ارزیابی سمیت سلولی ، خاصیت آنتی اکسیدانی و مطالعات داکینگ ملکولی مشتقات جدید 8-آلکیل مرکاپتوکافئین به عنوان عوامل ضد سرطان در لاین¬های سلولی C152، HUVEC، MCF-7 و A549

سرطان یک بیماری پیچیده ژنتیکی است که ۲۷۷ نوع بیماری را شامل می‌شود. سرطان یک مشکل عمده بهداشت عمومی در جهان است و از هر ۴ مورد مرگ ۱مورد مربوط به سرطان است(1). در حال حاضردر برخی از کشورها به عنوان دومین علت مرگ و میر و در ایران بعد از بیماری های قلبی عروقی و سوانح و حوادث به عنوان سومین عامل مرگ و میر محسوب می شود. سرطان در نتیجه تقسیم غیر قابل کنترل سلول ها‍، فرار آنها از سیستم ایمنی، تهاجم به بافت ها و انتشار سلول ها از جایگاه اولیه به سایر نقاط بدن به وجود می آید که محصول عوامل محیطی و اختلالات ژنتیکی است(2). سرطان زمانی آغاز می شود که سلول ها در ژن‌های کنترل کننده رشد دچار جهش شوند. سه دسته از ژن‌های کلیدی که در هدایت سلول‌های سرطانی نقش دارند شامل انکوژن ها؛که ازدیاد فعالیت آن ها باعث رشد غیر قابل کنترل سلول‌ها می‌شود(3). ژن های مهار کننده توموری؛که فقدانشان باعث تقسیم غیر قابل کنترل سلول های سرطانی می شود(4). ژن های ترمیم کننده که نقش اصلی در ترمیم ژن های صدمه دیده را دارند و موتاسیون در این ژن ها مانع از آن می شود که نقایص ژن‌ها بازسازی شود(5). سرطان پستان (breast cancer) یک بیماری پیچیده و ناهمگن است که با تغییرات ژنتیکی و ویژگی های متمایز مورفولوژیک و مولکولی مشخص می شود (6). سرطان پستان بیماری است که در آن سلولهای بدخیم از بافت پستان منشا گرفته و به طور نامنظم و فزاینده ای تکثیر می‌یابند و بدون اینکه موجب عکس‌العمل تدافعی و تهاجمی سیستم ایمنی بدن شوند از آن عبور می کنند (7).در حال حاضر سرطان پستان یکی از شایع ترین انواع سرطان در زنان سرتاسر جهان بویژه در میان زنان ایرانی محسوب می شود و سالانه ۷۰۰۰ هزار زن به این نوع سرطان مبتلا می شوند .بر طبق گزارش وب سایت بین المللی تحقیقات جهانی سرطان حدود ۳۲ درصداز کل سرطان ها در زنان و ۱۹ درصد از مرگ و میرهای ناشی از سرطان در زنان مربوط به سرطان سینه می‌باشد. پیش‌بینی شده است که بروز سرطان پستان بیشتر به خاطر عوامل محیطی و رفتاری که به شدت بر روی فاکتورهای اصلی ایجاد کننده سرطان اثر می گذارند ایجاد می شود. سرطان دهان (Oral cancer) به عنوان شایع ترین نوع سرطان سر و گردن، یک مشکل جدی و مرتبط با سلامت عمومی جهانی است .علیرغم پیشرفت در تحقیقات و درمان، بقا در سال های اخیر بهبود قابل توجهی نداشته است (8). تقریباٌ 50 درصد از بیماران، همچنان در اثر این بیماری جان می دهند. علاوه براین شواهد واضحی وجود دارد که بروز سرطان های دهان و اوروفارنکس رو به افزایش اند(9). در سرتاسر جهان سرطان های دهان ( شامل لب ها، ‌زبان، لثه،‌کف دهان و غدد بزاقی ) و حنجره از نظر شیوع رتبه ششم را دارا می­باشند. عواملی چون مصرف الکل، تنباکو، رژیم غذایی، ویروس­ها، اشعه، استعداد خانوادگی و ژنتیک و غیره بر گسترش کارسینوم سلول سنگفرشی دهان اثر می گذارند. سرطان دهان در اکثر نژادها، در مردان 2 تا 3 برابر بیشتر از زنان است. این نوع کارسینوم، رایج ترین نوع سرطان دهان است. جراحی، شیمی درمانی، رادیوتراپی، هورمون تراپی و ایمونوتراپی از جمله روش های درمانی سرطان هستند اما به علت عوارض جانبی این روش ها، امروزه داروسازان از ترکیباتی با منشأ طبیعی که دسترسی بهتر و عوارض جانبی کمتر و قیمت ارزان داشته برای سنتز داروهای جدید و درمان بیماری ها بهره می برند (10). از بین سایر توموهای جامد، سرطان ریه  (Lung cancer) نوعی بیماری است که مشخصه آن رشد کنترل نشده سلول در بافتهای ریه است. اگر این بیماری درمان نشود، رشد سلولی میتواند در یک فرایند به نام متاستاز به بیرون از ریه گسترش پیدا کند و به بافت­های اطراف یا سایر اعضای بدن برسد (11). عامل عمده ابتال به سرطان ریه مجاورت طولانی مدت با مواد سرطانزا و کارسینوژن موجود در دود تنباکو می باشد، %45 از موارد سرطان ریه مربوط به افراد غیر سیگاری و افرادی که در ارتباط با فاکتورهای مضر ژنتیکی مثل گاز رادون، آزبستوز ، آلودگی هوا و یا سیگاری­های ثانویه استنشاق دود سیگار دیگران می باشد. به طورکلی سرطان­های ریه از نظر آسیب شناختی و بر اساس سلولها و رفتارهای این سرطان­ها نسبت به درمان و پیش­آگاهی بیماران به دو دسته بزرگ سرطان ریه با سلول کوچک (SCLC) و  سرطان ریه با سلول غیرکوچک (NSCLC) تقسیم می شوند (12, 13). شواهد بیانگر آن است که سلول­های بنیادی اپی­تلیوم ریه چند پتانسیلی بوده و توانایی تمایز به فنوتیپ­های مختلفی را دارند. درصورتی که یک سلول نتواند بر اساس فرایندهای طبیعی و نرمال خود را ترمیم کند، مسیرهای سیگنالینگ آپوپتوز فعال می شود تا سلول دارای اختلال را از بین ببرد و مانع از گسترش آن شود. با توجه به اینکه سلول­های سرطانی مدام در حال تکثیرهستند می توان گفت که میزان زیادی از این سلول­ها در فاز S و مشغول سنتز DNA می­باشند. اما وقتی به ماهیت سلول­های طبیعی توجه شود انتظار می­رود که درصد بسیار بالایی از این سلول­ها در فازهای G0/G1 باشند زیرا یا نیازی به تکثیر دائم یعنی سنتز DNA آن ها نیست یا اینکه به طور موقت یا دائم وارد فاز G0 شده و از سنتز DNA صرف نظر کرده­اند. به هر حال درصد سلول­ها در هر مرحله­ای از چرخه سلولی به کمک  دستگاه فلوسیتومتری قابل تشخیص است (14, 15). از میان داروهای شیمی درمانی فعلی، سیس­پلاتین (cisplatin)[PtCl2(NH3)2]  یک داروی ضدسرطانی است که به طور گسترده برای درمان سرطان­های مختلف از جمله سرطان سینه و تخمدان استفاده می­شود (16). در سال ۱۹۶۹ با آزمایش بر روی مدل حیوانی پی بردند که دارای خاصیت ضد تومور می­باشد. داروی ضد سرطان سیس پلاتین علاوه بر از بین بردن سلول­های سرطانی، در بافت­های سالم نیز اثرات تخریبی اعمال می­کند. (17, 18). مکانیسم عمل سیس­پلاتین به نحوی­ است که این دارو یک ترکیب آلکیله کننده و ضدتومور بوده که از طریق ایجاد پیوندهای جانبی با DNA باعث تداخل در عملکرد آن و RNA می­شود. این دارو بر چرخه سلولی اثر کرده ولی  در مرحله  Sاز سیکل سلولی مؤثرتر است و لذا یک داروی سایتوتوکسیک بوده که باعث عدم رشد یا مرگ سلول می شود (19). القاء مرگ سلولی، یکی از مکانیسم اصلی عملکرد داروی سیس پلاتین است و در طی سالهای اخیر همواره به عنوان داروی اصلی جهت کموتراپی مبتلایان به سرطان تخمدان مورد استفاده بوده است. اخیراً مقاومت نسبت بـه سـیس­پلاتـین در برخــی تومورهــا افــزایش پیــدا کــرده اســت کــه مکانیــسم­هــای مختلفــی در ایجاد مقاومت نقش دارند و یکی از مهمتـرین آنهـا افـزایش بیـان پـروتئین ضـد آپوپتوتیـک  Bcl-2 درسـلول هـای تومـوری است (20). همچنین افزایش بیان ژن های MDR1 (P-glycoprotein)، MRP1[1]،[2]BCRP،Topo 2[3] و y-GCS[4]نیز در تومورهای مقاوم به سیس­پلاتین گزارش شده است(21, 22). فاکتور ها و مکانیسم های مختلفی در ایجاد مقاومت به سیس­پلاتین شناسایی شده­اند که از جمله ی آنها می توان به افزایش خروج دارو از سلول، تسهیل و افزایش تعمیر DNA، تغییر در مکانیسم­های آپوپتوز سلولی و غیر قابل دسترس بودن سلول هدف اشاره کرد.

