مقایسه اثر مهاری عصاره های گیاهی رازیانه و مرزه با نیستاتین برکاندیدا آلبیکانس در محیط آزمایشگاهی

علم شناسایی و استفاده از گیاهان داروئی به قدمت عمر انسان بر می گردد. تا قبل از قرن 19 میلادی استفاده ازمنابع طبیعی و عمدتأ گیاهان از راه های اصلی درمان بیماری ها بوده است. پیشرفت سریع علم شیمی وکمبود منابع باعث شد که ترکیبات شیمیایی جدید جایگزین داروهای گیاهی شود. اما امروزه مجددأ دانشمندان بسیاری از رشته های گوناگون به داروهای گیاهی روی آورده اند. اثرات ضد میکروبی، ضد قارچی و ضد سرطانی در گیاهان ایران سرمنشأ بسیاری از تحقیقات بوده و به سرانجام رسیدن این تحقیقات می تواند سبب خود کفائی و استقلال در صنایع دارویی کشور شود¹. با توجه به اینکه درحال حاضر اکثر مواد اولیه دارویی در ایران ساخته نشده و نیاز به واردات این کالاها وجود دارد و از طرفی مقاوم شدن باکتری ها نسبت به داروهای ساختگی شیمیایی، نیاز به بررسی و تولید انواع ضد میکروبی گیاهی به نظر منطقی می رسد.از سوئی بیماران خاص مثل افراد سالخورده و ناتوان همچنین افراد دیگر با بیماری هایی که منجر به تضعیف عضلات دست می شود و یا افراد در معرض خطر میکروبی مثل افراد مستعد به اندوکاردیت ، ضعف سیستم ایمنی، دیابتی ها، بیماران خونی در برابر کنترل پلاک و کنترل ضایعات قارچی ملزم به استفاده از موارد آنتی میکروبیال می باشند. با گسترده شدن دامنه کاربرد دهانشویه ها دسترسی به موادی که حداقل اثرات جانبی (مثل ایجاد رنگیزه بر دندان ها و مواد پر کردگی عفونت های ناخواسته و سمیت بافتی( حداکثر اثرات مطلوب را ایجاد نماید بسیار لازم و ضروری به نظر می رسد .^2,3,4,5

کاندیدا البیکانس یک پاتوژن فرصت طلب و جزء فلور نرمال دهان محسوب می شود . در یک بررسی از بیماران توانسته اند کاندیدا را از 48 درصد مبتلایان به برفک، 57 درصد مصرف کنندگان آنتی بیوتیک دهان،55 درصد التهاب لب و گوشه دهان، 96 درصد زخم های ناشی از پروتز 48 ،درصد کاندیدازیس مزمن هایپرپلاستیک و 11 درصد کاندیدیازیس مزمن پوستی مخاطی جدا نمایند.

نقش کاندیدا به عنوان یک عامل فرصت طلب اتیولوژیک درضایعات سفید کراتوتیک و غیرکراتوتیک دهان دقیقاً مشخص شده است. اخیراً مطالعات اولترامیکروسکوپیک ومیکروبیولوژیک اطلاعاتی را در این زمینه فراهم نموده است  در همین رابطه اهمیت این ارگانیسم به عنوان سرطانزا و یا موثر در ایجاد سرطان های دهان نامشخص است. به هر حال حضور دائمی کاندیدا در محیط آزمایشگاهی حاکی از این است که کاندیدا امکان دارد تنها یک عامل عفونی بی ضرر نباشد در درمان ضایعات سفید مزمن باید در حذف و کنترل کاندیدازیس کوشش نمود. ³

کاندیدیاز توسط قارچ هایی از جنس کاندیدا و به طور اعم کاندیدا آلبیکنسایجاد می شود. سیر بالینی آن به صورت اشکال حاد، تحت حاد یا مزمن اسپورادیک است. عفونت ممکناست منحصر به دهان، گلو، پوست، واژن، انگشتان، ناخن ها، نای، ریه یا دستگاه گوارش بوده و یا به صورت سیستیمک همراه با سپتی سمی، اندوکاردیت و منتژیت مشاهده گردد. واکنش پاتولوژیک نیز به صورت مختلف بوده و از یک تحریک و التهاب ساده، یک واکنش گرانولومائی حاد یا مزمن متغیر است.

