بررسی پلی مورفیسم ژن های GAS5 و IFNAR1 در زنان مبتلا به سرطان پستان و مقایسه آن با زنان سالم

سرطان پستان یکی از شایعترین انواع سرطان است و بعنوان اصلی ترین علت مرگ و میر ناشی از سرطان در میان زنان در دنیا شناخته می­شود (1). سالانه نزدیک به 7/1 میلیون مورد جدید سرطان پستان تشخیص داده می­شود .در سال 2012، نیم میلیون مرگ ناشی از آن گزارش شده است (2). پیش بینی می­شود تا سال 2050، 2/3 میلیون مورد جدید سرطان پستان در جهان شناسایی شود (3).

افزایش مرگ و میر ناشی از آن می­تواند با تغییر رفتارهای تولید مثلی، اثرات دموگرافیک جمعیتی، اقتصاد، تفاوتهای جغرافیایی، استراتژیهای غربالگری و دسترسی ناکافی به امکانات تشخیصی و درمانی مرتبط باشد (4-6).

طی سالهای اخیر جنبه های زیادی از سرطان پستان مورد مطالعه قرار گرفته است. علی رغم پیشرفتهای صورت گرفته در شناسایی آنتی ژن ها و رسپتورهای سطحی سرطان پستان (که بر اساس آن طبقه بندی هایی صورت گرفته است)، همچنان بخش وسیعی از اساس مولکولی پاتوژنز آن، بدلیل ناهمگونی بسیار زیاد ناشناخته باقی مانده است (7).

پیشرفت سرطان پستان تحت تاثیر چندین عامل از جمله عوامل محیطی، عوامل اپی ژنتیکی و ژنهای مستعد کننده که نقش بسیار مهمی در تعیین میزان شانس ابتلا، رفتار بافت سرطانی و پاسخ به درمان دارند، قرار دارد (8, 9).

از نظر بالینی، درمان سرطان پستان بر اساس طبقه بندی مولکولی آن موجب بهبود قابل ملاحظه ای در پیش آگهی بیماران شده است. اما برای بیمارانی که در اصطلاح triple-negative (یعنی فاقد رسپتورهای استروژن و پروژسترون و HER2 هستند) یا مقاوم به درمان هستند، کنترل عود بیماری و متاستاز همچنان بعنوان یک مساله اساسی باقی مانده است (10). با این وجود نیز، هنوز بیشتر تومور ها در مراحل بسیار پیشرفته شناسایی می­شوند (11).

آنالیز های کاریوتایپیک نشان داده اند که سرطان پستان بصورت فزاینده ای رو به بدخیم تر و تهاجمی تر شدن است (12).

از این رو بسیار ضروری است که بیومارکرهایی برای تشخیص زودهنگام، پیش بینی پاسخ به درمان- که برای تعیین استراتژی درمانی بسیار مهم است- و تعیین پیش آگهی سرطان پستان شناسایی شود.

Long non-conding RNA ها

 RNA های طویل غیر کد شونده، گروهی از RNA های غیرکد شونده با طول بیش از 200 نوکلئوتید هستند که توسط RNA پلیمرازII رونوشت برداری میشوند(13)این RNAها میتوانند بیان ژن را از طریق تعدیل ری­ مدلینگ کروماتینی و نیز در سطح ترجمه و پس از ترجمه، تنظیم کنند (14). lncRNA ها، تنظیم کننده های کلیدی در تعدادی از فرآیند های حیاتی بیولوژیک، از جمله چرخه سلولی، تمایز سلولی و آپوپتوز محسوب میشوند (15, 16). شواهد فزاینده ای، نشان دهنده ناتنظیمی در جنبه های گوناگونی از فیزیولوژی سلول که برای ایجاد، پیشرفت و متاستاز سرطان ضروری هستند، وجود دارد (17, 18).