آنزیم‌های فسفودی‌استراز نوکلئوتیدهای حلقوی (PDEs) با کاتالیز کردن هیدرولیز cAMP وcGMP، غلظت درون سلولی و در نتیجه اعمال فیزیولوژیکی آن ها را تنظیم می‌کنند و تا کنون 11 خانواده (PDE1-PDE11) و 53 ایزوآنزیم از آنها شناخته شده است. آنزیم‌های PDE از لحاظ ساختار، خواص کینتیکی، مکانیسم‌های تنظیمی، حساسیت به مهار کننده ها و پاسخ به عامل‌های خاص و نیز میل ترکیبی به سوبسترا (cAMP وcGMP) با یکدیگر متفاوت هستند. فعالیت فسفودی استرازها برای سیگنالینگ سلولی بااهمیت است زیرا متابولیسم نوکلئوتیدهای حلقوی موجب تنظیم غلظت درون سلولی آنها گردیده و درنتیجه بروی پاسخ های سلولی آنها اثرگذار می باشد (23, 24).  سه نوع از فسفودی استراز وجود دارد : خانواده های 1، 2، 3 و 10 ، که همcGMP و cAMP را هیدرولیز می‌کنند، خانواده های 4 ،7 و 8 ، cAMP را هیدرولیز می نمایند و خانواده های 5، 6 و9 که به طور اختصاصی موجب هیدرولیز cGMP می شوند. فسفودی استرازها در تنظیم عملکرد قلب، سنتز استروئیدهای غده آدرنال و در پدیده انتقال نور نقش دارند. فسفودی استراز 5، cGMP را هیدرولیز می کند. cGMP درشل شدن عضلات معده و مهار تجمع پلاکت‌ها وبینایی نقش دارد این آنزیم معمولا در سیتوپلاسم و در عضلات معده، پلاکتها و کلیه قرار دارد. شواهد نشان داده cGMP نقش مهمی در تکثیر سلولی تمایز وآپوپتوز دارد(25). به تازگی گزارش شده است که فعالیت PDE ها در تومورها و همچنین بیانشان در سرطان ها افزایش می یابد. مهارکننده های PDE جهت درمان شرایط غیربدخیمی از قبیل بیماری های التهابی استفاده می شود و همچنین جهت درمان انواع مختلفی از سرطان از قبیل لوکمی پرومایلوسیتیک حاد پیشنهاد می شود (26). درون سلول،  cGMPتوسط گوانیلات سیکلاز سنتز می­شود و پروتئین کیناز G را فعال می‌کند و توسط فسفودی استراز هیدرولیز می‌شود (27, 28). افزایش بیان فسفودی‌استراز 5 و کاهش cGMP که همراه با پروتئین کیناز G است درسرطان­های مختلف مثل سرطان پستان، سرطان کولون و سرطان سلول‌های سنگفرشی دهان مشاهده می‌شود(28). درنتیجه پیشنهاد شده که فسفودی استراز 5  در ایجاد سرطان نقش دارد و مهار فعالیت آن ممکن است نقش ضد سرطانی داشته باشد. اخیرا اثرات مهار فسفو دی استراز 5 در توسعه سرطان پوست نشان داده شده و پیشنهاد شده که مهار فسفودی‌استراز 5 می تواند به کاهش خطر توسعه سرطان کولون و لنفوسیت منجر شود. مطالعات نشان داده که بیان فسفودی استراز 5 در سلول های سرطان پستان نسبت به سلول های سالم و تومور های خوش خیم به مقدار قابل توجهی بالا است و ارتباط مثبتی بین افزایش استراز 5  و درجه تومور و درگیری غدد لنفاوی وجود دارد (29). بدون شک متیل گزانتین‌ها (methyl xanthines) یکی از جالب ترین ترکیباتی هستند که مردم سرتاسر جهان در طی زندگی روزانه با آن سروکار دارند (30). مشتقات متیل گزانتین شامل تئوفیلین، تئوبرومین و کافئین می باشد که به ترتیب در چای،کاکائو و قهوه یافت می شوند و ویژگی‌های فارماکولوژیک مشابهی دارند، ولی شدت اثر در فرآورده‌های مختلف، متفاوت است. به‌عنوان مثال اثرات محرک کافئین و تئوفیلین بر روی CNS و عضله اسکلتی نسبت به تئوبرومین بسیار بیشتر است (31) .متیل گزانتین ها و مشتقاتشان به خاطر خواص شگفت انگیز شیمی درمانی که دارند در سال های اخیر مورد توجه بسیار قرار گرفته اند. اثر درمانی مهم متیل گزانتین‌ها شامل گشاد نمودن برونش­ها، درمان آسم، ضد صرفه ، ضد میگرن، محرک CNS، اثرات قبلی و عروقی، ضد میگرن و غیره می­باشد (32). گزانتین ها همچنین آنتاگونیست های گیرنده آدنوزین هستند. علاوه بر آن یکی از مهمترین فعالیتهای دارویی متیل گزانتین ها مهار فعالیت آنزیم های فسفودی استراز­ها می باشد(33). کافئین یک آلکالوئید شناخته شده از خانواده متیل گزانتین‌ و محرک سیستم عصبی مرکزی است که خواص آن به تئوفیلین و تئوبرومین هم شبیه ‌است. کافئین خالص، به صورت پودر سفید رنگ تلخی می‌باشد. افزایش متابولیسم بدن، تحریک سیستم اعصاب مرکزی و افزایش میزان هوشیاری و آگاهی محیطی از مهم‌ترین آثار کافئین است. کافئین خالص پودر نرم، بی‌بو، سفید و براقی می‌باشد(34). آنزیم فسفودی استراز ،آدنوزین منو فسفات حلقوی را به شکل غیر حلقوی تبدیل می‌کند و سبب کاهش غلظت (CAMP) می‌شود (35). در سال 2017 Saravani و همکاران با هدف بررسی عصاره ی هیدروالکلی گیاه بومادران بر بیان ژن فسفودی استراز 5 و پیام رسانی گوانوزین مونوفسفات حلقوی در سرطان پستان (MCF-7 and MDA-Mb-468)، نشان دادند که این گیاه اثر ضد تکثیری از طریق مسیر گوانوزین مونوفسفات حلقوی بر رده­ی سلولی سرطان پستان دارد (36). Sultani و همکاران در سال 2017 نشان دادند غلظت­های 10 الی 50 میکرومولار از مشتقات مرکاپتوگزانتین بر روی سلول­های لاین MCF-7 و k562 خاصیت کشندگی دارد.  Huberو همکاران در سال 2003 نشان دادند کافئین و سایر مشتقات آن فعالیت آنزیم DNA متیل ترانسفراز کبدی را افزایش داده که می­تواند منجر به افزایش میزان مرگ سلولی شود(37). Martins و همکاران در سال 2013 نشان دادند مشتقات سلنوکافئین فاقد اثر آنتی اکسیدانی بوده و به طور معنی داری قادر به القاء مرگ سلولی در لاین های سرطانی MCF-7 و نرمال MCF10A از بافت سرطانی پستان نبوده اند(38). در مطالعه­ی دیگری توسط Zhang و همکاران کافئین به عنوان سرکوب کننده­ی فرایند آپوپتوز در لاین سلولی RT4 سرطان مثانه معرفی شده است (39). به نظر می­رسد تفاوت در ساختار شیمیایی و استخلاقات جانبی آنالوگ­های سنتتیک کافئین می­تواند توجیه کننده­ی اثرات بیولوژیک متفاوت آن باشد. مطالعات مشابه بیشتری روی خواص سایتوتوکسیک این دسته از ترکیبات در مدل In vitro در انواع سلول­های سرطانی انجام نشده است. همچنین، مشاهده شده است برخی مشتقات کافئین از جمله تئوکافئین ها دارای خواص آنتی اکسیدانی بلقوه به جهت کاهش میزان رادیکال­های آزاد درون سلول بوده اند (40).

