokurenko EV, Klemm P. Molecular characterization of the Escherichia coli FimH adhesin. The Journal of infectious diseases. 2001;183(Supplement_1):S28-S31.

15.         Thankavel K, Madison B, Ikeda T, Malaviya R, Shah AH, Arumugam PM, et al. Localization of a domain in the FimH adhesin of Escherichia coli type 1 fimbriae capable of receptor recognition and use of a domain-specific antibody to confer protection against experimental urinary tract infection. Journal of Clinical Investigation. 1997;100(5):1123.

16.         Hagan EC, Mobley HL. Uropathogenic Escherichia coli outer membrane antigens expressed during urinary tract infection. Infection and immunity. 2007;75(8):3941-9.

17.         ANTONIA DE FRANCESCO M, Ravizzola G, Peroni L, Negrini R, Manca N. Urinary tract infections in Brescia, Italy: etiology of uropathogens and antimicrobial resistance of common uropathogens. Medical science monitor. 2007;13(6).

18.         Li X, Mobley HL. Vaccines for Proteus mirabilis in urinary tract infection. International journal of antimicrobial agents. 2002;19(6):461-5.

19.         Warren JW. Catheter-associated urinary tract infections. International journal of antimicrobial agents. 2001;17(4):299-303.

20.         Li X, Johnson DE, Mobley HL. Requirement of MrpH for mannose-resistantProteus-like fimbria-mediated hemagglutination byProteus mirabilis. Infection and immunity. 1999;67(6):2822-33.

21.         Cuadros C, Lopez-Hernandez FJ, Dominguez AL, McClelland M, Lustgarten J. Flagellin fusion proteins as adjuvants or vaccines induce specific immune responses. Infection and immunity. 2004;72(5):2810-6.

22.         Marciani DJ. Vaccine adjuvants: role and mechanisms of action in vaccine immunogenicity. Drug discovery today. 2003;8(20):934-43.

23.         Huleatt JW, Jacobs AR, Tang J, Desai P, Kopp EB, Huang Y, et al. Vaccination with recombinant fusion proteins incorporating Toll-like receptor ligands induces rapid cellular and humoral immunity. Vaccine. 2007;25(4):763-75.

24.         Gewirtz AT, Simon Jr PO, Schmitt CK, Taylor LJ, Hagedorn CH, O’Brien AD, et al. Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response. Journal of Clinical Investigation. 2001;107(1):99.

25.         Slütter B, Bal S, Keijzer C, Mallants R, Hagenaars N, Que I, et al. Nasal vaccination with N-trimethyl chitosan and PLGA based nanoparticles: nanoparticle characteristics determine quality and strength of the antibody response in mice against the encapsulated antigen. Vaccine. 2010;28(38):6282-91.

26.         Gelperina S, Kisich K, Iseman MD, Heifets L. The potential advantages of nanoparticle drug delivery systems in chemotherapy of tuberculosis. American journal of respiratory and critical care medicine. 2005;172(12):1487.

27.         Nagamoto T, Hattori Y, Takayama K, Maitani Y. Novel chitosan particles and chitosan-coated emulsions inducing immune response via intranasal vaccine delivery. Pharm Res. 2004;21(4):671-4.

28.         Perrie Y, Crofts F, Devitt A, Griffiths HR, Kastner E, Nadella V. Designing liposomal adjuvants for the next generation of vaccines. Advanced drug delivery reviews. 2016;99:85-96.

29.         Kazakov S. Liposome-nanogel structures for future pharmaceutical applications: an updated review. Current pharmaceutical design. 2016;22(10):1391-413.

30.         Fan Y, Sahdev P, Ochyl LJ, Akerberg JJ, Moon JJ. Cationic liposome–hyaluronic acid hybrid nanoparticles for intranasal vaccination with subunit antigens. Journal of Controlled Release. 2015;208:121-9.

31.         Bhowmick S, Ravindran R, Ali N. gp63 in stable cationic liposomes confers sustained vaccine immunity to susceptible BALB/c mice infected with Leishmania donovani. Infection and immunity. 2008;76(3):1003-15.

32.         Guermonprez P, Valladeau J, Zitvogel L, Théry C, Amigorena S. Antigen presentation and T cell stimulation by dendritic cells. Annual review of immunology. 2002;20(1):621-67.

33.         Taylor PR, Gordon S, Martinez-Pomares L. The mannose receptor: linking homeostasis and immunity through sugar recognition. Trends in immunology. 2005;26(2):104-10.

34.         Keler T, Ramakrishna V, Fanger MW. Mannose receptor-targeted vaccines. Expert opinion on biological therapy. 2004;4(12):1953-62.

35.         Tan M, Mommaas AM, Drijfhout JW, Jordens R, Onderwater JJ, Verwoerd D, et al. Mannose receptor‐mediated uptake of antigens strongly enhances HLA class II‐restricted antigen presentation by cultured dendritic cells. European journal of immunology. 1997;27(9):2426-35.

36.         White KL, Rades T, Furneaux RH, Tyler PC, Hook S. Mannosylated liposomes as antigen delivery vehicles for targeting to dendritic cells. Journal of pharmacy and pharmacology. 2006;58(6):729-37.

37.         Joralemon MJ, Murthy KS, Remsen EE, Becker ML, Wooley KL. Synthesis, characterization, and bioavailability of mannosylated shell cross-linked nanoparticles. Biomacromolecules. 2004;5(3):903-13.

با توجه به ماهیت مطالعه نیاز به پرسشنامه یا فرم مطالعاتی نمی باشد