GAS5 (rs145204276)

ژن GAS5[1] بر روی بازوی بلند کروموزوم 1 (1q25.1) قرار داشته و RNA طویل غیر کد شونده GAS5 را کد میکند و عملکرد سرکوب­گر[2] تومور دارد (15). مطالعات متعددی نشان داده اند که بیان GAS5، در انواعی از سرطان های انسانی (چون سرطان پروستات، ریه و کولورتال)  کاهش میابد (19-23).

بنظر میرسد که واریان های ژنتیکی درناحیه پروموتور lncRNA ها، باعث تغییر در بیان آن ها می­شود (24). بیان GAS5 توسط پلیمورفیسم 5 جفت بازی حذف/الحاق (-/AGGCA) در ناحیه ی پروموتور ژن  (rs145204276) GAS5، تحت تاثیر قرار میگیرد (25).

Tao و همکاران، نشان دادند که rs145204276 میتواند با خطر سرطانزایی در کارسینوم هپاتوسلولار از طریق تغییر در وضعیت متیلاسیون ناحیه پروموتور GAS5 و نتیجتا فعالیت رونوشت برداری آن، مرتبط باشد (26).

همچنین مطالعه­ی انجام شده توسط Zheng و همکاران (2016)  به این نتیجه رسید که rs145204276 قویا با احتمال پیشرفت و گسترش لنفاوی کارسینوم کولورکتال مرتبط است (27).

مطالعه ی Yuan و همکاران (2018)  نشان داد که rs145204276 میتواند با افزایش خطر ابتلا به گلیوما مرتبط باشد (28).

در یک متاآنالیز انجام شده بر روی گروهی از سرطان­ها (سرطان­های ریه، معده، هپاتوسلولر، استئوسارکوم، کولورکتال و سرویکس) توسط هاشمی و همکاران (2018)، نشان داده شد که ارتباطی بین این lncRNA و سرطان وجود ندارد؛ هرچند عدم وجود این ارتباط را میتوان ناشی از هتروژن بودن گروه سرطانها دانست (29).

IFNAR1 (rs17875871)

ژن IFNAR1، پروتئین غشایی نوع 1 را کد کرده که یکی از دو زنجیزه گیرنده برای اینترفرون آلفا و بتا را شکل میدهد. اتصال و فعال شدن این گیرنده، مسیر JAK را تحریک کرده، که به نوبه خود چندین پروتئین از جمله STAT1 و STAT2 را فسفریله می کند (30).

نشان داده شده که IFNAR1، با سرطانزایی در کبد مرتبط است (31). همچنین مطالعات دیگری مانند مطالعه He و همکاران (32) و نیز مطالعه Zhang و همکاران (33)، ارتباط آن را با تکثیر ویروس هپاتیت C و عفونت مزمن هپاتیت B نشان داده اند. علاوه بر این، از آنجایی که اینترفرون آلفا یکی از واسطه های اساسی در ایمنی زایی نسبت به عفونت هپاتیت B محسوب میشود، نشان داده شده که پلیمورفیسم ژنتیکی این ژن، با تظاهرات و نتایج بالینی هپاتیت B مرتبط است (34).

مطالعه Zhao و همکاران در سال 2012 نشان داد که پلیمورفیسم 4 جفت بازی حذف/الحاق (rs17875871) ژن IFNAR1 با خطر ابتلا به کارسینوم هپاتوسلولار مرتبط است (35).

در رابطه با ارتباط این پلیمورفیسم 4 جفت بازی IFNAR1، مطالعات بسیار محدودی انجام شده که عمدتا در زمینه­ی کارسینوم هپاتوسلولار بوده است

پلیمورفیسم ژنتیکی

در هر 1000 جفت باز کروموزوم­های انسان، تخمین زده می­شود که بطور میانگین یک جایگاه نوکلئوتیدی بین دو کپی از آن کروموزوم متفاوت باشد (36). و زمانی به یک لوکوس پلیمورفیک گفته می­شود که حداقل در دو واریان وجود داشته باشد و تواتر الل شایعترین واریان، کمتر از 99%  باشد(یا به عبارت دیگر، حداقل در دو واریان با تواتر بیش از یک درصد از ناشایعترین آلترناتیو آن وجود داشته باشد)(37).

