بررسی اثر آنتی باکتریال عصاره های آبی و الکلی میوه و برگ گیاه Citrullus colocynthis بر مهار رشد و تکثیر باکتری های موثر در پوسیدگی دندان (استرپتوکوک موتانس و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس) _ مطالعه ی آزمایشگاهی

Citrullus colocynthis (حنظل، هندوانه ی ابوجهل، bitter apple) از جمله گیاهانی است که در طب سنتی، تغذیه و داروسازی به صورت وسیع مورد استفاده قرار گرفته است.  گزارش شده است که از این گیاه در طب سنتی برای درمان دیابت، درد مفاصل، عفونت های میکروبی مختلف، دندان درد و ... استفاده می شود⁽¹⁾. در مورد خواص دارویی اثبات شده ی این گیاه می توان به خواص ضدمیکروبی، ضدالتهاب و تسکین درداشاره نمود^(1-3).

از سوی دیگر عده ای از فعالان عرصه ی طب سنتی در ایران بر این باورند که استعمال این ماده بر روی پوسیدگی های دندانی می تواند باعث توقف پوسیدگی، رفع آن و حتی بازسازی دندان شود⁽⁴⁾ اما در جست و جو های ما هیچ تحقیق علمی و آزمایشگاهی در این زمینه پیدا نشد.

اثر ضدباکتریایی گیاهCitrullus colocynthis    بر روی بسیاری از باکتری ها مورد بررسی قرار گرفته است :

در مطالعه ی Elkamali و همکاران که بر روی اثر ضد باکتریایی عصاره های متانولی وآبی این گیاه بر روی 25 نوع باکتری عفونت زای روده و معده انجام شده است، مشخص شد که این عصاره ها اثر ضد باکتریایی موثری ندارند ⁽⁵⁾.

Marzouk و همکاران در مطالعه ای نشان دادند همه ی عصاره های آبی و استونی برگ، ریشه، میوه و دانه ی این گیاه بر روی چند نوع کوکسی گرم مثبت و باسیل گرم منفی و همچنین چند گونه قارچ اثر ضد باکتریایی و ضد قارچی دارند. همچنین بیان کردند استفاده ی دارویی این گیاه در بین مردم به عنوان یک ماده ی ضد میکروبی وسیع الطیف مورد اعتبار است ^(6).

طبق بررسی هایی که Mehta و همکاران انجام دادند، عصاره های اتر، کلروفرم، اتانولی و آبی میوه، برگ و ریشه ی گیاه بر روی گونه های حساس و مقاوم به داروی باکتری سل اثر ضد باکتریایی دارد. آنها اظهار کردند میوه ی این گیاه اثرات ضد باکتریایی وسیع الطیف دارد و از آن میتوان برای ساخت دارو های طبیعی ضد سل استفاده کرد ⁽⁷⁾.

پس از بررسی اثر ضد باکتریایی عصاره های اتانولی و آبی میوه، برگ و ریشه ی گیاه مورد نظر بر روی باکتری استافیلوکوک اورئوس، Najafi و همکاران بیان کردند که یکی از مواد شیمیایی موجود در عصاره ی اتانولی گیاه (برای مثال alkaloid ، flavonoide  و  glycoside ) میتواند اثر ضد باکتریایی قوی ای (حتی بیشتر از نووبیوسین) بر روی باکتری مورد مطالعه داشته باشد ⁽⁸⁾.

حذف میکروارگانیسم های پوسیدگی زای دندان یکی از فاکتور های بسیار مهم پیشگیری از پوسیدگی های اولیه یا باقی مانده دندان است . تحقیقات نشان میدهد که استرپتوکوک موتانس (Streptococcus mutans) و لاکتوباسیل اسیدوفیلوس (Lactobacillus acidophilus) جزو باکتری های شایع پوسیدگی زای دندان هستند .استرپتوکوک موتانس اصلی ترین عامل اتیولوژیک در پوسیدگی ها است که هم در شروع پوسیدگی ها نقش دارد و هم در پوسیدگی های مینا و عاج یافت می شود. همچنین لاکتوباسیل ها گروهی از باکتری ها هستند که به مقدار زیاد در پوسیدگی های عمیق عاجی دندان یافت میشوند ⁾⁹⁾.

