بررسی میزان بیان mRNA و الگوی متیلاسیون ناحیه پروموتر ژن های OCT3 و CHD5 در بیماران مبتلا به سرطان هپاتوسلولار در مقایسه با افراد سالم

سرطان کبد پنجمین سرطان شایع در مردان وهفتمین سرطان شایع زنان در جهان است. متاسفانه به دلیل تشخیص در مراحل پیشرفته، این سرطان سومین علت مرگ و میر بیماران سرطانی در جهان محسوب می شود. به استناد سازمان جهانی گوارش سالانه ۷۰۰ هزار نفر در جهان در اثر سرطان کبد جان خود را از دست می دهند. یعنی هر ۳۰ ثانیه یک نفر  جان خود را بر اثر سرطان کبد از دست می دهد. تقریباً ۸۵% از ابتلاهای سرطان کبد، در کشورهای جهان سوم و در حال توسعه رخ می دهد و در این میان کشورهای شرق و جنوب شرقی آسیا و آفریقای مرکزی وغربی با بیشترین شیوع مواجه هستند (1). شیوع واقعی ابتلا به سرطان کبد در ایران هنوز ناشناخته است. سالانه 622000 مرگ به علت ابتلا به سرطان کبد در جهان گزارش می شود. ایران در منطقه ای با ریسک پایین برای ابتلا به این سرطان قرار دارد و سالانه کمتر از 5 نفر در هر 1000000 نفر به علت ابتلا به این سرطان جان خود را از دست می دهند. نتایج تحقیقات نشان می دهد که میزان مرگ و میر حاصل از سرطان کبد در ایران پایین است. اما در طول سالیان اخیر افزایش مختصری داشته است. ایران در منطقه خاورمیانه قرار گرفته است. ناحیه ای که در آن اکثر موارد مبتلا به سرطان کبد در مراحل متوسط یا پیشرفته شناسایی می شوند (2-4).

80 تا ۹۰% سرطانهای کبد، از نوع هپاتوسل کارسینوما (HCC) هستند. شیوع جهانی HCC رو به افزایش است. محققان پیش بینی می کنند، شاهد یک اوج ابتلاء به سرطان کبد تا سال ۲۰۲۰ باشیم، که علت آن مبتلایان به هپاتیت  B و C در دهه های ۵۰ و۶۰ میلادی است (1, 5-7). از آنجا که تشخیص زود هنگام HCC  در بهبود و بقای بیماران سرطانی بسیار مهم است، شناسایی مارکرهای بیولوژیکی جدید و قابل اعتماد جهت مدیریت مناسب و صحیح در بروز HCC ، عود و متاستاز این بدخیمی ضروری است. همزمان با پیشرفت سرطان کبد، یکی از دلایل اصلی بالا رفتن نرخ مرگ و میر در بیماران مبتلا به HCC  فقدان گزینه های درمانی موثر است، به ویژه برای کسانی که مبتلا به بیماری پیشرفته هستند. اگر چه در برخی از بیماران مبتلا به HCC  جراحی می تواند منجر به کنترل طولانی مدت در مراحل اولیه پس از تشخیص شود اما نرخ عود مجدد همچنان بالا است (حدود 50٪ در3 سال) (8). علاوه بر این، با توجه به ماهیت بدون علامت بودنHCC  در مراحل اولیه، عدم آگاهی و وجود استراتژی های غربالگری ضعیف ، حدود 80 درصد از این بیماران معمولا با بیماری پیشرفته و یا غیرقابل برگشت به پزشک مراجعه می کنند. این بیماران به طور کلی پیش آگهی بسیار ضعیفی دارند و درمان هایی مانند شیمی درمانی، پرتو درمانی، ایمونوتراپی یا هورمون درمانی، عمدتا به عنوان تسکین دهنده با میزان بقای نسبی 5 ساله (تنها در 7 درصد بیماران) استفاده می شود (9, 10) و این امر نیاز به روش های نوآورانه جهت تشخیص، پیش آگهی و درمان سرطان کبد را برجسته می سازد.

در حال حاضر کاربرد بیومارکرهای سرولوژیکی و نشانگرهای مولکولی برای HCC  به تنهایی چندان مفید نیست. بنابراین، کشف و اعتبار سنجی نشانگرهای زیستی ویژه برای HCC بسیار ضروری است و البته باید در نظر داشت که این نشانگرها باید تا حد زیادی  منجر به کاهش نتایج منفی کاذب و در نتیجه جلوگیری از تشخیص نادرست گردد.

در سال 1990، جونز و همکارانش به درک نوینی از اپی‌ژنتیک رسیدند. آنان اپی‌ژنتیک را تنظیم بیان ژن بدون تغییر در توالی آن تعریف کردند. بر این اساس، اپی‌ژنتیک پدیده‌ای انعطاف‌پذیر و موروثی است که بیان تعدادی از ژن‌ها را تنظیم می‌کند. گرچه متیلاسیون DNA  عمومی‌ترین تغییر در اپی‌ژنتیک است، اما تغییر هیستون‌ها، شامل استیلاسیون و داستیلاسیون نیز در این کار دخالت دارند (11). متیلاسیون DNA نوعی تغییر کووالان است که طی آن در ژنوم یک گروه متیل از طریق - S  آدنوزیل متیونین4  به یک سیتوزین متصل می‌شود. این فرایند طی یک واکنش آنزیمی پس از همانندسازی DNA  رخ می‌دهد. در سلول‌های پستانداران، متیلاسیونDNA   معمولاً به موقعیت ۵ حلقه پیریمیدین واحدهای سیتوزین که در دی‌نوکلئوتیدهای مستقر در جزایری با محتوای C:G pair (CpG)   واقع‌ شده‌اند، محدود می‌شود. . CpGهای متیله در تنظیم ساختار کروماتین و بیان ژن ایفای نقش می‌کنند و در حافظه اپی‌ژنتیک از اهمیت زیادی برخوردارند. دی‌نوکلئوتیدهای CpG به فراوانی در جزایر CpG، که نواحی غنی از جایگاه‌های CpG هستند، خوشه‌بندی می‌شوند. این جزایر به طول Kb ۳-۵/۰ به‌طور متوسط در هر Kb 100 ژنوم و به‌طور متوسط در نیمی از همه ژن‌های انسانی یافت می‌شوند. به‌نظر می‌رسد متیلاسیون سایر CpGها فاقد عملکردهای زیستی باشد (11).