از آنجایی که گونه های کاندیدا اندوژن می باشند، بیماری حاصل از آنان به صورت عفونت فرصت طلبت ظاهر می کند. ⁵نیستاتین آنتی بیوتیکی از خانواده پلیین است که بصورت پماد جلدی و یاقطره خوراکی مصرف می گردد. اسم اصلی آن فانژیسیدین می باشد ولی چون برای اولین با رتوسط کارکنان اداره بهداشت ایالت نیویورک کشف گردیده، بدین لحاظ آن رانیستاتین نام نهادند. برای اولین بار نیستاتین را از باکتری استرپتویاس نورسئی بدست آورده و خالص ساختند. فعالیت ضد قارچی آن در محیط های کشت، دررابطه با شبه مخمرها از شدت بیشتری برخوردار است. از ویژگیهای نیستاتین مانند بقیه آنتی بیوتیکهای گروه پلیین، جذب بسیار ناچیز یا حتی عدم جذب آن از راه خوراکی است. و به علت مزه بد و مقاومت دارویی نسبت به این  دارو ، محققین بدنبال داروهای گیاهی بی ضرر برای درمان کاندیدیازیس می باشند. بنابراین کشف گیاهان دارویی که تاثیرات ضد میکروبی داشته باشد برای کاهش عوارض جانبی و کم کردن اثرات سمی روی بافت و همچنین از لحاظ اقتصادی بسیار مقرون به صرفه است.^3و4

گزارش های متعددی وجود دارد که نشان دهنده خواص ضدمیکروبی و ضدقارچ اسانس های گیاهی است. ترکیب-هایی همچون سینئول  ،کامفور  ، لینالول  ، آلفا پینن 4، بتا پینن 5، برنئول 6 ، کارون 7 ، لیمونن  ، کارواکرول  ، سیمن  ، کامفن  و آلفا ترپ ینئول  که دراسانس مختلف گیاهی وجود دارند دارای خواص ضدمیکروبی و ضدقارچی هستند .⁶

مرزه با نام علمی Satureja bachtiarica اغلب در مناطق مدیترانه ای پراکندگی دارد و بومی ایران نیز می-باشد و در ایران 15 گونه از آن شناخته شده است.⁷رازیانه با نام علمی Foeniculum vulgare نیز از گیاهان دارویی مشهور است که ازدیرباز خواص میکروب زدایی آن مورد توجه بوده است .⁸افشاری و همکاران(2013 )، اثر اسانس رازیانه بر رشد قارچ Aspergillus flavus را مورد بررسی و آزمایش قرار دادند  و به نتایج مثبتی دست یافتند.⁹

راد و همکاران2011) ) اسانس مرزه و آویشن را به منظور مهار رشد قارچ Aspergillus parasiticus مورد استفاده قرار دادند و به تاثیر مثبت گیاه مرزه بر این گونه قارچ پی بردند.¹⁰

با این وجود تاثیر دو گیاه رازیانه و مرزه بر مهار رشد کاندیدا آلبیکانس مورد ارزیابی قرار نگرفته است.با توجه به اینکه گیاهان دارویی امروزه بدلیل عوارض کم و مقرون به صرفه بودن نسبت به داروهای شیمیایی مورد توجه قرار گرفته اند این مطالعه با هدف مقایسه تاثیر مهاری دو گیاه رازیانه و بابونه با نیستاتین روی کاندیدا آلبیکانس طراحی شده است.

- 1 اثر مهاری  نیستاتین روی کاندیدا آلبیکانس در محیط آزمایشگاهی چگونه است؟

- 2 اثر مهاری عصاره گیاهی رازیانه  روی کاندیدا آلبیکانس در محیط آزمایشگاهی چگونه است؟

- 3 اثر مهاری  عصاره گیاهی مرزه روی کاندیدا آلبیکانس در محیط آزمایشگاهی چگونه است؟

4-اثر مهاری  عصاره گیاهی مرزه و رازیانه روی کاندیدا آلبیکانس با نیستاتین در محیط آزمایشگاهی تفاوت دارد

