ارزیابی اثرات نانوذرات متشکل از هسته ی اکسیدآهن-پوستهی طلا حاوی کنژوگه های اسید فولیک بر آنزیمهای دخیل در استرس اکسیداتیو به صورت in vitro و in vivo

مقدمه و مرور متون

   امروزه فناوری نانو در گستره‌ی وسیعی از پزشکی (تشخیص و درمان)، داروسازی، صنایع غذایی، صنایع الکترونیک، ورزش، پاکسازی محیط زیست، لوازم آرایشی و بهداشتی مطرح شده است [1]. با وجود افزایش تولید و استفاده‌ی بالقوه از نانوذرات، بسیاری از نگرانی‌ها در جامعه، صنایع و مقامات نظارتی (اتحادیه‌ی اروپا) در مورد مواد شیمیایی و استفاده‌ی ایمن از آنها، و نیز سرنوشتشان در سیستم‌های بیولوژیکی ایجاد شده است. تعامل نانوذرات با سیستم‌های بیولوژیکی نتایجی غیرقابل پیش‌بینی دارد، در نتیجه درک سمیت آنها برای جلوگیری از اثرات مضر بر بدن انسان ضروری است [2].  

   در میان نانوذرات پلاسمونیک[1] که تا به امروز شناخته شده‌اند، نانوذرات طلا[2] به عنوان پاسخ دهنده‌ی قوی به نور معرفی شده‌اند. نانوذرات طلا به علت خواص ترموفیزیکی ایده‌آل، اندازه‌ی مناسب برای تجمع داخل تومور بواسطه‌ی هدف گیری غیرفعال، قابلیت طراحی چند منظوره برای تنظیم اندازه و مورفولوژی در طیف وسیع، اتصال با لیگاندهای اختصاصی جهت هدف‌گیری فعال و کارایی در تصویربرداری زیست پزشکی بسیار مورد توجه قرار گرفته‌اند. به علاوه، نانوذرات طلا به عنوان یکی از مهمترین نانومواد برای درمان ترکیبی سرطان به طور گسترده مطرح شده‌اند. ویژگی‌هایی نظیر سازگاری زیستی ذاتی، نسبت بالای سطح به حجم، چند منظوره بودن، سمیت بسیار پایین و حلالیت چشمگیر، قابلیت کاربرد این نانوذرات را در ژن درمانی[3] و دارورسانی[4] مسیر ساخته است [3].

  یکی از اهداف اصلی درمان فتوترمال[5] تومور در حالی‌که بافت سالم اطراف حفظ شود، هدایت نانوذرات طلا به طور مستقیم و با دقت بالا به سلول‌های سرطانی می‌باشد. نانوذرات طلا قابلیت ذاتی پاسخگویی به تابش نور را دارا می‌باشند که طی دهه‌ی گذشته در درمان فتوترمال مورد توجه قرار گرفته‌اند. این نانوذرات هنگامی که تحت تابش نور لیزر قرار می‌گیرند، قادرند انرژی نوری را به گرما تبدیل کرده و در نتیجه دمای محیط اطراف را افزایش دهند. بنابراین، هدایت هدفمند نانوذرات طلا به تومور و سپس تابش اشعه‌ی لیزر پس از آن می‌تواند روش هدایت مستقیم گرما به سلول‌های تومور را تحقق بخشد [3].

  آهن، به عنوان یک عنصر پرکاربرد، و جزء در ساختار  متالوپروتئین‌ها[6] است و نقش عمده‌ای در فعالیت‌های بیوشیمیایی حیاتی مانند انتقال اکسیژن، انتقال الکترون و نیز نقش کاتالیزوری دارد. نانوذرات آهن به عنوان یک ترکیب امیدوارکننده به عنوان عامل کنتراست[7] در تصویربرداری، دارو رسانی و یک عامل حساس به اشعه برای روش‌های پرتودرمانی و حرارتی محسوب می‌شوند. دو نوع نانوذره آهن، Fe2O3 و Fe3O4 با پوسته‌های مختلف و ساختارهای  عملکردی، به طور گسترده ای در زمینه‌ی هیپرترمی[8] سرطان، در سطح سلول و نیز در مدل حیوانی مورد استفاده قرار گرفته‌اند [4, 5].

  با توجه به ویژگی‌های منحصر بفرد نانوذرات آهن و طلا،  ایندو ساختار می‌توانند با هم ترکیب شده و در طیف وسیعی استفاده شوند. نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسید آهن و پوشش طلا در تحقیقات بسیاری به عنوان یک عامل ترانوستیک[9] مطرح شده‌اند زیرا می‌توانند در عین حال هم به عنوان عامل کنتراست در تصویربرداری، و هم بعنوا عامل حساس به دما برای افزایش اثرات هیپرترمی در حضور میدان مغناطیسی، لیزر و امواج رادیویی استفاده شوند [4]. نانوذرات ترکیبی طلا و آهن فاکتورهای اصلی درمان‌های جدید نظیر درمان فتوترمال می‌باشند. برای القای هدف‌گیری فعال که براساس شناسایی اختصاصی لیگاندهای (پروتئین‌ها، پپتیدها و مولکول‌های کوچک) متصل شده به سطح نانوذرات توسط گیرنده‌های سطحی سلول‌های سرطانی می‌باشد، اسید فولیک[10] استفاده می‌شود. این ترکیب یک ماده‌ی ضروری برای تکثیر سلولی است. با توجه به رشد سریع تومور، سلول‌های سرطانی میزان بیان بالایی از گیرنده‌های اسید فولیک را در سطح خود نسبت به سلول‌های معمولی نشان می‌دهند. بنابراین افزودن اسید فولیک به نانوذرات طلا رویکرد هدف‌گیری دقیق‌تر سلول‌های سرطانی بوده و درمان موثرتری را ارائه می‌دهد. بعلاوه افزودن آهن به نانوذرات طلا و القای میدان مغناطیسی خارجی، رویکرد دیگری جهت هدایت هدفمند نانوذرات به تومور می‌باشد تا بازده درمان ترکیبی به حداکثر برسد [6, 7].