در صورت تغییر ریتم و آهنگ متیلاسیون، بیماری‌های فراوانی گسترش می‌یابند که ازجمله آن‌ها می‌توان به انواع سرطان ها اشاره کرد (12). به‌طور معمول، حالات غیرعادی متیلاسیون دو جنبه هیپرمتیلاسیون و هیپومتیلاسیون را دربرمی‌گیرند. پس از وقوع متیلاسیون، کروموزوم‌ها پایدار می‌شوند و فعالیت آن‌ها کاهش می‌یابد. متیلاسیون، بیان ژن را با دو مکانیسم جداگانه مهار می‌کند: ممانعت مستقیم، در این مکانیسم از رونویسی کروموزوم متیله شده ممانعت می‌شود و ممانعت غیرمستقیم، در این مکانیسم، دو نوع از پروتئین‌ها شامل پروتئین‌های وابسته به متیلاسیون و هیستون داستیلازها در سطح کروموزوم به خدمت گرفته می‌شوند (12). به‌طورکلی، متیلاسیون و داستیلاسیون در پیوند با بیان ژن عمل می‌کنند؛ اما متیلاسیون واقعه‌ای متقدم در این فرایند است. با وجود این، تحت برخی شرایط، داستیلاسیون مقدمه وقوع متیلاسیون است.

الگوهای غیرطبیعی در متیلاسیون DNA عموماً در بسیاری از بیماری‌ها دیده می‌شوند. خواه به‌عنوان نتیجه‌ای از افزایش بیان پروتئین‌های وابسته به متیلاسیون یا وقوع هیپرمتیلاسیون در راه‌اندازهای ویژه سلول‌های سرطانی، الگوی چرخه سلولی، آپوپتوز و بروز تغییرات در ترمیم DNA، شاهد انحراف متعاقب در تمایز و اتصالات سلول‌ها هستیم که عموماً مشخصه بیماری‌هاست (11). هنگام بروز متیلاسیون DNA غیرعادی، رخ دادن چهار حالت محتمل است: غیرفعال شدن ترمیم جفت شدن بازی اشتباه، ناپایداری کروموزوم‌ها، هیپومتیلاسیون ژن‌های سرطانی، هیپرمتیلاسیون ژن‌های بازدارنده تومور. به طور تقریبی 60 درصد از ژن های انسانی با الگوی متیلاسیون CpG در نواحی تنظیمی کنترل می گردد.جزایر CpG معمولا در نواحی پروموتری واقع هستند و در صورت طبیعی بودن الگوی متیلاسیون، فاکتورهای رونویسی به راحتی به نقطه شروع رونویسی متصل می شوند و بیان ژن به طور طبیعی صورت می گیرد. با افزایش متیلاسیون در این نواحی بیان ژن مورد نظر کاهش یافته و حتی ممکن است ژن به طور کامل خاموش گردد. بررسی های اخیر حاکی از آن است که الگوی غیر طبیعی متیلاسیون در توموری شدن سلول ها موثر است به طوری که افزایش متیلاسیون در نواحی تنظمی ژن های سرکوب کننده تومور و ترمیم کننده DNA منجر به خاموش شدن این ژنها و در نتیجه ایجاد و پیشرفت سرطان می شود. از طرف دیگر کاهش متیلاسیون در نواحی تنظیمی انکوژن ها باعث افزایش بیان آنها و در نتیجه هدایت سلول ها به سمت توموری شدن می شود. این مکانیسم با فعال سازی انکوژن های دخیل در فرایند رشد و بقای سلولی و آپوپتوز و چرخه سلولی در گسترش سلول های سرطانی نقش دارد (13). در مجموع می‌توان گفت از آنجا که انکوژن‌ها و ژن‌های بازدارنده تومور می‌توانند نقش‌ مهمی در سرطان داشته باشند و با توجه به اینکه متیلاسیون می‌تواند بیان ژن را مهار کند، سطح متیلاسیون ژن‌های خاص در سرطان، می‌تواند انعکاسی از این موضوع باشد که ژن مذکور یک انکوژن است یا یک بازدارنده تومور.

ناقلین کاتیونی ارگانیک (OCT) پرتئین های انتقالی غشایی هستند که در بسیاری از فرایندهای متابولیک و سم زدایی مشارکت دارند. مهمترین اعضای این خانواده عبارتند از: OCT1(SLC22A1), OCT2 (SLC22A2), OCT3 (SLC22A3) که هر کدام نسبت به سوبستراهای ویژه حساسند و الگوی بیان متفاوتی در بافت ها دارند. در انسان، OCT1 عمدتا در کبد و در غشا پایه هپاتوسیت ها، OCT2 در غشا پایه سلول های اپیتلیال کلیه و سیستم ادراری و تناسلی بیان می شوند در حالیکه OCT3 در بسیاری از بافت ها از قبیل جفت، قلب، کبد و ماهیچه های اسکلتی بیان می شود. عملا، ناقلین OCT در بسیاری از مسیرهای متابولیسم حضور دارند و موجب تقویت اثر یکدیگر می شوند (14, 15).

نکته جالب توجه این است که بیان پروتئین های OCT در بسیاری از لاین های سلولی سرطانی و بافت های توموری شناسایی شده است. در این زمینه، Heise  و Lautem  در دو مطالعه جداگانه نشان دادند که بیان OCT1 و OCT3 در افراد مبتلا به HCC و کارسینومای کلانژیوسلولار کم می شود و این کاهش بیان ارتباط معناداری با میزان پیشرفت تومور و بقای بیمار دارد (16, 17). فرایند بیان OCT ها توسط مکانیسم های پیچیده ای تنظیم می شود (18, 19) و هرچند مطالعات متعددی در زمینه شناسایی این مکانیسم ها انجام شده است اما همچنان مسیر کنترل عملکرد دقیق این پروتئین ها شناسایی نشده است.

مطالعات نشان داده است که فعالیت OCT1 با عملکرد مهار کننده های تیروزین کیناز (TK1) در ارتباط است و منجر به افزایش حساسیت TK1 در بیماران مبتلا به سرطان مزمن لوکمی می شود (20-22). همچنین بیان SLC22A1 ممکن است نحوه پاسخ به درمان های حاوی سورافنیب را تحت تاثیر قرار دهد (23). در همین راستا، Grimm  و همکاران نشان دادند که در بیماران دریافت کننده رژیم سورافنیب، میزان بیان mRNA پروتئین OCT1 زیاد می شود و می توان از این پدیده به عنوان یک فاکتور پیش آگهی دهنده مثبت و معنادار در بیماران استفاده کرد (24). هرچند این دسته از مطالعات نقش OCT1 را در HCC نشان می دهد، ولیکن نقش OCT3 به خوبی شناخته نشده است. در این مطالعات عملکرد تاثیرگذار OCT1 در بیماری HCC به وضوح مورد تایید قرار گرفته است.