با توجه به این موضوع و نیز وجود تفاوتهای جمعیتی در رابطه با پلی مورفیسم ژنتیکی و ارتباط محتمل آن با پاتوژنز و میزان شیوع سرطان پستان و نیز تفاوت مشاهده شده در یافته ها در رابطه با تاثیر پلیمورفیسم های ذکر شده بر خطر ابتلا به سرطان، علاوه بر نبود مطالعات کافی در این زمیه، برآن شدیم تا مطالعه حاضر را با هدف بررسی پلیمورفیسم ژنهای GAS5 و IFN1AR درزنان مبتلا به سرطان پستان و مقایسه آن با زنان سالم به انجام رسانیم.

فراوانی پلی مورفیسم 5 جفت بازی حذف/الحاق GAS5 (rs145204276) در زنان مبتلا به سرطان پستان با زنان سالم متفاوت است.

فراوانی پلی مورفیسم 4 جفت بازی حذف/الحاق INFAR1 (rs17875871) در زنان مبتلا به سرطان پستان با زنان سالم متفاوت است.

تعیین فراوانی پلی مورفیسم ژن های GAS5 و INFAR1 در زنان مبتلا به سرطان پستان و مقایسه آن با زنان سالم

مقایسه تعیین فراوانی پلی مورفیسم 5 جفت بازی حذف/الحاق GAS5 (rs145204276) در زنان مبتلا به سرطان پستان و مقایسه آن با زنان سالم

مقایسه تعیین فراوانی پلی مورفیسم 4 جفت بازی حذف/الحاق INFAR1 (rs17875871) در زنان مبتلا به سرطان پستان و مقایسه آن با زنان سالم

دانشگاه ها و مراکز تحقیقاتی

پلیمورفیسم ژنتیکی

در هر 1000 جفت باز کروموزوم­های انسان، تخمین زده می­شود که بطور میانگین یک جایگاه نوکلئوتیدی بین دو کپی از آن کروموزوم متفاوت باشد (36). و زمانی به یک لوکوس پلیمورفیک گفته می­شود که حداقل در دو واریان وجود داشته باشد و تواتر الل شایعترین واریان، کمتر از 99%  باشد(یا به عبارت دیگر، حداقل در دو واریان با تواتر بیش از یک درصد از ناشایعترین آلترناتیو آن وجود داشته باشد)(37).

مورد – شاهد  (case –control

از نمونه های موارد سرطان پستان موجود در آزمایشگاه بیوشیمی که قبلا توسط آنکولوژیست جمع آوری شده و بیمارآنها تایید شده است. گروه شاهد نیز از نمونه های زنان سالم مربوط به طرح بررسی سندرم متابولیک استفاده میشود.

برای بررسی پلی مورفیسم ژنتیکی از زنان مبتلا به سرطان سینه در زاهدان به تعداد حداقل 150 مورد و به همین تعداد نیز گروه شاهد از زنان سالم انتخاب می شوند.

نمونه گیری آسان و در دسترس

 یافته های آزمایشگاهی

برای بررسی پلی مورفیسم ژنی نمونه خون بیماران و افراد شاهد در 20 - درجه سانتیگراد نگهداری می شود. DNA نمونه خون افراد گروه شاهد و مورد به روش salting out تخلیص می شود. پرایمرهای اختصاصی جهت تعیین پلی مورفیسم ژنی به روش PCR-RFLP و PCR-ARMS  طراحی می شود. در مرحله بعد شرایط PCR برای تعیین این پلی مورفیسم ها بهینه می شود . سپس محصول PCR توسط Restriction Enzyme اختصاصی (در روش RFLP) برش داده و قطعات حاصل روی ژل آگاروز الکتروفورز شده و پلی مورفیسم ها ی ژنی ر نمونه ها آنالیز می شوند.

