بررسی اثر گالیک‌ اسید بر اختلال عملکرد دستگاه تولید مثلی نر در موش دیابتی القا شده با متیل گلی اکسال

بیماری دیابت (بویژه نوع دو) یکی از مشکلات جدی بهداشتی دنیای امروزی بوده و موجب خسارات و اختلالات طولانی مدت در اندام های مختلف از جمله نفروپاتی، بیماریهای قلبی عروقی و اختلال عملکرد بیضه می شود. متابولیسم گلوکز نقش مهمی در اسپرماتوژنز دارد و مطالعات انجام شده در حیوان و انسان اثرات زیان آور هیپرگلیسمی بر عملکرد جنسی از جمله پارامترهای اسپرم (1) را تایید کرده است. دیابت اثرات مختلفی از جمله تغییر در وزن بدن، متابولیسم گلوکز] آنزیمهای کبدی و شاخصهای استرس اکسیداتیو (2)، کاهش تعداد و عملکرد سلول های لایدیک و کاهش بیان رسپتور FSH در لوله های سمینفروس را در بیضه موجب میشود (3).  مطالعات دیگری کاهش حرکت و غلظت اسپرم، اختلال نعوذ (4)، و کاهش قدرت باروری مردان دیابتیک (5) را گزارش کرده اند. مکانیسم های مختلفی از جمله اختلالات اندوکرین، نوروپاتی و افزایش استرس اکسیداتیو (6) میتواند تخریب ایجاد شده در اسپرم و سیستم تولید مثلی را توجیه کند.

         متیل‌گلای‌اکسال (MGO[1]) ترکیبی بسیار واکنش‌پذیر و پرکرسور(پیشساز) قوی در ایجاد [2]AGEs است و به طور عمده از متابولیسم گلوکز و فروکتوز مشتق میشود و این ماده در شرایط فیزیولوژیکی، توسط سیستم گلای‌اکسالاز سم‌زدایی می‌شود. شواهد تجربی حاکی از این است که مقدار آن با افزایش سن و هایپرگلیسمی افزایش می‌یابد، (7). گزارشات نشان می دهد که اختلال عروقی ناشی از دیابت (8) و آپوپتوز ناشی از استرس اکسیداتیو در اندوتلیوم عروق (9) به واسطه ی وجود متیل گلای اکسال است. متیل‌گلی‌اکسال از طریق دو مرحله واکنش آنزیمی توسط گلای‌اکسالاز1و2 و با استفاده از گلوتاتیون به عنوان کوفاکتور سم‌زدایی می‌شود (10, 11)، بطوریکه برای جلوگیری و درمان عوارض احتمالی دیابت می‌توان از القاکننده‌های گلای‌اکسالاز استفاده کرد (12). متیل‌گلای‌اکسال درون سلول تولید می‌شود ولی مقدار بسیار کمی از آن به خارج نشت کرده که همین امر گلیکه شدن پروتئین‌های‌سلولی و خارج‌سلولی توسط متیل‌گلای‌اکسال را افزایش می‌دهد (13).

        در یک مطالعه Mirra و همکاران در سال 2016 مقاومت انسولینی ناشی از متیل‌گلای‌اکسال را در سلول‌های اندوتلیال عروق موش کوچک آزمایشگاهی مورد بررسی قرار دادند (14). در سال 2016، Huang و همکاران نیز نشان دادند که متیل‌گلای‌اکسال عامل درد نوروپاتیک ناشی از دیابت القا شده با STZ در موش صحرایی می‌باشد (15). همچنین Wu و همکاران در 2002 نشان دادند که استفاده از متیل‌گلای‌اکسال باعث کاهش معنادار در مقدار IKβ (مهارکننده فاکتور هسته ایی کاپا) و افزایش میزان فاکتور هسته ایی کاپا (NF-Kβ) در عروق موش صحرایی گردید (16). Cardoso و همکاران در سال 2014 نشان دادند که متیل‌گلای‌اکسال با تولید گونه‌های فعال اکسیژن، دفاع آنتی‌اکسیدانی میتوکندری مغز موش صحرایی را سرکوب کرده و باعث آسیب استرس اکسیداتیو می‌شود (17). Dhar و همکاران نیز در سال 2011 نشان دادند که تزریق وریدی متیل‌گلای‌اکسال با القای دیابت نوع 2 منجربه اختلال عملکرد سلول‌های بتا پانکراس می‌شود (18). Sakamoto و همکاران در سال 2002 نشان دادند که متیل‌گلای‌اکسال با گلیکوزیله (قنددار) نمودن hsp-27 سلول‌ها باعث تحریک کاسپاز و وقوع آپوپتوز درسلول‌های توموری و بقای سلول‌های سالم می‌گردد (19).