در مطالعه ی حاضر، اثر ضدباکتریایی عصاره ی میوه وبرگ گیاه   citrullus colocynthis بر روی دو باکتری اصلی و شایع پوسیدگی زا (استرپتوکوک موتانس و لاکتوباسیل اسیدوفیل) مورد بررسی قرار خواهد گرفت .

1-اثرآنتی باکتریال عصاره ی آبی میوه ی citrullus colocynthis    در رقت های مختلف بر روی باکتری استرپتوکوک موتانس در محیط آزمایشگاهی چگونه است؟

2-اثرآنتی باکتریال عصاره ی الکلی میوه citrullus colocynthis    در رقت های مختلف بر روی باکتری استرپتوکوک موتانس در محیط آزمایشگاهی چگونه است؟

3-اثرآنتی باکتریال  عصاره ی آبی برگ citrullus colocynthis   در رقت های مختلف بر روی باکتری استرپتوکوک موتانس در محیط آزمایشگاهی چگونه است؟

4- اثرآنتی باکتریال عصاره ی الکلی برگ citrullus colocynthis   در رقت های مختلف بر روی باکتری استرپتوکوک موتانس در محیط آزمایشگاهی چگونه است؟

5-اثرآنتی باکتریال عصاره ی آبی میوه یcitrullus colocynthis   در رقت های مختلف بر روی باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس در محیط آزمایشگاهی چگونه است؟

6-اثرآنتی باکتریال عصاره ی الکلی میوهcitrullus colocynthis    در رقت های مختلف بر روی باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس در محیط آزمایشگاهی چگونه است؟

7- اثرآنتی باکتریال عصاره ی آبی برگcitrullus colocynthis    در رقت های مختلف بر روی باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس در محیط آزمایشگاهی چگونه است؟

8-اثرآنتی باکتریال عصاره ی الکلی برگcitrullus colocynthis   در رقت های مختلف بر روی باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس در محیط آزمایشگاهی چگونه است؟

9- در هریک از موارد بالا آیا اثرات مهاری عصاره الکلی و آبی citrullus colocynthis بر رشد باکتری ها قابل مقایسه با آنتی بیوتیک استاندارد (آمپی سیلین و ونکومایسین) است؟

تعیین اثر عصاره ی آبی و الکلی میوه و برگ گیاه Citrullus colocynthis   بر مهار رشد و تکثیر باکتری های  موثر در پوسیدگی دندان (استرپتوکوک موتانس و لاکتوباسیلوس اسیدوفیل)

1. تعیین اثر آنتی باکتریال عصاره ی آبی میوه citrullus colocynthis    در رقت های مختلف بر رشد  باکتری استرپتوکوک موتانس در محیط آزمایشگاهی
2. تعیین اثر آنتی باکتریال عصاره ی الکلی میوهcitrullus colocynthis    در رقت های مختلف  بر رشد  باکتری استرپتوکوک موتانس در محیط آزمایشگاهی
3. تعیین اثر آنتی باکتریال عصاره ی  آبی برگcitrullus colocynthis  در رقت های مختلف بر رشد  باکتری استرپتوکوک موتانس در محیط آزمایشگاهی
4. تعیین اثر آنتی باکتریال عصاره ی الکلی برگcitrullus colocynthis    در رقت های مختلف بر رشد  باکتری استرپتوکوک موتانس در محیط آزمایشگاهی
5. تعیین اثر آنتی باکتریال عصاره ی آبی میوه یcitrullus colocynthis    در رقت های مختلف بر رشد  باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس در محیط آزمایشگاهی
6. تعیین اثرآنتی باکتریال عصاره ی الکلی میوه یcitrullus colocynthis    در رقت های مختلف بر رشد  باکتری باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس در محیط آزمایشگاهی
7. تعیین اثر آنتی باکتریال عصاره ی آبی برگ citrullus colocynthis    در رقت های مختلف بر رشد  باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس در محیط آزمایشگاهی
8. تعیین اثر آنتی باکتریال عصاره ی الکلی برگcitrullus colocynthis    در رقت های مختلف بر رشد  باکتری باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس در محیط آزمایشگاهی
9. مقایسه ی اثر مهاری عصاره های آبی و الکلی citrullus colocynthis  بر رشد باکتری ها با آنتی بیوتیک استاندارد (آمپی سیلین و ونکومایسین).