SLC22A3 ژن کد کننده پروتئین غشایی OCT3 به وزن 62 کیلو دالتون می باشد و اخیرا مطالعات نشان داده است که SLC22A3 نقش حیاتی در پاتوژنز بیماری های قلبی دارد (25).

به منظور ارزیابی میزان بیان OCT3 در هپاتوکارسینوژنز،  Vollmarو همکارانش طی مطالعه  in vivo بر روی موش های  Oct3-knockout متوجه شدند که حذف OCT3 می تواند منجر به پیشرفت ضایعات بدخیم و هپاتوکارسینوژنز شود (26).

Heise  و Lautem  در دو مطالعه جداگانه نشان دادند که بیان OCT1 و OCT3 در افراد مبتلا به HCC و کارسینومای کلانژیوسلولار کم می شود و این کاهش بیان ارتباط معناداری با میزان پیشرفت تومور و بقای بیمار دارد (16, 17).

بررسی ها نشان می دهد که موش های Oct3-/- بسیار مستعد بروز و پیشرفت تومورهای کبدی هستند و تایید کننده این موضوع است که در افراد مبتلا به HCC نیز کاهش بیان پروتئین های OCT می تواند با پیشرفت ضایعه به تومور بدخیم مرتبط باشد (16).

ضمن مطالعه لاین سلولی سرطان کبد HepG2 مشخص شد که بیان SLC22A3 ارتباط مستقیمی با قدرت کارسینوژنیسیته ترکیبات هیدروکربنی پلی سیکلیک و آروماتیک (PHA) دارد (27).

طی مطالعه ای که در آسیا انجام شده ، تغییرات ژنتیکی ژن SLC22A3 به عنوان یک ریسک فاکتور سرطان کولون دیستال گزارش شده است (28).

مطالعات Chen (19) بیانگر تغییرات مخرب در متابولیسم سلول هایی است که فاقد OCT1 می باشند و Fu نشان داده است که کمپلکس OCT3 مکانیسم های دخیل در ایجاد متاستاز سرطان مری را تحت تاثیر قرار دهد (29).

Nies گزارش کرده است که پروتئین OCT3 عمدتا در غشا پایه هپاتوسیت ها بیان می شود و در بیماران مبتلا به کولستاز کبدی بیان آن در سطح mRNA کم می شوند (30).

در مطالعه ای که در آمریکا انجام شد، Chen نشان داد که تغییرات ژنتیک و اپیژنتیک ناحیه پروموتر می تواند میزان بیان OCT3 را تحت تاثیرقرار دهد. فراوانی هاپلوتایپ های ویژه در اقوام آفریقایی-آمریکایی درسایر اقوام با افزایش بیان این پروتئین همراه می باشد. آنها نشان دادند که بیان OCT3 mRNA در بافت کبد آسیایی ها و قفقازی های واجد آلل هموزیگوت  g.-2A/A  نسبت به سایر اقوام بیشتر است. همچنین متیلاسیون ناحیه پروموتر این ژن ارتباط تنگاتنگی با میزان بیان پروتئین OCT3 و قابلیت تومورزایی در انواع لاین های سلولی سرطان پروستات دارد (31).

کرومودومین هلیکاز اتصالی 5  DNA     (Chromodomain helicase DNA-binding 5, CHD5) یکی از اعضای خانواه پروتئین های تغییر شکل دهنده کروماتین تحت عنوان Swi/Snf (SWItch/Sucrose Non-Fermentable) است. این پروتئین ها در هسته سلول های یوکاریوت مستقر هستند و وظیفه آنها کنترل مسیر های بسته بندی DNA می باشد و نیز در بیان ژن تاثیر گذارند (32). اخیرا Bagchi و همکارانش ضمن مطالعه بر روی نمونه های موش تشخیص دادند که CHD5 عملکرد های ویژه یک ژن سرکوب کننده تومور را ایفا می کند (33). وی نشان داد که حتی جزی ترین نقص در عمکرد CHD5 می تواند باعث اختلال در مسیر پیام رسانی P53 شود و به عبارتی عدم وجود عملکرد های کنترلی CHD5  باعث فعال شدن مکانیسم های به شدت مخرب و تقویت پیشرفت و گسترش سرطان می شود. این احتمال که CHD5 به عنوان یک سرکوب کننده تومور بتواند نقش موثری در بیان و عملکرد  پروتئین OCT3 داشته باشد چندان دور از ذهن نیست و تا کنون بررسی نشده است. برای اولین بار طی مطالعاتی که بر روی نوروبلاستوما انجام شد مشخص گردید که حذف توالی مربوط به لوکوس CHD5  در کروموزوم 1p36.3  انسانی تقریبا رایج است و می تواند دلیل خوبی در ایجاد سرطان های اولیه انسانی باشد زیرا CHD5  یک مهار کننده تومور است (34). بیان CHD5  همواره در رده های سلولی سرطانی و نیز نوروبلاستومای اولیه کم می شود و این در حالی است که احتمالا متیلاسیون این ژن تاثیر مستقیمی بر بیان آن دارد (35, 36).

تا امروز تنها شواهد نشان دهنده نقش موثر CHD5  در سرطان انسان از مطالعات GWAS سرطان های سینه و کولون و تعیین توالی این ژن ناشی شده است به گونه ای که بدنبال این مطالعات ژن CHD5  با عبارت “CAN-gene”  معرفی شده است (37). در این راستا جهش های مخرب هتروزیگوت در 2 مورد از 24 بیمار مبتلا به سرطان اولیه سینه و 1 مورد از 11 گونه سل لاین مشاهده شد. این پدیده در سرطان های سینه و تخمدان بسیار رایج است (38, 39) بنابراین بسیار منطقی است که CHD5  به عنوان یک ژن کاندید هدف در انواع سرطان ها مورد مطالعه قرار بگیرد.