         گالیک اسید (GA، 3،4،5-trihydroxybenzoic acid) یک ماده پلی فنولی مهم در چای سبز، انگور، انبه، گردو است. در مطالعات فارماکولوژیکی نشان داده شده است که گالیک اسید دارای اثرات ضد التهابی، ضد انعقاد و دارای فعالیت ضد توموری می باشد. گالیک اسید همچنین بعنوان یک محافظت کننده شیمیایی مطرح است (20). همچنین اثرات ضدالتهابی و ضد حساسیتی (21) و آنتی‌اکسیدانی (22) آن در مطالعات مختلف گزارش شده است. Oyaqbemi و همکاران در سال 2016 اثر گالیک اسید (GA) بر روی مسمومیت بیضه ناشی از سیکلوفسفامید (CPA[3]) در مدل موش صحرایی مورد بررسی قرارداده و نتیجه گرفتند که گالیک اسید با دوزmg/kg/d  60 و 120 بمدت 14 روز بصورت داخل صفاقی سبب بهبود پارامترهای تولیدمثلی شده است (23). Olusoji و همکاران در سال 2017 اثر گالیک اسید (GA) بر روی مسمومیت بیضه و مجرای اپیدیدیم ناشی از دوکسوروبیسین (DOX) را در مدل موش صحرایی بررسی نموده و نتیجه گرفتند که گالیک اسید با دوز 60 و 120 میلی گرم/کیلوگرم بمدت 7 روز بصورت خوراکی سبب بهبود پارامترهای تولیدمثلی شده است (24). بعلاوه در سال 2017، Yigitturk و همکاران اثر گالیک اسید (GA)  بر روی مدل دیابت نوع 1 ناشی از استرپتوزوتوسین(STZ)  را در موش صحرایی مطالعه نموده و دیدند که گالیک اسید با دوز  mg/kg/d 20 بمدت 28 روز بصورت خوراکی اثر درمانی ضعیفی بر پارامترهای تولیدمثلی (از قبیل: تخریب اسپرماتیدها، ادم بین سلولی، حضور سلولهای غیرمعمول در مجرا و فیبروز استروما) داشته است (25).

         با توجه به اینکه تاکنون اثر گالیک اسید بر دستگاه تولید مثلی موش آزمایشگاهی دیابتی القاء شده با متیل‌گلای‌اکسال مورد بررسی قرار نگرفته است و نتیجه مطالعات مرتبط با اثرات گالیک اسید بر عوارض تولید مثلی در دیابت متناقض می باشد، هدف این مطالعه بررسی اثرات اسید گالیک بر تغییرات بافتی بیضه و مقدار هورمونهای جنسی مانند تستوسترون و LH و FSH در موش کوچک آزمایشگاهی دیابتیک می باشد.