داروسازان –باکتری شناسان-گیاه شناسان - دندانپزشکان

Citrullus colocynthis :

گیاهی است که در طب سنتی، تغذیه و داروسازی به صورت وسیع مورد استفاده قرار گرفته است⁽¹⁾

cariogenic bacteria:

باکتری هایی که باعث ایجاد پوسیدگی میشوند واز شایع ترین آنها باکتری استرپتوکوک موتانس  و لاکتوباسیل اسیدوفیل میباشند⁽⁹⁾

^{Anti-bacterial agent:}

موادی که سبب مهار رشد و تکثیر باکتری ها میشوند⁽⁶⁾

تجربی آزمایشگاهی

سویه های استانداردباکتری های استرپتوکوک موتانس و لاکتوباسیل اسیدوفیل که از مرکز ملی ذخایر ژنتیک و زیستی ایران تهیه می شود .

با توجه به اینکه چهار اثر عصاره ای بر روی دو نوع باکتری  مورد مطالعه قرار میگیرد و همچنین حداکثر ده غلظت برای عصاره ها در نظر گرفته شده است و طبق مطالعات مشابه برای هر غلظت میانگین سه دیسک مد نظر قرار میگیرد و کل آزمایشات برای دقت بیشتر سه بار تکرار میشود⁽¹⁰⁾ ، در مجموع تعداد 720 دیسک برای آزمایش لازم است .

4 ⨯ 2 ⨯ 10 ⨯ 3 ⨯ 3 = 720

در این صورت اگر تعداد هفت دیسک در هر پلیت  جای بگیرد، دوتای آن کنترل مثبت و منفی خواهد بود. پس  تعداد پنج دیسک حاوی عصاره در هر پلیت قرار داده میشود. در این صورت  120 پلیت باکتری (برای هر باکتری  60   پلیت)  در نظر گرفته میشود.

720 ÷ 5  = 120

بر اساس راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی، کد های: 1، 9، 28، 29، 30، 31

انجام آزمایشات و ثبت نتایج حاصل از آنها طبق فرم اطلاعاتی ضمیمه

میوه وبرگ تازه ی گیاه  citrullus colocynthis  جمع آوری شده و شست و شو داده میشوند و به مدت دو هفته زیر سایه خشک می شوند و با آسیاب به صورت پودر درآورده میشوند. سپس عصاره گیری با دستگاه سوکسله با دو حلال آب و اتانول 96% انجام می شود. پس از آن عصاره ها در دمای محیط قرار داده می شوند تا حلال ها پرانده شودو عصاره ی خالص به دست آمده جهت انجام آزمایش های میکروبی در یخچال نگه داری می شوند.

نمونه استاندارد دو باکتری استرپتوکوکوس موتانس و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس از انستیتو پاستور ایران تهیه می شود.

تعیین حساسیت باکتری ها در برابر عصاره ها به دو روش انتشار دیسکی(Disk diffusion method) و روش Microdilution صورت می گیرد.

روش انتشار دیسکی: کلنی های باکتریایی استاندارد به لوله ای محتوی محیط کشت Muller Hinton broth منتقل می شوند و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری می شوند. سپس کدورت محیط کشت مایع تا حد 0.5 مک فارلند تنظیم می گردد. 50 میکرولیتر از این محیط کشت مایع فوراً به مرکز پتری دیش حاوی Muller Hinton agar منتقل و به صورت یکسان در تمام پتری دیش با استفاده از سواب گسترده می گردد.

