بررسی سرولوژی و ملکولی انگل توکسوپلاسما گوندی در زنانی که سقط خود به خودی داشته اند در شهر زاهدن در سال 1399

توکسوپلاسموز نوعی عفونت انگلی است که توسط Toxoplasma gondii ایجاد می شود و علائم بالینی متنوعی دارد. توکسوپلاسما گوندی تک یاخته ای از شاخه اپی کمپلکس ها،زیر شاخه اسپروزوآ،زیر رده کوکسیدیا و متعلق به جنس توکسوپلاسما می باشد. این تک یاخته یک انگل داخل سلولی اجباری،مشترک بین انسان و حیوانات است .گربه میزبان نهایی و پستانداران و پرندگان نقش میزبان واسط را دارند .[1, 2]توکسوپلاسما می تواند از طریق خوردن ااوسیستهای موجود درغذا یا آب و توسط مصرف کیستهای بافتی موجود در گوشت خام یا نپخته به اشخاص انتقال یابد که گوشت خوک مهمترین منبع گوشتی از نظر توکسوپلاسما گوندی در ایالت متحده وگوشت بره مهمترین منبع در سراسر جهان است[3]. همچنین عفونت با این انگل در نتیجه خوردن آب و سبزیجات آلوده به مدفوع گربه نیز رخ می دهد[4].

اغلب ایزوله های جدا شده توکسوپلاسما گونـدای از منـابع انسانی و حیوانی در 3 گروه ژنـوتیپی I ،II و III دسـته بندی شده اند. تفاوتهای بیولوژیکی چشـمگیری میـان تیپ سویه های مختلف توکسوپلاسما گوندای مشاهده گردیده، بطوریکه تیپ I برای موشهـا کشـنده ولـی تیپهای II و III ،حدت کمتری دارند. تیپII به عنـوان عامــل اصــلی مانــدگاری عفونــت در گوســفند و بــز شناسایی شده و بیشترین عفونتهای انسـانی نیـز در ارتبـاط بـا همـین تیـپ مـیباشـند. ژن B1  با 35 کپی در بین تمام گونه های توکسوپلاسما حفظ شده است و  دارای حساسیت واختصاصیت بالاتری در تشخیص توکسوپلاسما می باشد. مارکرهای مختلفی جهت ژنوتایپینگ توکسوپلاسما استفاده می شود ازجمله DNAریبوزومال IGS,ریبوزومال ولوکوس های ژنی دیگرشامل SAG1،آنتی ژنهای گرانولی خشن(GRA4)  و ژن بتا توبولین. عمدتا از GRA6 که دارای یک کپی در ژن توکسوپلاسما می باشد جهت تعیین گونه های توکسوپلاسما استفاده می شود. [5]. 

تخمین زده میشود که حدود یک سوم مردم جهان در سرم خون خود دارای آنتی بادی ضد توکسوپلاسما گوندی هستند ، بدین معنی که با انگل توکسوپلاسما آلوده شده اند.  در ایران در یک مطالعه سرواپیدمیولوژی در 12 استان کشور با استفاده از روش ایمنوفلورسانس غیر مستقیم ( IFA ) مشخص گردید که به طور متوسط 8/51 درصد افراد دارای سرم مثبت در مقابل آنتی ژن توکسوپلاسما بودند[6]. تفاوت های آشکار بین میزان شیوع توکسوپلاسموز در مناطق مختلف به دلیل پراکندگی جغرافیائی آب و هوا یا رژیم و عادات غذایی بر عامل بیماری است، چرا که توکسوپلاسموز در نواحی خشک کمترین شیوع و در نواحی گرم و مرطوب بالاترین شیوع را دارد[7].

تظاهرات بیماری به صورت توکسوپلاسموز اکتسابی ، مادرزادی و در افراد نقص سیستم ایمنی رخ میدهد

 افرادی که مبتلا به بیماری های تضعیف کننده سیستم ایمنی هستند. در این گروه معمولا افرادی قرار دارند که مبتلا به ویروس HIV هستند. در این افراد به دلیل رشد زیاد انگل در بدن و عدم توانایی سیستم ایمنی در متوقف ساختن آن، علائم بالینی ظاهر می شود که میتوان به علائم عصبی شدید، تشنج، فلجی، کما و مرگ حتی با وجود اقدام به درمان، اشاره کرد[8].

