ارزیابی بیوکمپاتیبیلیتی و پتانسیل تمایز ادنتو/استئوژنیک یک سیمان جدید کلسیم سیلیکات بر سلول های بنیادی پاپیلای آپیکال

طی 200 سال گذشته تغییرات زیادی در شیوه درمان اندودونتیکس صورت گرفته است. با افزایش تقاضای بیماران برای حفظ دندان­ها و پیشرفت علم مواد و نوآوری در تجهیزات، پروتکل­های استاندارد درمانی دچار تغییراتی شده اند. از مهم ترین تغییرات صورت گرفته در این زمینه می توان به معرفی سیمان­های مبتنی بر سیلیکات کلسیم از جمله MTA  اشاره نمود(1). نتایج بسیار امیدوار کننده­ی حاصل از MTA و توانایی آن در سیل کردن، سازگاری زیستی و کاربردهای بالینی آن در پوشش پالپ دندان­های شیری و دائمی(2)، رتروفیل در جراحی اپیکال  و سیل ناحیه پرفوره موجب گردید تا به شدت مورد توجه قرار گرفته و گسترش یابد(3, 4). علیرغم داشتن کارایی بالینی فوق العاده، MTA از معایبی همچون Setting time بالا(5)، manipulation سخت(6)، تغییر رنگ(7)، وجود عناصر سمی(8) و مقاومت بسیار کم در مقابل شسته شدن در ساعات اولیه برخوردار است. از این رو تحقیقات جدید  به سمت موادی با خواص کلینیکی مشابه، قیمت ارزان‌تر و مشکلات کمتر از MTA پیش ببرند و در این راه موفقیت­های چشمگیری نیز حاصل شد. (6).

Biodentin جدیدترین سیمان بر پایه سلیکات کلسیم است که در سال های اخیر وارد بازار شده و توانسته تحولی عظیم در صنعت دندانپزشکی ایجاد نماید. این ترکیب با اصلاح فرمولاسیون ساختاری MTA به دست آمده است. بنابراین  handlingو بسیاری از خواص فیزیکی آن بهبود یافته که از آن جمله می توان به دانسیته بیشتر و تخلخل کمتر(9)، مقاومت فشاری بیشتر(10)، استحکام خمشی(11)،microhardness  (12)، حلالیت کمتر(13)، عدم تغییر رنگ(14)، خواص ضدباکتری و ضد قارچ بالاتر(15)، زیست سازگاری بالا(16) و سمیت سلولی کمتر اشاره کرد. از این رو این ماده به صورت گسترده ای در اندودونتیکس مورد استفاده قرار می گیرد. این ماده به عنوان ترکیب جایگزین عاج دندان  می تواند بداخل توبول های عاجی نفوذ کرده و پس از کریستالیزاسیون  به عاج دندان چسبیده و خواص مکانیکی مناسبی را ایجاد می­کند(17).

Calcium Enriched Mixture(CEM)، سمان اندودونتیک جدیدی که توسط عسکری و همکارانش معرفی شده ، سمانی قلیایی که در ضمن و بعد از سخت شدن کلسیم هیدروکساید آزاد می نماید . بزرگترین جزء پودر آن ( 75/51 درصد ) کلسیم اکساید بوده و زمانی که با محلول خودش ترکیب می گردد ترکیب غنی از کلسیم و فسفات را تشکیل می دهد .

زمان سخت شده کمتر از یک ساعت  ، فلوی بیشتر و Film thickness کمتر در مقایسه باMTA  دارد .CEMیون کلسیم و فسفر آزاد نموده و تشکیل هیدروکسی آپاتایت می دهد . سیل بالایی داشته ،PHقلیایی بالا ، اثرات آنتی باکتریال ، سازگاری بافتی بالا ، سایتوتوکسیسیتی پایین ، اثرات ضد دردی و ضد التهابی و اثر تشکیل هیدروکسی آپاتایت، از مشخصه این سمان می باشد(18) . نشان داده شده است که در 1،4 و 8 هفته بعد از ایمپلنت CEM  و MTA در استخوان فمور RAT ، تعدادسلولهای آماسی کاهش یافته و تشکیل استخوان جدید نیز بطور فزاینده ای در هر دو ماده مشاهده شد (19).