مقایسه اثر مهاری عصاره گیاهی رازیانه  و  مرزه  با نیستاتین برکاندیدا آلبیکانس در محیط آزمایشگاهی

- 1 تعیین اثر مهاری  نیستاتین روی کاندیدا آلبیکانس در محیط آزمایشگاهی

- 2 تعیین اثر مهاری عصاره گیاهی رازیانه روی کاندیدا آلبیکانس در محیط آزمایشگاهی

- 3 تعیین اثر مهاری عصاره گیاهی مرزه روی کاندیدا آلبیکانس در محیط آزمایشگاهی

 4 -مقایسه اثر مهاری  عصاره های گیاهی بابونه  و مرزه با نیستاتین روی کاندیدا آلبیکانس در محیط آزمایشگاهی

علوم پزشکی

مرزه با نام علمی Satureja bachtiarica اغلب در مناطق مدیترانه ای پراکندگی دارد و بومی ایران نیز می-باشد و در ایران 15 گونه از آن شناخته شده است.⁷

رازیانه با نام علمی Foeniculum vulgare نیز از گیاهان دارویی مشهور است که ازدیرباز خواص میکروب زدایی آن مورد توجه بوده است .⁸

 آزمایشگاهی

جامعه مورد آزمایش, قارچ کاندیدا آلبیکانس گونه Timm2441 )) یک گونه ایزوله شده از انستیتو قارچ شناسی پزشکی.

حجم نمونه بر طبق مطالعات گذشته برای هرعصارۀ گیاهی 10دیسک در نتیجه 20 محیط آزمایشگاهی .⁸

آسان

 ارزیابی لابراتواری

در این مطالعه توصیفی- تحلیلی، سوش استاندارد کاندیدا آلبیکنس شماره Timm2441 در محیط s.c ( sabuard dextor Agar حاوی کلرامفنیکل(کشت داده می شود. 5

31 گرم از پودر هر گیاه( رازیانه و مرزه) در 111 میلی لیتر متانول خالص حل می شود و محلول بمدت 44 ساعت روی شیکر(هم زن( گذاشته می شود, سپس هر عصاره از کاغذ فیلتراسیون whatman شماره 1 گذرانده می شود.درمرحله بعد محلول 2 میلی گرم بر میلی / فیلتراسیون در انکوباتور 33 درجه سانتیگراد بمدت 44 ساعت گذاشته می شود. سپس  دیسکهای خالی را داخل بشر ریخته و درب آن را بسته و بعد از آن بوسیله اتوکلاو استریل می شود. در شرایط استریل، هر 10 دیسک در محفظه شیشه ای حاوی یکی از انواع عصاره متانول گیاهی قرار داده و روی آن پوشیده می شود. ضمناً 10 دیسک هم داخل متانول گذاشته می شود. بعد از 1 ساعت دیسکهای اشباع شده در شرایط استریل بوسیله انبر برداشته و در انکوباتور 41 درجه سانتیگراد بمدت 21دقیقه خشک می گردد. در این آزمایش، روش انتشار دیسک کاغذی استاندارد ¹¹شده برای ارزیابی فعالیت ضد قارچی استفاده  می شود.بدین صورت که ابتدا سوسپانسیونی از1 واحد مک / کاندیدا در سرم فیزیولوژی استریل تهیه می کنیم به نحوی که کدورت حاصله معادل لوله 5فارلند شود و سپس با استفاده از 1 سواپ استریل از سوسپانسیون مربوطه برداشته و در تمامی سطح یک پلیت محتوی محیط سابرد گسترش داده و سپس داخل هر پلیت، 1 دیسک عصاره گیاهی، 1 دیسک نیستاتین 111 واحدی به عنوان کنترل مثبت و یک دیسک متانول و یک دیسک خالی بعنوان کنترل منفی استفاده می شود. دیسک ها به فاصله 15 میلیمتراز لبه پلیت و 24 میلیمتر از مرکز دیسک بعدی گذاشته می شود. تمام پلیت ها در انکوباتور 33 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت قرار داده می شود تا زمانی که هیچ هاله عدم رشدی اطراف دیسک کنترل منفی دیده نشود و برای هر گیاه این تست 10 بار انجام خواهد شد. بالاترین رقت موجود از عصاره که در آن رشد قارچ مشاهده نگردد به عنوان MFCاین عصاره در نظر گرفته می شود .منطقه مهار هر تست گیاهی علیه کاندیدا با منطقه مهار تست نیستاتین بوسیله کولیس با دقت نیم میلیمتراز طریق آنالیز ANOVAمقایسه می شود

با استفاده از نرم افزار21 SPSS از آزمون ANOVA استفاده می شود.