 توکسوپلاسموز مادرزادی ، با شیوع 5-1 در هر1000 حاملگی رخ می دهد و بر اساس سن جنین در زمان ابتلاء مادر و وجود یا عدم وجود آنتی بادی ضد توکسوپلاسما در بدن مادر ،عوارض گوناگونی را به دنبال دارد اکثریت نوزادان در حین تولد نشانه های بالینی را نشان نمی دهند و به مرور زمان این علائم شکل میگیرد.

 هنگامی که یک زن برای اولین بار در دوران بارداری فرم های الوده کننده انگل را میخورد یا مبتلا به فرم های الوده کننده انگل میشود ، فرم تاکی زوئیت در سراسر بدن از طریق خون پخش می شوند. جنین نیز از طریق جفت به این انگل الوده میشود  . عفونت مادر قبل از بارداری به ندرت جنین را در معرض خطر قرار می دهد. بنابراین توکسوپلاسموز مادرزادی عموماً هنگامی رخ می دهد که مادر در دوران بارداری به تازگی به توکسوپلاسما مبتلا شود که می تواند منجر به عفونت های مختلفی در جنین مانند سقط جنین ، زایمان و تولد زنده کودک با علائم کلاسیک توکسوپلاسموز مانند هیدروسفالی ، میکروسفالی ، کلسیفیکاسیون مغزی و کوریورتینیت میشود خطر انتقال پس از عفونت اولیه از 25٪ (در سه ماهه اول) تا 65٪ (در سه ماهه آخر) متغیر است. با این حال ، جنین های جوان بیشتر مستعد ابتلا به این عفونت هستند. در ایران میزان سقط جنین در نتیجه توکسوپلاسموز ناشناخته است. اکثر مطالعات انجام شده در مورد سقط جنین ، که مشکوک به نتیجه توکسوپلاسما است ، براساس یافته های سرولوژیکی در مورد مادران انجام شده است [4].

در مطالعهRahmati-Balaghaleh     و همکاران در سال 2019 ، روی 208 زن باردار در جنوب شرق ایران بیان کردند تقریباً 60٪ از زنان باردار از خطرات ناشی از توکسوپلاسما گوندی در امان نبودند. بنابراین ، این گروه در معرض ابتلا به عفونت اولیه توکسوپلاسموز در حین بارداری هستند[9].

در مطالعه J. Saki و همکارانش در سال 2015 بررسی سرولوژی با روش الایزا از سرم 130 زن با سقط جنین و 130 زن مبتلا به زایمان طبیعی برای آنتی بادی های IgG و IgM ضد توکسوپلاسما گوندی انجام شد و نشان داد که 6/24٪ از نمونه ها با سقط جنین و 5/21٪ نمونه ها با زایمان طبیعی از نظر آنتی بادی IgG مثبت بودند. اما ، تجزیه و تحلیل آماری تفاوت معنی داری  را نشان نداد [10].

در مطالعه Nasir Arefkhah و همکاران در سال 2019 روی زنان باردار مبتلا به سقط خودبخودی در جنوب غربی ایران و با استفاده از روشهای سرولوژی و مولکولی انجام شده است. روش الایزا ، Real-Time PCR و روش PCR معمول ، شیوع T. gondii را  با استفاده از این روشها به ترتیب در 10٪ ، 3٪ و 2٪ از زنان باردار شناسایی کردند . میزان شیوع آنتی بادی T. gondii در این مطالعه نشان داد که 7٪ از خانمهای باردار که از نظر IgG از نظر خون مثبت بودند ،توسط روشهایی ملکولی نیز مثبت شدند . این به طور عمده نشان دهنده قرار گرفتن در معرض قبلی از توکسوپلاسما در موارد مثبت از نظر خطر بدون توکسوپلاسموز مادرزادی در افراد دارای نقص ایمنی است[11].

