مقایسه فراوانی پلی‌مورفیسم‌های rs10754558 و rs4612666 ژن NLRP3 در خون مادر و جفت ومیزان بیان ژن NLPR3 در جفت زنان باردار مبتلا به پره‌اکلامپسی و گروه کنترل

بیان مسئله تحقیق (مشتمل بر مرور تحقیقات گذشته داخلی وخارجی مرتبط با موضوع با ذکر منابع و توجیه ضرورت انجام طرح) :

پره اکلامپسی(PE) یک سندروم خاص دوران بارداری است که به عنوان یکی از علل مهم و عمده مرگ و میر مادر و نوزاد در سرتاسر جهان معرفی گردیده است.PE یک عارضه چند سیستمی است که 3 تا 5 درصد زنان باردار سراسر جهان را تحت تأثیر قرار می دهد. دارای شیوع% 5-2 در کشورهای توسعه یافته و شیوع 10% در کشورهای در حال رشد می باشد. و بروز آن در هر منطقه جغرافیایی متفاوت است(1, 2).

 این بیماری پس از هفته بیستم حاملگی رخ می دهد و بصورت فشارخون برابر یا بیشتر ازmmhg  90/140 به همراه پروتئینوری (1≥+ در تست نواری) دیده می شود. بطوریکه وجود 300 mg یا بیشتر پروتئین در ادرار 24 ساعته و یا حضور پابرجای 30mg/dl پروتئین در نمونه تصادفی ادرار به همراه فشارخون ذکر شده دال بر وجود PE است (3).تفاوت پره اکلامپسی با فشارخون حاملگی ،بالا بودن فشارخون بعد از هفته 20 حاملگی بدون وجود پروتئین در ادرار می باشد.در صورتیکه در مراحل بعد وجود پروتئین در ادرار باعث می شود که تشخیص به PE تغییر کند (4).

این وضعیت تقریبأ در یک چهارم زنانی که در ابتدا تشخیصشان فشارخون حاملگی است دیده می شود. علایم دیگر به صورت چند سیستمی بروز می کند مانند: سردرد شدید، ادم، نقص کبدی، نقص در هموستاز، HELLP  (همولیز، سندروم افزایش فعالیت آنزیم های کبدی و کاهش میزان پلاکت). (5)

مطالعات اپیدمیولوژیک نشان می دهد که ارتباطی بین پره‌اکلامپسی و افزایش خطر ابتلا به بیماری های قلبی – عروقی و سندرم متابولیک در زنان در سنین پیری وجود دارد(5).

در مطالعات نشان داده شده که پره‌اکلامپسی و اکلامپسی با خطر سندرم مرگ ناگهانی شیر خوار همراه است(5).

عوامل خطر پره اکلامپسی  شامل بیماری کلیوی مزمن، فشار خون مزمن، سابقه خانوادگی پره اکلامپسی، حاملگی چند قلو، شریک جنسی جدید، سن مادرکمتر از 19 سال و بالاتر از 40 سال، دیابت، ناسازگاریRH، چاقی، تغذیه، کمبود ویتامین ها و مواد معدنی، عفونت ها و آرترواسکلروزیس، از بین رفتن سد جفتی و ورود تروفوبلاست ها به جریان خون مادر می باشد(6-8).

میزان شیوع پره اکلامپسی در ایران براساس مطالعات پراکنده انجام شده، بین 1 تا 8 درصد گزارش شده است. عوارض پره اکلامپسی به 2 دسته مادری و جنینی تقسیم می شود. پره اکلامپسی منجر به جدا شدن زودرس جفت و اختلالات هماتولوژیک گردیده و باعث صدمه به ارگان های حیاتی می شود (9).

درحال حاضر درمان قطعی برای پره اکلامپسی وجود ندارد و زنان بارداری که پره اکلامپسی در آن ها تشخیص داده  شده به همراه دیگر عوارض بارداری بیش از 60 درصد موارد بستری زنان در بخش مراقبت های ویژه را به خود اختصاص می دهند(10).

مطالعات  جدید  نشان داده است که استرس اکسیداتیو، التهاب و اتوفاژی  می تواند در بروز پره اکلامپسی نقش داشته باشد.

اینفلامازوم­ها[1]، کمپلکس‌های چند پروتئینی سیتوزولیک می‌باشند که معمولاً متشکل از یک مولکول حسگر (برای مثال، گیرنده‌ی شناسایی الگو[2]یا PRR)، پروتئین آداپتور (پروتئین شبه لکه‌ی مرتبط با آپوپتوز حاوی دومین‌های جذب کاسپاز[3](ASC)) کاسپاز-1 پیش التهابی هستند. مولکول‌های حسگر اینفلامازوم مسئول شناسایی و تشخیص الگوهای مولکولی متصل به پاتوژن (PAMPs) و الگوهای مولکولی مرتبط با آسیب/آلارمین ها/ سیگنال‌های خطر درون زا (DAMPs) می‌باشند. در صورت شناسایی، الیگومریزاسیون کمپلکس اینفلامازوم و فعال‌سازی کاسپاز 1 رخ می‌دهد که موجب شروع پاسخ‌های پایین‌دست ازجمله پردازش و آزادسازی IL-1b و IL-18 و نیز پیروپتوز[4]، که فرم لیتیک مرگ سلولی است می‌شود.

قبلاً تصور می‌شد که اینفلامازوم مختص سیگنالینگ ایمنی ذاتی  هستند، ولی، گزارش‌های اخیر نشان داده است که این پلتفرم‌ها موجب بهبود پاسخ‌های ایمنی تطبیقی و اکتسابی  می‌شوند. چندین عضو از خانواده‌ی پروتئین حاوی تکرار غنی از دمین الیگومریزاسیون اتصال نوکلئوتیدی (NLR) به عنوان مولکول‌های حسگر اینفلامازوم، وجود دارند. بنابراین، ابتدا تصور می‌شد که سیگنالینگ یا پیام رسانی NLR، برای فعال‌سازی اینفلامازوم استفاده می‌شود. در نتیجه، اینفلامازوم های وابسته به NLR چندگانه، یعنی پروتئین حاوی دمین پیرین و NLR(NLRP-1) ، NLRP3 و پروتئین-4 حاوی دومین (CARD) جذب و فعال‌سازی کاسپاز از خانواده‌ی NLR(NLRC4) توصیف شده‌اند. تاکنون، ویژگی‌های پنج اینفلامازوم مجزا به‌طور دقیق شناخته‌شده‌اند به‌طوری‌که هر یک با مولکول حسگر اختصاصی خود شناسایی می‌شوند: NLRP1, NLRP3, NLRC4, AIM2 و پیرین(11).