1. گالیک اسید باعث افزایش تعداد اسپرم در موش های نر دیابتی القا شده با متیل گلی‌اکسال می‌شود.
2. گالیک اسید باعث افزایش تستوسترون پلاسما در موش های نر دیابتی القا شده با متیل گلی‌اکسال می‌شود.
3. گالیک اسید باعث افزایش مقادیر FSH  و LH در موش های نر دیابتی القا شده با متیل گلی‌اکسال می‌شود.
4. گالیک اسید باعث بهبود تغییرات بافت شناسی، اندازه، قطر و حجم بیضه در موش های نر دیابتی القا شده با متیل گلی‌اکسال میشود.
5. گالیک اسید باعث بهبود مقادیر پلاسمایی انسولین و میزان قند خون در موش های نر دیابتی القاشده با متیل گلای اکسال میشود.
6. گالیک اسید باعث بهبود میزان MDA و آنزیم SOD پلاسما در موش های نر دیابتی القا شده با متیل گلی اکسال میشود.

بررسی اثرات گالیک‌اسید بر اختلال عملکرد دستگاه تولید مثلی نر در موش سوری دیابتی القاء شده با متیل گلی اکسال

الف) تعیین و مقایسه میانگین تعداد اسپرم در گروههای مختلف مورد مطالعه

ب) تعیین و مقایسه سطح پلاسمایی تستوسترون در گروههای مختلف مورد مطالعه

ج) تعیین و مقایسه سطح پلاسمایی هورمونهای LH و FSH در گروههای مختلف مورد مطالعه

د) تعیین و مقایسه تغییرات اندازه و قطر مجاری سمینفر و حجم بیضه در گروههای مختلف مورد مطالعه

ه) تعیین و مقایسه میانگین سطح پلاسمایی انسولین در گروههای مختلف مورد مطالعه

و) تعیین و مقایسه میانگین سطح پلاسمایی گلوکز ناشتا در گروههای مختلف مورد مطالعه

ز) تعیین و مقایسه میانگین MDA  در بافت بیضه در گروههای مختلف مورد مطالعه

ح) تعیین و مقایسه میانگین SOD  در بافت بیضه در گروههای مختلف مورد مطالعه

دانشگاهها و سایر مراکز تحقیقاتی

دیابت: در این مطالعه تشخیص دیابت بر مبنای قند خون غیرناشتای بالاتر از 250 میلی گرم در دسی لیتر خواهد بود.

تجربی Experimental

موشهای سوری بالغ جنس نر با محدوده وزنی 20 تا 25 گرم

بر اساس مطالعات مشابه(1)، تعداد ده سر موش سوری در هر گروه و در مجموع پنجاه سر موش سوری خواهیم داشت.

موشها بر اساس معیارهای ورود به مطالعه انتخاب و سپس بطور تصادفی در گروههای مختلف قرار خواهند گرفت.

برای شمارش اسپرم از لام هموسیتومتر استفاده خواهد شد(1). مقدار هورمونها، انسولین، قند خون و شاخصهای استرس اکسیداتیو به کمک کیتهای اختصاصی اندازه گیری خواهد شد و تغییرات اندازه و قطر لوله های سمینیفر و ارتفاع اپیتلیوم مجاری پس از رنگ آمیزی هاماتوکسیلین/ائوزین، با مشاهده میکروسکوپی و به کمک نرم افزار آنالیز تصویر (Motic Image plus 2 software) بررسی خواهد شد(1).

 این مطالعه بر روی 50 سر موش کوچک سفید آزمایشگاهی با محدوده وزنی 20 تا 25 گرم انجام می­شود که بمنظور سازگاری، یک هفته پیش از شروع مطالعه به اتاق حیوانات انتقال داده شده و در شرایط کنترل شده (دوره تاریکی/روشنایی 12 ساعته، دمای 3 ± 22 و رطوبت 35 درصد) نگهداری نموده و دسترسی آزاد به آب و غذا خواهند داشت. سپس موش‌ها بطور تصادفی به چهار گروه به شرح ذیل تقسیم خواهند شد.