مطالعه Somaie Matin و همکارانش  با هدف آزمایش PCR جهت شناسایی عفونتهای اخیر با توکسوپلاسما در زنان باردار در سنین مختلف حاملگی مراجعه کننده به بخش زنان و زایمان بیمارستان علوی اردبیل طی سالهای 2014 و 2016 انجام شد. درمجموع ، 16 بیمار در هر دو روش ELISA و PCR نتایج مثبتی داشتند و 174 مورد نتایج منفی برای عفونت جدید داشتند. نشان داد که T. gondii ممکن است یکی از عوامل مهم منجر به سقط جنین باشد ، و اینکه تجزیه جفت می تواند برای دستیابی به افزایش حساسیت مهم باشد[12].

در مطالعه Asgari, Q. و همکارانش (2013) نشان داد  که با توجه به میزان بالای آلودگی توکسوپلاسما در جنین های سقط شده در این مطالعه ، توکسوپلاسما  میتواند تا حد زیادی در سقط خود به خود ی نقش داشته باشد[13].

 در مطالعه Badr MS و همکارانش(2016)  هدف شناسایی نوع ژنوتایپ احتمالی توکسوپلاسما گوندی  از نظر مولکولی در نمونه های جفت زنانی که حاملگی آنها تشخیص داده شده و در سه ماهه اول به طور خودجوش خاتمه یافتند(دارای سقط)، بودند. ژنوتیپ های توکسوپلاسما I و II شناسایی شدند ، در حالی که نوع III در نمونه ها تشخیص داده نشده است [4].

Leila Danehchin و همکارانش(2016) در مطالعه مولکولی بر روی جنین های سقط شده در استان خراسان رضوی ، ایران و تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک نشان داد که همه نمونه های جدا شده به تیپ I مرتبط بودند[14].

Abdel-Hameed (2008) ژنوتیپ توکسوپلاسما را در سی و هشت بیمار زن مبتلا به سقط جنین و مرگ جنین داخل رحمی در مصر با استفاده از روش PCR-RFLP در محل SAG2 ارزیابی کرد. از 38 جدایه ، نوع II شایع ترین ژنوتیپ موجود در 33 مورد (87٪) و نوع I در 5 مورد (13٪) جدایه ها مشاهده شد[15].

با توجه به اینکه توکسوپلاسما گوندی در سقط جنین نقش دارد و میزان سقط جنین ناشی از توکسوپلاسما مادرزادی در بسیاری از مناطق که میزان توکسوپلاسموز اکتسابی زیاد است ،نامشخص میباشد همچنین با توجه به میزان بالای باروری در این استان و علائم نامشخص سقط در این منطقه ،انجام این مطالعه با فقدان چنین اطلاعاتی در این زمینه قابل توجیه است.

با توجه به حساسیت و اختصاصیت بررسی ملکولی توکسوپلاسما زنان با سابقه سقط ، علاوه بر شناسایی قطعی موارد مثبت در زنان با سابقه سقط و عامل سقط، میتوان به درصد اختلاف بین ازمایشات سرولوژی و ملکولی پی برد .

مطالعه حاضر با هدف بررسی سرولوژی و مولکولی از نظر ژنوتایپینگ توکسوپلاسما گوندی در زنانی که سابقه سقط خود به خودی داشته اند در زاهدان  پیشنهاد میشود .

​​

1. میزان تیتر آنتی بادی  ,IgG Avidity IgG  و    IgMضد توکسوپلاسما گوندی در زنان که سابقه سقط خود به خودی داشته اند، چقدر است؟
2. فراوانی موارد مثبت آنتی بادی  ,IgG Avidity IgG  و    IgMضد توکسوپلاسما در زنان که سابقه سقط خود به خودی داشته اند، چقدر است؟
3.  فراوانی ژن  B1 توکسوپلاسما  گوندی در زنان که سابقه سقط خود به خودی داشته اند ، چقدر است؟
4. فراوانی ژنوتایپ ( I,II,III  ) توکسوپلاسما گوندی  با استفاده از ژن GRA6در در زنان که سابقه سقط خود به خودی داشته اند،  چقدر است؟

بررسی سرولوژی و مولکولی توکسوپلاسما گوندی در زنانی که با  سقط خود به خودی به بیمارستان علی ابن ابیطالب زاهدان در سال 1399 مراجعه کرده اند.

1. تعیین میزان تیتر آنتی بادی  ,IgG Avidity IgG  و    IgMضد توکسوپلاسما گوندی در زنان که سابقه سقط خود به خودی داشته اند
2. تعیین فراوانی موارد مثبت آنتی بادی  ,IgG Avidity IgG  و    IgMضد توکسوپلاسما در زنان که سابقه سقط خود به خودی داشته اند
3. تعیین فراوانی ژن  B1 توکسوپلاسما  گوندی در زنان که سابقه سقط خود به خودی داشته اند (تعیین فراوانی موارد مثبت توکسوپلاسما گوندی بر حسب ژن B1 با استفاده از ازمایش PCR در زنانی که سابقه سقط خودبخودی داشته اند )
4. تعیین انواع ژنوتایپ ( I,II,III  ) توکسوپلاسما گوندی  با استفاده از ژن GRA6در زنان که سابقه سقط خود به خودی داشته اند

مراکز تحقیقاتی و درمانی

توکسوپلاسما گوندی تک یاخته ای از شاخه اپی کمپلکس ها،زیر شاخه اسپروزوآ،زیر رده کوکسیدیا و متعلق به جنس توکسوپلاسما می باشد.این تک یاخته یک انگل داخل سلولی اجباری،مشترک بین انسان و حیوانات است .

IgG avidity : یکی از روشهای شناسایی مراحل حاد عفونت توکسوپلاسما استفاده از تست Anti-Toxoplasma IgG avidity  است. بعضی مواقع به دلایل مختلف ارزیابی IgM Anti-Toxoplasma صرفا برای مراحل حاد توکسوپلاسما گوندی مفید نیست که از آن جمله می توان به پاسخ های طولانی مدت کلاس IgM، تاخیر در تولید این آنتی بادی و یا پاسخ های غیر اختصاصی پلی کلونال گوناگون نام برد. در سال های اخیر کشف روش IgG avidity در بررسی عفونت های اخیر با انگل توکسوپلاسما گوندی راهکاری مناسب برای این موضوع است که فقط به ارزیابی آنتی بادی از کلاس IgG می پردازد. در اوایل عفونت IgG تولید شده اویدیتی یا تمایل کمی در اتصال به آنتی ژن دارد (Low avidity) و با ادامه عفونت تمایل آنتی بادی مذکور برای آنتی ژن انگل توکسوپلاسما افزایش می یابد و در حالت اویدیتی بالا (High avidity) قرار می‌گیرد که نشانه عفونت طولانی مدت می‌باشد که از این حالت برای تفکیک عفونت حاد از مزمن توکسوپلاسما در موارد بیماری مخصوصا در مادران باردار می‌توان سود جست.

GRA6:   گرانولهای فشرده اندامک های دفعی ترشحی هستند که در حفظ و بقای انگل در حفره پارازیتوفوروس اکثر سلول های هسته دار میزبان نقش دارند. در این پژوهش تشخیص تیپ های مختلف توکسوپلاسما با استفاده از ژن GRA6 که ژنی تک کپی است و پلی مورفیسم بالایی را نسبت به ژنهای دیگر توکسوپلاسما نشان می دهد.

توصیفی مقطعی

معیار ورود : زنان با  سقط خودبه خودی طی چند روز گذشته که در 3 ماهه اول بارداری به بیمارستان مراجعه کرده اند و به صورت داوطلبانه در مطالعه شرکت کردند .

معیار خروج: زنانی که مدت زیادی از سقط انها گذشته باشد و همچنین در ماههای نخست دچار سقط نشده اند.

با توجه به میزان افراد بیمارمراجعه کننده و همچنین با توجه به حجم نمونه سایر مقالات، حجم نمونه 100 نفر زن با سقط خودبه خودی در نظر گرفته شده است و در صورتی افراد بیشتری در دسترس باشند  و هزینه های طرح این امکان را بدهد حجم نمونه  به 150 نفر افزایش می یابد.

دردسترس بر اساس معیارهای ورود و خروج

مشاهده و بررسی های آزمایشگاهی و فرم اطلاعاتی

فرم اطلاعاتی به صورت شفاهی از افراد داوطلب دارای معیار ورود به مطالعه پرسیده میشود و فرم رضایت اگاهانه در مورد اخذ نمونه های خون با امضاء از افراد داوطلب دارای معیار ورود به مطالعه تهیه میشود

پس از شناسایی زنان با  سقط خودبه خودی  در 3ماهه اول بارداری  ، 4 mlنمونه ی خون جمع آوری و سرم این زنان  از نظر آنتی بادی های ضد توکسوپلاسما  با استفاده از ازمایشات سرولوژی الیزا مورد ارزیابی قرار میگیرد .با استفاده از روش دستی استخراج  DNA  از نمونه خون  انجام شده، سپس پرایمرهای اختصاصی برای ژن  B1برای تایید  اینکه فرد توکسوپلاسما  مثبت یا منفی است طراحی میگردد،شرایط PCR بهینه سازی میشود و در صورت مثبت بودن نمونه از نظر توکسوپلاسما ، پرایمرهای اختصاصی برای ژن GRA6 طراحی میگردد و PCR  دوم انجام شود و سپس توالی یابی  انجام میگردد و توالی نوکلئوتید ها با استفاده از نرم افزار Chormas نسخه 5 ویرایش و با استفاده از پایگاه داده BLAST هم تراز شده در ادامه با داده های ژن بانک مقایسه میشود و ژنوتایپها مشخص میگردد.

داده ها در فرم های اطلاعاتی مربوطه ثبت می گردد؛ آنگاه اطلاعات جهت توصیف داده ها وارد نرم افزارSPSS  می شود و محاسبه توزیع فراوانی و در صد و میانگین و انحراف معیار بیان خواهد شد.

با رضایت کامل از بیماران نمونه‌گیری می‌شود و تعهد می‌شود نام و مشخصات بیماران در هیچ گزارشی قید نشود. انجام آزمایشات هیچگونه هزینه‌ای برای بیمار نخواهد داشت

کدهای 1,2,3,8,9,10,11,13,15.18.25.28  از مصوبات کمیته کشوری اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی دارای ازمودنی انسانی وکدهای 1و2و3و4و7 از راهنمای اخلاقی پژوهش در روی عضو وبافت انسانی  و همچنین کدهای 5,6,10,11,13,14 راهنمای اخلاقی پژوهشهای ژنتیک
پزشکیدر این طرح رعایت خواهد شد.

عدم رضایت بیمار در ورود به مطالعه

توکسوپلاسما گوندی , سقط خود به خودی,سرولوژی-ملکولی, ژنوتایپ

1.            Mesquita, R.T., et al., Real-time quantitative PCR in cerebral toxoplasmosis diagnosis of Brazilian human immunodeficiency virus-infected patients. J Med Microbiol, 2010. 59(Pt 6): p. 641-7.

2.            Dubey, J.P., Strategies to reduce transmission of Toxoplasma gondii to animals and humans. Vet Parasitol, 1996. 64(1-2): p. 65-70.

3.            Jauregui, L.H., et al., Development of a real-time PCR assay for detection of Toxoplasma gondii in pig and mouse tissues. J Clin Microbiol, 2001. 39(6): p. 2065-71.

4.            Badr, M.S., et al., GENETIC POLYMORPHISM OF TOXOPLASMA GONDII FROM RECENTLY INFECTED ABORTED EGYPTIAN WOMEN. J Egypt Soc Parasitol, 2016. 46(1): p. 49-55.

5.            Nourmohammadi M, H.H., Tabandeh MR, Goraninejad S, Bahrami S, Genotyping of Zoonotic Toxoplasm gondii Isolated from Aborted  GRA6 Molecular MarkersFetuses of Ewes of Lorestan Province Based on SAG2 ،SAG3 and GRA6 Molecular Markers. Journal of Ardabil University of Medical Sciences, 2017. 17(3): p. 343-352.

6.            Assmar, M., et al., [Toxoplasmosis in Iran. Results of a seroepidemiological study]. Bull Soc Pathol Exot, 1997. 90(1): p. 19-21.

7.            Swierzy, I.J., et al., Toxoplasma gondii within skeletal muscle cells: a critical interplay for food-borne parasite transmission. Int J Parasitol, 2014. 44(2): p. 91-8.

8.            Ueno, N., et al., Toxoplasma gondii-infected natural killer cells display a hypermotility phenotype in vivo. Immunol Cell Biol, 2015. 93(5): p. 508-13.

9.            Mansour Rahmati-Balaghaleh, B.R.H.F., Mehdi Zarean, Saeed Hatami-Pourdehno, Hadi Mirahmadi, Lida Jarahi, Yousef Sharifi, Omid Ahmadi, Seyed Aliakbar Shamsian, Elham Moghaddas & Seyed Mohammad Hashemi Shahri Diagnosis of acute toxoplasmosis by IgG avidity method in pregnant women referred to health centers in south-eastern Iran. Journal of Parasitic Diseases 2019. 43: p. 517-521.

10.          Saki, J., et al., Seroprevalence of Toxoplasma gondii in women who have aborted in comparison with the women with normal delivery in Ahvaz, southwest of Iran. ScientificWorldJournal, 2015. 2015: p. 764369.

11.          Arefkhah, N., et al., Molecular genotyping and serological evaluation of Toxoplasma gondii in mothers and their spontaneous aborted fetuses in Southwest of Iran. Comp Immunol Microbiol Infect Dis, 2019. 66: p. 101342.

12.          Matin, S., et al., Comparison of Placenta PCR and Maternal Serology of Aborted Women for Detection of Toxoplasma gondii in Ardabil, Iran. Korean J Parasitol, 2017. 55(6): p. 607-611.

13.          Asgari, Q., et al., Molecular Genotyping of Toxoplasma gondii in Human Spontaneous Aborted Fetuses in Shiraz, Southern Iran. Iran J Public Health, 2013. 42(6): p. 620-5.

14.          Danehchin, L., G. Razmi, and A. Naghibi, Isolation and Genotyping of Toxoplasma gondii Strains in Ovine Aborted Fetuses in Khorasan Razavi Province, Iran. Korean J Parasitol, 2016. 54(1): p. 15-20.

15.          Abdel-Hameed, D.M. and O.M. Hassanein, Genotyping of Toxoplasma gondii strains from female patients with toxoplasmosis. J Egypt Soc Parasitol, 2008. 38(2): p. 511-20.

بررسی سرولوژیک توکسوپلاسما گوندی در زنانی که سابقه سقط خود به خودی داشته اند با تاکید بر آنالیز فیلوژنیک در شهر زاهدان

دارد

بررسی سرولوژی و مولکولی از نظر ژنوتایپینگ و رسم درخت فیلوژنیک توکسوپلاسما گوندی در  زنانی که سابقه سقط خود به خودی داشته اند در زاهدان  

ندارد

ندارد

بر عهده مجری طرح است

ندارد

نام بیمار محرمانه است 

در زمان نمونه گیری و پس از حصول نتیجه به پرسشها پاسخ داده می شود

دارند

رضایت اگاهانه از بیمار گرفته می شود

کد بیمار                                                                 :تاریخ:

1. نام و نام خانوادگی:
2. سن بر حسب سال: 
3. محل سکونت:       

   □شهری        □روستایی         

4. میزان تحصیلات:

        □ بیسواد        □ ابتدایی    □ زیر دیپلم         □ دیپلم    □ دانشگاھی

5. قومیت:                

   □ فارس      □ بلوچ           □ سایر    

6. آیا از آب تصفیه شده مصرف می کنید؟                □ بلی            □ خیر
7. آیا گوشت نیم پز مصرف می کنید :                       □ بلی            □ خیر

□ یک بار در هفته          □ کمتر از 1-3 بار در ماه

8.  آیا سبزیجات خام مصرف می کنید :                      □ بلی            □ خیر

□یک بار در هفته           □کمتر از 1-3 بار در ماه 

9. آیا تماس با خاک داشته اید :                                  □ بلی            □ خیر
10. آیا تماس با گربه داشته اید :                                    □ بلی            □ خیر
11. آیا سابقه سقط داشته اید :                                       □ بلی            □ خیر 
12. بارداری چندم است؟
13. تعداد فرزندان؟