پس از گردآوری اطلاعات لازم، یافته ها در نرم افزار آماری SPSS وارد شده و داده ها با استفاده از آزمونهای آماری χ2 و t-test مستقل مورد تجزیه و تحلیل قرار خواهند گرفت. برای تعیین ارتباط پلی مورفیسم از آزمون logistic regression  استفاده می کنیم.

کدهای 1، 2، 3، 8، 10، 11، 13، 15، 18، 25، 28، مصوب کمیته کشوری اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی که در دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش‌های دارای آزمودنی انسانی در جمهوری اسلامی ایران، دربردارنده‌ی اصول و مقررات اخلاقی‎ مطرح  و در سال 1392 در 31 بند تصویب شده است و همچنین کدهای 1، 2، 3، 4، 7 مربوط به دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی ایران از قسمت راهنمای عمومیوکدهای 1، 5، 6، 10، 11، و 13 از دفترچه  راهنمای اخلاقی پژوهشهای ژنتیک پزشکی در جمهوری اسلامی ایران در این طرح رعایت می شود. تمامی بیماران تحت مطالعه آگاهانه و برای مقاصد علمی  اقدام به دادن نمونه خواهند کرد. شرکت در این طرح هیچ گونه هزینه ای برای بیماران ندارد و نام و مشخصات بیماران گزارش نخواهد شد.

باتوجه به بررسی میدانی که قبلا توسط محقق صورت گرفته،هیچ گونه محدودیتی در جمع آوری نمونه ها وجود ندارد.

زمان بر شدن تهیه مواد

GAS5, IFNAR1, polymorphism, breast cancer

1.         Torre LA, Bray F, Siegel RL, Ferlay J, Lortet‐Tieulent J, Jemal A. Global cancer statistics, 2012. CA: a cancer journal for clinicians. 2015;65(2):87-108.

2.         Tao Z, Shi A, Lu C, Song T, Zhang Z, Zhao J. Breast cancer: epidemiology and etiology. Cell biochemistry and biophysics. 2015;72(2):333-8.

3.         Hortobagyi GN, de la Garza Salazar J, Pritchard K, Amadori D, Haidinger R, Hudis CA, et al. The global breast cancer burden: variations in epidemiology and survival. Clinical breast cancer. 2005;6(5):391-401.

4.         Cazap E, Buzaid A, Garbino C, de la Garza J, Orlandi F, Schwartsmann G, et al. Breast cancer in Latin America: experts perceptions compared with medical care standards. The Breast. 2010;19(1):50-4.

5.         Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International journal of cancer. 2015;136(5).

6.         DeSantis CE, Bray F, Ferlay J, Lortet-Tieulent J, Anderson BO, Jemal A. International variation in female breast cancer incidence and mortality rates. Cancer Epidemiology and Prevention Biomarkers. 2015;24(10):1495-506.

7.         Polyak K. Heterogeneity in breast cancer. The Journal of clinical investigation. 2011;121(10):3786.

8.         Key TJ, Verkasalo PK, Banks E. Epidemiology of breast cancer. The lancet oncology. 2001;2(3):133-40.

9.         Mavaddat N, Antoniou AC, Easton DF, Garcia-Closas M. Genetic susceptibility to breast cancer. Molecular oncology. 2010;4(3):174-91.

10.       Kumar P, Aggarwal R. An overview of triple-negative breast cancer. Archives of gynecology and obstetrics. 2016;293(2):247-69.

11.       Meissner HI, Klabunde CN, Han PK, Benard VB, Breen N. Breast cancer screening beliefs, recommendations and practices. Cancer. 2011;117(14):3101-11.

