بررسی اثر حفاظتی کوئرستین بر سطح سرمی فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز (BDNF) ، حافظه و اضطراب در موش صحرایی مدل پارکینسون

بیماری پارکینسون[1] ( PD) به گروهی از اختلالات عصبی پیشرونده و مزمن اشاره دارد که با اختلال در فعالیت هسته­های قاعده­ای مغز مرتبط می­باشند (1). اگر چه بیماری پارکینسون معمولا وابسته به سن و ایدیوپاتیک است، در برخی موارد غیر معمول توسط جهش­های ژنتیکی در ژن­هایی که پروتئین­های مرتبط با عملکرد میتوکندری را رمز می­کنند نیز ایجاد می­شود. (2).

با توجه به فراوانی اختلالات عصبی، پارکینسون جایگاه دوم پس از آلزایمر را به خود اختصاص داده است. بروز این بیماری به شدت در میان گروه­های مختلف قومی متفاوت بوده و بستگی به موقعیت جغرافیایی آن­ها دارد. در کل، تعداد مبتلایان پارکینسون در جهان نزدیک به چهار میلیون نفر بوده و بیش از 5 درصد از جمعیت بالای 13 سال جهان یا بیشتر از 5 تا 4 درصد از جمعیت بالای 61 سال، به طور متوسط، از پارکینسون ایدیوپاتیک[2] رنج می­برند. تعداد مبتلایان به پارکینسون ایدیوپاتیک در حال رشد و سن شروع این بیماری در حال کاهش است. متوسط سن شروع این بیماری حدود 12 سال می­باشد و 1 تا 53 درصد موارد، اولین علائم این بیماری را زودتر و قبل از 43 سالگی نشان می­دهند. با این حال، مستقل از علت و سن شروع توسعه بیماری، طول دوره زندگی در بیماران به طور قابل توجهی کوتاه می­شود. متوسط طول عمر در مبتلایان به پارکینسون با محاسبه از شروع بیماری 3 سال می­باشد؛ اگر چه تفاوت­های فردی محدودی بین 5تا 99 سال را نشان می­دهد (1).

علائم حرکتی پارکینسون به طور معمول در بخشی از اندام و هنگامی که غلظت دوپامین[3]  به زیر 60 تا 70 درصد در جسم مخطط[4] مقابل افت می­کند آغاز خواهد شد . شروع ویژگی­های حرکتی به از دست دادن دوپامین در پوتامن خلفی مربوط می­شود که با منطقه حرکتی جسم مخطط در ارتباط می­باشد . ویژگی­های اصلی پارکینسون شامل برادی کینزیا[5] یا کندی حرکت، سفتی عضلات اسکلتی صورت و دست، لرزش استراحتی و بی ثباتی وضعیتی بوده و بنابراین به طور عمده به اختلال در مدار حرکتی مربوط می­شود این علائم حرکتی معمولاَ به صورت نامتقارن بوجود آمده و به تدریج بخش­های مخالف بدن را نیز تحت تأثیر قرار می­دهند (3).

انحطاط پیشرونده یا آسیب به ساختار و عملکرد سلول­های عصبی توسط رادیکال­های آزاد، تحت عنوان نورودژنراسیون نامیده می­شود. با وجود اینکه سیستم عصبی مرکزی به میزان بالایی از اکسیژن نیاز دارد، اما در آنزیم­هایی که ترکیبات سمی حاصل از اکسیژن را پاکسازی می­کنند، دچار کمبود است (1). با توجه به پایین بودن سطح آنتی اکسیدانی در نورون­ها، آنها ذاتا فاقد تجهیزات لازم برای دفاع در برابر افزایش استرس اکسیداتیو هستند (1) آسیب اکسیداتیو به مولکول­های زیستی، منجر به اختلال عملکرد آن­ها و تداخل با مسیرهای سیگنالینگ شده و باعث بروز بیماری­های ناشی از استرس اکسیداتیو می­گردد. (2)

اصطلاح ' آنتی اکسیدان ' به هر مولکول قادر به برقراری ثبات و یا غیرفعال کردن رادیکال­های آزاد قبل از حمله آنها به سلول اشاره دارد. این ترکیبات مسئول حذف رادیکال­های آزاد، پاکسازی ROS و یا پیش­سازهای آن­ها، مهار تشکیل ROS و اتصال به یون­های فلزی مورد نیاز برای کاتالیز تولید ROS می­باشند (4).