1. شم کنترل: دریافت کننده نرمال سالین بصورت گاواژ
2. دریافت‌کننده گالیک اسید  با دوز موثر (50 میلی گرم بازای کیلوگرم) بصورت گاواژ بمدت 28 روز
3. دریافت‌کننده  MGOبا دوز (600 میلی گرم بازای کیلوگرم) بصورت گاواژ بمدت  28روز (26)
4. دریافت‌کننده MGO (600 میلی گرم بازای کیلوگرم) +گالیک اسید (50 میلی گرم بازای کیلوگرم) بمدت 28 روز (27)
5. دریافت‌کننده MGO (600 میلی گرم بازای کیلوگرم) + متفورمین (200 میلی گرم بازای کیلوگرم) بمدت 28 روز (28)

      برای القای دیابت، حیوانات تمام گروهها بجز گروه شم کنترل، متیل گلای اکسال را با دوز 600 میلی گرم بازای کیلوگرم برای مدت 28 روز دریافت خواهند کرد (26) . پس از مشاهده علائم دیابت (پرنوشی، پرادراری و پرخوری)، قند خون اندازه گیری شده و قند غیرناشتای بالای 250 میلی گرم در دسی لیتر بعنوان بروز دیابت در نظر گرفته خواهد شد (29). میزان مصرف آب و غذای حیوانات نیز بصورت هفتگی اندازه گیری خواهد شد. پس از القای دیابت، درمان با گالیک اسید (50 میلی گرم بازای کیلوگرم بمدت 28 روز) و یا متفورمین (200 میلی گرم بازای کیلوگرم) بمدت 28 روز انجام خواهد شد. بیست و چهار ساعت بعد از دریافت آخرین دوز گالیک اسید و یا متفورمین، حیوانات با کتامین-زایلازین بیهوش شده، ابتدا خونگیری از قلب انجام شده و سپس با ایجاد برش در ناحیه بیضه بافت اپیدیدیم را جدا نموده و برای شمارش اسپرم مورد استفاده قرار می گیرد. پس از سانتریفیوژ کردن خون، نمونه پلاسما برای انجام آزمایشات بعدی (اندازه گیری تستوسترون، LH، FSH، انسولین و قند) و شاخصهای استرس اکسیداتیو (در بافت بیضه) در فریزر منفی هفتاد درجه نگهداری خواهند شد. سپس بافت بیضه جدا شده و در فیکساتیو فرمالین 10% نگهداری و پس از پردازش بافتی مقاطع 5 تا 7 میکرونی تهیه و با هماتوکسیلین/ائوزین رنگ آمیزی شده و قطر لوله های سمینیفر و قطر مجرا و ارتفاع اپیتلیوم سمینیفر به کمک نرم افزار مخصوص (Motic image plus 2 image software analysis) اندازه گیری خواهد شد(1). از بیضه هر حیوان حداقل 6 اسلاید تهیه و توسط میکروسکوپ نوری بررسی خواهند شد.

       آنالیز داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 17 انجام خواهد شد. در صورت نرمال بودن متغیرهای کمی در گروه‌های مورد بررسی از آزمون آنالیز واریانس یکطرفه به همراه آزمون تعقیبی مناسب (تست توکی) استفاده خواهد شد. در صورت نرمال نبودن متغیرهای وابسته از معادل نا‌پارامتری این آزمون‌ها استفاده می‌شود. نتایج بصورت  Mean ± SEM ارائه شده و مقدار P کمتر از 05/0معنی‌دار تلقی می شود. برای مقایسه تغییرات بافتی بیضه در گروههای مختلف از آزمون مجذور کای استفاده خواهد شد.

       انجام کار به تایید کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی زاهدان خواهد رسید. محققین خود را در طول مطالعه ملزم به رعایت اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی بر اساس استانداردهای وزارت بهداشت درمان و آموزش پزشکی میدانند و چک لیست کار با حیوانات آزمایشگاهی مصوب وزارت متبوعه تکمیل و پیوست می باشد. 

کدهای اخلاقی مورد توجه:

تهیه و حمل و نقل حیوانات: کد (بند) د

روشهای نگهداری حیوانات: کد (بند) الف و ب

نیروهای اجرائی: کد (بند) الف، ب و د

محققین و پژوهشگران: کد (بند) الف، ب و ج

محدودیتهای مالی و تهیه کیتهای مورد استفاده، امید است با تدابیر اندیشیده شده، مشکل خاصی پیش نیاید.