شناخته‌شده‌ترین اینفلامازوم ها، اینفلامازوم NLRP3 هستند(12). این اینفلامازوم دارای دو مشخصه‌ی کلیدی است: اول، با طیف وسیعی از مولکول‌های غیر مرتبط فعال می‌شود ازجمله PAMPs و هر دوی DAMP های درونزا و برون‌زا یا آلارمین ها که قبلاً مرور و بررسی شدند(13). دوم، اینفلامازوم NLRP3 در سلول‌های ایمنی ذاتی نظیر ماکروفاژها، نوتروفیل ها و سلول‌های دندریتی و نیز بافت های متعدد به شدت بیان می‌شوند(14). به ویژه، فعال‌سازی کلاسیک یا متعارف اینفلامازوم NLRP3 نیازمند دو مرحله‌ی مجزا است: پرایمینگ و بازسازی.

با توجه به این‌که اجزای اینفلامازوم توسط سلول‌های جفت، که در بالا نیز بررسی شد، بیان می‌شوند، مطالعات اولیه اثبات کرده‌اند که اینفلامازوم ها در پاسخ‌های التهابی مرتبط با بیماری‌های جفتی نقش دارند(11).

Mulla و همکاران(15) و Xie و همکاران(16) اولین بار اثبات کردند که فعال‌سازی اینفلامازوم NLRP3 در تروفوبلاست ها و خون پیرامونی (محیطی) در پاتوژنز پره اکلامپسی[5] نقش دارند. در واقع، نشان داده شده است که مونوسیت های پیرامونی زنان مبتلا به پره اکلامپسی، بهبود بیان NLRP1 و NLRP3 و پلی مورفیسم در ژن‌های کد کننده‌ی آن‌ها با توسعه‌ی این سندرم مرتبط است را به دنبال دارد. به‌علاوه، زنان مبتلا به پره اکلامپسی دارای سطح بالایی از کلسترول کل و اسید اوریک، بودند، این‌ها متابولیت‌های سلولی هستند که به عنوان آلارمین در صورت آزادسازی برون سلولی عمل می‌کنند(17) و می‌توانند به‌طور بالقوه موجب فعال‌سازی اینفلامازوم های NLRP3 در لایه‌ی سیتوتروفوبلاست جفت شوند(18). مطالعات توصیفی نیز نشان داده‌اند که جفت [6]زنان مبتلا به پره اکلامپسی شدید، بیان بالاتر NLRP3، کاسپاز-1 و IL-1b در مقایسه با زنان باردار با فشار خون عادی[7]  را نشان می‌دهند. به‌علاوه، مطالعات درون تنی  یک رابطه بین فعال‌سازی اینفلامازوم های NLRP3 جفتی القا شده توسط آلارمین و عوارض بارداری مرتبط باالتهاب جفتی را ارائه کرده‌اند. همسو با این شواهد، مطالعه‌ی اخیر با استفاده از مدل‌های موش و بافت انسان نشان داد که وزیکول‌های برون سلولی مشتق شده از اندوتلیال موجب القای فعال‌سازی اینفلامازوم های NLRP3 شده و منجر به تحریک سندرم شبه پره اکلامپسی می‌شوند که این سندرم با مهار و بازدارندگی این مسیر، تضعیف می‌شوند. روی هم رفته، این یافته‌ها حاکی از آن است که فعال‌سازی اینفلامازوم های NLRP3 در فرایندهای التهابی جفت درپاتوفیزیولوژی پره اکلامپسی نقش دارند(11).

ژن NLRP3 بر روی کروموزم 1q44 واقع شده است که در آن پلی مورفیسم ها با بیماری‌های التهابی ایمنی نظیر آرتریت روماتوئید مرتبط بوده‌اند. پلی مورفیسم rs10754558 در ̍ 3  منطقه‌ی ترجمه نشده، بر پایداری NLRP3 mRNA اثر می‌گذارد. از همه مهم‌تر این که، NLRP3 rs10754558 با افزایش ترشح IL-1b, مرتبط می باشد که بیان اینفلامازوم آن در سلول‌های ایمنی و سایر سلول‌ها نظیر فیبروبلاست ها مشاهده می‌شود(19).

مروری بر مطالعات انجام شده

در مطالعه ای که توسط Weel و همکاران در کشور چین و در سال 2017 انجام گرفت نتایج حاصله نشان داد که میزان بیان NLRP3 در جفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی بالاتر بود که نشان دهنده نقش NLRP3 در حالت التهابی بیش از حد در پره اکلامپسی می باشد(20).

 در مطالعه ای که توسط Xu و همکاران که بر روی 1024 فرد مبتلا به پره اکلامپسی و 1194 گروه کنترل در کشور چین انجام گرفت نتایج حاصله نشان دهنده وجود تفاوت معنی داری در فراوانی ژنوتیپی پلی مورفیسم NLRP3 rs10754558  بین بیماران مبتلا به پره اکلامپسی و زنان باردار سالم بود. (19)

در مطالعه ای که توسط Pontillo و همکاران بر روی 286 بیمار برزیلی مبتلا به پره اکلامپسی و 309 فرد سالم انجام گرفت نتایج حاصله نشان دهنده عدم وجود رابطه معنا دار بین پلی مورفیسم NLRP3 rs10754558 و ریسک ابتلا به بیماری پره اکلامپسی بود(21).

در مطاله ای در سال 2016 Dong Zhou و همکارانش ، ارتباط پلی مورفیسم rs10754558 ژن NLRP3 را در بروز و پیش آگهی بیماری عروق کرونری در جمعیت چین بررسی کرده که  ارتباط معنی داری بین این پلی مورفیسم وبیماری عروق کرونری  مشاهده شد (22).

در یک مطالعه دیگر در سال 2017 Quan-Bo Zhang و همکاران، ارتباط پلی مورفیسم NLRP3 با حساسیت به آرتریت نقرس اولیه در جمعیت چین مورد مطالعه قرار دادند و ارتباط معنی داری بین پلی مورفیسم rs10754558  و حساسیت به این بیماری را مشاهده کردند(23).