سیستم­های آنتی­اکسیدانی طبیعی در دو گروه عمده، آنزیمی و غیر آنزیمی طبقه بندی شده­اند،  از آنتی اکسیدان های آنزیمی می­توان به گلوتاتیون پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون ردوکتاز و از آنتی اکسیدان های غیر آنزیمی می­توان به اسکوربیک اسید، ویتامین E، لیپوئیک اسید، پلی فنول­ها و کاروتنوئیدهای برگرفته از منابع غذایی اشاره کرد (4).

فلاونوئیدها فراوانترین ترکیبات پلی فنلی در گیاهان می­باشند (5). این ترکیبات بر اساس اشباع حلقه بنیادی فلاوان و سطح هیدروکسیلاسیون، الکیلاسیون و گلیکوزیلاسیون به زیر گروه­های فلاونول، فلاوانول، آنتوسیانین، ایزوفلاوونوئید، فلاوانون و فلاون­ها تقسیم می­شوند، اغلب فلاونوئیدها یک ساختار مشترک شامل دو حلقه آروماتیک A و B دارند که با یک پل سه کربنه به یکدیگر باند شده و یک هتروسیکل اکسیژنه را تشکیل می­دهند.  خواص آنتی اکسیدانی در فلاونوئیدها توسط گروه­های هیدروکسیل متصل به ساختارهای حلقه ارائه می­شود و آنها می­توانند به عنوان عوامل احیاء، اهدا کننده هیدروژن، رفع کننده واحد اکسیژن، از بین برنده رادیکال سوپراکسید عمل کنند . برخی از مهمترین این ترکیبات شامل کاتچین، کاتچین گالات، کوئرستین و کامفرول هستند (5).

کوئرستین (3,3′,4′,5,7-pentahydroxyflavone, H5Que) یکی از رایجترین فلاونول­های موجود  در طبیعت است )در پیاز، انگور، انواع توت­ها، سبزیجات سبز، حبوبات، مرکبات، سیب، جعفری، مریم گلی و چای(، که با توجه به داشتن خواص بیولوژیکی عمده، نظر بسیاری از محققان را به خود جلب کرده است.

کوئرستین خواص مختلفی از جمله ضد التهاب، آنتی هیستامین، آنتی آرتریت و آنتی اکسیدانی را نشان می­دهد ( 6)

علاوه بر این، به خوبی شناخته شده است که کوئرستین ممکن است یون­های فلزی را شلاته کند که موجب جلوگیری از تولید رادیکال­های اکسید کننده­ی مخرب با واسطه فلزات و حفاظت از اهداف بیولوژیکی در مقابل استرس اکسیداتیو می­گردد (6).

کوئرستین به طور قابل توجهی از سلول­های عصبی در مقابل نورودژنراسیون ناشی از استرس اکسیداتیو در بیماری­های عصبی محافظت کرده و موجب کاهش پراکسیداسیون لیپیدی، بهبود فعالیت کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز و همچنین جلوگیری از کاهش گلوتاتیون می­گردد (7).

BDNF (فاکتور نوروتروفیک مشتق شده از مغز) که از تخریب نرون های دوپامینرژیک جلوگیری می کند، یکی از فاکتورهای خانواده نوروتروفین می­باشد که به طور وسیع در مغز پستانداران در قسمت­های هیپوکامپ، آمیگدال، هیپوتالاموس، مغز میانی و کورتکس مغز ترشح می­شود  (8). این فاکتور نقش حیاتی در تکامل و حفظ سلامت سیستم عصبی مرکزی و محیطی، شکل پذیری سیناپس­ها و نورون­های مغزی، تکثیر و بقای سلول عصبی و نیز یادگیری، حافظه و تغییرات خلقی بر عهده دارد. کاهش بیان این ماده در جسم سیاه به طور مستقیم با از بین رفتن نرون های دوپامینرژیک نیگرال و توسعه بیماری پارکینسون مرتبط است، قرار گرفتن در معرض BDNF قبل از تزریق داخل جسم مخططی 6 هیدروکسی دوپامین ، موجب محافظت نرون های دوپامینرژیکی از اثرات سمی این ماده در موش­های جوان و پیر می­شود . اگر چه محافظت در موش­های پیر کمتر از موش­های جوان می­باشد (9).