کشت سلولی[5] در واقع رشد سلول های جدا شده از بافت اصلی از طریق جدا سازی به وسیله روشهای فیزیکی و یا آنزیمی است و لذا بافت یا حاصل کشت، از یک کشت اولیه تکثیر می یابد و در معمول ترین حالت خود به صورت رشد سلول بر روی یک بستر جامد صورت می گیرد، سلول ها در داخل ظرف کشت در یک محیط مایع افشانده و سپس این سلول ها به هم چسبیده و تکثیر می یابند (41). استفاده از کشت سلولی در سم شناسی فارماکوژی شرایطی را برای تحقیق در انواع مواد دارویی و روشهای جدید درمانی به وجود آورده و در سال های اخیر از آن در جهت سنجش سمیت سلولی مواد شیمیایی ، دارویی، آفت کشها، افزودنی های مواد غذایی و غیرهاستفاده می­شود. کاربرد کشت سلولی در انجام آزمایشات گوناگون و سنجش اثرات مواد از قرن بیستم و با مطالعات هاریسون برروی بافت عصبی قورباغه آغاز شد و در سال ۱۹۵۲ آقای GeorgeGey  سلولهای Hela و از یک کارسینومای تخمدان جدا نمود و کشت داد که در واقع این کشت تکثیر یافته اولین پاساژ سلول های انسان است (42). به دلیل عوارض جانبی غیر قابل اجتناب و ایجاد مقاومت دارویی، ضروری به نظر می­رسد اهداف درمانی جدیدی جایگزین داروهای مرسوم شیمی درمانی از جمله سیس­پلاتین شوند. پتانسیل ضد توموری مشتقات جدید 8-آلکیل مرکاپتوکافئین در جهت فعال کردن مسیرهای سیگنالینگ منتهی به مرگ سلولی به اثبات رسیده است و اخیراً استفاده ازین ترکیبات آلی سنتتیک به عنوان جایگزینی برای داروهای مرسوم شیمی درمانی مورد توجه قرار گرفته ­است. در این مطالعه 12 ترکیب آلی از مشتقات 8-آلکیل مرکاپتوکافئین سنتز و شناسایی شده و اثر ضد تکثیری، آنتی اکسیدانی و آپوپتوتیک آن­ها در سلول های  HUVEC،,C152 MCF-7 و A549 بررسی خواهد شد. همچنین مطالعات داکینگ مولکولی جهت بررسی مقایسه توانایی اتصالی این مشتقات به مولکول­های دخیل در سیگنالینگ سلولی انجام خواهد شد.