در سال 2016 Liwei Bai و همکاران ، ارتباط پلی مورفیسم  های ژن NLRP3  و خطر ابتلا به دیابت نوع II را در جمعیت چین بررسی کرده و بین پلی مورفیسم rs10754558 و خطر ابتلا به دیابت نوع II ارتباط معنی داری مشاهده شد ولی بین پلی مورفیسم rs4612666 و این بیماری تفاوت معنی داری دیده نشد (24).

Lufeng Cheng و همکاران در سال 2018  در یک مطالعه ارتباط پلی مورفیسم rs4612666 ژن NLRP3 و احتمال وقوع سکته مغزی آترواسکلروتیک را در جمعیت چین مورد بررسی قرار داده و ارتباط معنی داری بین این پلی مورفیسم و خطر ابتلا به سکته مغزی را به دست آوردند(25).

تا کنون مطالعه ای در مورد پلی مورفیسم های  rs10754558و rs4612666 ژن  NLRP3و ارتباط این پلی مورفیسم ها وبیان ژن مزبور در پره اکلامپسی صورت نگرفته است.

فراوانی پلی مورفیسم rs10754558 ژن NLRP3 در خون زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه کنترل متفاوت است

فراوانی پلی مورفیسم rs10754558 ژن NLRP3 درجفت  زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه کنترل متفاوت است

فراوانی پلی مورفیسم rs4612666 ژن NLRP3 درخون  زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه کترل متفاوت است

فراوانی پلی مورفیسم rs4612666 ژن NLRP3 درجفت  زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه کنترل متفاوت است

میزان بیان ژن NLRP3 درجفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه کنترل متفاوت است

میزان بیان ژن NLRP3 و پلی مورفیسم rs10754558 ژن NLRP3 در جفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه کنترل ارتباط دارد.

میزان بیان ژن NLRP3 و پلی مورفیسم rs4612666 ژن NLRP3 در جفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه کنترل ارتباط دارد.

مقایسه پلی‌مورفیسم‌های rs10754558 و rs4612666 ژن  NLRP3در خون مادر و جفت و میزان  بیان ژن NLRP3 در جفت زنان باردار مبتلا به پره‌اکلامپسی و گروه کنترل

مقایسه فراوانی پلی مورفیسم rs10754558 ژن NLRP3 درخون زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه کنترل

مقایسه فراوانی پلی مورفیسم rs10754558 ژن NLRP3 درجفت  زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه کنترل

مقایسه فراوانی پلی مورفیسم rs4612666 ژن NLRP3 درخون زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه کنترل

مقایسه فراوانی پلی مورفیسم rs4612666 ژن NLRP3 درجفت  زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه کنترل

مقایسه میزان بیان ژن NLRP3 درجفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه کنترل متفاوت است

تعیین ارتباط پلی مورفیسم rs10754558 ژن NLRP3 با بیان این ژن در جفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه کنترل

تعیین ارتباط پلی مورفیسم  rs4612666 ژن NLRP3  با بیان این ژن در جفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه کنترل

دانشگاه علوم پزشکی زاهدان

 پره اکلامپسی: سندرم خاص بارداری است که با افزایش فشار خون و پروتئین اوری شناخته می شود

پلی مورفیسم: چند شکلی تک نوکلئوتیدی، جایگزینی از یک نوکلئوتید منفرد است که در یک موقعیت خاص در ژنوم رخ می دهد.

  موردی- شاهدی(case –control  )

این مطالعه مورد شاهدی بر روی مراجعین به بیمارستان علی ابن ابیطالب شهر زاهدان انجام می گیرد. کلیه زنان زایمان کرده که جهت ایشان تشخیص پره اکلامپسی گذاشته شده وارد گروه مورد مطالعه، و کلیه زنان با نتیجه طبیعی حاملگی وارد گروه شاهد می شوند . تشخیص پره اکلامپسی براساس فشار خون مساوی یا بیشتر از 90/140 میلی متر جیوه بعد از هفته بیست حاملگی و پروتئینوری 300 میلی گرم یا بیشتر در 24 ساعت یا +1 یا بیشتر ( در تست نواری ادرار) در نمونه تصادفی ادرار می باشد .

نمونه های مورد نظر  از بین زنان مبتلا به پره اکلامپسی و زنان با حاملگی طبیعی مراجعه کننده به بیمارستان علی ابن ابیطالب زاهدان انتخاب می شوند.

کلیه زنان مبتلا به هریک از بیماری های سیستمیک، عفونی ، قلبی، کلیوی، لوپوس و بیماری التهابی  از مطالعه حذف می شوند.

شرایط خروج از مطالعه:  زنان مبتلا به حاملگی 2 یا چند قلو و بیماران مبتلاء به دیابت، بیماری کلیوی، بیماری کبدی، کلیه بیماریهای سیستمیک و لوپوس و غیره و یا جنین مبتلا به مول هیداتیدیفرم و هیدروپس جنینی، و بیماری های التهابی از مطالعه حذف می گردند . پس از توجیه   بیماران در مورد مطالعه و کسب رضایت آگاهانه از ایشان ابتدا اطلاعات مربوط در فرم اطلاعاتی ثبت می شود .

برای بررسی بیان ژن  و بررسی ارتباط پلی مورفیسم ها با بیان ، جفت حداقل 100 بیمار مبتلا به پره اکلامپسی و حداقل به همان تعداد گروه کنترل در نظر گرفته شده است .

برای بررسی پلی مورفیسم های NLRP3 درخون مادران ،حداقل 200 نمونه خون تام برای هر گروه بیمار و کنترل در نظر گرفته شده است.