در مراحل اولیه بیماری حدود 30-20 درصد نورون های دوپامینرژیک و با پیشرفت بیماری حدود  90-80 درصد نورون­ها از بین می­روند (10). به تدریج با تحلیل نورون­های دوپامینرژیک، غلظت انتقال دهنده های عصبی مانند دوپامین و نورآدرنالین در ناحیه هیپوکامپ کاهش می­یابد (11). کاهش دوپامین با کاهش حافظه و ناتوانی در بازیابی اطلاعات از حافظه بلند مدت در ارتباط بوده، به طوری که افزایش فعالیت نورون­های دوپامینرژیک با فیدبک مثبت سبب افزایش یادگیری در بیماری پارکینسون می­گردد (12).

فلاونوئیدها گزینه مناسبی برای تعدیل عملکرد عصبی، بهبود یادگیری، حافظه و شناخت محسوب می­شوند، غذاهای حاوی فلاونوئید، مانند زغال اخته و چای سبز منجر به بهبود کاهش حافظه و یادگیری مرتبط با سن می­شوند. (13)

مطالعات گذشته:

1- کوئرستین به طور قابل توجهی قابلیت حفاظت نورونی داشته و از نورودژنراسیون ناشی از استرس اکسیداتیو می­کاهد. کاهش پراکسیداسیون لیپیدی، بهبود فعالیت کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز و همچنین جلوگیری از کاهش گلوتاتیون از دیگر خواص به ثبت رسیده از این ترکیب می­باشند ( 14).

2- کوئرستین با مهار کاتکول- O- متیل یا منوآمین اکسیداز شکستن دوپامین را کاهش داده و با خفظ سطوح دوپامین موجب بهبود بقای سلول­های عصبی می­گردد، بنابراین آنتی اکسیدانی مفید در درمان بیماری پارکینسون است (14)

3- در سال 2012 پژوهشی، 3 غلظت کوئرستین 50، 100 و 200 میلی گرم در کیلوگرم را در موش مدل پارکینسونی مورد بررسی قرار داد، نتایج نشان داد که مصرف غلظت 200 میلی گرم بر کیلوگرم کوئرستین موثرتر از دو غلظت دیگر منجر به افزایش سطح دوپامین، استیل کولین و فعالیت حرکتی می­گردد. (15)

4- Sriraksa و همکاران (2012) اثرات شناختی افزایش دهنده کوئرستین در یک مدل موش مبتلا به بیماری پارکینسون ناشی از 6 هیدروکسی دپامین را مطالعه کردند. مشخص شد که تمام دوزهای کوستین حافظه فضایی را افزایش داده است. فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانی شامل سوپر اکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز به طور معنی ­داری افزایش یافته است. بنابراین پیشنهاد شده است که اثر شناختی تقویت کننده کوئرستین به واسطه کاهش آسیب اکسیداتیو، منجر به افزایش تراکم نورون می­شود (16).

5-  وانگ و همکاران در پژوهشی در سال 2014 نشان دادند که غلظت 40 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن، کوئرستین به مدت 16 روز سبب بهبود اختلالات شناختی و افزایش یادگیری و حافظه در حدود 4/56 درصد در مدل آلزایمری از طریق تست تشخیص شناسایی شیء جدید شده است (17).

هدف از مطالعه حاضر بررسی اثر حفاظتی کوئرستین بر فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز (BDNF) در ناحیه هیپوکمپ،  حافظه  و اضطراب در موش صحرایی مدل پارکینسون می باشد.

1.مصرف خوراکی کوئرستین موجب تغییر سطح سرمی BDNF در موش صحرایی مدل پارکینسون خواهد شد.

2.مصرف خوراکی کوئرستین موجب بهبود حافظه و یادگیری در موش صحرایی مدل پارکینسون خواهد شد.

3- مصرف خوراکی کوئرستین موجب کاهش اضطراب در موش صحرایی مدل پارکینسون خواهد شد.