1. میزان سمیت مشتقات 8-آلکیل مرکاپتوکافئین در سلول های  HUVEC،,C152 MCF-7 و A549 در مقایسه با سلول­های تیمار نشده متفاوت است.
2. سمیت مشتقات 8-آلکیل مرکاپتوکافئین سنتز شده در سلول های  HUVEC،,C152 MCF-7 و A549 در مقایسه با سیس پلاتین به عنوان داروهای مرجع متفاوت است.
3. درصد سلول های  HUVEC،,C152 MCF-7 و A549تیمار شده با 8-آلکیل مرکاپتوکافئین در هر فاز از سیکل سلولی در مقایسه با سلول­های تیمار نشده متفاوت است.
4. مشتقات 8-آلکیل مرکاپتوکافئین سنتز شده باعث کاهش میزان رادیکال­های واکنش پذیر اکسیژن در سلول های    HUVEC،,C152  MCF-7 و A549 در مقایسه با سلول­های تیمار نشده می­شوند.
5.  قابلیت مشتقات 8-آلکیل مرکاپتوکافئین در اتصال اختصاصی به آنزیم­های فسفو دی استرازی متفاوت است.

تعیین سمیت سلولی، خاصیت آنتی اکسیدانی و مطالعات داکینگ ملکولی مشتقات جدید 8-آلکیل مرکاپتوکافئین به عنوان عوامل ضد سرطان در لاین­های سلولی  C152، MCF-7 و  A549

1. مقایسه میزان سمیت مشتقات 8-آلکیل مرکاپتوکافئین در سلول های  HUVEC،,C152 MCF-7 و A549 در مقایسه با سلول­های تیمار نشده.
2. مقایسه سمیت مشتقات 8-آلکیل مرکاپتوکافئین سنتز شده در سلول های  HUVEC،,C152 MCF-7 و A549 در مقایسه با سیس پلاتین به عنوان داروی مرجع.
3. مقایسه درصد سلول های  HUVEC،,C152 MCF-7 و A549 تیمار شده با مشتقات 8-آلکیل مرکاپتوکافئین در هر فاز از سیکل سلولی در مقایسه با سلول های تیمار نشده.
4. مقایسه قابلیت مشتقات 8-آلکیل مرکاپتوکافئینسنتز شده در کاهش میزان رادیکال­های واکنش پذیر اکسیژن در سلول های  HUVEC،,C152 MCF-7 و A54 در مقایسه با سلول­های تیمار نشده .
5. مقایسه قابلیت مشتقات 8-آلکیل مرکاپتوکافئین در اتصال اختصاصی به آنزیم ­های فسفو دی استرازی.

دانشگاه­ها و شرکت­های دارویی

سرطان: تکثیر بیش از حد و غیر طبیعی سلول ها

آنتی اکسیدان: هر ماده­ای که مبتواند با تولید رادیکال­های آزاد اکسیژن در سلول مقابله کند.