نشان داده شده است که سازگاری سلولی بیودنتین در غلظتهای 1، یک دوم و یک چهارم بطور معنی داری کمتر از MTA و BA (Bioaggregate) که یک بیوسرامیک است می باشد . mRNA ژنهای استئوژنیک بطور معنی داری در گروه MTA و BA نسبت به گروه کنترل افزایش نشان داد ، در حالیکه mRNA ژنهای استئوژنیک بیودنتین نسبت به گروه کنترل افزایش نشان داد اما تفاوت معنی دار نبود (20).

نشان داده شده است ،وقتی سلولهای بنیادی مغز استخوان استخراج شده از استخوان کرانیو فاسیال در معرض 02/0 میلی گرم در میلی لیتر MTA قرارمی گیرند بطور منی داری فعالیت الکالین فسفاتازی این سلولها افزایش یافته و ندول مینرالیزه بیشتری نسبت به سلولهای درمان نشده ساخته اند. از طرفی ژن / پروتئین مارکرهای ادنتو/استئوبلاستیک سلولهای درمان شده با MTA بطور مشخصی افزایش یافته است و همچنین phosphorylated Jun N-Terminal Kinase (P - JNK) و Phosphorylated Extracellular Regulated   Protein Kinase (P-ERK)در سلولهای درمان شده باMTA با گذشت زمان بطور معنی داری افزایش می یابد ،در حالیکه مهار JNK و ERK  بطور معنی داری دیفرانسیاسیون ادنتو/استئوبلاستیک و میزان ALP را کاهش داد   (21).

از آنجاییکه بیودنتین در بازار ایران یافت نمی شود و جایگزین مناسب تری برای MTA می باشد . نسبت به سنتز و بهینه سازی آن اقدام گردیده است و لازم است اثرات بیولوژیک آن در شرایط آزمایشگاهی مورد ارزیابی قرار گیرد .

بنابراین، این مطالعه با هدف مقایسه میزان تکثیر،تمایز و پتانسیل ادنتو/ استئوژنز سلول های بنیادی پاپیلای اپیکال درمان شده با MTA angelos ، Calcium Enriched Mixture و یک سیمان کلسیم سیلیکات جدید می باشد .  فرضیه صفراین بود که تفاوت در تکثیر و تمایز ادنتو/استئوژنیک وجود ندارد.

1- اثر MTA بر فعالیت ادنتو/ استئوژنز سلولهای SCAPs   چگونه است؟.

2- اثر MTA بر پرولیفراسیون سلولهای  SCAPs  در زمان های مختلف چگونه است؟.

3- اثر CEM بر فعالیت ادنتو/ استئوژنز سلولهای SCAPs چگونه است؟.

4- اثر CEM بر پرولیفراسیون سلولهای SCAPs  در زمان های مختلف چگونه است؟.

 5- اثر cement new calcium silicate  بر فعالیت ادنتو/ استئوژنز سلولهای SCAPs چگونه است؟.

6- اثر new calcium silicate cement  بر پرولیفراسیون سلولهای SCAPs  در زمان های مختلف چگونه است؟.

7- بین اثر ادنتو/ استئوژنز و پرولیفراسیون سلولهای SCAPsمواد فوق تفاوتی وجود ندارد .

تعیین بیوکمپاتیبیلیتی و پتانسیل تمایز ادنتو/استئوژنیک یک سیمان  جدید کلسیم سیلیکات بر سلول های بنیادی پاپیلای آپیکال

-تعیین  اثر MTA بر فعالیت ادنتو/ استئوژنز سلولهای SCAPs   .

2-تعیین  اثر MTA بر پرولیفراسیون سلولهای SCAPs   در زمان های مختلف .

3-  تعیین اثر CEM بر فعالیت ادنتو/ استئوژنز سلولهای SCAPs .