گالیک اسید، دیابت، اختلال عملکرد تولید مثلی، موش سوری

1.            Ahangarpour A, Oroojan AA, Khorsandi L, Arzani G, Afshari G. Effects of Betulinic Acid on the Male Reproductive System of a Streptozotocin-Nicotinamide-Induced Diabetic Mouse Model. The world journal of men's health. 2016;34(3):209-16.

2.            Hasanpour M, Ashrafi M, Erjaee H, Nazifi S. The effect of saffron aqueous extract on oxidative stress parameters and important biochemical enzymes in the testis of streptozotocin-induced diabetic rats. Physiology and Pharmacology. 2018;22(1):28-37.

3.            Ballester J, Munoz MC, Dominguez J, Rigau T, Guinovart JJ, Rodriguez-Gil JE. Insulin-dependent diabetes affects testicular function by FSH- and LH-linked mechanisms. Journal of andrology. 2004;25(5):706-19.

4.            Amaral S, Oliveira PJ, Ramalho-Santos J. Diabetes and the impairment of reproductive function: possible role of mitochondria and reactive oxygen species. Current diabetes reviews. 2008;4(1):46-54.

5.            Bahojb Soldozi H, Jalili F, Sohrabi M, Keshtmand Z, Jalili C. The effects of crocin on the serum levels of sex hormone and NO in streptozotocin–induced diabetic rats. Scientific Journal of Kurdistan University of Medical Sciences. 2018;23(2):103-13.

6.            La Vignera S, Condorelli R, Vicari E, D'Agata R, Calogero AE. Diabetes mellitus and sperm parameters. Journal of andrology. 2012;33(2):145-53.

7.            Maessen DE, Stehouwer CD, Schalkwijk CG. The role of methylglyoxal and the glyoxalase system in diabetes and other age-related diseases. Clinical science (London, England : 1979). 2015;128(12):839-61.

8.            Bourajjaj M, Stehouwer CD, van Hinsbergh VW, Schalkwijk CG. Role of methylglyoxal adducts in the development of vascular complications in diabetes mellitus. Biochemical Society transactions. 2003;31(Pt 6):1400-2.

9.            Nagaraj RH, Oya-Ito T, Bhat M, Liu B. Dicarbonyl stress and apoptosis of vascular cells: prevention by alphaB-crystallin. Annals of the New York Academy of Sciences. 2005;1043:158-65.

10.          Kalapos MP. The tandem of free radicals and methylglyoxal. Chemico-biological interactions. 2008;171(3):251-71.

11.          Thornalley PJ. The glyoxalase system in health and disease. Molecular aspects of medicine. 1993;14(4):287-371.

12.          Rabbani N, Thornalley PJ. The critical role of methylglyoxal and glyoxalase 1 in diabetic nephropathy. Diabetes. 2014;63(1):50-2.

13.          Karachalias N, Babaei-Jadidi R, Rabbani N, Thornalley PJ. Increased protein damage in renal glomeruli, retina, nerve, plasma and urine and its prevention by thiamine and benfotiamine therapy in a rat model of diabetes. Diabetologia. 2010;53(7):1506-16.

14.          Mirra P, Nigro C, Prevenzano I, Procopio T, Leone A, Raciti GA, et al. The role of miR-190a in methylglyoxal-induced insulin resistance in endothelial cells. Biochimica et biophysica acta Molecular basis of disease. 2017;1863(2):440-9.

15.          Huang Q, Chen Y, Gong N, Wang YX. Methylglyoxal mediates streptozotocin-induced diabetic neuropathic pain via activation of the peripheral TRPA1 and Nav1.8 channels. Metabolism: clinical and experimental. 2016;65(4):463-74.