تعیین اثر حفاظتی کوئرستین بر سطح سرمی فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز (BDNF)،  حافظه  و اضطراب در موش صحرایی مدل پارکینسون

1. تعیین اثرحفاظتی  کوئرستین بر سطح سرمی BDNF در موش صحرایی مدل پارکینسون
2. تعیین اثرحفاظتی کوئرستین بر حافظه و یادگیری در موش صحرایی مدل پارکینسون
3. تعیین اثرحفاظتی کوئرستین بر اضطراب در موش صحرایی مدل پارکینسون

نتایج این تحقیق می­تواند برای تحقیقات بعدی در دانشگاه­ها و مراکز تحقیقاتی که بر روی بیماری پارکینسون کار می­کنند مفید باشد.

کوئرستین:  فلاونولی است که در بیشتر میوه‌ها، سبزیجات، برگ‌ها و دانه‌ها یافت می‌شود.

BDNF: یکی از فاکتورهای خانواده نوروتروفین می­باشد که به طور وسیع در مغز پستانداران در قسمت­های هیپوکامپ، آمیگدال، هیپوتالاموس، مغز میانی و کورتکس مغز ترشح می­شود که در حفظ سلامت سلول های عصبی نقش دارد.

حافظه: حافظه استعدادی ذهنی برای ذخیره، حفظ و به یاد آوردن اطلاعات و تجربیات است. پایه آن تشکیل ارتباطات موقتی قوی و کافی در قشر مغزی می‌باشد.

اضطراب: یک احساس منتشر، ناخوشایند و مبهم هراس و نگرانی با منشأ ناشناخته، که به فرد دست می‌دهد و شامل عدم اطمینان، درماندگی و برانگیختگی فیزیولوژی است

مداخله ای، از نوع تجربی

معیارهای ورود:

1-موش­های صحرایی نژاد ویستار

2- جنس نر

3- وزن230-200

4- سن 3 ماه

معیارهای خروج:

1-جنس ماده

2- وزن بیشتر از 230 گرم

3- وزن کمتر از 200 گرم

4- سن بیشتر یا کمتر از 3 ماه

تعداد 40 رت نژاد ویستار به صورت کاملاً تصادفی انتخاب می شود.

تعداد 40 سر  موش صحرایی نژاد ویستار به صورت کاملاً تصادفی به 5 گروه 8 تایی تقسیم می شوند. گروه­های کنترل و مداخله به صورت زیر تیماربندی می­شوند.

گروه اول: گروه سالم یا کنترل که جراحی و تیمار نمی­شوند.

گروه دوم: گروه شم که پس از جراحی، محلول بی اثر سالین (2میکروگرم بر کیلوگرم) به جسم مخطط تزریق می شود و در طول مطالعه با آب مقطر به صورت روزانه گاواژ می­شوند.

گروه سوم: گروه پارکینسونی که پس از جراحی و تزریق 6 هیدروکسی دوپامین (8 میکروگرم بر کیلوگرم) تیمار و در طول مطالعه با آب مقطر به صورت روزانه گاواژ می­شوند.

گروه چهارم: گروه پارکینسونی تیمار شده با کوئرستین (روزانه  دوز 10میلی­گرم بر کیلوگرم وزن بدن کوئرستین دریافت می­کنند)

گروه پنجم: گروه پارکینسونی تیمار شده با کوئرستین (روزانه  دوز25 میلی­گرم بر کیلوگرم وزن بدن کوئرستین دریافت می­کنند)

با توجه به هزینه اختصاص داده شده توسط دانشگاه و مطالعات انجام شده در این زمینه مانند مطالعه منسوجی و همکاران همچنین برای استفاده از حداقل ممکن حیوانات، حجم نمونه مورد مطالعه 40  سر موش­ صحرایی نر  محاسبه  می­شود. (18).

برای انجام این تحقیق از 40 سر موش صحرایی نژاد ویستار با محدوده وزنی200 تا 230 گرم استفاده می­شود. محل نگهداری حیوانات از نظر شرایط فیزیکی دارای دوره­ی روشنایی و تاریکی 12 ساعته، دما 25-23 درجه­ی سانتیگراد و تغذیه­ی حیوانات به وسیله­ی خوراک مخصوص موش آزمایشگاهی صورت می­گیرد. به منظور القاء بیماری پارکینسون از داروی 6-هیدروکسی دوپامین که از شرکت سیگما تهیه خواهد شد، استفاده می­شود. حیوانات به طور تصادفی به 5 گروه 8 تایی تقسیم خواهند شد.