تعیین قطر هاله عدم رشد کاندیدا البیکانس در سه داروی مورد مطالعه

کدهای  راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی  به شرح ذیل در این مطالعه رعایت می شود

کد 1-10-11-14-27-28-29-30

ندارد

داروی گیاهی،کاندیدا آلبیکانس ،نیستاتین

herbal drug, Nystatin, Candida Albicans

1- Blanco J,  Garcia ME. Immune Response To Fungal Infections. Vet Immunol:

Immunopathology 2008;125: 47–70 .

2-Ruddock PS, Liao M, Foster BC, Lawson L, Arnason JT, Dillon JA.Garlic Natural Health Products Exhibit Variable Constituent Levels And Antimicrobial Activity Against Neisseria Gonorrhoeae, Staphylococcus Aureus and Enterococcus Faecalis. Phytother Res. 2005 Apr;19(4):327-34.

3- Bougnoux M, Aanensen S, Morand M. The´Raud,B. Spratt  And C. d’Enfert. Multilocus Sequenc Typing Of  Candida Albicans: Strategies, Data Exchange And Applications. Infect. GenetEvol 2004;4:243– 252.

4-Gürgan CA, Zaim E, Bakirsoy I, Soykan E. Short-term Side Effects of 0.2% Alcohol-Free Chlorhexidine Mouthrinse Used As An Adjunct To Nonsurgical Periodontal Treatment: A Double-Blind Clinical Study. J Periodontol  2006;77(3):370-84.

 5-Arbabi Kalati F,  Shirzai M, Pourzamani  M, Dabiri S. Comparison of the Effect of Thyme, Clove and Cinnamon Extract with Nystatin on Inhibitory Candida Albicans.

. J  Research in Dentistry 2011; 4(30):175-179
6-Soltani Pour M.A. The Comparison of collected essence combinations of Majdae(Zhameria)’s Leaf at different growth stages from different parts of hormozgan and the evaluation of allelopathic potential and antimicrobial properties of extracted essence. MA Student’s Thesis of Plant Science, Faculty of Science, Shiraz University 2002(in Persian).

7-Soylu  S, Soylu E.M, Evrendilek G.A.Chemical composition and antibacterial activity of essential oils of bitter fennel (Foeniculum vulgare) and dill (Anethumgraveolens) against the growth of food-borne and seed-born pathogenic bacteria. Italian Journal Food Science 2009;21(3): 347-355

8- Arran A, Noorollahi M, Shahiandand Z.  Antifungal Effects of Bakhtiari Savory Oil, Cinnamon and Fennel on Growth of Three Species of Fungal Disease in Lab conditions. Applied Biology2018; 31(1): 190-206.31 (1): 190-206. doi: 10.22051/jab.2018.3686 doi: 10.22051 / jab.2018.3686

9-Afshari H, Ziveai F, Bagheri G, Afshari M, Zadehbagheri M. Study the antifungaleffects of plant medicinal essences on growth of Aspergillus flavus and Aflatoxin B1 in Pistachio (Pistacia vera L.). J of Rostamineh 2013; 5(3): 16-23

10-Rad S, Afshari H, Hokmabadi H, Tahmasbi S. Study of antifungal effects ofherbal essenses on Aspergillus parasiticus, a producer of aflatoxin in Pistachio. J Med Plant Res 2011; 5(20): 5155-5159

11-Ahmad I, Beg AZ. Antimicrobial And Phytochemical Studies On 45 Indian Medicinal  Plants Against Multi, Drug Resistant Human Pathogens. J Of Ethno Pharmacal 2001؛ 74(2): 113-23.

پرسشنامه طلاعاتی (ضمیمه شماره 1)

 نوع داروی ضد قارچ...............................

قطر هاله عدم رشد ..........................