رقت های یک دوم(100%- 50%- 25%- 12.5%- 6.25%- 3.12%- 1.56%- 0.78%- 0.39%-019%) از عصاره در دی متیل سولفوکساید تهیه می شود سپس  دیسک های بلانک استریل را به 20 میکرولیتر از غلظت های مختلف عصاره آغشته میکنیم(3 دیسک برای هر غلظت) و بلافاصله بر روی پتری دیش های تلقیح شده با باکتری، قرار میدهیم (حداکثر 9 دیسک در هر پتری دیش، پتری دیش های با قطر 12 سانتی متر و رعایت فاصله حداقل 24 میلی متر بین دیسک ها و فاصله 15 میلی متر از لبه پتری دیش). آب مقطر استریل و آمپی سیلین و ونکومایسین به عنوان کنترل منفی و مثبت مورد استفاده قرار میگیرند. سپس نمونه ها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه در  محفظه حاوی شمع (Candle jar) قرارداده می شوند ( 5% دی اکسید کربن). پس از گرمخانه گذاری پتری دیش ها از نظر رشد یکسان کلنی ها(دانه دار، نمای شیشه مات یا شیشه خرد شده) و تشکیل منطقه مهار رشد، مورد بررسی قرار می گیرند و منطقه مهار رشد در اطراف هر دیسک بر حسب میلی متر اندازه گیری می شود. میانگین 3 دیسک یکسان برای هر رقت بعنوان اثر مهاری محاسبه می شود. آزمایش برای دقت بیشتر دوبار تکرار می شود.

عصاره ها و غلظت هایی که در روش انتشاردیسکی بیشتر از 10 میلی متر اثرمهاری بر روی رشد باکتری داشته باشند، به روش Microdilution در میکروپلیت برای تعیین دقیق رقت های

MIC (minimal inhibitory concentration), MBC (minimal bactericidal concentration)

مورد ارزیابی قرار می گیرند.

روش Microdilution: MIC عصاره ها به روش زیر اندازه گیری می شود: با استفاده از روش رقت سازی مایع (Broth microdilution method) در محیط کشت مولر-هینتون انجام می شود. ابتدا هر عصاره در 4% حجمی از DMSO حل می شود. رقت های سریالی با استفاده از محیط کشت مولر هینتون براث در غلظت های 0.50 – 0.01 % حجمی تهیه می شوند. 100 میکرو لیتر از سوسپانسیون باکتریایی (10⁶ CFU/mL) و 390 میکرولیتر از هر غلظت عصاره ای( که در روش پخش دیسکی اثرات ضدباکتریایی داشته اند) محلول در محیط کشت براث مولر-هینتون اضافه می گردد. کنترل های بدون عصاره نیز تهیه می شوند. پس از 24 ساعت گرمخانه گذاری در دمای 37 درجه سانتیگراد، کمترین غلظتی که مهار رشد باکتریایی به صورت چشمی قابل مشاهده باشد، به عنوان MIC در نظر گرفته می شود.

به منظور اندازه گیری MBC غلظتی از عصاره که در کشت انتقالی از محیط مایع به محیط کشت جامد و پس از 24 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتیگراد، هیچ کلنی باکتریایی دیده نشود، تعیین می گردد.

عصاره گیری مواد در آزمایشگاه مواد غذایی و انجام آزمایشات در آزمایشگاه میکروب شناسی دانشگاه علوم پزشکی زاهدان توسط تکنسین ها انجام می شود.

برای توصیف داده ها از شاخص های مرکزی، پراکندگی و جداول توزیع فراوانی (مطلق و نسبی) استفاده خواهد شد. برای تحلیل داده ها از آزمون آنالیز-واریانس و در صورت نیاز سایر آزمون های آماری پارامتری یا ناپارامتری متناسب با ماهیت داده ها استفاده خواهد شد.

  جدول میانگین قطر هاله ی عدم رشد حاصل از رقت های مختلف عصاره های آبی و الکلی میوه و برگ گیاه Citrullus colocynthis و میزان MIC و MBC عصاره بر روی باکتری های استرپتوکوک موتانس و لاکتوباسیل اسیدوفیل

بر اساس راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی ، کد های :1، 9، 28، 29، 30، 31

اشکالات مربوط به آماده سازی عصاره گیاه :  تکرار عصاره گیری

اشکالات مربوط به کشت میکروبی سوش های باکتری : تکرار کشت باکتری ها

Anti-Bacterial Agents, Citrullus colocynthis,Cariogenic bacteria

باکتری های پوسیدگی زا، گیاه حنظل (هندوانه ابوجهل)، مواد ضدباکتریایی

 1. AI, Rathore HA, Sattar MZ, Chatha SA, Sarker SD, Gilani AH. Citrullus colocynthis (L.) Schrad (bitter apple fruit): a review of its phytochemistry, pharmacology, traditional uses and nutritional potential. J Ethnopharmacol. 2014;155(1):54-66.

2.-Snafi AE. Chemical constituents and pharmacological effects of Citrullus colocynthis-A review. IOSR Journal Of Pharmacy. 2016;6(3):57-67.

3.Gurudeeban S, Satyavani K, Ramanathan T. Bitter apple (Citrullus colocynthis): An overview of chemical composition and biomedical potentials. Asian Journal of Plant Sciences. 2010;9(7):394.

4.فریور، سعید. کتاب طب معصومین(ع) آیت الله تبریزیان چهار جلدی، بیانات احیاگر طب اسلامی حضرت آیت الله تبریزیان دامت برکاته. تهران: انتشارات مولف ، 1396.

5.Elkamali HH, Mahjoob SE. Evaluation of antibacterial activity of some medicinal plants used in Sudanese folk medicine for treatment of gastrointestinal tract infections. American Journal of Life Sciences. 2015;3(3):230-7.

6.Marzouk B, Marzouk Z, Décor R, Edziri H, Haloui E, Fenina N, et al. Antibacterial and anticandidal screening of Tunisian Citrullus colocynthis Schrad. from Medenine. Journal of ethnopharmacology. 2009;125(2):344-9.

7.Mehta A, Srivastva G, Kachhwaha S, Sharma M, Kothari S. Antimycobacterial activity of Citrullus colocynthis (L.) Schrad. against drug sensitive and drug resistant Mycobacterium tuberculosis and MOTT clinical isolates. Journal of ethnopharmacology. 2013;149(1):195-200.

8.Najafi S, Sanadgol N, Nejad BS, Beiragi MA, Sanadgol E. Phytochemical screening and antibacterial activity of Citrullus colocynthis (Linn.) Schrad against Staphylococcus aureus. Journal of Medicinal Plants Research. 2010;4(22):2321-5.

9.   Uzer Celik E, Tunac AT, Ates M, Sen BH. Antimicrobial activity of different disinfectants against cariogenic microorganisms. Brazilian oral research. 2016;30(1):e125.

10. Wassel MO, Khattab MA. Antibacterial activity against Streptococcus mutans and inhibition of bacterial induced enamel demineralization of propolis, miswak, and chitosan nanoparticles based dental varnishes. Journal of Advanced Research. 2017 2017/07/01/;8(4):387-92.

فرم اطلاعاتی

1.تاریخ عصاره گیری : 

2.تاریخ انجام آزمایشات باکتریایی:

جدول میانگین قطر هاله ی عدم رشد حاصل از رقت های مختلف عصاره های آبی و الکلی میوه و برگ گیاه Citrullus colocynthis و میزان MIC و MBC عصاره بر روی باکتری های استرپتوکوک موتانس و لاکتوباسیل اسیدوفیل