گروه اول: گروه سالم یا کنترل که جراحی و تیمار نمی­شوند.

گروه دوم: گروه شم که پس از جراحی، محلول بی اثر سالین (2میکروگرم بر کیلوگرم) به جسم مخطط تزریق می شود و در طول مطالعه با آب مقطر به صورت روزانه گاواژ می­شوند.

گروه سوم: گروه پارکینسونی که پس از جراحی و تزریق 6 هیدروکسی دوپامین (8 میکروگرم بر کیلوگرم) تیمار و در طول مطالعه با آب مقطر به صورت روزانه گاواژ می­شوند.

گروه چهارم: گروه پارکینسونی تیمار شده با کوئرستین (روزانه  دوز 10میلی­گرم بر کیلوگرم وزن بدن کوئرستین دریافت می­کنند)

گروه پنجم: گروه پارکینسونی تیمار شده با کوئرستین (روزانه  دوز25 میلی­گرم بر کیلوگرم وزن بدن کوئرستین دریافت می­کنند)

برای القاء بیماری پارکینسون موش­های صحرایی با تزریق داخل صفاقی 90 میلی گرم بر کیلوگرم کتامین هیدرو کلراید و 10 میلیگرم بر کیلوگرم زیلازین بیهوش می­شوند. سپس موش در دستگاه استرئوتاکس قرار گرفته و توسط قطعه دهانی و میله­های داخل گوشی بر روی دستگاه ثابت خواهند شد و موهای ناحیه پشتی جمجمه تراشیده می­شود. توسط پنبه الکلی پوست سر حیوان ضدعفونی شده و یک برش طولی از میان سطح پشتی سر بین دو چشم تا فاصله نقطه سطح پشتی میانی گوش­ها ایجاد می­گردد. بافت­های پیوندی روی سطح جمجمه زدوده شده تا نقطه برگما نمایان شود. نقطه برگما و لامبدا در یک سطح برابر قرار داده شده و نشانگر دستگاه بر روی آن تنظیم خواهد شد. سپس با توجه به مختصات استخراج شده از اطلس جراحی مغز، مختصات  MFB(Medial forebrain bundle) مشخص خواهد گردید.

 موش­ها با تزریق یک طرفه 8 میکروگرم نوروتوکسین 6-هیدروکسی دوپامین تهیه شده در 2 میکرولیتر نرمال سالین حاوی 1 درصد اسیدآسکوربیک در دسته قدامی میانی مغز پارکینسونی خواهند شد. گروه شم هم پس از جراحی، به کمک سرنگ هامیلتون، سالین دریافت خواهند کرد. موش­های دریافت کننده کوئرستین به مدت چهار هفته روزانه با دوز 10 و25 میلی گرم بر کیلوگرم کوئرستین به صورت گاواژ تیمار خواهند شد.

سنجش میزان BDNF: در انتهای آزمایش برای تعیین میزان سطح سرمی BDNF حیوانات بیهوش می­شوند و سر آنها توسط گیوتین جدا خواهد شد. پس از خارج کردن کامل مغز از جمجمه به سرعت ناحیه استریاتوم مغز در نیترورژن مایع منجمد می گردد و تا انجام آزمایش های بیوشیمیایی در دمای منفی 80 درجه سانتی گراد در فریزر نگهداری می­شود.در زمان آزمایش بافت با بافر 17 میلی مولار فسفات و با سـرعت 8000 دور در دقیقـه هموژن می­گردد.

سنجش حافظه و یادگیری با استفاده از آزمون ماز آبی موریس:

آزمون رفتاری به منظور ارزیابی یادگیری فضایی در دستگاه ماز آبی موریس به مدت 5 روز  انجام می­گیرد ( 4 روز مرحله آموزش و 1 روز مرحله آزمون). این دستگاه از یک حوضچه با قطر 150 و ارتفاع 60 سانتیمتر ساخته شده است که تا ارتفاع 25 سانتیمتر با آب 1±21 درجه سانتی گراد پر می­شود. یک سکو با قطر 10 سانتیمتر در مرکز ربع دایره در جنوب غربی قرار گرفت. از طریق یک دوربین مدار بسته حرکات موش به کامپیوتر و نرم انتقال می­یابد و پارامترهای مختلف از جمله مسافت طی شده و مدت زمان سپری شده در ماز آبی موریس ثبت می­گردد. در مرحله سازش با محیط هر موش 24 ساعت قبل از آموزش به مدت 3 دقیقه در ماز بدون سکو قرار داده می شود. در مرحله آموزش هر موش به مدت 4 روز و هر روز 4 بار در ماز قرار داده می شود و مسیر حرکات حیوان به مدت 90 ثانیه ثبت می گردد. در این مرحله پارامترهای ذکر شده مربوط به کل مسافت طی شده و مدت زمان سپری شده تا یافتن سکوی مخفی در ماز ثبت می گردد. در مرحله ارزیابی 24 ساعت پس از آخرین روز مرحله آموزش، حافظه فضایی موش­ها در ماز فاقد سکو مورد ارزیابی قرار گرفت. در این مرحله یک آزمون 60 ثانیه ای از هر حیوان ثبت می شود و در طی این مدت، مدت زمان حضور موش در محوطه­ای که قبلا سکو وجود داشته به عنوان شاخص و ملاک حافظه ثبت و مورد تجزیه و تحلیل قرار می گیرد. (19)

سنجش حافظه و یادگیری با استفاده از آزمون عادت کردن به زمینه باز (Open field):

این نوع از آزمون حافظه در آزمایشگاه­ها به منظور بررسی حافظة فضایی که نوعی حافظة اخباری است انجام می شود. عادت کردن به زمینة باز متشکل از قرار دادن یک حیوان در ناحیة باز در یک محیط جدید  بـدون هیـچ تحریـک ناخوشـایند و یـا خوشـایند اسـت و بـه حیــوان اجــازه داده می­شــود کــه در مــدت زمانــی مشــخص محوطــه را آزادانــه مــورد جســتجو قــرار دهــد. به منظور ارزیابی عدم وجود نقص حرکتی و بررسی فعالیت جستجوگرانه  از تکنیک Open field استفاده می­شود. حیوانات به مدت 5 دقیقه در این جعبه قرار می­گیرند .جعبه ای با دیواره هایی از جنس پلکسی گلس (Plexiglass) به ابعاد 50 ×50×50 سانتی متر  که جعبه به 9 مربع با اندازه های مساوی ( 6/16 × 6/16) تقسیم شده است. پارامتر اصلی crossing  یعنی تعداد اضلاع مربع­هایی که حیوان از آن عبور می­کند شمرده می شود و مورد بررسی قرار می­گیرد.  اگرچه علاوه بر شاخص مذکور حرکاتی مثل grooming یعنی تعداد دفعاتی که عمل تمیز کردن  ( یا خاراندن) خود را انجام می­دهد و Rearing  یعنی تعداد دفعاتی که حیوان روی دو پای خود می­ایستد نیز شمارش می­شود اما نتایج بدست آمده مورد بررسی قرار نمی­گیرد. (20).

سنجش اضطراب  با استفاده از آزمون ماز بعلاوه­ای مرتفع (Elevated plus maze):

برای ارزیابی اضطراب از دستگاه ماز بعلاوه ای شکل مرتفع  که مدلی استاندارد جهت ارزیابی سطح اضطراب در جوندگان است استفاده می شود. این دستگاه شامل دوبازوی باز ( هر یک 10 × 50 سانتی متر) و دو بازوی بسته ( هر یک 40× 10× 50) و یک کفه مرکزی ( 10× 10 سانتی متر) است که بازوهای باز روبروی هم و بازوهای بسته هم روبروی یکدیگر قرار دارند این دستگاه حدود 50 سانتیمتر از کف اطاق بالاتر قرار می­گیرد،  هر موش قبل از آزمون به اطاق کار منتقل و به طور جداگانه 5 دقیقه در جعبه ای به ابعاد 10× 40× 30 سانتی متر قرار می گیرد تا فعالیت جستجوگرانه حیوان افزایش یابد،  آنگاه به مدت 5 دقیقه در ماز (قسمت کفه و رو به بازوی باز) قرار داده می شود و شاخص­های استاندارد ارزیابی اضطراب از طریق مشاهده آن ها بررسی و فعالیت های جستجوگرانه ثبت می شود که شامل: 1- زمانی که هر حیوان در بازوهای بسته و یا باز سپری کرده که تبدیل به درصد زمان سپری شده می گردد. 2- تعداد ورود به بازوهای باز و بسته. افزایش ورود به بازوهای باز و افزایش مدت سپری شده در بازوی باز شاخص کاهش اضطراب در موش تلقی می شود. همچنین قضاوت در مورد اختلاف معنی دار سطح اضطراب بدین صورت است که اگر هم زمان هر دو شاخص (ورود به بازوی باز و مدت سپری شده در آن­ها)  در یک راستا کاهش و یا افزایش یابد و حداقل یکی از آنها تفاوت معنی داری با گروه کنترل داشته باشد به عنوان تغییر معنی دار در سطح اضطراب در نظر گرفته می شود. (21)

در این مطالعه از آمار توصیفی برای تعیین شاخص­های مرکزی (میانگین) و پراکندگی (انحراف استاندارد) استفاده می­گردد و آزمون شاپیرو-ویلک نیز، جهت تعیین طبیعی بودن توزیع داده های گروه ها به کار گرفته می­شود . از آمار استنباطی تحلیل واریانس یک طرفه و آزمون تعقیبی توکی در صورت نرمال بودن داده­ها و از آزمون کروسکال والیس و من ویتنی یو در صورت غیر نرمال بودن داده­ها برای تجزیه و تحلیل یافته ها استفاده می­شود. معنا داری اختلاف داده ها نیز برای تمام محاسبات در سطح 05/0 P≤ در نظر گرفته  می­شود. کلیه نمودارهای مورد نظر توسط نرم افزار Excel رسم خواهند شد.

با توجه به اینکه تمام مراحل تحقیق بر روی مدل حیوانی انجام می­شود ، تمامی قوانین مربوط به نگهداری و کار با حیوانات آزمایشگاهی ، به طور کامل رعایت می­شود، خونگیری در حالت بیهوشی حیوان انجام می­گیرد و برای انجام آزمایشات از حداقل ممکن حیوانات استفاده می­شود.

از انجایی که این مطالعه بر روی مدل حیوانی انجام می­گیرد ، احتمال اینکه موش­ها در طول مدت آزمایش به سایر بیماری­ها به غیر از بیماری تجربی القاء شده مبتلا شوند، وجود دارد. برای کاهش این عامل سعی می­شود موش­ها در محیطی کاملا مناسب و تحت شرایط استاندارد( دمای 25 – 20 درجه سانتی گراد ، رطوبت 50-40 %، 12 ساعت شب و 12 ساعت روز) نگهداری شوند تا خطر انتقال بیماری از سایر منابع به آن­ها کاهش یابد. همچنین در طول مدت آزمایش و قبل از آن، به منظور جلوگیری از سوء تغذیه، مواد غذایی مناسب و کافی از طریق رژیم استاندارد در اختیار گروه­های موش قرار می­گیرد تا از هر گونه اختلال در حین انجام تحقیق پیشگیری شود.

کوئرستین، پارکینسون، BDNF

1. Shadrina, M. I., Slominsky, P.A. and Limborska, S. (2010). “Molecular mechanisms of pathogenesis of Parkinson's disease.” International review of cell and molecular biology, Vol. 281, p. 229-266.
2. Albarracin, S.L., Stab, B., Casas, Z., Sutachan, J., Samudio, I., Gonzalez, J., Gonzalo, L., Capanil, F., Marales, L. (2012). “Effects of natural antioxidants in neurodegenerative disease.” Nutritional Neuroscience, Vol. 15, No. 1, p. 1-9.
3. Rodriguez-Oroz, M.C., Jahanshahi, M., Krack, P., Litvan, I., Macias, R., Bezard, E., Obeso, J. (2009). “Initial clinical manifestations of Parkinson's disease: features and pathophysiological mechanisms.” The Lancet Neurology, Vol. 8, No. 12, p. 1128-1139.
4. Uttara, B., Singh A. V., Zamboni P. and Mahajan R.T. (2009). “Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options.” Current neuropharmacology, Vol. 7, No. 1, p. 65-74.
5. Carocho, M. and Ferreira, I.C. (2013). “A review on antioxidants, prooxidants and related controversy: Natural and synthetic compounds, screening and analysis methodologies and future perspectives.” Food and Chemical Toxicology, Vol. 51: p. 15-25.
6. Kaur, H. and Kaur, G. (2014). “A Critical Appraisal of Solubility Enhancement Techniques of Polyphenols.” Journal of Pharmaceutics, Vol. 2014. P. 1-14.
7. Sriraksa, N., Wattanathorn j., Muchimapura, S., Tiamkao, S., Brown, K. and Chaisiwamongkol K. (2011). “Cognitive-enhancing effect of quercetin in a rat model of Parkinson's disease induced by 6-hydroxydopamine.” Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, Vol. 2012, p. 1-9.
8. Lang U. E, Gunther L, Scheuch K, Klein J, Eckhart S, Hellweg R…(2009) . Higher Bdnf Concentrations In The Hippocampus And Cortex Of An Aggressive Mouse Strain. Behavioural Brain Research; 197: 246-249
9. Nisingh S, Ahmad R, Mathur D, Sagar RK, Krishana B. (2006)Neuroprotective effect of BDNF in young and aged 6-OHDA treated rat model of Parkinson disease. 44(9):699-704.
10. Kandiah, N., N. H. Zainal, K. Narasimhalu, R. J. Chander, A. Ng, E. Mak, W. L. Au, Y. Y. Sitoh, N. Nadkarni and L. C. Tan (2014). Hippocampal volume and white matter disease in the prediction of dementia in Parkinson's disease. Parkinsonism & related disorders,. 20(11): p. 1203-1208.
11. Yang, J., S. Song, J. Li and T. Liang (2014). Neuroprotective effect of curcumin on hippocampal injury in 6-OHDA-induced Parkinson's disease rat. Pathology-Research and Practice,. 210(6): p. 357-362.
12. Chiaravalloti, N. D., N. Ibarretxe-Bilbao, J. DeLuca, O. Rusu, J. Pena, I. García-Gorostiaga and N. Ojeda (2014). The source of the memory impairment in Parkinson's disease: Acquisition versus retrieval. Movement Disorders,. 29(6): p. 765-771.
13. Rendeiro, C., J. D. Guerreiro, C. M. Williams and J. P. Spencer (2012). Flavonoids as modulators of memory and learning: molecular interactions resulting in behavioural effects. Proceedings of the Nutrition Society,.71(02): p. 246-262.
14. Bao D et al, Protective Effect of Quercetin against Oxidative Stress-Induced Cytotoxicity in Rat Pheochromocytoma (PC-12) Cells. Molecules 2017: 22, 1122
15. Lv, C., T. Hong, Z. Yang, Y. Zhang, L. Wang, M. Dong, J. Zhao, J. Mu and Y. Meng (2012). Effect of quercetin in the 1-Methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine-induced mouse model of Parkinson's disease. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 2012.
16.   Sriraksa N, Wattanathorn J, Muchimapura S, Tiamkao S, Kamoltip B, and Kowit Ch. Cognitive-Enhancing Effect of Quercetin in a RatModel of Parkinson’s disease Induced by 6-Hydroxydopamine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2012; 1-9
17.  Wang, D.-M., S.-Q. Li, W.-L. Wu, X.-Y. Zhu, Y. Wang and H.-Y. Yuan (2014). Effects of Long-Term Treatment with Quercetin on Cognition and Mitochondrial Function in a Mouse Model of Alzheimer’s Disease. Neurochemical research,. 39(8): p. 1533-1543.

18- منسوجی، م و همکاران، اثر حفاظتی نانوکریستال کوئرستین بر اختلالات حرکتی ناشی از 6-هیدروکسی دوپامین در استریاتوم موش صحرایی، بیست و دومین کنگره فیزیولوژی و فارماکولوژی ایران. 1395

19- Majlessi N, Kadkhodaee M, Parviz M, Naghdi N. Serotonin depletion in rat hippocampus attenuates L-NAME-induced spatial learning deficits. Brain Res 2003 Feb; 963(1-2): 244-51.

20- Wang H, Zuo D, He B, Qiao F, Zhao M, Wu Y. Conditioned fear stress combined with single-prolonged stress: a new PTSD mouse model. Neurosci Res 2012; 73: 142-152.

21- Rashidy-Pour A, Vafaei AA, Hesami E, Taherian AA. Evaluation the role of nitric oxide in corticosterone effect’s on anxiety like behaviors in mice. J Golestan Univ Med Sci 2008; 10(1): 5-11.