4-تعیین  اثر CEM بر پرولیفراسیون سلولهای SCAPs در زمان های مختلف  .

 5 تعیین – اثرcement  new calcium silicate  بر فعالیت ادنتو/ استئوژنز سلولهای SCAPs .

6- تعیین  اثر cement new calcium silicate  بر پرولیفراسیون سلولهای  SCAPs  در زمان های مختلف .

      7- بین اثر ادنتو/ استئوژنز و پرولیفراسیون سلولهای SCAPsمواد فوق تفاوتی وجود ندارد .

دانشجویان و دندانپزشکان و مرکز تخصصی و تحقیقاتی دندانپزشکی

Biocompatibility,توانایی تحمل ماده توسط بدن

 root canal material:مواد مورد استفاده در درمان ریشه

,survival of  stem cell:توانایی زنده ماندن سلولهای بنیادی

تجربی آزمایشگاهی  

سلول های بنیادی استخراج شده ازدندان های مو لر سوم با ریشه نابالغ

20000 سلول به ازای هر well plate  جهت بررسی سایتوتوکسیسته و 200000 سلول جهت ارزیابی ادنتو /استئوژنیسیته

تصادفی آسان و در دسترس

فرم های ضمیمه

در این مطالعه 3 ماده MTA ، CEM Cement و new calcium silicate cement  استفاده خواهد شد . نمونه ها در دیسک هایی با ارتفاع 2 میلی متر و قطر 5 میلی متر تحت شرایط استریل و طبق دستور کارخانه سازنده مخلوط و بمدت 2 تا 3 ساعت جهت setting  اولیه در دمای اتاق قرار خواهند گرفت ، سپس جهت تکمیل setting در انکوباتور با رطوبت 95 درصد و  CO2  5 درصد بمدت 48 ساعت  انکوبه خواهند شد .

استریل سازی نمونه ها :

دیسک های  تفلونی توسط گاز اتیلن اکساید استریل و سپس درLow  glucose Dulbco modified ( L-G DMEM)  و سرم گاوی  10 درصد و پنی سیلین استرپتوماسین 1 درصد جهت بررسی هرگونه قارچ و باکتری بمدت 24 تا 48 ساعت قرار خواهند گرفت .

استخراج سلول های SCAP :

سلول های SCAP از دندان عقل با آپکس نابالغ استخراج خواهند شد . دندان ها بلافاصله بعد از کشیده شدن در محلول PBS شست شو و در همین محلول نگهداری خواهند شد . سپس سلول ها با استفاده از هضم آنزیمی از اپیکال پاپیلا جدا خواهند شد و در سوسپانسیون پلی – لیزین D قرار می گیرند . بعد از مشاهده سلول های SCAP ، سلول ها در محیط کشت حاوی تریپسین ، 5 تا 8 بار برای بدست آوردن سلول بیشتر کشت داده می شوند . در نهایت سلول های SCAP توسط سیتومتری و Tri Linage با توجه به پروتوکل لابراتواری شناسایی خواهند شد .

Cell Seeding  :

سلول های SCAP با استفاده از تریپسین و EDTA  تریپسینه شده و سپس بوسیله PBS شست شو می شوند . سلول ها در غلظت 320 میلی لیتر و با سرعت rpm   1200 بمدت 5 دقیقه ساتریفوژ خواهند شد . بخش سطحی لوله های ساتریفوز شده تخلیه و سلول های باقیمانده بر روی دیسک های سمانی قرار خواهند گرفت . ابتدا دیسک های سمانی در انتهای هر یک از well plate ها قرار داده خواهند شد و یک میلی لیتر از LG-DMEM روی آن اضافه خواهد شد و سپس سلول ها با غلظت  20000 ( cell /cement disk 20000 (  بر روی آنها قرار خواهند گرفت . ارزیابی سایتوتوکسیستی به روش MTT  با اضافه کردن 20 میکرولیتر به هر well و بعد از 3 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی گراد ..........................در روز های 1 ، 3 و 7 با شمارش سلول های زنده انجام خواهد شد . جهت اطمینان از نتایج حاصله هر مرحله 3 با تکرار خواهد شد .

ارزیابی استئو/ادنتوژنزیس :

سمان ها در انتهای هر well قرار داده شده و سلول های SCAP با غلظت 200000 سلول به ازای هر سمان در هر well  قرار داده خواهد شد . مدیوم استئو/ادنتوژنزیس که شامل LG- DMEM و 10 درصد سرم گاوی ، 0.1 درصد دگزامتازون و 10 میلی مول بتا گلیسیرول فسفات و 50 میکرولیتر در میلی لیتر آسکوربیک اسید به هر well اضافه خواهد شد . میدیوم هر سه روز یکبار برای مدت 21 روز تعویض می گردد .

در پایان 21 روز فعالیت  ادنتو/ استئوژنز  با ارزیابی مارکر های مربوطه انجام  خواهد شد .

تحلیل آماری داده ها با آزمون آنالیز واریانس یک طرفه و به دنبال آن آزمون Tukey جهت بررسی  و معنی داری در سطح P≤0.05 در نظر گرفته می شود.

میزان سلول های زنده باقیمانده به تفکیک گروه و زمان

کدهای 1،5،9،10،11،12،13،14،15 از دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش با سلول های بنیادی در جمهوری اسلامی ایران

و کد های 1،2،3،4،6،7،8،9،10،11،12،از کدهای راهنمای عمومی دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی ایران

و کدهای 1،2،3،4،5،7،8،9،،10،11،11،12،13،14،15،16،17،18،19،20،21،22،23،24،25،26،27،28،29،30،31 از دفترچه ی راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی دارای ازمودنی انسانی در جمهوری اسلامی ایران رعایت میگردد

هزینه بالای تامین مواد و تست های آزمایشگاهی

که با تامین بخشی از هزینه ای مربوطه توسط معاونت تحقیقات فناوری دانشگاه مشکلات کمتر خواهد شد .

Biocompatibility, root canal material,survival of  stem cell

بقای  سلول های بنیادی ،،مواد مختلف اندودنتیک- بیوکامپتیبیلیتی

• 1             Parirokh M, Torabinejad M. Mineral trioxide aggregate: a comprehensive literature review—part III: clinical applications, drawbacks, and mechanism of action. Journal of endodontics. 2010;36(3):400-13.
• .2            FORD TRP, Torabinejad M, ABEDI HR, BAKLAND LK, KARIYAWASAM SP. Using mineral trioxide aggregate as a pulp-capping material. The Journal of the American Dental Association. 1996;127(10):1491-4.
• .3            Arens DE, Torabinejad M. Repair of furcal perforations with mineral trioxide aggregate: two case reports. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology. 1996;82(1):84-8.
• .4            Torabinejad M, Chivian N. Clinical applications of mineral trioxide aggregate. Journal of endodontics. 1999;25(3):197-205.
• .5            Chng HK, Islam I, Yap AUJ, Tong YW, Koh ET. Properties of a new root-end filling material. Journal of Endodontics. 2005;31(9):665-8.
• .6            Kaur M, Singh H, Dhillon JS, Batra M, Saini M. MTA versus biodentine: Review of literature with a comparative analysis. Journal of clinical and diagnostic research: JCDR. 2017;11(8):ZG01.