12.       Lee EY, Muller WJ. Oncogenes and tumor suppressor genes. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2010;2(10):a003236.

13.       Quinn JJ, Chang HY. Unique features of long non-coding RNA biogenesis and function. Nature Reviews Genetics. 2016;17(1):47.

14.       Salviano-Silva A, Lobo-Alves S, Almeida R, Malheiros D, Petzl-Erler M. Besides pathology: Long non-coding RNA in cell and tissue homeostasis. Non-coding RNA. 2018;4(1):3.

15.       Pickard M, Williams G. Molecular and cellular mechanisms of action of tumour suppressor GAS5 LncRNA. Genes. 2015;6(3):484-99.

16.       Li J, Lian Y, Yan C, Cai Z, Ding J, Ma Z, et al. Long non‐coding RNA FOXP 4‐AS 1 is an unfavourable prognostic factor and regulates proliferation and apoptosis in colorectal cancer. Cell proliferation. 2017;50(1):e12312.

17.       Chan J, Tay Y. Noncoding RNA: RNA regulatory networks in cancer. International journal of molecular sciences. 2018;19(5):1310.

18.       Hassanzarei S, Hashemi M, Sattarifard H, Hashemi SM, Bahari G, Ghavami S. Genetic polymorphisms of HOTAIR gene are associated with the risk of breast cancer in a sample of southeast Iranian population. Tumor Biology. 2017;39(10):1010428317727539.

19.       Wang K, Li J, Xiong G, He G, Guan X, Yang K, et al. Negative regulation of lncRNA GAS5 by miR-196a inhibits esophageal squamous cell carcinoma growth. Biochemical and biophysical research communications. 2018;495(1):1151-7.

20.       Wang M, Guo C, Wang L, Luo G, Huang C, Li Y, et al. Long noncoding RNA GAS5 promotes bladder cancer cells apoptosis through inhibiting EZH2 transcription. Cell death & disease. 2018;9(2):238.

21.       Ye K, Wang S, Zhang H, Han H, Ma B, Nan W. Long Noncoding RNA GAS5 Suppresses Cell Growth and Epithelial–Mesenchymal Transition in Osteosarcoma by Regulating the miR‐221/ARHI Pathway. Journal of cellular biochemistry. 2017;118(12):4772-81.

22.       Zheng Y, Song D, Xiao K, Yang C, Ding Y, Deng W, et al. LncRNA GAS5 contributes to lymphatic metastasis in colorectal cancer. Oncotarget. 2016;7(50):83727.

23.       Zhang N, Wang A, Wang X, Sun X, Xue H. GAS5 is downregulated in gastric cancer cells by promoter hypermethylation and regulates adriamycin sensitivity. European review for medical and pharmacological sciences. 2016;20(15):3199-205.

24.       Tao R, Hu S, Wang S, Zhou X, Zhang Q, Wang C, et al. Association between indel polymorphism in the promoter region of lncRNA GAS5 and the risk of hepatocellular carcinoma. Carcinogenesis. 2015;36(10):1136-43.

25.       Xu L, Xia C, Xue B, Sheng F, Xiong J, Wang S. A promoter variant of lncRNA GAS5 is functionally associated with the development of osteosarcoma. Journal of bone oncology. 2018;12:23-6.

26.       Wang C, Li L, Zhang Q, Tao R, Zhu S, Wang S, et al. Association between indel polymorphism in the promoter region of lncRNA GAS5 and the risk of hepatocellular carcinoma. Carcinogenesis. 2015;36(10):1136-43.

27.       Zheng Y, Song D, Xiao K, Yang C, Ding Y, Deng W, et al. LncRNA GAS5 contributes to lymphatic metastasis in colorectal cancer. Oncotarget. 2016;7(50):83727-34.

28.       Jupeng Y, Nasha Z, Yan Z, Yi-Dong C, Jie L, Ming Y. LncRNA GAS5 Indel Genetic Polymorphism Contributes to Glioma Risk Through Interfering Binding of Transcriptional Factor TFAP2A. DNA and Cell Biology. 2018;37(9):750-7.