آلکیل مرکاپتوکافئین: مشتقات کافئین حاوی اتم های گوگرد متصل به گروه­های مختلف آلکیل

سیتوتوکسیسیتی: اثر سمیت سلولی

داکینگ مولکولی: تکنیک پیش بینی تمایل برهم کنش مولکول و گیرنده

تجربی

تعداد 3 لاین سلولی (C152، HUVEC ، MCF-7 و A549) از سرطان­های دهان، پستان و شش و تعداد 12 ترکیب از دسته مشتقات 8-آلکیل مرکاپتوکافئین که در جدول زیر ساختار مولکولی آن­ها مشخص شده است. در مطالعه حاضر 3 تکرار برای هر تست (سمیت، سطح رادیکالهای آزاد و سیکل سلولی) انجام خواهشد شدکه در نهایت تعداد تست های انجام شده 324 خواهد بود.

ندارد

ندارد

مشاهدات آزمایشگاهی

الف- سنتز مشتقات 8-آلکیل مرکاپتوکافئین

به بالن سه دهانه مجهز به مبرد مخلوطی از آلکیل برماید و تیواوره در اتانول 96 درصد اضافه کرده و رفلاکس صورت می گیرد تا زمانی که کروماتوگرافی لایه نازک اتمام واکنش را نشان دهد. محلول سود به مخلوط فوق اضافه کرده و رفلاکس به مدت یک ساعت دیگر ادامه می یابد. مخلوط واکنش خنک شده و 8-بروموکافئین به آن اضافه می شود. پس از اتمام واکنش حلال تبخیر گشته و باقیمانده واکنش در کلروفرم رقیق شده و آب به آن اضافه می شود. محصول واکنش توسط کریستالیزاسیون تخلیص خواهد شد.

ب- بررسی سیتوتوکسیسیتی:

سمیت سلولی مشتقات جدید 1و4-بنزوکسازین بر روی رده های سلولی C152 ,HUVEC، MCF-7 و A549 روش MTT به شرح زیر مورد بررسی قرار خواهد گرفت:

- افزایش 100 میکرولیتر از محلول حاوی سلول‌های مورد نظر با دانسیته مناسب به هر چاهک میکروپلیت 96 چاهکی.

- مقدار 100 میکرولیتر از محلول X2 نمونه مورد آزمایش به چاهک واکنش ارزیابی افزوده خواهد شد. ارزیابی در پنج غلظت200، 100 ، 50 ، 25 و 10 میکرومولار انجام خواهد گرفت.

- میکروپلیت به مدت 72 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه خواهد شد.

- پس از سانتریفیژ میکروپلیت با دور g350 به مدت 10 دقیقه، 170 میکرولیتر از محلول هر چاهک برداشته و 80 میکرولیتر از محلولMTT (mg/ml 5 ) رقیق شده با RPMI بدون فنول، به آن اضافه خواهد شد.

- میکروپلیت به مدت 4 ساعت در دمایC37 انکوبه می شود.

- در این مرحله ml80 از محلول هر چاهک برداشته و به ازای آن DMSO ml200  به هر چاهک افزوده خواهد شد.

- میکروپلیت به مدت 1 ساعت در دمای C°37 انکوبه شده و پس از آن به مدت نیم ساعت با سرعت 130 دور در دقیقه هم زده خواهد شد.

- در نهایت جذب هر چاهک در طول موج nm۴۹۲ نسبت به فیلتر مرجع nm6۳۰ ثبت می شود. مراحل فوق سه بار تکرار شده و نتیجه نهایی به صورت IC₅₀ گزارش خواهد شد.

ج) آنالیز سیکل سلولی :

جهت بررسی توقف رشد سلول در فازهای مختلف چرخه سلولی در این آزمایش تعداد 150×0 سلول ردهC152  MCF-7, HUVEC  و A549 که از بانک سلولی پژوهشکده زیست فناوری دانشگاه فردوسی مشهد خریداری شده است توسط غلظت­های مختلف از مشتقات جدید 1و4-بنزوکسازین تیمار شده و ۴۸ ساعت پس از تیمار، با بافر فسفات سالین شسته می­شوند. سلول­های هر پلیت در 255 میکرولیتر بافر فسفات سالین سوسپانس گردید. برای تثبیت شدن سلول­ها 4 میلی لیتر اتانول 75 درصد به آن اضافه شد. سلول­ها به مدت 2 ساعت در دمای 4 درجه سانتی گراد انکوبه شدند. در نهایت، نمونه­ها برای نگهداری طولانی مدت تا زمان آنالیز به فریزر ۲۵- درجه سانتی گراد منتقل شدند. سوسپانسیون سلولی گروه­های تیمار و کنترل به مدت 35 دقیقه با محلول 100 میکروگرم بر میلی لیتر پروپودیوم یدید RNase تیمار و با دستگاه فلوسیتومتری مدل Partec آنالیز می­گردند. درصد سلول­ها در فازهای­G0/G1 ،S ،G2/M ،S ،G2/M با استفاده از نرم افزار نصب شده بر روی دستگاه محاسبه می­شوند (43).

د) اندازه گیری رادیکال های اکسیژن واکنش پذیر داخل سلولی[1]

برای اندازه گیری رادیکالهای اکسیژن واکنش پذیر داخل سلولی از پروب 2’-, 7’-DCFH-DA[2] استفاده میشود (44).   DCFH-DA  تحت تاثیر استراز[3] به DCFH هیدرولیز می­شود که توسط سلول به دام می افتند. این مولکول غیرفلورسنت به واسطه فعالیت اکسیدانت های داخل سلولی به DCF فلورسنت تبدیل میشود. DCFH-DA در HBSS[4] رقیق میشود. پس از شستشوی سلول ها با HBSS، انکوباسیون با محلول رقیق شده در دمای اتاق و تاریکی انجام میشود و در ادامه تیمار با نانوذرات انجام میشود. سپس شدت فلورسنت در 484 و 520 نانومتر با دستگاه الیزا اندازه گیری میشود.