1. برای محاسبه حجم نمونه از فرمول ذیل استفاده شده وبا توجه به اینکه گرفتن جفت محدودیت دارد تعداد نمونه های جفت از خون کمتر است و نمونه گیری در طول یک سال انجام خواهد شد

α = 0.05

β=0.2

نمونه گیری آسان و در دسترس برای نمونه های بیمار و کنترل

دو گروه از نظر سن و BMI مچ شده و سایرمتغیرها مثل مصرف سیگار در بررسی های بعدی ارزیابی می شود

از طریق تشخیص بالینی و انجام آزمایشات واقدامات پاراکلینیک. برای تعیین ژنوتیپ ها از روش PCR-RFLP  و سنجش بیان ژن از روش Real Time PCR

این مطالعه مورد شاهدی بر روی مراجعین به بیمارستان علی ابن ابیطالب شهر زاهدان انجام می گیرد. کلیه زنان زایمان کرده که جهت ایشان تشخیص پره اکلامپسی گذاشته شده وارد گروه مورد مطالعه، و کلیه زنان با نتیجه طبیعی حاملگی وارد گروه شاهد می شوند . تشخیص پره اکلامپسی براساس فشار خون مساوی یا بیشتر از 90/140 میلی متر جیوه بعد از هفته بیست حاملگی و پروتئینوری 300 میلی گرم یا بیشتر در 24 ساعت یا +1 یا بیشتر ( در تست نواری ادرار) در نمونه تصادفی ادرار می باشد .

افراد مبتلا به حاملگی 2 یا چند قلو و بیماران مبتلاء به دیابت، بیماری کلیوی، بیماری کبدی ، کلیه بیماریهای سیستماتیک و لوپوس و غیره و یا جنین مبتلا به مول هیداتیدیفرم و هیدروپس جنینی و بیماری های التهابی  از مطالعه حذف می شوند. پس از توجیه بیماران در مورد مطالعه و کسب رضایت آگاهانه از ایشان ابتدا اطلاعات مربوط در فرم اطلاعاتی ثبت می شود.

1- از بافت جفت هر فردmRNA  با استفاده از کیت، استخراج می شود. سپس بیان ژن NLRP3 با روشReal Time PCR  بررسی می شود و نسبت بیان آن در گروه ها ارزیابی می گردد.

2- از خون هر فرد مورد مطالعهDNA  به روش salting out استخراج گردیده و سپس با استفاده از تکنیک PCR-RFLP، پلی مورفیسم های ژن NLRP3 تعیین می گردد.

پس از گردآوری اطلاعات لازم، یافته ها در نرم افزار آماری SPSS وارد گشته و داده ها با استفاده از آزمون­های آماری χ2 و آزمون فیشرو تی تست مستقل و رگرسیون لجستیک مورد تجزیه و تحلیل قرار خواهند گرفت.

1. برای انجام آزمون های آماری از نرم افزار SPSS-23 استفاده می گردد. ابتدا آماره های توصیفی شامل فراوانی ، درصد، میانگین و انحراف معیار مورد بررسی قرار میگیرند. برای مقایسه متغیرهای پارامتریک بین دو گروه از آزمون Ttest وبرای مقایسه متغیرهای غیرپارامتریک از آزمون دقیق فیشیر استفاده می شود . جهت بررسی اثر ژنوتیپ ها بر ریسک ابتلا به بیماری آزمون Binary logistic regression  انجام می شود. 

راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش‌های علوم پزشکی 

دارای آزمودنی انسانی

1. هدف اصلی هر پژوهش‌باید ارتقای سلامت انسان‌ها توأم با رعایت کرامت و حقوق ایشان باشد.
2. در پژوهش بر آزمودنی انسانی، سلامت و ایمنی فرد فرد آزمودنی‎ها در طول و بعد از اجرای پژوهش، بر تمامی مصالح دیگر اولویت دارد. هر پژوهشی که بر روی آزمودنی انسانی انجام می‌گیرد، باید توسط افرادی طراحی و اجرا شود که تخصص و مهارت بالینی لازم و مرتبط را داشته باشند. در کارآزمایی‌های بالینی  بر روی بیماران یا داوطلب‌های سالم نظارت پزشک دارای مهارت و دانش متناسب الزامی است.
3. پژوهش بر انسان فقط در صورتی توجیه‌پذیر است که منافع بالقوه‌ی آن برای هر فرد آزمودنی بیش‌تر از خطرهای  آن باشد. در پژوهش‌های دارای ماهیت غیر درمانی، سطح آسیبی که آزمودنی در معرض آن قرار می‌گیرد نباید بیش‌تر از آن‌چه باشد که مردم عادی در زندگی روزمره‌ی خود با آن مواجه می‌شوند. حصول اطمینان از این امر برعهده‌ی طراحان، مجریان و همکاران پژوهش و تمامی شوراهای بررسی یا پایش‌کننده‌ی پژوهش از جمله کمیته‌ی اخلاق در پژوهش‌ است.

4. مواردی از قبیل سرعت، سهولت کار، راحتی پژوهشگر، هزینه‌ی پایین‌تر و/ یا صرفاً عملی بودن آن به هیچ وجه نباید موجب قرار دادن آزمودنی در معرض خطر یا زیان افزوده یا تحمیل هر گونه محدودیت اختیار اضافی به وی شود.
5. قبل از آغاز هر پژوهش پزشکی ، باید اقدامات  اولیه جهت به حداقل رساندن زیان احتمالی وارده به آزمودنی‌ها و تامین سلامت آن‌ها انجام گیرد.

7-        اگر در حین اجرای پژوهش مشخص شود که خطرات شرکت در این پژوهش برای آزمودنیها بیش از فواید بالقوهی آن است، باید آن پژوهش بلافاصله متوقف شود.

9-         در پژوهشهای پزشکی که ممکن است به محیط زیست آسیب برسانند، باید احتیاطهای لازم در جهت حفظ و نگهداری و عدم آسیب رسانی به محیط ریست انجام گیرد.

11-       کمیته ی اخلاق در پژوهش علاوه بر بررسی و تصویب طرحنامه و دستورالعمل، این حق را دارد که طرحها را در حین و بعد از اجرا را از نظر رعایت ملاحظات اخلاقی مورد پایش قرار دهد. اطلاعات و مدارکی که برای پایش از سوی کمیتهی اخلاق درخواست میشود، باید از سوی پژوهشگران در اختیار این کمیته گذاشته شود.   

12-       انتخاب آزمودنیهای بالقوه از میان جمعیت بیماران یا هر گروه جمعیتی دیگر، باید منصفانه باشد، بهنحوی که توزیع بارها (خطرات یا هزینهها) و منافع شرکت در پژوهش، در آن جمعیت و کل جامعه، تبعیضآمیز نباشد.

13-       کسب رضایت آگاهانه و آزادانه در هر پژوهشی که بر روی آزمودنی انسانی اجرا میشود، الزامی است. این رضایت باید به شکل کتبی باشد. در مواردی که اخذ رضایت آگاهانهی کتبی غیر ممکن یا قابل صرفنظر باشد، باید موضوع با ذکر دلایل به کمیتهی اخلاق منتقل شود. در صورت تأیید کمیتهی اخلاق، اخذ رضایت کتبی قابل تعویق یا تبدیل به رضایت شفاهی یا ضمنی خواهد بود.

14-       اگر در طول اجرای پژوهش تغییری در نحوه اجرای پژوهش داده شود یا اطلاعات جدیدی به دست آید که احتمال داشته باشد که بر تصمیم آزمودنی مبنی بر ادامهی شرکت در پژوهش تاثیر گذار باشد، باید موضوع به اطلاع کمیتهی اخلاق رسانده شود و در صورت موافقت کمیته با ادامهی پژوهش، مراتب به اطلاع آزمودنی رسانده شود و رضایت آگاهانه مجددا اخذ گردد.

15-       پژوهشگر باید از آگاهانه بودن رضایت اخذشده اطمینان حاصل کند. برای این منظور، در تمامی پژوهشهای پزشکی، اعم از درمانی و غیردرمانی، پژوهشگر موظف است فرد در نظر گرفته شده بهعنوان آزمودنی را از تمامی اطلاعاتی که میتوانند در تصمیمگیری او مؤثر باشند، بهنحو مناسبی آگاه سازد. این اطلاعات مشتملند بر: عنوان و اهداف پژوهش، طول مدت پژوهش، روشی که قرار است بهکار گرفته شود (شامل احتمال تخصیص تصادفی به گروهمورد یا شاهد)، منابع تأمین بودجه، هر گونه تعارض منافع احتمالی، وابستگی  سازمانی پژوهشگر، و فواید و زیانهایی که انتظار میرود مطالعه در بر داشته باشد. همچنین، هر آزمودنی باید بداند که میتواند هر لحظه که بخواهد از مطالعه خارج شود و باید دربارهی خطرات و زیانهای بالقوهی ناشی از ترک زودرس پژوهش آگاه و پشتیبانی شود. پژوهشگر همچنین باید به تمامی سؤالات و دغدغههای این افراد، با حوصله و دقت پاسخ بدهد. این موارد باید در رضایتنامهی آگاهانه منعکس شود.

16-       پژوهشگر باید از آزادانه بودن رضایت اخذ شده اطمینان حاصل کند. رفتارهایی که به هر نحوی متضمن تهدید، اغوا، فریب و یا اجبار باشد موجب ابطال رضایت آزمودنی میشود. به فرد باید فرصت کافی برای مشاوره با افرادی که مایل باشد – نظیر اعضای فامیل یا پزشک خانواده - داده شود. همچنین، در پژوهشهایی که پژوهشگر مقام سازمانی بالاتری نسبت به آزمودنی  داشته باشد، دلایل این شیوهی جذب آزمودنی، باید توسط کمیتهی اخلاق  تأیید شود، در این موارد شخص ثالث و معتمدی باید رضایت را دریافت کند.

17-       پژوهشگر ارشد مسؤول مستقیم ارائهی اطلاعات کافی و به زبان قابل فهم برای آزمودنی ، اطمینان از درک اطلاعات ارائه شده، و اخذ رضایت آگاهانه است. در مواردی که بنا بهدلیلی، نظیر زیاد بودن تعداد آزمودنیها، این اطلاعرسانی از طریق شخص دیگری انجام میگیرد، این پژوهشگر ارشد است که مسؤول انتخاب فردی آگاه و مناسب برای این کار و حصول اطمینان از تأمین شرایط مذکور در این بند است.

18-       در پژوهشهایی که از مواد بدنی (شامل بافتها و مایعات بدن انسان)  یا دادههایی استفاده میشود که هویت صاحبان آنها معلوم یا قابل کشف و ردیابی است، باید برای جمعآوری، تحلیل، ذخیره‎سازی و /یا استفادهی مجدد از آنها رضایت آگاهانه گرفته شود. در مواردی که اخذ رضایت غیرممکن باشد یا اعتبار پژوهش را خدشهدار کند، میتوان در صورت بررسی مورد و تصویب کمیتهی اخلاق ، از دادهها یا مواد بدنی ذخیره شده، بدون اخذ رضایت آگاهانه استفاده کرد.

19-       عدم قبول شرکت در پژوهش، یا ادامه ندادن به همکاری، نباید هیچگونه تأثیری بر خدمات درمانی که در همان مؤسسه – نظیر بیمارستان – به فرد ارائه میشود، داشته باشد. این موضوع باید در فرایند اخذ رضایت آگاهانه، به آزمودنی اطلاع داده شود.

20-       در مواردی که آگاه کردن آزمودنی دربارهی جنبهای از پژوهش باعث کاهش اعتبار پژوهش می شود، ضرورت اطلاعرسانی ناکامل از طرف پژوهشگر باید توسط کمیتهی اخلاق تأیید شود. بعد از رفع عامل این محدودیت، باید اطلاعرسانی کامل به آزمودنی انجام گیرد.

21-       برخی از افراد یا گروههایی از مردم، نظیر ناتوانان ذهنی، کودکان، جنین و نوزاد، بیماران اورژانسی، یا زندانیانکه ممکن است بهعنوان آزمودنی در پژوهش شرکت کنند، نمیتوانند برای دادن رضایت، آگاهی یا آزادی لازم را داشته باشند. این افراد یا گروهها آسیبپذیر دانسته میشوند و باید مورد حفاظت ویژه قرار گیرند.

22-       از گروههای آسیبپذیر هیچگاه نباید (به دلایلی چون سهولت دسترسی ) به عناون آزمودنی ترجیحی استفاده شود. پژوهش پزشکی با استفاده از گروهها یا جوامع آسیبپذیر تنها در صورتی موجه است که با هدف پاسخگویی به نیازهای سلامت و اولویتهای همان گروه یا جامعه طراحی و اجرا شود و احتمال معقولی وجود داشته باشد که همان گروه یا جامعه از نتایج آن پژوهش سود خواهد برد.

23-       در پژوهش بر روی گروههای آسیبپذیر، وظیفهی اخذ رضایت آگاهانه مرتفع نمیشود. در مورد افرادی که سرپرست قانونی دارند، پژوهشگر موظف است که علاوه بر اخذ رضایت آگاهانه از سرپرست قانونی، متناسب با ظرفیت خود فرد، از وی رضایت آگاهانه اخذ کند. در هر حال، باید به امتناع این افراد از شرکت در پژوهش احترام گذاشته شود.

24-       اگر در حین اجرای پژوهش، آزمودنی دارای ظرفیت، ظرفیت خود را از دست بدهد یا آزمودنی فاقد ظرفیت، واجد ظرفیت شود، باید با توجه به تغییر حاصله، رضایت آگاهانه برای ادامهی پژوهش از سرپرست قانونی یا خود فرد اخذ شود. 

25-       پژوهشگر مسؤول رعایت اصل رازداری و حفظ اسرار آزمودنیها و اتخاذ تدابیر مناسب برای جلوگیری از انتشار آن است. همچنین، پژوهشگر موظف است که از رعایت حریم خصوصی آزمودنیها در طول پژوهش اطمینان حاصل کند. هرگونه انتشار دادهها یا اطلاعات بهدست آمده از بیماران باید بر اساس رضایت آگاهانه انجام گیرد.

26-       هر نوع آسیب یا خسارت ناشی از شرکت در پژوهش باید بر طبق قوانین مصوب جبران خسارت شود. این امر باید در هنگام طراحی پژوهش لحاظ شده باشد. نحوهی تحقق این امر ترجیحاً بهصورت پوشش بیمهای نامشروط باشد.

27-       در پایان پژوهش، هر فردی که بهعنوان آزمودنی به آن مطالعه وارد شده است، این حق را دارد که دربارهی نتایج مطالعه آگاه شود و از مداخلات یا روشهایی که سودمندیشان در آن مطالعه نشان داده شده است، بهرهمند شود.

28-       پژوهشگران موظفند که نتایج پژوهشهای خود را صادقانه ، دقیق، و کامل منتشر کنند. نتایج، اعم از منفی یا مثبت، و نیز منابع تأمین بودجه، وابستگی  سازمانی، و تعارض منافع – در صورت وجود – باید کاملاً آشکارسازی شوند. پژوهشگران نباید در هنگام عقد قرارداد انجام پژوهش، هیچ  گونه شرطی را مبنی بر حذف یا عدم انتشار یافتههایی که از نظر حمایت کنندهی پژوهش  مطلوب نیست، بپذیرند.

29-       نحوهی گزارش نتایج پژوهش باید ضامن حقوق مادی و معنوی تمامی اشخاص مرتبط با پژوهش، از جمله خود پژوهشگر یا پژوهشگران، آزمودنیها و مؤسسهی حمایت کنندهی  پژوهش باشد.

30-       گزارشها و مقالات حاصل از پژوهشهایی که مفاد این راهنما را نقض کردهاند، نباید برای انتشار پذیرفته شوند.

31-       روش پژوهش نباید با ارزشهای احتماعی، فرهنگی و دینی  جامعه در تناقض باشد.

راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی

راهنمای عمومی

1- پژوهشگر باید به این امر مهم توجه داشته باشد که بافت‌ها و اعضای مورد استفاده، دارای منشأ انسانی‌اند و کرامت انسانی اقتضا می‌کند که جمع‌آوری، نگه‌داری، استفاده و نابودسازی آن‌ها توأم با رعایت ملاحظات و شؤون مرتبط باشد.

2- از اجزای بدنی دارای منشأ انسانی باید تنها در پژوهش‌هایی استفاده شود که اهداف ارزشمندی را در راستای مبارزه با بیماری‌ها و ارتقای سلامت انسان‌ها دنبال می‌کنند.

3- تمامی پژوهش‌ها بر روی عضو و بافت انسانی، پیش از اجرا، باید مورد تأیید کمیته‌ی اخلاق در پژوهش مرتبط قرار گیرد. کمیته‌ی اخلاق در پژوهش حق دارد که در تمامی مراحل پژوهش بر آن نظارت داشته باشد. پژوهشگران باید در این زمینه با کمیته‌ی اخلاق در پژوهش همکاری کنند.

4- رضایت آگاهانه‌ی فرد دهنده‌ی عضو یا بافت، یا جانشین قانونی او، شرط اساسی در تأیید اخلاقی هر پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی است. رضایت‌نامه باید با رعایت تمامی اصول مرتبط تهیه و هنگام ارسال طرح‌نامه برای تصویب، به آن پیوست شده باشد.

5- در مواردی که اخذ رضایت آگاهانه از دهنده‌ی نمونه‌ی ذخیره‌شده یا جانشین قانونی او امکان‌پذیر نباشد، به‌شرط وجود رضایت کلی اولیه بر استفاده‌ی پژوهشی، در صورت تأیید کمیته‌ی اخلاق در پژوهش می‌توان از آن نمونه برای پژوهش استفاده کرد. در چنین مواردی باید از نمونه‌هایی استفاده شود که به ‌نحو برگشت‌ناپذیر بی‌نام ‌شده باشد. ‌

6- تمامی اطلاعاتی که از صاحبان عضو یا بافت مورد پژوهش، جمع‌آوری و ثبت می‌شود، راز حرفه‌ای تلقی می‌‌شود؛ از این ‌رو، تمامی اصول و ملاحظات مربوط به رازداری و حفظ حریم شخصی، باید در مورد آن‌ها مراعات شود.

7- مرکز انجام دهنده‌ی پژوهش بر روی عضو و بافت باید مهارت و امکانات لازم برای حفظ رازداری را داشته باشد؛ در غیر این صورت، اطلاعات باید به شکل بی‌نام و غیرقابل ردیابی ثبت و ذخیره شود.

8- پژوهشگر باید از اعضاء و بافت‌هایی که به منظور پژوهش در اختیار او قرار می‌گیرد استفاده‌ی بهینه کرده، از هدر رفتن آن‌ها جلوگیری کند

9- پژوهشگر موظف است که تمهیدات لازم ایمنی، از جمله آزمون‌های غربالگری و وسایل محافظت‌کننده را برای جلوگیری از انتقال آلودگی از اجزای بدنی مورد استفاده به هر فرد دیگر، اعم از پژوهشگران، آزمودنی‌ها یا سایر افرادی که در فرایند پژوهش با این مواد سروکار خواهند داشت، پیش‌بینی و تأمین کند.

10- پژوهش بر روی عضو و بافت ممکن است به ایجاد روش‌ها و محصولاتی منجر شود که به استفاده‌ی تجاری از آن‌ها بینجامد. حقوق مالکیت معنوی نتایج حاصل از این‌گونه پژوهش‌ها باید مورد تأیید و حمایت قرار گیرد. احتمال استفاده‌ی تجاری از نتایج پژوهش و اشخاصی که احتمالاً از آن منتفع خواهند شد باید در رضایت‌نامه‌آورده شود.

11- زمان، نحوه و میزان اطلاع آزمودنی‌ها از نتایج پژوهش باید در رضایت‌نامه آورده شود. در هر حال، آزمودنی یا نماینده‌ی قانونی او باید به تمامی اطلاعاتی که در طول پژوهش درباره‌ی او به‌دست می‌آید، دسترسی داشته باشد.

12- در صورت کمبود بافت یا عضو، باید استفاده‌های درمانی بر استفاده‌های پژوهشی اولویت داده شود. 

راهنماهای اختصاصی

فصل 1:  استفاده از اعضاء و بافت‌های جنین سقط شده‌ی انسان برای پژوهش

به موجود حاصل از لقاح، تا 8 هفتگی «رویان»، پس از 8 هفتگی تا زمان زایمان «جنین» و بلافاصله پس از آن تا 28 روزگی «نوزاد» اطلاق می‌گردد. در هر گونه پژوهش بر روی جنین، علاوه بر مفاد این راهنما، باید اصل کرامت انسانی و تمامی موازین قانونی و شرعی رعایت شود.

1- ضرورت انجام پژوهش و سایر اجزای طرح‌نامه باید توسط کمیته‌ی اخلاق در پژوهش تأیید شود.

2- جنین انسانی نباید مورد خرید و فروش یا هر گونه استفاده‌ی تجاری دیگر قرار گیرد.

3- در مورد استفاده از اجزای بدن جنین سقط شده - و نیز خون بند ناف، از آن‌جا که خون جنینی محسوب می‌شود- اخذ رضایت آگاهانه هم از پدر و هم از مادر جنین مورد استفاده ضروری است.

4- جفت و سایر محتویات رحم به‌جز جنین، از بافت‌های مادر محسوب می‌شوند لذا رضایت مادر برای استفاده از آن‌ها لازم و کافی است.

5- فرد یا تیمی که در مورد انجام سقط جنین تصمیم‌گیری می‌کند باید کاملاً مستقل از تیم طراحی‌کننده یا اجرا کننده‌ی پژوهش بر روی آن جنین بعد از سقط باشد.

6- تا پیش از پایان مراحل سقط جنین، نباید هیچ‌گونه تصمیم‌گیری یا مذاکره‌ای درباره‌ی استفاده‌ی احتمالی آتی از آن جنین در پژوهش انجام گیرد.

7- در تمامی مراحل انجام و انتشار نتایج پژوهش باید رازداری و حریم خصوصی افراد مرتبط با جنین حفظ شود.

8- پژوهش نباید دربردارنده‌ی هیچ‌گونه آسیب یا زیانی برای مادر باشد.

- عدم همکاری بیمار

راه حل : در صورت عدم همکاری بیمار ، از مطالعه حذف می شود

 -مشکل تهیه مواد وامکان طولانی شدن زمان دریافت آنها

راه حل: از آنجاییکه این مساله از طرف ما راه حلی ندارد مدت زمان طرح را افزایش می دهد

Preeclampsia; polymorphism; NLRP3

1.            Student ZCP, Student BOEM, Student ZMB, Student RSNB. Prevalence of Preeclampsia and Eclampsia in Iran. Archives of Iranian medicine. 2016;19(1):50.

2.            Harmon QE, Huang L, Umbach DM, Klungsøyr K, Engel SM, Magnus P, et al. Risk of fetal death with preeclampsia. Obstetrics & Gynecology. 2015;125(3):628-35.

3.            Rodríguez-Sureda V, Crovetto F, Triunfo S, Sánchez O, Crispi F, Llurba E, et al. Increased secretory sphingomyelinase activity in the first trimester of pregnancy in women later developing preeclampsia: a nested case-control study. Biological chemistry. 2016.

4.            Nerenberg K, Daskalopoulou SS, Dasgupta K. Gestational diabetes and hypertensive disorders of pregnancy as vascular risk signals: an overview and grading of the evidence. Canadian Journal of Cardiology. 2014;30(7):765-73.

5.            Mandò C, Pileri P, Mazzocco MI, Lattuada D, Zolin A, Plebani M, et al. Maternal and fetal HLA-G 14 bp gene polymorphism in pregnancy-induced hypertension, preeclampsia, intrauterine growth restricted and normal pregnancies. The Journal of Maternal-Fetal & Neonatal Medicine. 2015:1-6.

6.            Connealy BD, Carreno CA, Kase BA, Hart LA, Blackwell SC, Sibai BM. A history of prior preeclampsia as a risk factor for preterm birth. American journal of perinatology. 2014;31(6):483-8.

7.            Villar J, Belizan JM. Same nutrient, different hypotheses: disparities in trials of calcium supplementation during pregnancy. The American journal of clinical nutrition. 2000;71(5 Suppl):1375S-9S.

8.            Rajkovic A, Mahomed K, Rozen R, Malinow MR, King IB, Williams MA. Methylenetetrahydrofolate reductase 677 C --> T polymorphism, plasma folate, vitamin B(12) concentrations, and risk of preeclampsia among black African women from Zimbabwe. Molecular genetics and metabolism. 2000;69(1):33-9.

9.            Kianpour M, Norozi S, Bahadoran P, Azadbakht L. The relationship between metabolic syndrome criteria and preeclampsia in primigravid women. Iranian journal of nursing and midwifery research. 2015;20(2):263-8.

10.          Eiland E, Nzerue C, Faulkner M. Preeclampsia 2012. Journal of pregnancy. 2012;2012:586578.

11.          Gomez-Lopez N, Motomura K, Miller D, Garcia-Flores V, Galaz J, Romero R. Inflammasomes: Their Role in Normal and Complicated Pregnancies. J Immunol. 2019;203(11):2757-69.

12.          Franchi L, Eigenbrod T, Núñez G. Cutting edge: TNF-alpha mediates sensitization to ATP and silica via the NLRP3 inflammasome in the absence of microbial stimulation. J Immunol. 2009;183(2):792-6.

13.          Swanson KV, Deng M, Ting JP. The NLRP3 inflammasome: molecular activation and regulation to therapeutics. Nat Rev Immunol. 2019;19(8):477-89.

14.          Goldberg EL, Asher JL, Molony RD, Shaw AC, Zeiss CJ, Wang C, et al. beta-Hydroxybutyrate Deactivates Neutrophil NLRP3 Inflammasome to Relieve Gout Flares. Cell Rep. 2017;18(9):2077-87.

15.          Mulla MJ, Myrtolli K, Potter J, Boeras C, Kavathas PB, Sfakianaki AK, et al. Uric acid induces trophoblast IL-1β production via the inflammasome: implications for the pathogenesis of preeclampsia. Am J Reprod Immunol. 2011;65(6):542-8.

16.          Xie F, Hu Y, Turvey SE, Magee LA, Brunham RM, Choi KC, et al. Toll-like receptors 2 and 4 and the cryopyrin inflammasome in normal pregnancy and pre-eclampsia. Bjog. 2010;117(1):99-108.

17.          Jiang D, Chen S, Sun R, Zhang X, Wang D. The NLRP3 inflammasome: Role in metabolic disorders and regulation by metabolic pathways. Cancer Lett. 2018;419:8-19.

18.          Stodle GS, Silva GB, Tangeras LH, Gierman LM, Nervik I, Dahlberg UE, et al. Placental inflammation in pre-eclampsia by Nod-like receptor protein (NLRP)3 inflammasome activation in trophoblasts. Clin Exp Immunol. 2018;193(1):84-94.

19.          Xu L, Li S, Liu Z, Jiang S, Wang J, Guo M, et al. The NLRP3 rs10754558 polymorphism is a risk factor for preeclampsia in a Chinese Han population. J Matern Fetal Neonatal Med. 2019;32(11):1792-9.

20.         I CW, Romao-Veiga M, Matias ML, Fioratti EG, Peracoli JC, Borges VT, et al. Increased expression of NLRP3 inflammasome in placentas from pregnant women with severe preeclampsia. J Reprod Immunol. 2017;123:40-7.

21.         Pontillo A, Reis EC, Bricher PN, Vianna P, Diniz S, Fernandes KS, et al. NLRP1 L155H Polymorphism is a Risk Factor for Preeclampsia Development. Am J Reprod Immunol. 2015;73(6):577-81.

22-Zhou D, Wang X, Chen T, Wen W, Liu Y, Wu Y, Yuan Z. The NLRP3 rs10754558 polymorphism is associated with the occurrence and prognosis of coronary artery disease in the Chinese Han population. BioMed research international. 2016;2016.

23-Zhang QB, Qing YF, He YL, Xie WG, Zhou JG. Association of NLRP3 polymorphisms with susceptibility to primary gouty arthritis in a Chinese Han population. Clinical rheumatology. 2018 Jan 1;37(1):235-44.

24-Bai L, Cao M, Zhai Q, Wang D, Hai J, Jin S, Zhang Q. Association of two common SNPs in NLRP3 with risk of type 2 diabetes mellitus and their interaction with environmental factors. Int J Clin Exp Pathol. 2016 Jan 1;9(10):10499-506.

25-Cheng L, Yin R, Yang S, Pan X, Ma A. Rs4612666 Polymorphism of the NLRP3 Gene Is Associated with the Occurrence of Large Artery Atherosclerotic Ischemic Strokes and Microembolic Signals. BioMed research international. 2018;2018.

26-Abolfathi M, Bagheri N, Iranparast S, Soltani A, Sanaei A, Rahimian G, Kheiri S. Associations of a NLRP3 rs10754558 Polymorphism with Helicobacter pylori-Infected Patients with Gastritis and Peptic Ulcer Disease. Jundishapur Journal of Microbiology. 2019;12(5).

  27-Cheng L, Yin R, Yang S, Pan X, Ma A. Rs4612666 Polymorphism of the NLRP3 Gene Is Associated with the Occurrence of Large Artery Atherosclerotic Ischemic Strokes and Microembolic Signals. BioMed research international. 2018;2018.

فرم پیوست میباشد

مقایسه فراوانی پلی‌مورفیسم‌های  rs10754558 و rs4612666 ژن NLRP3 در خون  مادر و جفت و بیان ژن  NLPR3 در جفت زنان باردار مبتلا به پره‌اکلامپسی و گروه کنترل

2 سی سی خون به منظور استخراج DNA و انجام PCR-RFLP

کمک به فهمیدن علت های ژنتیکی دخیل در ایجاد بیماری

عوارض جانبی برای بیمار ندارد.

عوارض جانبی برای بیمار ندارد.

انجام این طرح هیچ هزینه ای برای بیمار نخواهد داشت

نیاز به روش جایگزین ندارد

نتایج بصورت کاملاً محرمانه و صرفاً جهت مقاصد پژوهش به کار خواهد رفت و هویت بیماری

وی در چارچوب قانون و جامعه و خانواده محرمانه خواهد ماند.

دکترسعیده سلیمی 09123003175- sasalimi@yahoo.com  زاهدان

دانشگاه علوم پزشکی زاهدان- گروه بیوشیمی بالینی

شرکت من در مطالعه کاملاً اختیاری است و آزاد خواهم بود که از شرکت در مطالعه امتناع

نموده یا هر زمان که مایل بودم بدون آنکه تغییری در نحوه رفتار پزشک درمانگر یا نحوه درمان

و مراقبت از بیماری اینجانب ایجاد شود از پژوهش مذکور خارج  شوم

با توجه به اطلاعات موجود در این فرم و توضیحات حضوری مجری یا همکاران طرح موافقت

خود را با شرکت در این مطالعه اعلان می نمایم. یک نسخه از این فرم به من داده شده و فرصت

خواندن آن را داشته ام