شیوع واقعی ابتلا به سرطان کبد در ایران هنوز ناشناخته است و نتایج تحقیقات نشان می دهد که میزان مرگ و میر حاصل از سرطان کبد در ایران در طول سالیان اخیر افزایش داشته است. ایران در منطقه خاورمیانه قرار گرفته است. ناحیه ای که در آن اکثر موارد مبتلا به سرطان کبد در مراحل متوسط یا پیشرفته شناسایی می شوند. همچنین برآورد می شود که در ایران حدود 1.5 میلیون نفر به هپاتیت B مبتلا هستند که از این تعداد بیش از 15 تا 40 درصد در معرض ابتلا به سیروز کبدی یا سرطان کبد می باشند و نیز از داده ها چنین بر می آید که میزان ابتلا به سرطان کبد با افزایش سن، افزایش می یابد (40-42).

این دو مارکر هر کدام به تنهایی عامل موثر ایجاد کننده سرطان می باشند، با توجه به اینکه OCT3 یکی پروتئین غشایی است و  CHD5 یک پروتئین موثر در فولدینگ کروماتین است  به عبارتی می توان گفت که تغییرات ژنتیک و اپی ژنتیک CHD5 در بیان و عملکرد هر پروتئینی از جمله OCT3 موثر خواهد بود. لذا نظر به اهمیت این سرطان کشنده در دنیا و با در نظر گرفتن میزان مرگ و میر این سرطان و با توجه به عدم وجود برنامه های غربالگری، تشخیص زودهنگام بیماری، افزایش بروز این سرطان و پایین بودن بقای بیماران مبتلا به دلیل تشخیص بیماری در سطوح پیشرفته این سرطان، قصد داریم در این تحقیق به مطالعه ارتباط میان الگوی متیلاسیون ناحیه پروموتر ژنهای  OCT3 و CHD5 و بیان mRNA OCT3 و CHD5 در بیماران مبتلا به سرطان هپاتوسلولار و افراد سالم بپردازیم و میزان مشارکت این فاکتورها را در تشخیص و پیش آگهی بیماران مستعد ابتلا به HCC بررسی کنیم.

• میزان بیان ژن OCT3 در مبتلایان به HCC و سالم متفاوت است.
• الگوی متیلاسیون ناحیه پروموتر ژن OCT3 در مبتلایان به HCC و سالم متفاوت است.
• میزان بیان ژن  CHD5 در مبتلایان به HCC و سالم متفاوت است.
• الگوی متیلاسیون ناحیه پروموتر ژن CHD5 در مبتلایان به HCC و سالم متفاوت است.

تعیین میزان بیان mRNA و الگوی متیلاسیون ناحیه پروموتر ژن های OCT3  و  CHD5 در بیماران مبتلا به سرطان هپاتوسلولار در مقایسه با افراد سالم

• تعیین و مقایسه میزان بیان ژن OCT3 در مبتلایان به HCC و سالم.
• تعیین و مقایسه الگوی متیلاسیون ناحیه پروموتر ژن OCT3 در مبتلایان به HCC و سالم
• تعیین و مقایسه میزان بیان ژن CHD5 در مبتلایان به HCC، و سالم.
• تعیین و مقایسه الگوی متیلاسیون ناحیه پروموتر ژن CHD5 در مبتلایان به HCC و سالم

موسسات آموزشی، پژوهشی و درمانی- دانشگاه علوم پزشکی زاهدان

•  سرطان اولیه سلول های کبدی (HCC)، Hepatocellular carcinoma
• واکنش زنجیره ای پلیمراز ترانس کریپتاز معکوس کمی (QRT-PCR)،(RT-PCR)quantification reverse transcription polymerase chain reaction :یکی از انواع روش های واکنش زنجیره ای پلیمراز است که برای شناسایی میزان بیان RNA استفاده می شود.
• DNA methylation ، متیلاسیون DNA فرایند بیوشیمیایی است که در رشد و نمو عادی موجودات رده بالا دارای اهمیت می‌باشد. در این فرایند، یک گروه متیل به موقعیت ۵ حلقه پیریمیدین سیتوزین یا به نیتروژن شماره ۶ حلقه پورین آدنین اضافه می‌شود. این تغییرات می‌تواند از طریق تقسیمات سلولی به ارث برسند.
• OCT3: Organic Cation Transporter 3
• کرومودومین هلیکاز اتصالی 5  DNA     (Chromodomain helicase DNA-binding 5, CHD5)

موردی- شاهدی

بیماران مبتلا به هپاتوسل کارسینوم مراجعه کننده به بیمارستان شهید لبافی نژاد تهران،  بیمارستان سوم شعبان تهران و مرکز تحقیقات گوارش و کبد دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله الاعظم (عج) و بیمارستان های  دانشگاه علوم پزشکی شیراز (گروه مورد )  از سال 1394 تا پایان دوره طرح. بخشی از نمونه های خون از آرشیو بخش بافت شناسی و مربوط به طرح 7262 با عنوان (بررسی بیومارکرهای رشد سلولی و آپوپتوز و هیستومورفولوژی کبد به منظور شناسایی موارد سرطان هپاتوسلولار ناشی از HBV : یک مطالعه ایمونوهیستوشیمی، استریولوژی، واکنش QRT-PCR، و الکترون میکروسکوپی) استخراج خواهد شد و همچنین تمام افرادی که طی یک سال آینده به بیمارستان شهید لبافی نژاد تهران،  بیمارستان سوم شعبان تهران و مرکز تحقیقات گوارش و کبد دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله الاعظم (عج) و بیمارستان های  دانشگاه علوم پزشکی شیراز مراجعه کنند و معیار ورد به مطالعه را داشته باشند نیز تا پایان مطالعه وارد پژوهش خواهند شد و از آنها نمونه خون تهیه خواهد شد.

معیارهای ورود: ابتلا به هپاتوسل کارسینوم

معیارهای خروج: مصرف کنندگان مواد دخانی، زنان باردار، بیماران دیابت نوع یک و دو، بیماران قلبی عروقی و کلیوی، HIV ، افراد واجد ضایعات سرطانی خوش خیم و یا بدخیم در سایر ارگان ها، افراد مبتلا به بیماری های اتوایمیون.

تعیین حجم نمونه با مشورت با متخصص آمار، با توجه به شیوع متوسط هپاتوسلولار کارسینوما در ایران و بر اساس مطالعات مولکولی گذشته بادر نظر گرفتن 1/0=p ( نسبتی از جمعیت دارای صفت معین)، مقدار متغیر نرمال واحد استاندارد در میزان اطمینان 95 درصد (96/1=Z ) و میزان خطای قابل تحمل (04/0=d) حداقل به تعداد 100 نمونه (100 نمونه مبتلا به HCC و100 نمونه کنترل) برآورد شد.