ه) داکینگ مولکولی:

به منظور بررسی تاثیر اسید‌آمینه‌های مختلف موجود در اکتیو‌سایت و ارزیابی برهمکنش مهار‌کننده‌های مرکاپتوکافئینی در اکتیو‌سایت فسفودی استراز، فرایند داکینگ ملکولی انجام خواهد شد. ساختار­های طراحی و سنتز شده، به عنوان ورودی برای این مطالعه مورد استفاده قرار خواهند گرفت. تعداد ترکیبات بازدارنده در حدود 12 لیگاند مرکاپتوکافئینی خواهد بود که ابتدا به صورت دو بعدی رسم شده و سپس با استفاده از نرم‌افزار CHEMDRAW به صورت 3 بعدی باز‌ تولید می‌شوند تا برای فرایند داکینگ با پروتئین آماده شوند. بر اساس میزان انرژی به دست در پایان مراحل داکینگ به میزان پایداری کمپلکس لیگاند- پروتئین پی خواهیم برد.

فرایند داکینگ ملکولی لیگاندهای مرکاپتوکافئینی با استفاده از نرم افزار اتو‌داک 4 انجام خواهد شد. اتوداک 4 از الگوریتم ژنتیک لامارکی (LGA) برای پیش‌بینی کانفورماسیون‌های متصل که ترکیبی از ژنتیک روش الگوریتم و روش جستجوی محلی تطبیقی است، استفاده می‌کند. اکتیو‌سایت مورد نظر به صورت شبکه‌ای از نقاط پتانسیل در نظر گرفته می‌شود و برهمکنش اتم‌های لیگاند و اسید‌امینه‌های اکتیو‌سایت با استفاده از پتانسیل تعبیه شده در نرم افزار محاسبه شده و ساختارهای با پایین‌ترین انرژی به عنوان حالت اتصال لیگاند به پروتئین در نظر گرفته خواهند شد.

به منظور تجزیه و تحلیل داده ها، ابتدا نرمالیته توزیع داده ها با استفاده از آزمون کولموگروف -اسمیرنوف بررسی می شود. در صورت نرمال بودن داده ها از آزمون واریانس دو طرفهANOVA  و Post Hoc Tukey استفاده خواهد شد. نتایج به صورت Mean ± SEM گزارش می شود و p<0.05 معنی دار در نظر گرفته می شد. آزمونANOVA  جهت مقایسه پارامترهای مختلف بین سلول­های تیمار شده با غلظت­های مختلف از مشتقات 8- آلکیل مرکاپتوکافئینی و سلول­های تیمار نشده استفاده خواهد شد.

راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی ایران (کدهای 1 و 2و 3و 8) 

1- پژوهشگر باید به این امر مهم توجه داشته باشد که بافت‌ها و اعضای مورد استفاده، دارای منشأ انسانی‌اند و کرامت انسانی اقتضا می‌کند که جمع‌آوری، نگه‌داری، استفاده و نابودسازی آن‌ها توأم با رعایت ملاحظات و شؤون مرتبط باشد.

2- از اجزای بدنی دارای منشأ انسانی باید تنها در پژوهش‌هایی استفاده شود که اهداف ارزشمندی را در راستای مبارزه با بیماری‌ها و ارتقای سلامت انسان‌ها دنبال می‌کنند.

3- تمامی پژوهش‌ها بر روی عضو و بافت انسانی، پیش از اجرا، باید مورد تأیید کمیته‌ی اخلاق در پژوهش مرتبط قرار گیرد. کمیته‌ی اخلاق در پژوهش حق دارد که در تمامی مراحل پژوهش بر آن نظارت داشته باشد. پژوهشگران باید در این زمینه با کمیته‌ی اخلاق در پژوهش همکاری کنند.

8- پژوهشگر باید از اعضاء و بافت‌هایی که به منظور پژوهش در اختیار او قرار می‌گیرد استفاده‌ی بهینه کرده، از هدر رفتن آن‌ها جلوگیری کند

راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش‌های علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی  در جمهوری اسلامی ایران (کدهای 1و 9 و 11 و 28 و 29و 30 و 31)

1-هدف اصلی هر پژوهش‌باید ارتقای سلامت انسان‌ها توأم با رعایت کرامت و حقوق ایشان باشد.

9-در پژوهش‌های پزشکی که ممکن است به محیط زیست آسیب برسانند، باید احتیاط‌های لازم در جهت حفظ و نگهداری و عدم آسیب رسانی به محیط ریست انجام گیرد.

11-کمیته‌ی اخلاق در پژوهش علاوه بر بررسی و تصویب طرح‌نامه و دستورالعمل، این حق را دارد که طرح‌‌ها را در حین و بعد از اجرا را از نظر رعایت ملاحظات اخلاقی مورد پایش قرار دهد. اطلاعات و مدارکی که برای پایش از سوی کمیته‌ی اخلاق درخواست می‌شود، باید از سوی پژوهشگران در اختیار این کمیته گذاشته شود.   

28- پژوهشگران موظفند که نتایج پژوهش‌های خود را صادقانه ، دقیق، و کامل منتشر کنند. نتایج، اعم از منفی یا مثبت، و نیز منابع تأمین بودجه، وابستگی  سازمانی، و تعارض منافع – در صورت وجود – باید کاملاً آشکارسازی شوند. پژوهشگران نباید در هنگام عقد قرارداد انجام پژوهش، هیچ  گونه شرطی را مبنی بر حذف یا عدم انتشار یافته‌هایی که از نظر حمایت کننده‌ی پژوهش  مطلوب نیست، بپذیرند.