• 7             Accorinte M, Loguercio AD, Reis A, Carneiro E, Grande R, Murata S, et al. Response of human dental pulp capped with MTA and calcium hydroxide powder. Operative dentistry. 2008;33(5):488-95.
• .8            Asgary S, Parirokh M, Eghbal MJ, Stowe S, Brink F. A qualitative X-ray analysis of white and grey mineral trioxide aggregate using compositional imaging. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 2006;17(2):187-91.
• .9            De Souza ETG, Nunes Tameirão MD, Roter JM, De Assis JT, De Almeida Neves A, De‐Deus GA. Tridimensional quantitative porosity characterization of three set calcium silicate‐based repair cements for endodontic use. Microsc Res Tech. 2013;76(10):1093-8.
• .10         Sarkar N, Caicedo R, Ritwik P, Moiseyeva R, Kawashima I. Physicochemical basis of the biologic properties of mineral trioxide aggregate. Journal of Endodontics. 2005;31(2):97-100.
• .11         Walker MP, Diliberto A, Lee C. Effect of setting conditions on mineral trioxide aggregate flexural strength. Journal of endodontics. 2006;32(4):334-6.
• .12         Goldberg M, Pradelle-Plasse N, Tran X, Colon P, Laurent P, Aubut V. Emerging trends in (bio) material researches. Biocompatibility or cytotoxic effects of dental composites Oxford, UK: Coxmoor Publishing. 2009:181-203.
• .13         Grech L, Mallia B, Camilleri J. Investigation of the physical properties of tricalcium silicate cement-based root-end filling materials. Dental Materials. 2013;29(2):e20-e8.
• .14         Vallés M, Mercadé M, Duran-Sindreu F, Bourdelande JL, Roig M. Influence of light and oxygen on the color stability of five calcium silicate–based materials. Journal of endodontics. 2013;39(4):525-8.
• .15         Bhavana V, Chaitanya KP, Gandi P, Patil J, Dola B, Reddy RB. Evaluation of antibacterial and antifungal activity of new calcium-based cement (Biodentine) compared to MTA and glass ionomer cement. Journal of conservative dentistry: JCD. 2015;18(1):44.
• .16         Nuñez CMC, Bosomworth HJ, Field C, Whitworth JM, Valentine RA. Biodentine and mineral trioxide aggregate induce similar cellular responses in a fibroblast cell line. Journal of endodontics. 2014;40(3):406-11.
• 17           File BS. Active biosilicate technology, septodont. Saint-Maur-des-Fossés Cedex: R&D Department. 2010.
• 18           Asgary S, Shahabi S, Jafarzadeh T, Amini S, Kheirieh S. The properties of a new endodontic material. Journal of endodontics. 2008;34(8):990-3.
• 19           Rahimi S, Mokhtari H, Shahi S, Kazemi A, Asgary S, Eghbal MJ, et al. Osseous reaction to implantation of two endodontic cements: Mineral trioxide aggregate (MTA) and calcium enriched mixture (CEM). Medicina oral, patologia oral y cirugia bucal. 2012;17(5):e907.
• 20       Lee B-N, Lee K-N, Koh J-T, Min K-S, Chang H-S, Hwang I-N, et al. Effects of 3 Endodontic Bioactive Cements on Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem Cells. Journal of Endodontics. 2014.
• 21       Wang Y, Yan M, Fan Z, Ma L, Yu Y, Yu J. Mineral trioxide aggregate enhances the odonto/osteogenic capacity of stem cells from inflammatory dental pulps via NF‐κB pathway. Oral diseases. 2013.

فرم  ثبت اطلاعات پرولیفراسیون سلولی

ماده ای با حداقل اثر سیتوتوکسیک بر روی سلولهای بنیادی اپیکال پاپیلا معرفی شود.

ندارد

آگاهی هرچه بیشتر نسبت به اثرات سیتوتوکیسک متریال های اندودنتیکس

ندارد

ندارد

ندارد

ندارد

نتایج محرمانه وفقط برای مقاصد پژوهش خواهد بود.

دانشکده دندانپزشکی.بخش اندودنتیکس دکتر آرزو پیرحاجی  09378466611

شرکت شما در مطالعه کاملا اختیاری است و آزاد خواهید بود که از شرکت در مطالعه امتناع نموده یا هر زمان  که مایل بودید بدون آنکه تغییری در نحوه رفتار پزشک درمانگر یا نحوه درمان و مراقبت از بیماری شما ایجاد شود از پژوهش مذکور خارج شوید.

با توجه به اطلاعات موجود در این فرم و توضیحات حضوری مجری یا همکاران طرح موافقت خود را با شرکت در این مطالعه اعلان می نمایم. یک نسخه از این فرم به من داده شده و فرصت خواندن آن را داشته ام.