نمونه های مورد نظر  از بین افراد مبتلا به HCC که شاخص های ورود به مطالعه را داشته باشند انتخاب می شوند. گروه کنترل از بین افراد زنده که داوطلب اهدا کبد هستند و مطالعه بافت شناسی کبد آنها را نرمال گزارش می کند با توجه به شرایط ورود و عدم داشتن شرایط خروج، با همسان سازی سن و جنس به مطالعه  وارد خواهند شد. تست های مولکولی شامل اندازه گیری بیان ژن و الگوی متیلاسیون در مرکز تحقیقات جامع انجام خواهد شد.

فرم اطلاعاتی ضمیمه 1

استخراج DNA و RNA در مرکز تحقیقات بیماری های عفونی و گرمسیری دانشگاه علوم پزشکی زاهدان انجام خواهد شد. سپس تعیین و مقایسه میزان بیان کمی OCT3 و CHD5 ، ارزیابی الگوی متیلاسیون در مبتلایان به HCC و افراد سالم انجام خواهد شد.

بیماران مبتلا به HCC که به تشخیص پزشک معالج نیاز به نمونه گیری دارند انتخاب خواهد شد. همه بیمارانی که در ارزیابی های هیستوپاتولوژیک بافت کبد، محاسبه آزمایشگاهی شاخص آسیب کبدی (آلانین آمینوترانسفراز و آسپارتات آمینوترانسفراز)، شاخص سنتز کبدی )آلبومین، پروترومبین، بیلی روبین)، شاخص کلستاز(آلکالن فسفاتاز و گاما گلوتامیل ترانس پپتیداز)، سونوگرافی کبد، توموگرافی کامپیوتری و رزونانس مغناطیسی هسته ای (NMR) ابتلا به HCC در آنها محرض شده است و نیاز به نمونه گیری داشتند به عنوان گروه های مورد انتخاب خواهد شد.

شرکت کنندگان با پر کردن فرم رضایتنامه ،رضایت آگاهانه کتبی خود را مبنی بر شرکت در این پژوهش اعلام خواهند کرد.

در این طرح 5 میلی لیتر نمونه خون از هر فرد گرفته شده و به دو قسمت تقسیم خواهد شد. بخشی از نمونه خون محیطی در لوله حاوی EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid ) به عنوان ماده ضد انعقاد از افراد تهیه و در دمای 80 – درجه سانتیگراد تا زمانیکه استخراج DNA ژنومی و RNA بر روی نمونه های خون انجام شود فریز می گردد. استخراج DNA ژنومی با استفاده از روش نمک اشباع و به روش دستی و استخراج RNA تام  ژنومی با استفاده از کیت استخراج RNA  انجام خواهد شد. با استفاده ازدستگاه اسپکتروفوتومتر نسبت جذب نوری در طول موج260 نانومتر (طول موجی که DNA و یا RNA حداکثر جذب را دارد) به 280 نانومتر (طول موجی که در آن پروتئین حداکثر جذب را دارد) اندازه گرفته و نمونه هایی که بهترین خلوص را دارند(2>280/260 OD >1.8 )در 80- درجه سانتیگراد جهت استفاده در فرایند  qRT-PCR و MSP-PCR فریز خواهند شد . پرایمرهای اختصاصی برای بررسی بیان ژنی و متیلاسیون به روش  qRT-PCR و MSP-PCR طراحی خواهند شد. برای تعیین میزان بیان  RNA بیومارکر  از روش QRT-PCR (Quantification Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) یا واکنش زنجیره ای پلیمراز ترانس کریپتاز معکوس کمی استفاده خواهد شد. در این روش پس از طراحی و تهیه  پرایمرها و پروب های مناسب جهت تکثیر RNA و تولید CDNA مناسب و تکثیر آن برای بیومارکر، واکنش پلیمریزاسیون با استفاده از مواد اولیه خریداری شده از شرکت های معتبر و با استفاده از دستگاه Real Time انجام خواهد شد. روش ( MSP)  methylation specific  نیازمند دو جفت پرایمر می‌باشد، یک جفت پرایمر فوروارد و معکوس اختصاصی برای DNA تیمار شده با بی سولفیت نوع متیله (M) یک جفت پرایمر فوروارد و معکوس اختصاصی برای DNA تیمار شده با بیسولفیت از نوع غیرمتیله (U). بنابراین برای هر نمونه دواکنش PCR با هر جفت پرایمر انجام می‌شود. تکثیر با جفت پرایمرهای M متیلاسیون جایگاه‌های CpG را نشان می‌دهد اما تکثیر با جفت پرایمرهای U بیانگر عدم متیلاسیون در جایگاه‌های پرایمر می‌باشد یک احتمال دیگر هم وجود دارد و آن هم این است که توالی توسط هر دو جفت پرایمر M و U تکثیر شود که این بیانگر متیلاسیون جزئی این توالی می‌باشد.

مراحل استخراج DNA  به صورت مختصر: در یک میکروتیوپ 5/1 میلی لیتری به 500 میکرولیتر خون تام 1 میلی لیتر لیر بافر لیزکننده1 اضافه کرده و با چند بار سر و ته کردن مخلوط و پس از 2 دقیقه مرحله بعد را انجام میدهیم. مخلوط را به مدت 2 دقیقه در 12000rpm  در درجه حرارت اتاق سانتریفوژ و سوپرناتانت را دور میریزیم. به رسوب 500 میکرولیتر بافر لیزکننده 1را اضافه و با پیپتاژ حل نموده سپس حجم را با بافر 1 به 1500 میکرولیتر رسانده و پس از چند بار سرو ته کردن به مدت 2 دقیقه در 6000 دور و دمای اتاق سانتریفوژ و محلول رویی را دور میریزیم. به رسوب 400 میکرو لیتر بافر لیزکننده 2 ضافه کرده و به مدت 10 دقیقه در درجه حرارت اتاق قرار داده و با پیپتاژ رسوب را حل می نماییم. به مخلوط مرحله چهار 100 میکرولیتر کلرید سدیم اشباع و 600 میکرولیتر کلروفرم اضافه کرده و به آرامی با چند بار سرو ته کردن میکروتیوب مخلوط کرده به طوری که یک مخلوط شیری رنگ ایجاد شود سپس به مدت دو دقیقه و در 6000 دور سانتریفوژ میکنیم(دمای اتاق). 400میکرولیتر سوپرناتانت را به یک لوله تمیز انتقال داده و 800 میکرولیتر ایزوپروپیل سرد به آن اضافه نموده و به آرامی با چند بار سرو ته کردن میکروتیوب مخلوط می تماییم. سپس تیوب ها را به مدت 2 دقیقه در دمای 4 درجه و 12000 دور سانتریفوژ میکنیم. سوپر ناتانت را دور ریخته و به آن اتانول 70٪ سرد اضافه و با سرو ته کردن کردن تیوب ها مخلوط و سپس به مدت 2 دقیقه در 12000 دور و دمای 4 درجه سانتریفوژ میکنیم. محلول رویی را دور ریخته و تیوب را وارونه روی دستمال قرار داده و اجازه می دهیم رسوب در هوای اتاق خشک شود (20 دقیقه). به رسوب 100میکرولیتر آب مقطر استریل اضافه می کنیم.