  اخیرا، تیم تحقیقاتی ما اثرات نانو ذرات ترکیبی طلا-اکسید آهن[11] را طراحی و در سطح سلولی[12] و مدل حیوانی[13] بررسی کرد. در سال ۲۰۱۸ حسینی و همکاران نانوذرات اکسید آهن با پوشش طلا را سنتز و اثرات درمان فتوترمال و حساسیت به امواج دادیویی را بر روی سلول‌های کارسینوم انسانی اپیدرمال دهان و دندان[14] مورد بررسی قرار دادند. پس از انکوباسیون سلول‌ها با نانوذرات، تابش اشعه‌ی ایکس و لیزر انجام شد. نتایج حاصل نشان داد که انکوباسیون سلول‌های سرطانی با نانوذرات و سپس درمان ترکیبی با اشعه‌ی ایکس و لیزر، بعنوان یک رویکرد جدید درمانی  برای درمان تومور سر و گردن مطرح شد [4]. در تحقیقی دیگر، در سال ۲۰۱۸ میررحیمی و همکاران با استفاده از غلظت‌های مختلف نانوذرات طلا-اکسیدآهن، باحضور اسید فولیک و بدون آن، سلول‌های سرطانی انسانی نازوفارنژیال[15] را تحت درمان با اشعه‌ی لیزر[16] قرار دادند. نتایج حاصله نشان داد که نانوذرات حاصل، کروی و دارای اندازه هیدرودینامیکی ۳۳ نانومتر بوده و بطور موفقیت‌آمیزی با لیگاند اسید فولیک ترکیب شده‌اند. در ادامه با تابش لیزرُ نتایج اندازه‌گیری دما[17] افزایش معنی‌دار درجه حرارت را در سلول‌ها در حضور نانوذرات نشان داد. در عین حال، میزان افزایش دمای بیشتر و میزان آپوپتوز[18] بالاتری برای سلول هایی که در معرض نانوذرات هدفمند بودند در مقایسه با نانوذرات فاقد اسیدفولیک، به دست آمد. بنابراین، دستکاری نانوذرات با فاکتورهایی نظیر لیگاند اسید فولیک باعث بهبود کارایی درمان، کاهش دوز ترزیقی موثر، افزایش بیشتر دما، و در نهایت کاهش موثر مدت زمان درمان شد[8]. در سال ۲۰۱۹، عابد و همکاران نانوذره‌ی چند منظوره طلا-اکسیدآهن را ارزیابی کردند. پوسته‌ی طلا دارای خاصیت رزونانس پلاسمونی بود که ویژگی مهمی برای تحقق بخشیدن به درمان فتوترمال به شمار می‌رفت. هسته‌ی مغناطیسی آهن به عنوان یک عامل کنتراست برای تصویربرداری رزونانس مغناطیسی[19] عمل ‌کرده و برای هدف‌گیری فعال از طریق القای میدان مغناطیسی استفاده می‌شد. بررسی کارایی این نانوذره، بصورت ترزیق داخل وریدی به موش‌های دارای سرطان کولورکتال[20] انجام شد. در ادامه هدایت نانوذرات به تومور با القای میدان مغناطیسی خارجی و سپس درمان با اشعه‌ی لیزر قرار گرفت. تصویربرداری رزونانس مغناطیسی تجمع نانوذرات را در داخل بافت تومور نشان داد. نتایج حاصل از سنجش در مدل حیوانی نشان داد که تومور در گروه دارای هدف‌گیری مغناطیسی، میزان بیشتری افزایش دما را در مواجهه با اشعه‌ی لیزر نسبت به گروه غیرهدفمند داشته است. ارزیابی اثرات ضد سرطان نانوذرات نشان داد که تزریق سیستمیک آنها در ترکیب با هدف‌گیری مغناطیسی و تابش لیزر منجر به توقف چشمگیر رشد تومور می‌شود [3]. در سال ۲۰۱۹  هادی و همکاران، اثرات درمان ترکیبی سرطان شامل پرتودرمانی[21] و القای دما[22]  بواسطه‌ی امواج رادیویی[23] در حضور نانوذرات طلا-اکسیدآهن به عنوان ذرات حساس به دما و فرکانس را گزارش کردند. سلول‌های آدنوکارسینوم پستان انسان[24] با غلظت‌های مختلف نانوذرات مورد تیمار قرار گرفتند. پس از انکوباسیون با نانوذرات، امواج رادیویی به سلوله‌ا داده شده و میزان تغییرات دما با یک دوربین مادون قرمز[25]  بررسی شد. سپس سلول‌ها در معرض اشعه‌ی ایکس قرار گرفتند. جذب سلولی نانوذرات به صورت کیفی و کمی اندازه‌گیری شد. نتایج حاصل نشان داد که درمان ترکیبی با نانوذرات، تابش پرتو و امواج رادیویی در مقایسه با درمان مجزا، اثرات معنی‌دار هم افزا[26] را بر میزان القای  مرگ سلولی[27] داشته است [9].