16.          Wu L, Juurlink BH. Increased methylglyoxal and oxidative stress in hypertensive rat vascular smooth muscle cells. Hypertension (Dallas, Tex : 1979). 2002;39(3):809-14.

17.          Cardoso S, Carvalho C, Marinho R, Simoes A, Sena CM, Matafome P, et al. Effects of methylglyoxal and pyridoxamine in rat brain mitochondria bioenergetics and oxidative status. Journal of bioenergetics and biomembranes. 2014;46(5):347-55.

18.          Dhar A, Dhar I, Jiang B, Desai KM, Wu L. Chronic methylglyoxal infusion by minipump causes pancreatic beta-cell dysfunction and induces type 2 diabetes in Sprague-Dawley rats. Diabetes. 2011;60(3):899-908.

19.          Sakamoto H, Mashima T, Yamamoto K, Tsuruo T. Modulation of heat-shock protein 27 (Hsp27) anti-apoptotic activity by methylglyoxal modification. The Journal of biological chemistry. 2002;277(48):45770-5.

20.          Korani MS, Farbood Y, Sarkaki A, Fathi Moghaddam H, Taghi Mansouri M. Protective effects of gallic acid against chronic cerebral hypoperfusion-induced cognitive deficit and brain oxidative damage in rats. European journal of pharmacology. 2014;733:62-7.

21.          Liu KY, Hu S, Chan BC, Wat EC, Lau CB, Hon KL, et al. Anti-inflammatory and anti-allergic activities of Pentaherb formula, Moutan Cortex (Danpi) and gallic acid. Molecules (Basel, Switzerland). 2013;18(3):2483-500.

22.          Nabavi SM, Habtemariam S, Nabavi SF, Sureda A, Daglia M, Moghaddam AH, et al. Protective effect of gallic acid isolated from Peltiphyllum peltatum against sodium fluoride-induced oxidative stress in rat's kidney. Molecular and cellular biochemistry. 2013;372(1-2):233-9.

23.          Oyagbemi AA, Omobowale TO, Saba AB, Adedara IA, Olowu ER, Akinrinde AS, et al. Gallic acid protects against cyclophosphamide-induced toxicity in testis and epididymis of rats. Andrologia. 2016;48(4):393-401.

24.          Olusoji MJ, Oyeyemi OM, Asenuga ER, Omobowale TO, Ajayi OL, Oyagbemi AA. Protective effect of Gallic acid on doxorubicin-induced testicular and epididymal toxicity. Andrologia. 2017;49(4).

25.          Yigitturk G, Acara AC, Erbas O, Oltulu F, Yavasoglu NUK, Uysal A, et al. The antioxidant role of agomelatine and gallic acid on oxidative stress in STZ induced type I diabetic rat testes. Biomedicine & pharmacotherapy = Biomedecine & pharmacotherapie. 2017;87:240-6.

26.          Lee BH, Hsu WH, Chang YY, Kuo HF, Hsu YW, Pan TM. Ankaflavin: a natural novel PPARgamma agonist upregulates Nrf2 to attenuate methylglyoxal-induced diabetes in vivo. Free radical biology & medicine. 2012;53(11):2008-16.

27.          Patel SS, Goyal RK. Cardioprotective effects of gallic acid in diabetes-induced myocardial dysfunction in rats. Pharmacognosy research. 2011;3(4):239-45.

28.          Abdelsamia EM, Khaleel SA, Balah A, Abdel Baky NA. Curcumin augments the cardioprotective effect of metformin in an experimental model of type I diabetes mellitus; Impact of Nrf2/HO-1 and JAK/STAT pathways. Biomedicine & pharmacotherapy = Biomedecine & pharmacotherapie. 2019;109:2136-44.

29.          Komeili G, Hashemi M, Bameri-Niafar M. Evaluation of Antidiabetic and Antihyperlipidemic Effects of Peganum harmala Seeds in Diabetic Rats. Cholesterol. 2016;2016:7389864.

اطلاعات در هر حیوان در یک فرم اطلاعاتی ثبت خواهد شد.