روش استخراج RNA به صورت مختصر: 200 میکرولیتر خون تام را در تیوب ریخته و دوبرابر حجم خون آب مقطر سرد به آن اضافه می شود. به منظور لیز گلبول های قرمز چندین مرتبه به شدت  shake کرده و ۱۰ تا ۱۵ دقیقه به صورت متناوب با قرار دادن میکروتیوب بر روی یخ و قرار دادن در دمای اتاق، شوک حرارتی به نمونه داده می شود. افزایش گرانروی خون در نمونه نشانگر لیز شدن گلبول­های قرمز است. میکروتیوب را در دمای ترجیحا ۴ درجه سانتیگراد سانتریفوژ می کنیم. این مرحله را تا زمان شیری رنگ شدن رسوب (pellet) و عدم مشاهده رنگ قرمز تکرار می کنیم. بر روی رسوب ترایزول ریخته که از تمامیت ساختار RNA طی مراحل استخراج RNA محافظت می نماید. چندین مرتبه tap و در ادامهshake نموده تا محلول یکنواخت شود. ۱۰ تا ۱۵ دقیقه در دمای اتاق انکوبه می کنیم. کلروفورم سرد به میکروتیوب اضافه کرده و۳۰ ثانیه به شدت تکان می دهیم.۱۰ الی ۱۵ دقیقه میکروتیوب را در دمای اتاق قرار داده و سپس میکروتیوب حاوی نمونه را در ۱۴۰۰۰ rpm در دمای ۴ درجه سانتیگراد به مدت ۲۰ دقیقه سانتریفوژ می نماییم. فاز آبی رویی را به میکروتیوب جدید RNase free سرد منتقل نموده و بر روی آن به میزان هم حجم، ایزوپروپانل ( و یا دو برابر حجم، اتانل مطلق) سرد می ریزیم. چندین بار میکروتیوب را سر و ته کرده و به مدت حداقل ۲۰ دقیقه در فریزر  منفی ۲۰ درجه سانتیگراد قرار می دهیم. سپس میکروتیوب را به مدت ۲۰ دقیقه با دور ۱۴۰۰۰۰ rpm در دمای  ۴ درجه سانتیگراد سانتریفوژ می کنیم.  بر روی رسوب ml1 اتانل ۷۵% سرد اضافه می کنیم. چند مرتبه پیپتاژ کرده و سپس ۱۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتیگراد با دور ۱۰۰۰۰ rpm سانتریفیوژ نموده تا RNA رسوب کند. سوپرناتانت را خارج کرده و در محیط اجازه semi dehydration به RNA استخراج شده داده می شود. در نهایت ۲۰ میکرولیتر DEPC treated water اضافه کرده و با پیپتاژ کردن رسوب RNA را حل می کنیم.

جهت مقایسه فراوانی پلی مورفیسم ها از آزمون کای اسکوئر و برای مقایسه متغیرهای کمی از آزمون T-Test استفاده می گردد . برای اثبات تبعیت داده ها از توزیع نرمال ابتدا آزمون کولموگروف-اسمیرونوف (one sample Kolmogorov–Smirnov test) انجام خواهد پذیرفت. تست Tokeys posthoc برای مقایسه میانگین ها و تفاوت گروه های آزمایشی مورد استفاده قرار می گیرد. به منظور مقایسه و آنالیز متغیرهای وابسته ای که بیش از دو حالت دارند نیز از مدل رگرسیون لجستیک Multinomial Logistic Regression استفاده خواهد شد. برای آنالیز تمام داده ها و انجام تست های آماری از نرم افزار SPSS ویرایش 20 بهره خواهیم برد. هنگامیکه 05/0P≤ شود تفاوت ها معنی دار فرض خواهند شد.  

کدهای 1،2،3،4،5،10،13،18،28،30 مصوب کمیته کشوری اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی که در دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش‌های دارای آزمودنی انسانی در جمهوری اسلامی ایران، دربردارنده‌ی اصول و مقررات اخلاقی‎ مطرح  و در سال 1392 در 31 بند تصویب شده است در این طرح رعایت می شود. تمامی بیماران تحت مطالعه آگاهانه و برای مقاصد علمی  اقدام به دادن نمونه خواهند کرد. شرکت در این طرح هیچ گونه هزینه ای برای بیماران ندارد و نام و مشخصات بیماران گزارش نخواهد شد.

همچنین کدهای 1و2و3و4و5و6و7و8و9 مصوب کمیته کشوری اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی که در دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی مربوط به بخش عمومی تصویب شده است در این طرح رعایت می گردد.

همچنین کدهای 1و5و6و13 مصوب کمیته کشوری اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی که در دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش‌های ژنتیک پزشکی تصویب شده است در این طرح رعایت می گردد.

مشکلات مربوط به تهیه مواد اولیه و تجهیزات آزمایشگاهی مورد نیاز و بودجه مورد نیاز طرح عمده ترین محدودیت های اجرای طرح به نظر می رسد زیرا بسیاری از مواد مورد نیاز باید از منابع خارج از کشور تهیه شوند و در این ارتباط بحث تحریم های اقتصادی خودنمایی می کند. برای مدیریت این محدودیت و همچنین منابع مالی، بسیاری از محلول ها بصورت دستی تهیه خواهد شد.

ترانسپورتر کاتیون ارگانیک 3، کرومودومین هلیکاز اتصالی 5  DNA، هپاتوسلولار کارسینوما (HCC)، ریل تایم کمی، متیلاسیون

Organic Cation Transporter 3 (OCT3), Chromodomain helicase DNA-binding 5

1.         Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E, Forman D. Global cancer statistics. CA: a cancer journal for clinicians. 2011;61(2):69-90.

2.         Malekzadeh F, Sepanlou SG, Poustchi H, Naghavi M, Forouzanfar MH, Shahraz S, et al. Burden of Gastrointestinal and Liver Diseases in Iran: Estimates Based on the Global Burden of Disease, Injuries, and Risk Factors Study, 2010. Middle East journal of digestive diseases. 2015;7:138-54.