29-نحوه‌ی گزارش نتایج پژوهش باید ضامن حقوق مادی و معنوی تمامی اشخاص مرتبط با پژوهش، از جمله خود پژوهشگر یا پژوهشگران، آزمودنی‌ها و مؤسسه‌ی حمایت کننده‌ی  پژوهش باشد.

30-گزارش‌ها و مقالات حاصل از پژوهش‌هایی که مفاد این راهنما را نقض کرده‌اند، نباید برای انتشار پذیرفته شوند.

31-روش پژوهش نباید با ارزش‌های احتماعی، فرهنگی و دینی  جامعه در تناقض باشد.

-تاخیر در دریافت لوازم کشت و کیت ها و برای رفع مشکل باید ثبت سفارش قبل از سال میلادی جدید (2021) انجام شود.

-هزینه بالای مواد مورد نیاز برای سنتز و ارزیابی ترکیبات که میبایستی از کیت های تولید داخل با قیمت مناسب تر استفاده کرد.

- طولانی بودن زمان دریافت سفارشات که برای حل این مشکل سفارشات باید در اسرع زمان ارسال شوند.

-راندمان کم در مراحل سنتز که برای حل این مشکل باید روش سنتز تغییر باید.

8-آلکیل مرکاپتوکافئین، سمیت سلولی، داکینگ ملکولی

.             Fass L. Imaging and cancer: a review. Molecular oncology. 2008;2(2):115-52.

2.           Pecorino L. Molecular biology of cancer: mechanisms, targets, and therapeutics: Oxford university press; 2012.

3.           Weinstein IB, Joe AK. Mechanisms of disease: oncogene addiction—a rationale for molecular targeting in cancer therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 2006;3(8):448.

4.           Sonnenschein C, Soto AM, editors. Theories of carcinogenesis: an emerging perspective. Seminars in cancer biology; 2008: Elsevier.

5.           Qingyi W, Lei L. DNA repair, genetic instability, and cancer: World scientific; 2007.

6.           Prat A, Pineda E, Adamo B, Galván P, Fernández A, Gaba L, et al. Clinical implications of the intrinsic molecular subtypes of breast cancer. The Breast. 2015;24:S26-S35.

7.           Akbari A, Razzaghi Z, Homaee F, Khayamzadeh M, Movahedi M, Akbari ME. Parity and breastfeeding are preventive measures against breast cancer in Iranian women. Breast cancer. 2011;18(1):51-5.

8.           Xie Y, Wu J. MicroRNA-21 as prognostic molecular signatures in oral cancer: a meta-analysis. Int J Clin Exp Med. 2017;10(7):9848-56.

9.           Speight PM, Epstein J, Kujan O, Lingen MW, Nagao T, Ranganathan K, et al. Screening for oral cancer—a perspective from the Global Oral Cancer Forum. Oral surgery, oral medicine, oral pathology and oral radiology. 2017;123(6):680-7.

10.         Kumar M, Nanavati R, Modi TG, Dobariya C. Oral cancer: Etiology and risk factors: A review. Journal of cancer research and therapeutics. 2016;12(2):458.

11.         Longo DL, Fauci AS, Kasper DL, Hauser SL, Jameson JL, Loscalzo J. Harrison's principles of internal medicine 18E Vol 2 EB: McGraw Hill Professional; 2012.

12.         Kountouri MP, Mammas IN, Spandidos DA. Human papilloma virus (HPV) in lung cancer: unanswered questions. Lung Cancer. 2010;67(1):125.

13.         Repace JL, Jiang R-T, Acevedo-Bolton V, Cheng K-C, Klepeis NE, Ott WR, et al. Fine particle air pollution and secondhand smoke exposures and risks inside 66 US casinos. Environmental research. 2011;111(4):473-84.

14.         Yazdanparast R, Sadeghi H. Nucleic acid synthesis in cancerous cells under the effect of gnidilatimonoein from Daphne mucronata. Life sciences. 2004;74(15):1869-76.

15.         Fleisig H, Wong J. Measuring cell cycle progression kinetics with metabolic labeling and flow cytometry. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 2012(63):e4045.

16.         Florea A-M, Büsselberg D. Cisplatin as an anti-tumor drug: cellular mechanisms of activity, drug resistance and induced side effects. Cancers. 2011;3(1):1351-71.

17.         Tsukamoto G, Ichikawa H, Kobashi M, Yamada Y, Kikuchi T, Mese H, et al. Cisplatin-induced long-term dynorphin A-immunoreactivity in cell somata of rat area postrema neurons. Neuroscience letters. 2007;424(2):122-6.

18.         Altena R, De Haas E, Nuver J, Brouwer C, Van den Berg M, Smit A, et al. Evaluation of sub-acute changes in cardiac function after cisplatin-based combination chemotherapy for testicular cancer. British journal of cancer. 2009;100(12):1861-6.

19.         Clerici WJ, Hensley K, DiMartino DL, Butterfield DA. Direct detection of ototoxicant-induced reactive oxygen species generation in cochlear explants. Hearing research. 1996;98(1):116-24.

20.         Aebi S, Kröning R, Cenni B, Sharma A, Fink D, Los G, et al. all-trans retinoic acid enhances cisplatin-induced apoptosis in human ovarian adenocarcinoma and in squamous head and neck cancer cells. Clinical cancer research. 1997;3(11):2033-8.

21.         Hamaguchi K, Godwin AK, Yakushiji M, O'Dwyer PJ, Ozols RF, Hamilton TC. Cross-resistance to diverse drugs is associated with primary cisplatin resistance in ovarian cancer cell lines. Cancer Research. 1993;53(21):5225-32.

22.         Zhang K, Mack P, Wong K. Glutathione-related mechanisms in cellular resistance to anticancer drugs (Review). International journal of oncology. 1998;12(4):871-82.

23.         Lugnier C. Cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE) superfamily: a new target for the development of specific therapeutic agents. Pharmacol Ther. 2006;109(3):366-98.

24.         Corbin JD, Francis SH. Cyclic GMP phosphodiesterase-5: target of sildenafil. J Biol Chem. 1999;274(20):13729-32.

25.         Degerman E, Belfrage P, Manganiello VC. Structure, localization, and regulation of cGMP-inhibited phosphodiesterase (PDE3). Journal of Biological Chemistry. 1997;272(11):6823-6.

26.         Taylor RC, Cullen SP, Martin SJ. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nature reviews Molecular cell biology. 2008;9(3):231.

27.         Puzzo D, Sapienza S, Arancio O, Palmeri A. Role of phosphodiesterase 5 in synaptic plasticity and memory. Neuropsychiatric disease and treatment. 2008;4(2):371.

28.         Piazza GA, Keeton AB, Tinsley HN, Whitt JD, Gary BD, Mathew B, et al. NSAIDs: old drugs reveal new anticancer targets. Pharmaceuticals. 2010;3(5):1652-67.

29.         Tiwari AK, Chen Z-S. Repurposing phosphodiesterase-5 inhibitors as chemoadjuvants. Frontiers in pharmacology. 2013;4:82.

30.         Franco R, Oñatibia-Astibia A, Martínez-Pinilla E. Health benefits of methylxanthines in cacao and chocolate. Nutrients. 2013;5(10):4159-73.

31.         Fredholm BB. Methylxanthines: Springer Science & Business Media; 2010.

32.         Kennedy JF, Thorley M. Pharmaceutical Substances, A. Kleeman, J. Engel, B. Kutscher & D. Reichert George Thieme Verlag, Stuttgart/New York, 1999, 2286 pp., ISBN 3-13-558403-8/0-86577-817-5.[0pt][Electronic Version. ISBN 3-13-115133-1/0-86577-818-3]. Bioseparation. 1999;8(6):336-.

33.         Williams M, Jarvis MF. Adenosine antagonists as potential therapeutic agents. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 1988;29(2):433-41.

34.         Boaventura G, Krause L, Queiroz N, Contreras C, editors. Cosmetics with caffeine: Real benefits versus marketing claims. Proceedings of the 22nd Conference of the International Federation of Societies of Cosmetic Chemists; 2013.

35.         Herman A, Herman A. Caffeine’s mechanisms of action and its cosmetic use. Skin pharmacology and physiology. 2013;26(1):8-14.

36.         Saravani R, Galavi HR, Shahraki A. Inhibition of phosphodiesterase 5 and increasing the level of cyclic guanosine 3′, 5′ monophosphate by hydroalcoholic achillea wilhelmsii C. Koch extract in human breast cancer cell lines MCF-7 and MDA-Mb-468. Breast cancer: basic and clinical research. 2017;11:1178223417690178.

37.         Huber WW, Scharf G, Nagel G, Prustomersky S, Schulte-Hermann R, Kaina B. Coffee and its chemopreventive components Kahweol and Cafestol increase the activity of O6-methylguanine-DNA methyltransferase in rat liver—comparison with phase II xenobiotic metabolism. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 2003;522(1-2):57-68.

38.         Martins I, Miranda J, Oliveira N, Fernandes A, Gonçalves S, Antunes A. Synthesis and biological activity of 6-selenocaffeine: potential modulator of chemotherapeutic drugs in breast cancer cells. Molecules. 2013;18(5):5251-64.

39.         Zhang Z-W, Xiao J, Luo W, Wang B-H, Chen J-M. Caffeine suppresses apoptosis of bladder cancer RT4 cells in response to ionizing radiation by inhibiting ataxia telangiectasia mutated-Chk2-p53 axis. Chinese medical journal. 2015;128(21):2938.

40.         Jasiewicz B, Sierakowska A, Wandyszewska N, Warżajtis B, Rychlewska U, Wawrzyniak R, et al. Antioxidant properties of thio-caffeine derivatives: Identification of the newly synthesized 8-[(pyrrolidin-1-ylcarbonothioyl) sulfanyl] caffeine as antioxidant and highly potent cytoprotective agent. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 2016;26(16):3994-8.

41.         Chiu S, Bhakthan N. Experimental acetaminophen-induced hepatic necrosis: biochemical and electron microscopic study of cysteamine protection. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 1978;39(3):193-203.

42.         Mutimer D, Ayres R, Neuberger J, Davies M, Holguin J, Buckels J, et al. Serious paracetamol poisoning and the results of liver transplantation. Gut. 1994;35(6):809-14.

43.         Mianabadi M, Panahi E, Sadeghi H, Jafari A. K562 cell cycle arrest in G0/G1 phase by two species of Daphne family. ISMJ. 2015;18(1):125-34.

44.         Wang H, Joseph JAJFRB, Medicine. Quantifying cellular oxidative stress by dichlorofluorescein assay using microplate reader. 1999;27(5-6):612-6.

در این پژوهش اثر ضد سرطانی و آنتی اکسیدانی 12 ترکیب مشتق شده از 8-مرکاپتوکافئین بر روی 3 لاین سرطانی و یک لاین سلولی نرمال بررسی خواهد شد.

ندارد

کمک به درک مکانیسم های مولکولی دخیل در ایجاد و پیشرفت سرطان ریه، پستان و دهان

ندارد

شامل این طرح نمی شود

به توجه به اینکه طرح فعلی بر روی سلولهای سرطانی خریاداری شده انجام میشود، هیچ هزینه ای برای هیچ بیماری نخواهد داشت.

ندارد

شامل این طرح نمی شود

دکتر سامان سرگزی (09103161030)

شامل این طرح نمی شود

شامل این طرح نمی شود

ندارد