29.       Hashemi M, Moazeni-Roodi A, Tabasi F, Ghavami S. 5-bp insertion/deletion polymorphism in the promoter region of LncRNA GAS5 and cancer risk: A meta-analysis of 7005 cases and 8576 controls. Meta Gene. 2018.

30.       de Weerd NA, Samarajiwa SA, Hertzog PJ. Type I interferon receptors: biochemistry and biological functions. Journal of Biological Chemistry. 2007;282(28):20053-7.

31.       Bellodi-Privato M, Kubrusly M, Stefano J, Soares I, Wakamatsu A, Oliveira A, et al. Differential gene expression profiles of hepatocellular carcinomas associated or not with viral infection. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 2009;42(12):119-1127.

32.       He X-X, Chang Y, Jiang H-J, Tang F, Meng F-Y, Xie Q-H, et al. Persistent effect of IFNAR-1 genetic polymorphism on the long-term pathogenesis of chronic HBV infection. Viral immunology. 2010;23(3):251-7.

33.       Zhang Q, Gong R, Qu J, Zhou Y, Liu W, Chen M, et al. Activation of the Ras/Raf/MEK pathway facilitates hepatitis C virus replication via attenuation of the interferon-JAK-STAT pathway. Journal of virology. 2012;86(3):1544-54.

34.       Zhou J, Lu L, Yuen M-F, Lam T-W, Chung C-P, Lam C-L, et al. Polymorphisms of type I interferon receptor 1 promoter and their effects on chronic hepatitis B virus infection. Journal of hepatology. 2007;46(2):198-205.

35.       Zhou C, Yu Q, Chen L, Wang J, Zheng S, Zhang J. A miR-1231 binding site polymorphism in the 3′ UTR of IFNAR1 is associated with hepatocellular carcinoma susceptibility. Gene. 2012;507(1):95-8.

36.       Cooper DN, Smith BA, Cooke HJ, Niemann S, Schmidtke J. An estimate of unique DNA sequence heterozygosity in the human genome. Human genetics. 1985;69(3):201-5.

37.       Wang DG, Fan J-B, Siao C-J, Berno A, Young P, Sapolsky R, et al. Large-scale identification, mapping, and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the human genome. Science. 1998;280(5366):1077-82.

ندارد

جبران عوارض احتمالی بر عهده پژوهشگران خواهد بود.

 در این قسمت باید شرح داده شود که در صورت عدم پذیرش روش انتخابی پژوهشگر، بیمار از چه روشهای درمانی یا تشخیصی دیگرتوسط پژوهشگر می تواند استفاده نماید.

نتایج آزمایشها و روشهای به کار رفته به اطلاع بیمار خواهد رسید و این نتایج بصورت کاملاً محرمانه و صرفاً جهت مقاصد پژوهش به کار خواهد رفت و هویت بیماری وی در چارچوب قانون و جامعه و خانواده محرمانه خواهد ماند

دکتر غلامرضا بهاری

زاهدان- پردیس دانشگاه علوم پزشکی- دانشکده پزشکی- گروه بیوشیمی بالینی

تلفن: 09153497890

شرکت من در مطالعه کاملاً اختیاری است و آزاد خواهم بود که از شرکت در مطالعه امتناع نموده یا هر زمان  که مایل بودم بدون آنکه تغییری در نحوه رفتار پزشک درمانگر یا نحوه درمان و مراقبت از بیماری اینجانب ایجاد شود از پژوهش مذکور خارج شوم.

با توجه به اطلاعات موجود در این فرم و توضیحات حضوری مجری یا همکاران طرح موافقت خود را با شرکت در این مطالعه اعلان می نمایم. یک نسخه از این فرم به من داده شده و فرصت خواندن آن را داشته ام.