3.         Khajedaluee M, Dadgarmoghaddam M, Saeedi R, Izadi-Mood Z, Abrishami M, Zamani M. Mortality, Morbidity, Survival, and Burden of Top 9 Cancers in a Developing Country. Razavi Int J Med. 2014;2(3):e20073.

4.         Hajarizadeh B, Razavi-Shearer D, Merat S, Alavian SM, Malekzadeh R, Razavi H. Liver Disease Burden of Hepatitis C Virus Infection in Iran and the Potential Impact of Various Treatment Strategies on the Disease Burden. Hepat Mon. 2016;16(7):e37234.

5.         Bosetti C, Levi F, Boffetta P, Lucchini F, Negri E, La Vecchia C. Trends in mortality from hepatocellular carcinoma in Europe, 1980-2004. Hepatology. 2008;48(1):137-45.

6.         Ryerson AB, Eheman CR, Altekruse SF, Ward JW, Jemal A, Sherman RL, et al. Annual Report to the Nation on the Status of Cancer, 1975-2012, featuring the increasing incidence of liver cancer. Cancer. 2016;122(9):1312-37.

7.         Hashim D, Boffetta P, La Vecchia C, Rota M, Bertuccio P, Malvezzi M, et al. The global decrease in cancer mortality: trends and disparities. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 2016;27(5):926-33.

8.         Mulcahy MF. Management of hepatocellular cancer. Current treatment options in oncology. 2005;6(5):423-35.

9.         Thomas MB, Abbruzzese JL. Opportunities for targeted therapies in hepatocellular carcinoma. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2005;23(31):8093-108.

10.       Bosch FX, Ribes J, Diaz M, Cleries R. Primary liver cancer: worldwide incidence and trends. Gastroenterology. 2004;127(5 Suppl 1):S5-s16.

11.       Edwards JR, Yarychkivska O, Boulard M, Bestor TH. DNA methylation and DNA methyltransferases. Epigenetics & chromatin. 2017;10:23.

12.       Jung M, Pfeifer GP. Aging and DNA methylation. BMC biology. 2015;13:7.

13.       Yoo CB, Jones PA. Epigenetic therapy of cancer: past, present and future. Nature reviews Drug discovery. 2006;5(1):37-50.

14.       Jonker JW, Wagenaar E, Van Eijl S, Schinkel AH. Deficiency in the organic cation transporters 1 and 2 (Oct1/Oct2 [Slc22a1/Slc22a2]) in mice abolishes renal secretion of organic cations. Molecular and cellular biology. 2003;23(21):7902-8.

15.       Zwart R, Verhaagh S, Buitelaar M, Popp-Snijders C, Barlow DP. Impaired activity of the extraneuronal monoamine transporter system known as uptake-2 in Orct3/Slc22a3-deficient mice. Molecular and cellular biology. 2001;21(13):4188-96.

16.       Heise M, Lautem A, Knapstein J, Schattenberg JM, Hoppe-Lotichius M, Foltys D, et al. Downregulation of organic cation transporters OCT1 (SLC22A1) and OCT3 (SLC22A3) in human hepatocellular carcinoma and their prognostic significance. BMC cancer. 2012;12:109.

17.       Lautem A, Heise M, Grasel A, Hoppe-Lotichius M, Weiler N, Foltys D, et al. Downregulation of organic cation transporter 1 (SLC22A1) is associated with tumor progression and reduced patient survival in human cholangiocellular carcinoma. International journal of oncology. 2013;42(4):1297-304.

18.       Hyrsova L, Smutny T, Trejtnar F, Pavek P. Expression of organic cation transporter 1 (OCT1): unique patterns of indirect regulation by nuclear receptors and hepatospecific gene regulation. Drug metabolism reviews. 2016;48(2):139-58.

19.       Chen L, Shu Y, Liang X, Chen EC, Yee SW, Zur AA, et al. OCT1 is a high-capacity thiamine transporter that regulates hepatic steatosis and is a target of metformin. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111(27):9983-8.

20.       Crossman LC, Druker BJ, Deininger MW, Pirmohamed M, Wang L, Clark RE. hOCT 1 and resistance to imatinib. Blood. 2005;106(3):1133-4; author reply 4.

21.       White DL, Saunders VA, Dang P, Engler J, Venables A, Zrim S, et al. Most CML patients who have a suboptimal response to imatinib have low OCT-1 activity: higher doses of imatinib may overcome the negative impact of low OCT-1 activity. Blood. 2007;110(12):4064-72.

22.       White DL, Saunders VA, Dang P, Engler J, Zannettino AC, Cambareri AC, et al. OCT-1-mediated influx is a key determinant of the intracellular uptake of imatinib but not nilotinib (AMN107): reduced OCT-1 activity is the cause of low in vitro sensitivity to imatinib. Blood. 2006;108(2):697-704.

23.       Herraez E, Lozano E, Macias RI, Vaquero J, Bujanda L, Banales JM, et al. Expression of SLC22A1 variants may affect the response of hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma to sorafenib. Hepatology. 2013;58(3):1065-73.

24.       Grimm D, Lieb J, Weyer V, Vollmar J, Darstein F, Lautem A, et al. Organic Cation Transporter 1 (OCT1) mRNA expression in hepatocellular carcinoma as a biomarker for sorafenib treatment. BMC cancer. 2016;16:94.

25.       Li L, He M, Zhou L, Miao X, Wu F, Huang S, et al. A solute carrier family 22 member 3 variant rs3088442 G-->A associated with coronary heart disease inhibits lipopolysaccharide-induced inflammatory response. J Biol Chem. 2015;290(9):5328-40.

26.       Vollmar J, Lautem A, Closs E, Schuppan D, Kim YO, Grimm D, et al. Loss of organic cation transporter 3 (Oct3) leads to enhanced proliferation and hepatocarcinogenesis. Oncotarget. 2017;8(70):115667-80.

27.       Staal YC, van Herwijnen MH, van Schooten FJ, van Delft JH. Modulation of gene expression and DNA adduct formation in HepG2 cells by polycyclic aromatic hydrocarbons with different carcinogenic potencies. Carcinogenesis. 2006;27(3):646-55.

28.       Cui R, Okada Y, Jang SG, Ku JL, Park JG, Kamatani Y, et al. Common variant in 6q26-q27 is associated with distal colon cancer in an Asian population. Gut. 2011;60(6):799-805.