 اگر چه ترکیب آهن و طلا دارای عملکردهای بیولوژیکی گسترده‌ای است، اما می‌توانند اثرات جانبی نیز داشته باشند. برای مثال، آهن بصورت مشتقات سوپر[28] می‌تواند برای ارگانیسم‌ها عامل تهدیدکننده باشد. اضافه بار آهن می‌تواند موجب آسیب رشته‌ی DNA و نیز باعث بیماری‌هایی مانند هماکروماتوز[29] شود. علاوه بر این، ثابت شده است که غلظت های بالای آهن می‌تواند فاکتور خطر ابتلا به سرطان  باشد. به خوبی شناخته شده است که سمیت آهن عمدتا بر اساس توانایی آن در تشکیل رادیکال‌های آزاد هیدروکسیل (OH) از سوپراکسید (O2) و هیدروژن پراکسید (H2O2) می‌باشد. رادیکال‌های آزاد، گونه‌های بسیار واکنش‌پذیری هستند که می‌توانند بر عملکرد آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان، پراکسیداسیون لیپیدی[30]، ساختار اسیدهای نوکلئیک، تاثیر گذاشته و مرگ سلولی و آسیب بافتی را ایجاد کنند.  امروزه، نانوذرات آهن به طور گسترده‌ای در روند بازسازی ترکیبات آلی هالوژن‌دار و سایر ترکیبات در سیستم‌های آبی محیطی استفاده می‌شوند [5, 10].

   از چندین دهه قبل با کشف انواع فلزات و پلیمرها، مطالعات زیادی نه تنها به سنتز و ارزیابی ویژگی ساختاری این ترکیبات پرداخته‌اند بلکه، قابلیت کاربردی بالقوه‌ی این مواد در طیف گسترده، توجه زیادی را به خود جلب کرده است [11]. نانوذرات معدنی (فلزاتی نظیر آهن و طلا و ...) از لحاظ بیولوژیک قابل تجزیه نیستند و از این رو سمیت نانومواد مشتق از آنها باید بررسی شود. در دهه‌ی اخیر که نانوتکنولوژی بطور چشمگیری وارد عرصه‌ی زیست پزشکی شده است، مطالعات زیادی در جهت ارزیابی اثربخشی نانوذرات در سطح سلولی انجام گرفته است. مطالعات نشان داده‌اند که استرس اکسیداتیو در برخی از شرایط پاتولوژیک مانند التهاب افزایش می‌یابد. از این رو بررسی این امر مهم است که آیا نانوذرات می‌توانند با اثر بر عملکرد آنزیم‌های مسئول پاکسازی رادیکال‌های آزاد، تعادل این واسطه ها را بهم زده و با ایجاد استرس اکسیداتیو اثرات سمی بر روی سلول‌های سالم داشته باشند [12]. لذا هدف از این مطالعه تعیین و مقایسه‌ی اثرات نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه های اسید فولیک، بر آنزیم‌های دخیل در استرس اکسیداتیو در سلول‌های سالم و در حیوانات می‌باشد.

۱- تیمار نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک، بر میزان بقای سلولی اثر معنادار دارد(H₁).

۲- تیمار نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک، بر محتوای پروتئین در رده سلولی سالم اثر معنادار دارد(H₁).

۳-  تیمار نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک، بر فعالیت آنزیم لاکتات دهیدروژناز در رده سلولی سالم اثر معنادار دارد(H₁).

۴- تیمار نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک، بر سطح رادیکال‌های واکنش‌پذیر اکسیژن در رده سلولی سالم اثر معنادار دارد(H₁).

۵- تیمار نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک، بر سطح گلوتاتیون احیا شده در رده سلولی سالم اثر معنادار دارد(H₁).

۶-  تیمار نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک، بر پراکسیداسیون لیپیدی در رده سلولی سالم اثر معنادار دارد(H₁).

۷- تیمار نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک، بر ساختار رشته DNA در رده سلولی سالم اثر معنادار دارد(H₁).

۸. تیمار نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک، بر سطح سرمی نیتروژن اوره خون در رتهای تیمار شده اثر معنادار دارد(H₁).

۹. تیمار نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک، بر سطح سرمی کراتینین در رتهای تیمار شده اثر معنادار دارد(H₁).

۱۰. تیمار نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک، بر سطح سرمی آسپارتات آمینوترانسفراز (AST) در رتهای تیمار شده اثر معنادار دارد(H₁).

۱۱. تیمار نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک، بر سطح سرمی آلانین آمینوترانسفراز (ALT) در رتهای تیمار شده اثر معنادار دارد(H₁).

۱۲. تیمار نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک، بر فعالیت کاتالاز  CATسرمی در رتهای تیمار شده اثر معنادار دارد(H₁).

۱۳. تیمار نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک، بر فعالیت سوپراکسید دیسموتاز SOD  سرم در رتهای تیمار شده اثر معنادار دارد(H₁).

۱۴. تیمار نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک، بر سطح سرمی مالوندآلدئید MDA در رتهای تیمار شده اثر معنادار دارد(H₁).

۱۵. تیمار نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک، بر بافت کلیه و کبد در رتهای تیمار شده اثر معنادار دارد(H₁).

ارزیابی اثرات نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه های اسید فولیک بر آنزیم‌های دخیل در استرس اکسیداتیو به صورت in vitro  و in vivo

۱- تعیین و مقایسه‌ی اثرات نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک بر میزان بقای سلولی در رده سلولی سالم

۲- تعیین و مقایسه‌ی اثرات نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک بر محتوای پروتئین در رده سلولی سالم

۳- تعیین و مقایسه‌ی اثرات نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک بر فعالیت آنزیم لاکتات دهیدروژناز در رده سلولی سالم

۴- تعیین و مقایسه‌ی اثرات نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک بر سطح رادیکالهای واکنش پذیر اکسیژن در رده سلولی سالم

۵- تعیین و اثرات نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک بر گلوتاتیون احیا شده در رده سلولی سالم

۶- تعیین و مقایسه‌ی اثرات اثرات نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک بر پراکسیداسیون لیپیدی در رده سلولی سالم

۷- تعیین و مقایسه‌ی اثرات اثرات نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک  بر ساختار رشته DNA در رده سلولی سالم

۸- بررسی توزیع مکانی نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک در رده سلولی سالم

۹. تعیین و مقایسه‌ی اثرات تیمار نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک، بر سطح سرمی نیتروژن اوره خون در رتهای تیمار شده و گروه کنترل

۱۰. تعیین و مقایسه‌ی اثرات تیمار نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک، بر سطح سرمی کراتینین در رتهای تیمار شده و گروه کنترل

۱۱. تعیین و مقایسه‌ی اثرات تیمار نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک، بر سطح سرمی آسپارتات آمینوترانسفراز (AST) در رتهای تیمار شده و گروه کنترل

۱۲. تعیین و مقایسه‌ی اثرات تیمار نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک، بر سطح سرمی آلانین آمینوترانسفراز (ALT) در رتهای تیمار شده و گروه کنترل

۱۳. تعیین و مقایسه‌ی اثرات تیمار نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک، بر فعالیت کاتالاز  CATسرمی در رتهای تیمار شده و گروه کنترل

۱۴. تعیین و مقایسه‌ی اثرات تیمار نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک، بر فعالیت سوپراکسید دیسموتاز SOD  سرم در رتهای تیمار شده و گروه کنترل

۱۵. تعیین و مقایسه‌ی اثرات تیمار نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک، بر سطح سرمی مالوندآلدئید MDA در رتهای تیمار شده و گروه کنترل

۱۶. تعیین و مقایسه‌ی تیمار نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک، بر بافت کلیه و کبد در رتهای تیمار شده و گروه کنترل

مراکز تحقیقاتی

دانشگاهها

بیمارستانها و کلینیک ها

نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک: با توجه به ویژگی‌های منحصر بفرد نانوذرات آهن و نانوذرات طلا،  ایندو ساختار می‌توانند با هم ترکیب شده و در طیف وسیعی استفاده شوند. نانوذرات اکسید آهن با پوشش طلا حاوی لیگاند اسید فولیک و هسته‌ی آهن، تحت تحقیقات بسیاری به عنوان یک عامل ترانوستیک[1] امیدوار کننده مطرح شده‌اند زیرا می‌توانند در عین حال هم به عنوان عامل کنتراست در تصویربرداری، و هم عامل حساس به دما برای افزایش اثرات هیپرترمی در حضور میدان مغناطیسی، لیزر و امواج رادیویی استفاده می شود.

بنیادی-کاربردی

 رده سلولی سالم

ندارد.

ندارد.

انجام آزمایشات سلولی-مولکولی

سنتز نانوذرات متشکل از هسته‌ی اکسیدآهن-پوسته‌ی طلا حاوی کنژوگه‌های اسید فولیک

نانوذرات اکسید آهن-طلا در دانشگاه علوم پزشکی ایران، دپارتمان فیزیک پزشکی با استفاده از روش Lyon’s iterative hydroxylamine- seeding سنتر می‌شوند [4] .مورفولوژی و اندازه‌ی نانوذرات سنتز شده با استفاده از میکروسکوپ الکترونی با وضوح بالا[1] و میکروسکوپ الکترونی اسکن[2] تعیین می‌شود. قطر هیدرودینامیکی و بار سطحی آنها با ابزار پراکنش دینامیک نور[3] و زتاسایزر[4] اندازه‌گیری می‌شود. خواص نوری نانوذرات پراکنده در آب مورد با ابراز مربوطه[5] بررسی قرار می‌گیرد. اندازه گیری غلظت آهن و طلا در نانوساختار سنتز شده، بوسیله اسپکترومتری[6] انجام می‌شود.

کشت سلولی

براساس مطالعات قبلی رده سلولی سالم مورد بررسی قرار می‌گیرد [9]. محیط کشت [7]DMED یا  1640-RPMIبا ۱٪ پنی سیلین-استرپتومایسین[8] و  ۱۰٪ سرم جنین گاوی[9] در دمای ۳۷ درجه با غلظت ۵٪ CO2 و رطوبت ۹۵٪ کشت می‌شوند.

آماده‌کردن غلظت‌های نانوذرات

چند دقیقه قبل از تیمار سلول‌ها، سوسپانسیون نانوذرات در محیط کشت، بواسطه‌ی هم زدن با سونیکاتور[10] به مدت ۵ دقیقه و با غلظت‌های مختلف تهیه می‌شود. برای بررسی احتمال به هم چسبیدن ذرات در سوسپانسیون، قطر هیدرودینامیک نانوذرات بوسیله‌ی [11]DLS بررسی می‌شود [13].

تیمار سلولی و ارزیابی میزان بقا  به روش MTT، تعیین دوز مناسب

سلول‌ها در پلیت‌های ۹۶ چاهک با تراکم ۱۰۰۰۰ سلول در هر چاهک و با  μL ۱۰۰محیط کشت کامل، به مدت ۲۴ ساعت کشت داده می‌شوند. سپس μL ۱۰۰محیط کشت با غلظت‌های مختلفی از نانوذرات μg/ml ۰، ۵ ۱۰، ۱۵، ۲۰، ۲۵ و ۳۰ به چاهک‌ها اضافه می‌شود. بعد از ۴ ساعت سلول‌ها با بافر فسفات سالین شستشو داده شده و μL ۲۰۰محیط کشت تازه اضافه شده و سلول‌ها در انکوباتور قرار می‌گیرند. بعد از انکوباسیون overnight، محیط کشت حذف شده و محلول MTT μL ۱۰۰ باغلظت mg/ml PBS ۵ به هر چاهک اضافه می‌شود. انکوباسیون برای ۴ ساعت در ۳۷ درجه انجام شده بعد از حذف MTT، μL [12]DMSO ۱۰۰ اضافه می‌شود. سپس میزان جذب نوری در طول موج ۵۷۰ نانومتر خوانش می‌شود.

میزان بقا بر اساس فرمول زیر محاسبه میشود [14]:

Cell viability (%) = (OD_sample- OD_medium)/(OD_control- OD_medium)

در این مرحله دوز دارای کمترین سمیت انتخاب می‌شود. (تیمارها در هر غلظت بصورت سه تایی انجام می‌شود.)

ارزیابی اثرات نانوذرات

  برای ارزیابی اثرات نانوذرات، سلولها در دو مرحله کشت داده می‌شوند. در مرحله‌ی اول برای بررسی تراکم و سمیت سلولی، سلول‌ها به پلیت 24 چاهکی انتقال یافته (1×10^۵سلول در هر چاهک با 1میلی لیتر محیط) و 48 ساعت بعد از فیکس شدن، با غلظت اپتیمال حاصل از مرحله قبل نانوذرات از روش MTT تیمار می‌شوند. و ارزیابی اثرات نانوذرات بر رادیکال‌های اکسیژن واکنش پذیر داخل سلولی، و نیز بررسی لوکالیزاسیون نانوذرات انجام می‌شود.

  در مرحله‌ی دوم، برای بررسی مالونئید آلدهید[13] یا پراکسیداسیون لیپیدی، گلوتاتیون احیا و فعالیت آنزیم لاکتات دهیدروژناز، سلولها(2×10⁵) به فلاسک 75 cm² منتقل شده  13میلی لیتر محیط کشت اضافه می‌شود. بعد از 48 ساعت (زمان مناسب برای ارزیابی اثرات) سوسپانسیون نانوذرات اضافه می‌شود. سلول‌های تیمار نشده بعنوان گروه کنترل در نظر گرفته می‌شوند. در پایان محیط کشت سلولی برای ارزابی فعالیت آنزیم لاکتات دهیدروژناز استفاده شده، و هموژنات سلولی برای اندازه‌گیری گلوتاتیون احیا شده، مالونئید آلدهید و پروتئین در فریزر -70 درجه نگهداری می‌شود [13, 15].

• سمیت سلولی براساس توتال پروتئین

در پایان تیمار 24و 48و 72 ساعت، محیط کشت سلولی حذف شده و میزان بقای سلولها به روش [14]SRB براساس محتوای پروتئین، نسبت به گروه کنترل ارزیابی می‌شود [16]. بطور خلاصه، بعد از حذف کردن محیط کشت، سلول‌ها با تری کلرواستیک اسید[15] ثابت می‌شوند. سپس تری کلرواستیک اسید از محیط حذف شده، سلولها با آب مقطر شستشو داده شده و در ادامه خشک می‌شوند (آبگیری کردن). در دمای اتاق، سولفورودامین ب[16] جهت رنگ آمیزی به سلول‌ها اضافه می‌شود. بعد از ۳۰ دقیقه، محلول رنگ آمیزی حذف شده و سلول‌ها با استیک اسید شستشو داده می‌شوند. بعد از خشک کردن، رنگ در تریس بافر[17] سرد حل می‌شود. سپس با دستگاه الیزا در طول موج ۵۵۰ نانومتر، جذب نوری اندازه گیری می‌شود [13] .    SiO2یا crystalline silica (Min-U-Sil 5) به عنوان کنترل مثبت سمیت آنزیمی استفاده می‌شوند [13, 15].

• اندازه گیری فعالیت لاکتات دهیدروژناز[18] در محیط کشت

سوپرناتانت محیط کشت برای این هدف با کیت آنالیز می‌شود. آنزیم لاکتات دهیدروژناز، فرآیند اکسیداسیون لاکتات به پیروات را توام با احیای NAD+ به NADH کاتالیز می‌کند. میزان احیای NAD+ بطور مستقیم با میزان فعالیت آنزیم لاکتات دهیدروژناز محیط کشت در ارتباط می‌باشد. سپس با دستگاه الیزا در طول موج ۳۲۰ نانومتر، جذب نوری اندازه گیری می‌شود [13].

• اندازه گیری رادیکال‌های اکسیژن واکنش پذیر داخل سلولی[19] و ظرفیت آنتی اکسیدانی کل

برای اندازه‌گیری رادیکال‌های اکسیژن واکنش پذیر داخل سلولی از پروب 2’-, 7’-DCFH-DA[20] استفاده می‌شود [17]. DCFH-DA تحت تاثیر استراز[21] به DCFH هیدرولیز می‌شود که توسط سلول به دام می افتند. این مولکول غیرفلورسنت به واسطه‌ی فعالیت اکسیدانت‌های داخل سلولی به DCF فلورسنت تبدیل می‌شود. DCFH-DA در HBSS[22] رقیق می‌شود. پس از شستشوی سلول‌ها با HBSS، انکوباسیون با محلول رقیق شده در دمای اتاق و تاریکی انجام می‌شود و در ادامه تیمار با نانوذرات انجام می‌شود. سپس شدت فلورسنت در 484 و 520 نانومتر با دستگاه الیزا اندازه‌گیری می‌شود.

• اندازه‌گیری گلوتاتیون احیا شده[23] داخل سلولی

برای اندازه گیری سطح گلوتاتیون احیا شده، سلول ها در بافر سرین بورات[24] هموژن می‌شوند. هموژنات به حلال HPLC اضافه شده و بعد از انکوباسیون، مهار کننده واکنش اضافه می‌شود. و روش HPLC برای بررسی گلوتاتیون انجام می‌شود [13].

• اندازه گیری پراکسیداسیون لیپیدی (مالونئید آلدهید) داخل سلولی

محتوای پراکسیداسیون لیپیدی سلولی با اندازه‌گیری غلطت تیوباربیتوریک اسید[25] بررسی می‌شود. هموژنات سلولی با متانول و تریکلریک اسید مخلوط شده و به مدت نیم ساعت برای رسوب پروتئین‌ها حرارت دادع می‌شود. بعد از سرد کردن و سانتریفیوژ، سوپرناتانت جمع آوری شده و با محلول TBA اشباع شده، مخلوط می‌شود. بعد از بن ماری، سرد کردن تا دمای اتاق، سانتریفوژ انجام شده و سوپرناتانت در طول موج‌های  515و 550 نانومتر با دستگاه الیزا اندازه‌گیری می‌شود. آنالیز میشود.

• ارزیابی فعالیت سوپراکسید دیسموتاز

  بررسی فعالیت سوپراکسید دیسموتاز به واسطه کیت مریوطه انجام می‌شود. یک واحد فعالیت آنزیمی معادل مقداری از آنزیم است که موجب 50 درصد ممانعت احیای NBT در 560 نانومتر می شود. میزان فعالیت آنزیم بر حسب یک واحد در دقیقه به ازای میلی گرم پروتئین محاسبه گردید  

• کاتالاز

بررسی فعالیت کاتالاز به واسطه کیت مریوطه انجام می‌شود. یک واحد فعالیت آنزیمی معادل مقداری از آنزیم است که موجب 50 درصد ممانعت احیای NBT در 560 نانومتر می شود. میزان فعالیت آنزیم بر حسب یک واحد در دقیقه به ازای میلی گرم پروتئین محاسبه گردید  

• بررسی آسیب رشته‌ی DNA (الکتروفورز سلول واحد، COMMET ASSAY)

24 ساعت بعد از تیمار سلول‌ها با نانوذرات، سلولها شسته و تریپسینه می‌شوند. ۱×۱۰^۵ سلول در ۱میلی لیتر PBS غوطه ور می‌شوند. ۱۰ میکرولیتر از سوسپانسون سلولی  با آگاروز ملتون[26] مخلوط شده و بلافاصله در روی شیشه  قرار می‌گیرد. شیشه بصورت افقی در دمای 4 درجه به مدت 30 دقیقه قرار می‌گیرد. سپس در محلول لیز سلولی سرد قرار می‌گیرد. بعد از یک ساعت در دمای 4 درجه و در تاریکی، اسلایدها در آلکالین جهت دناتوره کردن رشته DNA قرار می‌گیرند. در پایان، اسلایدها بصورت افقی در دستگاه الکتروفورز و بافر مربوطه قرار می‌گیرند. الکتروفورز در ۲۷ ولت برای ۴۰ دقیقه و در ۴ درجه انجام می‌شود. بعد از شستشو، قرارگیری در اتانول، آبگیری و خشک کردن، سایبر گرین[27] جهت رنگ آمیزی زیر نور زرد استفاده شده و با میکروسکوپ فلورسنت (×۴۰۰) بررسی می‌شوند. بطور متوسط ۳۰ سلول بطور تصادفی انتخاب و با نرم افزار SlideBook 4.1 software آنالیز می‌شوند.  ( به دلیل حساسیت بیشتر، تست ارزیابی H2AX با کیت و به روش کالریمتریک الیزا جایگزین COMET ASSAY میشود).

• توزیع مکانی داخل سلولی نانوذرات

سلولها در پتری دیش‌های 100 cm2 با تراکم 8.0 × 10⁵ در دیش به مدت 48 ساعت کشت داده می‌شوند. در ادامه با نانوذرات به مدت 24 ساعت تیمار می‌شوند. بعد از شستشو و آبگیری، سلول ها در رزین قرار می‌گیرند. اسلایدهایی با ضخامت ۸۰نانومتر تهیه و بعد از رنگ آمیزی با اورانیل استات و سیترات، با میکروسکوپ الکترونی و یا ICP-MS بررسی می‌شوند [13].

• ارزیابی پروتئین

غلظت پروتئین کل با روش بردفرد[28] اندازه‌گیری میشود. BSA [29]بعنوان استاندارد در نظر گرفته می‌شود [18].

(لازم به ذکر است که در هر کدام از اندازه‌گیری‌ها، در صورت نیاز روش و مواد مورد استفاده می‌توانند تغییر کنند.)

• بخش کار روی حیوانات

32 موش صحرایی نر بالغ Sprague-Dawley (میانگین وزن 250-300 گرم) از مرکز آزمایشگاه حیوانات دانشگاه علوم پزشکی زابل خریداری میشوند. موش ها در اتاق استاندارد در درجه حرارت (23 درجه سانتیگراد) و چرخه های طبیعی روشنایی/تاریکی و در تهویه مناسب نگهداری می شوند. اتاق حیوانات دسترسی رایگان به آب لوله کشی و رژیم غذایی مناسب در طول آزمایش دارند. تجویز داروی خوراکی و هندلینگ حیوانات با رعایت

دستورالعمل مراقبت و استفاده از جوندگان آزمایشگاهی بر اساس گایدلاین انتشارات NIH (شماره 85-23) انجام میشود. قبل از گاواژ، حیوانات به طور تصادفی به دو گروه مساوی تقسیم میشوند: گروه کنترل (بدون مداخله) و گروه تیمار که بصورت وریدی نانوذره با دوز 20 میکروگرم بر میلی لیتر )  [(Au): 1 mM, (Fe): 2 mM, 0.2 ml] دریافت میکنند(19). بعد از 24 ساعت، نمونه خون جمع آوری شده از قلب سانتریفیوژ میشود تا سرم جدا شود.

• ارزیابی پارامترهای شیمیایی

سطح سرمی BUN (نیتروژن اوره خون) و کراتینین با توجه به دستورالعمل کیت اندازه گیری میشود. تمام تجزیه و تحلیل های بیوشیمیایی با استفاده از آنالیز کننده Selectra Pro M ، (Vital Scientific ،

هلند) انجام میشود. برای ارزیابی سطح سرمی آسپارتات آمینوترانسفراز (AST) و آلانین آمینوترانسفراز

سطوح (ALT) از روش رنگ سنجی استفاده میشود. فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدان درون زا نظیر فعالیت کاتالاز  CATدر سرم و بافت کبدی از طریق روش گوتی ( 20) اندازه گیری میشود. سوپراکسید سرم فعالیت دیسموتاز SOD در نمونه های سرم با استفاده از روش توصیف شده توسط Sun و همکاران ، با برخی تغییرات اندازه گیری میشود 21) .

• ارزیابی پراکسیداسیون لیپیدی

بررسی سطح مالوندآلدئید MDA در کلد ب روش Ohkawa و همکاران انجام میشود( 22).

• ارزیابی هیستوپاتولوژیک

بعد از تیمار رتها با نانوذرات، بیهوشی با پنتوباربیتول انجام شده و بعد از کشتن رتها، بافت کلیه و کبد برای ارزیابی های بافت شناسی استخراج و پردازش میشوند. فیکساسیون در بافر فرمالین به مدت دو روز انجام میشود. در ادامه نمونه های پارافینی تهیه و رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین  و ارزیابی زیر میکروسکوپ نوری انجام میشود.

روش تحلیل و توصیف داده‌ها (نمونه‌ای از جدول توخالی ضمیمه شود و روش های آماری مورد استفاده به طور کامل توضیح داده شود):

  داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار (در صورت لزوم میانگین ± انحراف میانگین) بیان می‌شوند. هر تست بصورت تکرار سه تایی انجام میشود و میانگین حاصله مورد آنالیز آماری قرار میگیرد.

برای تجزیه و تحلیل آماری، گروههای تیمار و کنترل مقایسه می‌شوند. بدین منظور تجزیه و تحلیل آنالیز واریانس یک طرفه One0way ANOVA  برای مقایسه‌ی میانگین بیش از دو گروه، و  تی تست t-test  برای مقایسه‌ی میانگین دو گروه، با نرم افزار SPSS  انجام می‌شود. برای رسم نمودار از نرم افزار Graphpad prism استفاده می‌شود.

p <0.05 یابرابر 0.05 از نظر آماری نشانگر معنی دار بودن اختلاف در بین گروهها است.

راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی ایران (کدهای 1 و 2و 3و 8)

1- پژوهشگر باید به این امر مهم توجه داشته باشد که بافت‌ها و اعضای مورد استفاده، دارای منشأ انسانی‌اند و کرامت انسانی اقتضا می‌کند که جمع‌آوری، نگه‌داری، استفاده و نابودسازی آن‌ها توأم با رعایت ملاحظات و شؤون مرتبط باشد.

2- از اجزای بدنی دارای منشأ انسانی باید تنها در پژوهش‌هایی استفاده شود که اهداف ارزشمندی را در راستای مبارزه با بیماری‌ها و ارتقای سلامت انسان‌ها دنبال می‌کنند.

3- تمامی پژوهش‌ها بر روی عضو و بافت انسانی، پیش از اجرا، باید مورد تأیید کمیته‌ی اخلاق در پژوهش مرتبط قرار گیرد. کمیته‌ی اخلاق در پژوهش حق دارد که در تمامی مراحل پژوهش بر آن نظارت داشته باشد. پژوهشگران باید در این زمینه با کمیته‌ی اخلاق در پژوهش همکاری کنند.

8- پژوهشگر باید از اعضاء و بافت‌هایی که به منظور پژوهش در اختیار او قرار می‌گیرد استفاده‌ی بهینه کرده، از هدر رفتن آن‌ها جلوگیری کند

راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش‌های علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی  در جمهوری اسلامی ایران (کدهای 1و 9 و 11 و 28 و 29و 30 و 31)

1-هدف اصلی هر پژوهش‌باید ارتقای سلامت انسان‌ها توأم با رعایت کرامت و حقوق ایشان باشد.

9-در پژوهش‌های پزشکی که ممکن است به محیط زیست آسیب برسانند، باید احتیاط‌های لازم در جهت حفظ و نگهداری و عدم آسیب رسانی به محیط ریست انجام گیرد.

11-کمیته‌ی اخلاق در پژوهش علاوه بر بررسی و تصویب طرح‌نامه و دستورالعمل، این حق را دارد که طرح‌‌ها را در حین و بعد از اجرا را از نظر رعایت ملاحظات اخلاقی مورد پایش قرار دهد. اطلاعات و مدارکی که برای پایش از سوی کمیته‌ی اخلاق درخواست می‌شود، باید از سوی پژوهشگران در اختیار این کمیته گذاشته شود.   

28- پژوهشگران موظفند که نتایج پژوهش‌های خود را صادقانه ، دقیق، و کامل منتشر کنند. نتایج، اعم از منفی یا مثبت، و نیز منابع تأمین بودجه، وابستگی  سازمانی، و تعارض منافع – در صورت وجود – باید کاملاً آشکارسازی شوند. پژوهشگران نباید در هنگام عقد قرارداد انجام پژوهش، هیچ  گونه شرطی را مبنی بر حذف یا عدم انتشار یافته‌هایی که از نظر حمایت کننده‌ی پژوهش  مطلوب نیست، بپذیرند.

29-نحوه‌ی گزارش نتایج پژوهش باید ضامن حقوق مادی و معنوی تمامی اشخاص مرتبط با پژوهش، از جمله خود پژوهشگر یا پژوهشگران، آزمودنی‌ها و مؤسسه‌ی حمایت کننده‌ی  پژوهش باشد.

30-گزارش‌ها و مقالات حاصل از پژوهش‌هایی که مفاد این راهنما را نقض کرده‌اند، نباید برای انتشار پذیرفته شوند.

31-روش پژوهش نباید با ارزش‌های احتماعی، فرهنگی و دینی  جامعه در تناقض باشد.

بر اساس گایدلاین اخلاقی تمام ملاحظات اخلاقی در نگهداری و کار با حیوانات آزمایشگاهی در تمام مراحل:

• نگهداری
• تیمار
• نمونه گیری رعایت میشود.

تهیه کیتهای اختصاصی

تجهیزات  آزمایشگاهی

میکروسکوپ الکترونی  TEM  و میکروسکوپ فاز کنتراست و یا ICP-MS برای بررسی لوکالیزاسیون  نانوذرات

(در بررسی با میکروسکوپ، به دلیل عدم دسترسی و ... نوع روش میتواند تغییر کند)

نانوذرات متشکل از هسته اکسیدآهن-پوسته طلا حاوی کنژوگه های اسید فولیک، آنزیم های دخیل در استرس اکسیداتیو

1.           Abbasalipourkabir, R., et al., Toxicity of zinc oxide nanoparticles on adult male Wistar rats. 2015. 84: p. 154-160.

2.           Baati, T., et al., In depth analysis of the in vivo toxicity of nanoparticles of porous iron (III) metal–organic frameworks. 2013. 4(4): p. 1597-1607.

3.           Abed, Z., et al., Iron oxide–gold core–shell nano-theranostic for magnetically targeted photothermal therapy under magnetic resonance imaging guidance. 2019: p. 1-7.

4.           Hosseini, V., et al., Multimodal cancer cell therapy using Au@ Fe2O3 core–shell nanoparticles in combination with photo-thermo-radiotherapy. 2018. 24: p. 129-135.

5.           Müller, K., et al., Effect of ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles (Ferumoxtran-10) on human monocyte-macrophages in vitro. 2007. 28(9): p. 1629-1642.

6.           Li, Y., et al., Self-targeted, shape-assisted, and controlled-release self-delivery nanodrug for synergistic targeting/anticancer effect of cytoplasm and nucleus of cancer cells. 2015. 7(46): p. 25553-25559.

7.           Samadian, H., et al., Folate-conjugated gold nanoparticle as a new nanoplatform for targeted cancer therapy. 2016. 142(11): p. 2217-2229.

8.           Mirrahimi, M., et al., Selective heat generation in cancer cells using a combination of 808 nm laser irradiation and the folate-conjugated Fe2O3@ Au nanocomplex. 2018. 46(sup1): p. 241-253.

9.           Hadi, F., et al., Combinatorial effects of radiofrequency hyperthermia and radiotherapy in the presence of magneto‐plasmonic nanoparticles on MCF‐7 breast cancer cells. 2019.

10.         Li, H., et al., Effects of waterborne nano-iron on medaka (Oryzias latipes): antioxidant enzymatic activity, lipid peroxidation and histopathology. 2009. 72(3): p. 684-692.

11.         Melegari, S.P., et al., Evaluation of toxicity and oxidative stress induced by copper oxide nanoparticles in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. 2013. 142: p. 431-440.

12.         Heng, B.C., et al., Toxicity of zinc oxide (ZnO) nanoparticles on human bronchial epithelial cells (BEAS-2B) is accentuated by oxidative stress. 2010. 48(6): p. 1762-1766.

13.         Lin, W., et al., Toxicity of nano-and micro-sized ZnO particles in human lung epithelial cells. 2009. 11(1): p. 25-39.

14.         Ryu, J.H., et al., Theranostic nanoparticles for future personalized medicine. 2014. 190: p. 477-484.

15.         Lin, W., et al., In vitro toxicity of silica nanoparticles in human lung cancer cells. 2006. 217(3): p. 252-259.

16.         Skehan, P., et al., New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening. 1990. 82(13): p. 1107-1112.

17.         Wang, H., J.A.J.F.R.B. Joseph, and Medicine, Quantifying cellular oxidative stress by dichlorofluorescein assay using microplate reader. 1999. 27(5-6): p. 612-616.

18.         Bradford, M.M.J.A.b., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. 1976. 72(1-2): p. 248-254.

مطالعه‌ی حاضر، نیاز به نمونه‌ی انسانی  نداشته، و در رده‌ی سلولی انجام می‌شود. 

لذا نیاز به پرسشنامه ندارد.