29.       Fu L, Qin YR, Ming XY, Zuo XB, Diao YW, Zhang LY, et al. RNA editing of SLC22A3 drives early tumor invasion and metastasis in familial esophageal cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114(23):E4631-e40.

30.       Nies AT, Koepsell H, Winter S, Burk O, Klein K, Kerb R, et al. Expression of organic cation transporters OCT1 (SLC22A1) and OCT3 (SLC22A3) is affected by genetic factors and cholestasis in human liver. Hepatology. 2009;50(4):1227-40.

31.       Chen L, Hong C, Chen EC, Yee SW, Xu L, Almof EU, et al. Genetic and epigenetic regulation of the organic cation transporter 3, SLC22A3. The pharmacogenomics journal. 2013;13(2):110-20.

32.       Marfella C G, Imbalzano A N. The Chd Family of Chromatin Remodelers. Mutat Res. 2007;618:30-40.

33.       Bagchi A, Papazoglu C, Wu Y, Capurso D, Brodt M, Francis D, et al. CHD5 is a tumor suppressor at human 1p36. Cell Biochem Funct. 2007;128:459–75.

34.       White PS, Thompson PM, Gotoh T, Okawa ER, Igarashi J, Kok M, et al. Definition and characterization of a region of 1p36.3 consistently deleted in neuroblastoma. Oncogene 2005;24:2684–94.

35.       Okawa ER, Gotoh T, Manne J, Igarashi J, Fujita T, Silverman KA, et al. Expression and sequence analysis of candidates for the 1p36.31 tumor suppressor gene deleted in neuroblastomas. Oncogene 2008;27:803–10.

36.       Thompson PM, Gotoh T, Kok M, White PS, GM B. CHD5, a new member of the chromodomain gene family, is preferentially expressed in the nervous system. Oncogene 2003;22:1002–11.

37.       Sjöblom T, Jones S, Wood LD, Parsons DW, Lin J, Barber TD, et al. The consensus coding sequences of human breast and colorectal cancers. Science 2006;314:268–74.

38.       Bernardini M, Lee CH, Beheshti B, Prasad M, Albert M, Marrano P, et al. High-resolution mapping of genomic imbalance and identification of gene expression profiles associated with differential chemotherapy response in serous epithelial ovarian cancer. Neoplasia. 2005;7:603–13.

39.       L.Gorringe. K, Choong. DYH, Williams. LH, Ramakrishna. M, Sridhar. A, Qiu. W, et al. Mutation and Methylation Analysis of the Chromodomain- Helicase-DNA Binding 5 Gene in Ovarian Cancer1,2. Neoplasia. 2008;10:1253–8.

40.       Hajiani E, Masjedizadeh R, Hashemi J, Azmi M, Rajabi T. Risk factors for hepatocellular carcinoma in Southern Iran. Saudi medical journal. 2005;26(6):974-7.

41.       Alavian SM, Hajarizadeh B, -Asl MA, Kabir A, Lankarani KB. Hepatitis B Virus Infection in Iran: A Systematic Review.8(4):281-94.

42.       Salehi-Vaziri M, Sadeghi F, Almasi Hashiani A, Gholami Fesharaki M, Alavian SM. Hepatitis B Virus Infection in the General Population of Iran: An Updated Systematic Review and Meta-Analysis. 2016;16(4):e35577.

نتایج تحقیقات نشان می دهد که میزان مرگ و میر حاصل از سرطان کبد در ایران در طول سالیان اخیر افزایش داشته است. همچنین برآورد می شود که در ایران حدود 1.5 میلیون نفر به هپاتیت B مبتلا هستند که از این تعداد بیش از 15 تا 40 درصد در معرض ابتلا به سیروز کبدی یا سرطان کبد می باشند. نظر به اهمیت این سرطان کشنده در دنیا و با در نظر گرفتن میزان مرگ و میر این سرطان و با توجه به عدم وجود برنامه های غربالگری، تشخیص زودهنگام بیماری، افزایش بروز این سرطان و پایین بودن بقای بیماران مبتلا به دلیل تشخیص بیماری در سطوح پیشرفته این سرطان، دیدگاه ما در این پژوهش این است که با کمک تکنیک بیان ژن و PCR بیومارکر جدیدی در تشخیص و پیش آگهی بیماران مستعد ابتلا به HCC ارائه دهیم. در مورد این موضوع OCT3 و CHD5 به عنوان یک عامل مستقل در شناسایی بیمار و عامل پیش آگهی بیماری و توصیف کننده میزان بقا، انتخاب شده و می تواند گامی موثر در شناسایی زودهنگام بیماران HCC در مراحل اولیه ابتلا بردارد.

دارد

ندارد

ندارد

ندارد

هزینه  آزمایشات  این طرح به عهده مجریان خواهد بود.

ندارد

نتایج بصورت کاملاً محرمانه و صرفاً جهت مقاصد پژوهش به کار خواهد رفت و هویت بیماری افراد در چارچوب قانون و جامعه و خانواده محرمانه خواهد ماند.

آدرس مجریان طرح جهت پاسخ گویی به سوالات بیماران شرکت کننده در مطالعه:

زاهدان، بزرگراه خلیج فارس، روبروی بیمارستان علی ابن  ابیطالب(ع) مجتمع پزشکی پردیس، گروه بافت شناسی

مرکز تحقیقات آزمایشگاه جامع

شرکت من در مطالعه کاملاً اختیاری است و آزاد خواهم بود که از شرکت در مطالعه امتناع نموده یا هر زمان  که مایل بودم بدون آنکه تغییری در نحوه رفتار پزشک درمانگر یا نحوه درمان و مراقبت از بیماری اینجانب ایجاد شود از پژوهش مذکور خارج شوم.

با توجه به اطلاعات موجود در این فرم و توضیحات حضوری مجری یا همکاران طرح موافقت خود را با شرکت در این مطالعه اعلام می نمایم. یک نسخه از این فرم به من داده شده و فرصت خواندن آن را داشته ام.

فرم اطلاعاتی طرح پژوهشی

بررسی میزان بیان mRNA و الگوی متیلاسیون ناحیه پروموتر ژن های OCT3  و  CHD5 در بیماران مبتلا به سرطان هپاتوسلولار در مقایسه با افراد سالم

اطلاعات زمینه ای:

نام ونام خانوادگی: 

گروه شاهد                     شماره .......                         گروه مورد              شماره ..........

سن(سال)  :            

جنس:       مرد                   زن

علائم بالینی بیمار: