بررسی میزان بیان miR-211 و الگوی متیلاسیون پروموتور ژن CHD5 در مردان نابارور مبتلا به الیگواسپرمی شدید در مقایسه با گروه کنترل

ناباروری یکی از تجربیات تلخ زندگی است و به عنوان یک بحران جدی در زندگی محسوب می­گردد که باعث اختلافات در زندگی زناشویی و افت کیفیت زندگی می‌شود.[1] این اختلال تقریباً 15% زوج‌ها را در سنین باروری درگیر می‌کندکه بر اساس تعریف سازمان بهداشت جهانی World Health Organization WHO) به حالتی اطلاق می‌شود که زوجین پس از یک سال مقاربت­های متوالی، منظم و بدون استفاده از روش­های پیشگیری،  با عدم­موفقیت در باروری مواجه می‌شوند.[2]

ناباروری دلایل مختلفی دارد که بر پایه مطالعات انجام شده، 30 تا 50% از علل ناباروری مربوط به فاکتورهای مردانه،30 تا 50% مربوط به علل زنانه، 25 تا 40% مربوط به تأثیر هم­زمان فاکتورهای مردانه و زنانه و درنهایت 10 تا 15% از موارد بدون هیچ علت مشخصی گزارش شده است.[3] بنابراین در حدود نیمی از موارد ناباروری، یک عامل مردانه دخیل است که به عوامل ژنتیکی و غیرژنتیکی مربوط می‌شود[4] شناخت کامل مسیر اصلی اسپرم­سازی و وقایع و حساسیت­های هر مرحله حائز اهمیت است. اسپرماتوژنز یکی از جالب‌ترین مکانیسم‌های تکامل سلولی است که در آن سلول­های بنیادی و دیپلوئید اسپرماتوگونی، اسپرماتوزوآی هاپلوئید را ایجاد می‌کنند که پس از بلوغ قادر به بارور کردن تخمک می‌باشد.[5]

تولیـد اسپرم در پسـتانداران شـامل سـه مرحلـه­ی تمـایزی می‌باشد. 1- میتـوز در (اسـپرماتوگونی) سلول‌های بنیادی بالغ 2- میوز یـا اسـپرماتوژنز و3- اسپرمیوژنز(گلیکوزیلـه شـدن، متراکم شدن هسته اسپرم، تبدیل اسپرماتید طویل شده به اسپرم بالغ و از دست دادن مقدار زیادی از سیتوپلاسم).[6] با وجود پیشرفت­های چشمگیر در روش­های تشخیصی و درمان،  در بیش از 25%­­ مردان، که آنالیز مایع منی غیرطبیعی دارند،  بیماری با علت و منشاء ناشناخته گزارش می‌شود، این شرایط تحت عنوان ناباروری ایدوپاتیک[1] خوانده می‌شود.[7] این افراد بر اساس معیارهای WHO در چهار دسته 1-آزواسپرمی[2]( عدم وجود کامل اسپرم در مایع­منی) ، 2- الیگواسپرمی[3] (تعدادکمتر از 15 میلیون در میلی لیتر) [8]، الیگواسپرمی شدید،[4]( نمونه هایی که تعداد اسپرم در هر میلی لیتر مایع انزالی کمتر از 5 میلیون باشد)، 3- آستنواسپرمی[5] (حرکت کمتر از 40٪) و 4- تراتواسپرمی[6] (کمتر از 4٪ شکل تخم مرغی نرمال) قرار می‌گیرند.[9]

از جمله دلایل الگواسپرمی شدید، می‌توان به نارسایی اولیه بیضه به دلیل اختلالات ژنتیکی، مادرزادی،  عفونی، بدخیمی‌ها،  شیمی­درمانی، پرتو­درمانی یا عوامل ناشناخته اشاره کرد.[10]

منابع آسیب رسان متعددی از جمله گونه‌های اکسیژن فعال ROS) Reactive Oxygen Species)[7]، اختلال در تراکم کروماتین اسپرم و آپوپتوز می‌تواند ­­­به اسپرماتوژنز آسیب برساند.[11] در اسپرماتیدهای در حال طویل شدن، پروتامین­ها جایگزین پروتئین­های انتقالی و هیستون می‌شوند، به طوری که DNA اسپرم حاوی 15 درصد هیستون و 85 درصد پروتامین می‌شود و اسپرم بـالغ بـه علـت داشـتن کرومــاتین متــراکم از نظــر رونویســی خــاموش وغیرفعال می‌شود[12] که سلول را در برابر انواع دناتوره شدن‌های فیزیکی و شیمیایی حفظ می‌کند. بدیهی است که روند طبیعی متراکم شدن کروماتین اسپرم در مردها بسیار حائز اهمیت بوده و هرگونه نقص در این جایگزینی، سبب کاهش پایداری  DNA و افزایش حساسیت دربرابر انواع استرس­ها شده و در نهایت بر قدرت باروری و حتی رشد و نمو اولیه جنین تأثیر می‌گذارد.[13] این فرآیند درحالت نرمال یک­بار در طی میوز اولیه زمانی­که سلول DNA خود را به منظور انجام نوترکیبی همولوگ در کروموزوم ترمیم می‌کند و بار دیگر، هنگامیکه اسپرماتیدهای کروی در حال طویل شدن هستند و به سمت بلوغ اسپرماتوزوآ پیش می‌روند، رخ می‌دهد.[14]

با توجه به اهمیت تراکم کروماتین، عواملی که از طریق اختلال در بیان ژن­های این فرآیند مانند (CHD5)  Chromodomain helicase DNA binding در اسپرماتوژنز نقص ایجاد­کنند، می‌توانند باعث ناباروری شوند. عوامل  اپی­ژنتیک[8] روی بیان ژن‌ها اثر می‌گذارد، اما بر توالی DNA اثری ندارد [15]  و یکی از عوامل مهم و قابل‌سنجش در ناباروری مردان است. طی تولید سلول‌های جنسی، تغیرات  اپی­ژنتیک ،ایجاد می شود، این اصطلاح، اولین بار در سال 1942 به‌کار رفت. [16, 17] مکانیسم‌های اپی­ژنتیک درگیر در تنظیم بیان ژن شامل تنظیم و تراکم کروماتین، متیلاسیون [9] DNA، تغییرات هیستون [18] و وضعیت قرارگیری نوکلئوزوم است. [19] متیلاسیون DNA در بسیاری از فرآیندهای بیولوژیک مانند رشد اسپرم و جنین و سرکوب برخی ژن‌ها دخیل است و اختلال در آن در بروز بیماری‌های زیادی نقش دارد.[20, 21]

مطالعات زیادی به اهمیت متیلاسیون DNA در اسپرماتوژنز به‌منظور روشن شدن ارتباط بین اختلال در تنظیم متیلاسیون DNA و ناباروری مردان پرداخته و این موضوع می تواند مبنایی برای پیشگیری یا درمان ناباروری در مردان باشد. [22]

سلول‌های جنسی طی مراحل مختلف اسپرماتوژنز تحت متیلاسیون قرار می­گیرند[23] که باعث فعال‌سازی یا سرکوب بیان ژن‌ها می‌شود. متیلاسیون DNA از عمده‌ترین زمینه‌های مطالعاتی اپی­ژنتیک در پستانداران بوده [24] و مکانیسم‌های مشابهی در خاموش یا روشن کردن ژن‌های مرتبط با ناباروری دارد. تغییرات بیوشیمیایی متیلاسیون DNA  و تشکیل 5 هیدروکسی متیل سیتوزین hmC، بیشتر در جزایر[10] CpG و بخش پروموتر ژن یا اولین اگزون، ایجاد می‌شود.[25] تقریبا ۶۰ % پروموترهای انسانی محتوی CpG بالایی دارند که در ژن‌هایی که رونویسی فعالی دارند به‌ صورت غیر متیله(هایپومتیله) و در پروموتر ژن‌های خاموش به­صورت هایپرمتیله دیده می­شود.[26, 27] آنچه نقش هایپرمتیلاسیون را در بیماری­ها قابل توجه کرده است توارث، برگشت‌پذیری و انعطاف‌پذیر بودن آن است. شانس بازگشت فنوتیپ سلول به شکل نرمال به‌ وسیله ممانعت از متیلاسیون، از مزایای قابل‌توجه روند اپی­ژنتیک  بر  ژنتیک کلاسیک است. تجزیه و تحلیل مایع منی مردان نابارور نشان داده است که 4/14٪ متیلاسیون غیرعادی در ژن H19 وجود دارد که ممکن است، با  فعالیت غیر طبیعی (DNMTs)  DNA methyltransferase همراه باشد.[28] در انسان، DNA هایپرمتیله اسپرم با پارامترهای ضعیف در آنالیز اسپرم و ناباروری ایدیوپاتیک مردان در ارتباط است[29-31] که عوامل ایجاد الیگواسپرمی، عمدتاً باآپوپتوز وتغییر درپروتئین‌های چرخه سلولی  ارتباط دارند.[32] با توجه به اهمیت اسپرماتوژنز و تغییرات اساسی که در بازآرایی کروماتین رخ می‌دهد، ژن­هایی که در آن نقش دارند، می‌توانند با ناباروری مردان ارتباط داشته باشند.[33]  ژن  CHD5که یک واسطه در آبشار حوادث مولکولی مورد نیاز برای حذف و جایگزینی هیستون با پروتامین است با تغییرات هایپر یا هایپومتیلاسیون می‌تواند فعال یا غیرفعال شود. این ژن یکی از اعضای خانواده کرومودومین هلیکاز-DNA اتصال یابنده به  DNA است و یکی از تنظیم­کننده‌های مهم  ساختار کروماتین بوده که تقریباً  به طور انحصاری در سیستم عصبی و بیضه (6 برابر بیشتر) بیان می‌شود،[34] CHD5 بر روی کروموزوم 1 و در ناحیه p36.3، قرار گرفته و به عنوان یک نوع (TSG) Tumor suppressor gene شناخته می شود.[35]

(PHD) Plant homology domain، از دو هومودومین گیاهی پشت ­سرهم تشکیل شده است. پروتئین‌های  CHD توسط کرومودومین­های پشت­سر هم N- ترمینال با دامنه هلیکاز کاتالیزوری Snf2 (پروتئین تعدیل کننده کروماتین هلیکاز وابسته به ATP) به طرف C ترمینال مشخص می‌شوند[36]. در حال حاضر 9 عضو شناخته شده از این خانواده در انسان (CHD1-CHD9) وجود دارد که (CHD3 و CHD4) به صورت کمپلکس‌های چند پروتئینی در بازسازی کروماتین شرکت می‌کنند و  CHD5 تنها همولوگ نزدیک  به آنها است.[37]

Zhuang و همکارانش در سال   2014 نقش این ژن را در یک نژاد  موش ناک اوت knockout (KO)  بررسی کردند. خاموش شدن این ژن، منجر به نقص در اسپرم­سازی، فاگوسیتوز ناقص و باقی ماندن سیتوپلاسم  اضافی در سرِاسپرم، ناتوانی در ورود به اپیدیدیم به دلیل مورفولوژی نامناسب و­ عدم جایگزینی هیستون و تراکم کروماتین شدکه ناباروری موش های نرها هموزیگوت KO را به همراه داشت.[38] مورفولوژی غیرطبیعی اسپرم در مقایسه­ بیوپسی بیضه مردان با اسپرماتوژنز کامل و ناقص، این امر را آشکار کرد که بیان CHD5 در آنها 75%-95% کاهش یافته است.[39] در سرطان‌های متعددی از جمله گلیوما، ریه، معده، روده بزرگ، تخمدان، پروستات و کلورکتال این ژن متیله می‌شود[40] و بیان کم ژن CHD5  به دلیل متیلاسیون  باعث ایجاد سرطان پستان،  می شود.[41]

مطالعات نشان داده که CHD5 مانند یک ژن سرکوبگر تومور  TSGsرشد سلول را در نوروبلاستوما و سایر تومورها کنترل می‌کند که تغییر در عملکرد آن می‌تواند منجر به ایجاد تومور شود، TSGsدر فرآیندهای مربوط به گامتوژنز[11]نیز نقش دارند،[42] خاموش کردن  اپی­ژنتیک TSG از طریق هایپرمتیلاسیون پروموتر CpG منجر به پیشرفت تومور می‌شود، بنابراین می‌توان از میزان بیان آنها به عنوان نشانگرهای­ اپی­ژنتیکی برای تشخیص استفاده کرد.[43]

3′-UTR قسمتی از مولکول  mRNAاست که  نقش مهمی در پایداری آن دارد و محل اتصال microRNA (miRNA) می‌باشد. miRNA ها وظایفی غیر ازویژگی­های  معمـولmRNA   در نظریه  مولکولی واتسون دارنـد، آنها 10% از ژن‌های غیرکدکننده وگروه کوچکی از RNA های تک­رشته‌ای هستندکه 18 تا 24 نوکلئوتید داشته و در تنظیم بیان ژن در سطح پس از رونویسی اهمیت دارند.[44, 45]  همچنین درتکوین و رشد موجودات اثر داشته و می‌توانند در تشخیص بیماری ها به عنوان بیومارکرهای زیستی به کار روند و در خانم­ها، پلی­مورفیسم miR196a2C>T با سقط مکرر، اندومتریوز، پره اکلامپسی و ناباروری ارتباط داشت.[46, 47]

مطالعه  Caiدر سال 2012 نشان داد علاوه براینکه، هیپرمتیلاسیون جزایر CpG پروموتور ژن CHD5  وکاهش بیان آن با سرطان کولورکتال ارتباط دارد،  miR-211نیز این ژن را از طریق تنظیم کاهشی، کنترل می­کند.[48]  Naraparaju درمطالعه ای در سال 2016 نشان داد که هفت miRNA  ، بیان ژن CHD5راتنظیم می­کنند، از جمله miR-211 که در نوروبلاستما به طور قابل توجهی از طریق تنظیم کاهشی ژن CHD5 به طور بالقوه برروی بیان این ژن اثر گذاشت و با این بیماری مرتبط بود.[49]  

با توجه به  شیوع بالای ناباروری در جهان، ایران و استان سیستان و بلوچستان،که نیمی از دلایل آن مربوط به مردان است و اهمیت ونقش فرزندآوری درحفظ بنیان خانواده، تلاش جهت پیدا کردن روشهای  شناسایی سریع و دقیق حائز اهمیت است.

بر اساس نظر کارشناسان، در نتایج  اسپرموگرام مردان نابارو، الیگواسپرمی شدید،  فراوان بوده و این افراد در مرحله بعد به پزشک، برای انجام  تست بالینی، اندازه گیری هورمونها، بیوپسی بیضه  و سایر  روشهای تشخیصی مراجعه می­کنند.انجام روشهای تهاجمی، هزینه­های بالا جهت تشخیص، دوره طولانی، موفقیت های نسبی درمان و استرس های وارد شده به فرد، معمولا باعث عدم پیگیر ی و ادامه درمان در مردان می­شود. لذا نیاز مبرمی به انجام مطالعات گسترده در زمینه روشهای تشخیص غیر تهاجمی و بدون استرس،کارآامد، ارزان و زود هنگام برای الیگواسپرمی احساس می­شود. انجام آزمایش های ژنتیک بر روی نمونه خون، به دلیل غیر تهاجمی، آسان، در دسترس بودن و دقت بالا می­تواند، پزشک را در انتخاب  روش درمان  صحیح،  یاری کند.

چون افراد نابارور اغلب رضایت به دادن نمونه بیضه نمی دهند و از طرف دیگر مطالعات حیوانی که قبلا روی بافت انجام شده هم براحتی قابل تعمیم به انسان نیست، باید تلاش کرد تا شاخص دیگر غیر تهاجمی پیدا کرد. بررسی شاخص های فوق در خون محیطی تلاشی است در این جهت می باشد. لذا هدف از این مطالعه بررسی میزان بیان miR-211  و الگوی متیلاسیون ژن CHD5 (که بر فرآیندهای پس از ترجمه اثردارد و فعالیت ژن را تغییر می­دهد) و در مردان نابارور مبتلا به الیگواسپرمی شدید در مقایسه با کنترل سالم است.

به عبارتی بررسی عوامل ژنتیک و اپی ژنتیک  می­تواند ما را با سرعت و دقت بیشتر و مطمئن تر از گذشته  با بکارگیری، مارکر های اختصاصی و دقیق به تشخیص صحیح  الیگواسپرمی شدید، رسانده  و انتخاب روش درمانی موثر، زود هنگام و سودمند، امید به درمان و بهبودی را افزایش خواهد داد.

1. میزان بیان miR-211  درمردان نابارور الیگواسپرمی شدید وآزواسپرمی غیر انسدادی با گروه کنترل متفاوت است.

2. توزیع فراوانی  متیلاسیون پروموتور ژن CHD5 در نمونه خون مردان نابارور الیگواسپرمی شدید وآزواسپرمی غیر انسدادی با گروه کنترل متفاوت است.

3. میزان  بیان  ژن miR-211  و متیلاسیون پروموتور ژن CHD5 با استعداد ابتلا به ناباروری مردان به علت الیگواسپرمی شدید وآزواسپرمی غیر انسدادی ارتباط دارد.

تعیین میزان بیان  miR-211  و متیلاسیون پروموتور ژن CHD5  در مردان نابارور الیگواسپرمی شدید وآزواسپرمی غیر انسدادی در مقایسه با گروه کنترل

1. تعیین و مقایسه  میزان  بیان miR-211  در مردان نابارور الیگواسپرمی شدید وآزواسپرمی غیر انسدادی با گروه کنترل

2. تعیین و مقایسه فراوانی  متیلاسیون پروموتور ژن CHD5 در مردان نابارور الیگواسپرمی شدید وآزواسپرمی غیر انسدادی باگروه کنترل

3. تعیین ارتباط میزان بیان ژن miR-211 و متیلاسیون پروموتور ژن CHD5 با استعداد ابتلا به ناباروری به علت الیگواسپرمی شدید وآزواسپرمی غیر انسدادی

• مراکز تحقیقاتی
• مراکز درمان ناباروری
• دانشگاه های علوم پزشکی و گروه های مرتبط وزات علوم، تحقیقات و فناوری

  نواحی  Untranslated region) UTR) قسمتی از مولکول mRNAاست که نقش مهمی در پایداری آن دارد و محل اتصال microRNA  می‌باشد.

MS-PCR-methylatio specific –PCR)) تکنیکی که توانایی شناسایی سیتوزین های متیله ارز غیر متیله دارد و باید DNA  بی­سولفیت شود و همه سیتوزین هابه اوراسیل تبدیل شوند به  جز سیتوزین های متیله، که دو جفت پرایمر طراحی شده و توالی مرد نظر در ناحیه تنظیمی جزایر CpG تکثیر می شود.

RT-PCR RealTime -PCR)) تکنیکی برای محاسبه کمی میزان بیان ژن در  نمونه با استفاده از یک رنگ اختصاصی،که میل ترکیبی با دو رشته DNA داشته باشد و نور ساطع شده نشان دهنده میزان تکثیراست. به تدریج طی تکثیر،  نورافزایش یافته و در نهایت ثابت می شود

مورد- شاهدی(case-control)

مردان نابارور الیگواسپرمی شدید وآزواسپرمی غیر انسدادی مراجعه کننده به مرکز ناباروری مولود بیمارستان علی ابن ابیطالب زاهدان برای انجام تست اسپرموگرام

معیارهای ورودبه مطالعه

1. آزمایش تعیین سطح هورمون FSH  که در افراد نرمال میزان آن  ( mIU/mL 9/10تا4/1 ) است و معمولا در مردان نابارورآزواسپرمی غیر انسدادی(عدم وجود اسپرم در مایع سمن) افزایش سطح این هورمون مشاهده می شود[53]    

   2- نتیجه آنالیزهای آزمایش اسپرموگرام آنها تعداد کمتر از 5 میلیون اسپرم در مایع منی را نشان دهد و الیگواسپرم شدید باشند.

3-مدت  یک سال بدون استفاده از روشهای جلوگیری از بارداری ، تلاش برای بارداری  همسرشان انجام داده و نتیجه ای حاصل نشده باشد .

4-کاریوتایپ غیر نرمال و ریزحذف های کروموزوم Y نداشته باشند.

معیارهای خروج  از مطالعه

1. آزو اسپرمی انسدادی (آزمایش تعیین سطح هورمون FSH  )

2- نتیجه آنالیزهای آزمایش اسپرموگرام آنها تعداد کمتر از 5 میلیون اسپرم در مایع منی را نشان ندهد و الیگواسپرم شدید نباشند.

    3- حداقل دارای یک فرزند باشند.

1. مردانی که طبق آنالیزهای اسپرموگرام، تراتواسپرمی  وآستنواسپرمی و الیگواسپرمی خفیف و متوسط  باشند.  

5- مردان الیگو اسپرمی شدید،که دیابت یا فشار خون بالا داشته باشند ویا از داروی خاصی مانند، داروهای زیبایی اندام (تستوسترون) استفاده کنند.

6-مردان الیگواسپرمی شدید که اطلاعات پرونده کاملی نداشته باشند و شماره تماسی از آنها موجود نباشد یا مایل به شرکت در مطالعه نباشند.

7- مردان الیگواسپرمی شدیدکه سیگاری شدید باشند.

8-مردانی که  واریکوسل داشته باشند

9-آزمایش ژنتیک کاریوتیپ غیر نرمال (کلاین فلترXXY 47)، وجود ریز حذفی کروموزوم Y،آنومالی بیضه

گروه کنترل:

1. مردانی که حداقل یک  فرزند داشته باشند
2. تست اسپرموگرام آنها نرمال باشد
3. بیماری زمینه ای مانند فشار خون ،دیابت، سرطان یا مصرف داروهای خاص و ایمنی نداشته باشند
4. اطلاعات پرونده آنها کامل باشد
5. مکمل های پروش اندام استفاده نکرده باشند
6. در محدوده سنی باروری قرار داشته باشند
7. دوری از مقاربت به مدت 3 - 5 شبانه روز

مصرف دخانیات ، الکل و داروهای پروش اندام نداشته باشند

براساس اصول کلی مطالعات ژنتیک و مولکولی قبل، حداقل 100 نمونه از هر گروه مورد نیاز است. 100 نمونه  خون مردان بارور و سالم در گروه کنترل، 100 نمونه  خون از مردان نابارور که  بر طبق آزمایش آنالیز اسپرم الیگواسپرمی شدید و آزواسپرمی غیر انسدادی  باشند، وارد خواهد شد.

بر اساس مطالعات قبلی، تعیین حجم نمونه با استفاده از فرمول کوکران با در نظر گرفتن 1/0=p ( نسبتی از جمعیت دارای صفت معین)، مقدار متغیر نرمال واحد استاندارد در میزان اطمینان 95 درصد (96/1=Z ) و میزان خطای قابل تحمل (04/0=d) به تعداد 200 نمونه (100 نمونه مردان بارور و100 نمونه مردان نابارورآزواسپرم/ الیگواسپرم شدید) با علل نامعلوم برآورد شد[54]

نمونه گیری به صورت آسان و در دسترس است. 

دو گروه ازنظر سن،BMI، تحصیلات، وضعیت شغلی و قومیت همسان سازی خواهند شد. با توجه به تعداد محدود افراد مبتلا به آزواسپرمی در صورت استفاده از از روشهای نمونه گیری احتمالی با کمبود حجم نمونه مواجه خواهیم شد.جهت تضمین حجم نمونه مورد نظر آزواسپرمی و الیگواسپرمی شدید مورد بررسی قرار خواهند گرفت. در مورد همسان سازی سن جهت پیشگیری از مواجهه با مشکلات overmatching، از همسان سازی گروهی استفاده خواهد شد.

5 میلی لیتراز خون محیطی افراد نابارور الیگواسپرمی شدید و آزواسپرمی غیر انسدادی گرفته و درداخل  میکروتیوب حاوی  محلول  EDTA ریخته، برای تحقیق استفاده می­کنیم و بخشی را برای انجام مراحل  بعدی در فریزر c °80- نگهداری خواهیم کرد.

نمونه­های مورد نظراز بین افراد مبتلا به الیگواسپرمی شدید و آزواسپرمی غیر انسدادی    طبق شاخص های ورود و خروج از مطالعه، انتخاب می شوند.گروه کنترل نیز، افرادی هستند که حداقل یک  فرزند داشته و تست اسپرموگرام آنها نرمال باشد، بیماری زمینه ای مانند فشار خون، دیابت، سرطان یا مصرف داروهای خاص و ایمنی و دخانیات نداشته باشند که با همسان سازی سن به مطالعه  وارد خواهند شد.

پس از خون گیری از مردان با الیگواسپرمی شدید آزوسپرمی و استخراج  DNA, RNA، با استفاده از تکنیک های مختلف  PCR میزان بیان miR-211  و تغییرات  متیلاسیون ژن CHD5ثبت می شود که فرم اطلاعاتی در پیوست ضمیمه شده است.

فرم اطلاعات دموگرافیک (ضمیمه)

فرم  ثبت اطلاعات نمونه (ضمیمه)

پس از اخذ تائیدیه کمیته اخلاق و رضایتنامه از مردان نابارور با الیگواسپرمی شدید و گروه کنترل که معیارهای ورد به مطالعه را داشته باشند، 5 میلی لیتر خون محیطی را در  لوله های حاوی  محلول  EDTA ریخته وبرای استخراج  DNA و RNA  در دمای c °80-  نگهداری خواهیم کرد. جهت آزمایش های مولکولی بر روی نمونه، DNA از خون تام  با استفاده از روشSalting out  ( استخراج نمکی ) جدامی­شود. برای ارزیابی کمی وتعیین غلظتDNA ،(از نظر الودگی به پروتئین و RNA) نسبت جذب طول  موج 260 به 280  نانومتر  را با کمک دستگاه اسپکتوفتومتر نانودراپ  بعد از کالیبره کردن با آب مقطر طبق دستور، اندازه گیر ی می­کنیم و جذب بین (2>280/260 OD >8/1 ) مطلوب خواهد بود .

بررسی کیفی نمونه نیز به کمک ژل آگارز  ساخته شده طبق دستور وروش الکتروفورزکه  باعث حرکت  ذرات شده و تحت میدان الکتریکی و براساس وزن مولکولی و بار آنها را جدا می­کند انجام می شود، سپس در دستگاه ژل داک، تصویر باندهای تشکیل شده را مشاهده،  عکس گرفته و کیفیت نمونه را بررسی خواهیم کرد.

 به رسوب  DNAاستخراج شده آب مقطر استریل اضافه کرده و برای انجام کارهای بعدی در دمای c °20- نگهداری می­کنیم.

برای بررسی وضعیت  متیلاسیون ژنCHD5 ، از تکنیک متیلاسیونMS-PCR  استفاده خواهد شدکه یک روش  PCRاختصاصی است و توانایی شناسایی سیتوزین های متیله از غیر متیله  را دار د. بنابراین ابتداDNA  استخراج شده را با استفاده از کیت، طبق دستورالعمل بی سولفیت کرده، یعنی تمام سیتوزین های موجود  درژنوم به غیر از سیتوزین های متیله به اوراسیل تبدیل می­کنیم، سپس  دو سری  پرایمراختصاصی برای شناسایی نواحی  متیله و غیر متیله پروموتور ژن CHD5 طراحی  می­کنیم که به ترتیب حاوی مکمل های گوانین و آدنین و قادر به اتصال توالی هدف هستند، مواد لازم  و چرخه دمایی برای برای هر دو پرایمر را تعیین کرده وطبق دستورMS-PCR  انجام وپس از الکتروفورز، باندهای متیله و غیر متیله، بررسی و متیلاسیون نواحی پروموتور ژن CHD5   بررسی خواهد شد.

برای سنجش میزان بیان miR-211، ابتدا RNA از نمونه خون تام، طبق دستور کیت، استخراج می شودکه خلوص آن در دستگاه نانودراپ، بین 8/1 تا 2 مناسب خواهد بود. نسبت های کمتر، آلودگی RNA را با پروتئین و مقادیر بزرگ‌تر از 2 دلیل وجود  DNAدر نمونه خواهد بود. RNA استخراج شده را در ژل آگارز، بارگذاری کرده و مشاهده­ی باندهای RNA های ریبوزومی (18s rRNA و28s rRNA) کیفیت و صحت استخراج RNA را تأیید خواهد کرد.

RNA به دلیل وجود هیدروکسی در ساختارش ناپایدار بوده، بنابراین آن را در دمای c °80-  برای آنالیز های بعدی نگهداری خواهیم کرد و با توجه به اینکه  نمی توان مستقیما از RNA  به  عنوان الگو برای واکنش PCR استفاده کرد، ابتدا بااستفاده از کیت تبدیل RNA به cDNA، آنزیم رونویسی معکوس    (Reversetranscriptase ) و پروتوکل، DNA مکمل سنتز می­شود، پس از طراحی پرایمرمناسب، به کمک  دستگاه Real-Time PCR  و رنگ اختصاصی (SYBER Grean) میزان کمی  بیان  miR-211ارزیابی خواهد شد. رنگ میل ترکیبی با  DNAدو رشته­ای داشته و نور ساطع  می­کند، به این ترتیب، هرچه رنگ بیشتری بین دو رشته DNA قرارگیرد، با گذشت زمان، متعاقبا بازتابش نور فلورسانس افزایش یافته که با میزان تکثیر DNA ( RNA  حاصل از بیان) ارتباط دارد، این بازتابش در دستگاه Real-Time به کمک یک آشکارگر، منحنی هایی را ثبت وگزارش خواهدکرد، آنالیز منحنی ذوب، تکثیرو اولین سیکل رو به افزایش بازتابش، یعنی سیکل آستانه برای محاسبات آماری و تعیین میزان بیان حائز اهمیت خواهد بود، علاوه براین، صحت وکنترل مراحل تبدیل را با نتیجه بیان  ژنی که، در تمام سلولها بیان نسبتا یکسانی دارد و به آن ژن خانگی House keeping gene   می­گویند مقایسه می کنیم.

نتایج حاصل  از میزان بیان miR-211  و متیلاسیون پروموتور ژن CHD5 و ارتباط هریک از این متغییرها باهم، در این تحقیق در افراد سالم و الیگواسپرمی شدید، بررسی و تفسیر خواهد شد.

بـرای ثبـت داده هـا و آنـالیز آمـاری از نــرم افــزار SPSS استفاده و در تمام آنالیزها p< 0.05  بـه عنـوان سـطح معنـی دار آمـاری در نظر گرفته خواهد شد. اطلاعات کمی به صورت میانگین  ± انحراف معیارارائه می­شود. تفاوت های آماری بین متغیرهـای کیفی دو گروه بیمار و کنترل با اسـتفاده از آزمون chi-square   یا  Fisher Exact Test و مقایسه داده های کمی  باindependent sample

 t- test انجام خواهد شد. به منظوربررسی بیان ژن  در دو گروه از روش    ^ct∆∆-2 استفاده و  جهت  مقایسه میزان بیان، آزمون mann whitney  را به کار خواهیم برد. برای  مقایسه mRNA  از آزمون T مستقل استفاده خواهد شد. مقایسه داده ها در افراد گروه های سالم و بیمار از نظر فراوانی متیلاسیون،  با آزمون(مجذور کای دو) x² ، تجزیه و تحلیل شده، جهت مقایسه پارامترهای بالینی با نوع ژنوتیپ از آزمونt- test  و برای ارتباط متیلاسیون و بیان بین دو گروه کنترل  و بیمار از رگرسیون لاجستیک استفاده خواهد شد

کدهای (1و2و3و4و5وو811و12و13و14و15و16و17و18و25و26و28و29و30و31) مصوب کمیته کشوری اخلاق در پژوهش  های علوم پزشکی که در دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهشهای علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی در جمهوری اسلامی ایران، در بردارنده اصول و مقررات  اخلاقی مطرح و در سال 1392  در 31 بند تصویب شده است در این طرح رعایت می شود .تمامی بیماران تحت مطالعه آگاهانه و برای مقاصد علمی اقدام به دادن خون خواهند کرد شرکت در این طرح ، هیچ گونه هزینه ای برای بیماران ندارد و نام ومشخصات آنها گزارش نخواهد شد.

همچنین کدهای(1و2و4و6و7و8) مصوب کمیته کشوری  اخلاق درپژوهش های  علوم پزشکی که در دفترچه

راهنمای عمومی، دفترچه راهنمای اخلاق پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی، تصویب شده است در این طرح رعایت می گردد.

عدم همکاری بیمارکه مجبور خواهیم شد زمان بیشتری صرف کنیم تا حجم نمونه تکمیل شود.

مشکل تهیه مواد وتجهیزات آزمایشگاهی مورد نیاز و امکان طولانی شدن زمان دریافت است که می توان زودتر آنها را سفارش داد و یا از تجهیزات مراکز و دانشگاه های دیگر استفاده کرد.

نقص اطلاعاتی بعضی پرونده ها که با بررسی و پیگیری بیشتر تعداد مواردی که  دارای اطلاعات کامل باشند، انتخاب خواهد شد

Methylation –CHD5- miR211- oligospermic infertiles

1.            Dabo, K., International Conference on Population and Development (ICPD). Follow-up to the Cairo and Ouagadougou programs of action. Pop Sahel: bulletin d'information sur la population et le developpement, 1999(28): p. 33.

2.            Luo, L.-F., C.-C. Hou, and W.-X. Yang, Small non-coding RNAs and their associated proteins in spermatogenesis. Gene, 2016. 578(2): p. 141-157.

3.            Agarwal, A., C. Ong, and D. Durairajanayagam, Contemporary and future insights into fertility preservation in male cancer patients. Translational andrology and urology, 2014. 3(1): p. 27-40.

4.            Wein AJ, K.L., Novick AC, Partin AW, Peters CA.,

Campbel–Walsh Urology. 10th Edition. Philadelphia: W, 2010: p. 25-30.

5.            ARYA, M. and T. VANHA‐PERTTULA, Lectin‐binding pattern of bull testis and epididymis. Journal of andrology, 1985. 6(4): p. 230-242.

6.            Meistrich, M.L. and R.A. Hess, Assessment of spermatogenesis through staging of seminiferous tubules, in Spermatogenesis. 2013, Springer. p. 299-307.

7.            Kara, E. and M. Simoni, Genetic screening for infertility: When should it be done? Middle East Fertility Society Journal, 2010. 15(3): p. 139-145.

8.            Poongothai, J., T. Gopenath, and S. Manonayaki, Genetics of human male infertility. Singapore Med J, 2009. 50(4): p. 336-347.

9.            Menkveld, R., Clinical significance of the low normal sperm morphology value as proposed in the fifth edition of the WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. Asian journal of andrology, 2010. 12(1): p. 47.

10.          Rowe, P.J., et al., WHO manual for the standardized investigation and diagnosis of the infertile male. 2000: Cambridge University Press.

11.          Ezeh, U., H. Moore, and I. Cooke, Correlation of testicular sperm extraction with morphological, biophysical and endocrine profiles in men with azoospermia due to primary gonadal failure. Human reproduction (Oxford, England), 1998. 13(11): p. 3066-3074.

12.          Sakkas, D., E. Mariethoz, and J.C.S. John, Abnormal sperm parameters in humans are indicative of an abortive apoptotic mechanism linked to the Fas-mediated pathway. Experimental cell research, 1999. 251(2): p. 350-355.

13.          Miller, D., M. Brinkworth, and D. Iles, Paternal DNA packaging in spermatozoa: more than the sum of its parts? DNA, histones, protamines and epigenetics. Reproduction, 2010. 139(2): p. 287-301.

14.          Nasr‐Esfahani, M., et al., Relationship between protamine deficiency with fertilization rate and incidence of sperm premature chromosomal condensation post‐ICSI. Andrologia, 2004. 36(3): p. 95-100.

15.          Gunter, K.M. and E.A. McLaughlin, Translational control in germ cell development: A role for the RNA‐binding proteins Musashi‐1 and Musashi‐2. IUBMB life, 2011. 63(9): p. 678-685.

16.          Gunes, S., et al., Epigenetics, Spermatogenesis, and Male Infertility, in Reproductomics. 2018, Elsevier. p. 171-187.

17.          Ingram, N., Waddington, Holmyard and Alchemy: Perspectives on the Epigenetic Landscape. Endeavour, 2019. 43(3): p. 100690.

18.          Jablonka, E. and G. Raz, Transgenerational epigenetic inheritance: prevalence, mechanisms, and implications for the study of heredity and evolution. The Quarterly review of biology, 2009. 84(2): p. 131-176.

19.          Wang, P., et al., Cell cycle arrest induced by inhibitors of epigenetic modifications in maize (Zea mays) seedling leaves: characterization of the process and possible mechanisms involved. New Phytologist, 2016. 211(2): p. 646-657.

20.          Portela, A. and M. Esteller, Epigenetic modifications and human disease. Nature biotechnology, 2010. 28(10): p. 1057.

21.          Verma, A., et al., Genome-wide profiling of sperm DNA methylation in relation to buffalo (Bubalus bubalis) bull fertility. Theriogenology, 2014. 82(5): p. 750-759. e1.

22.          Komiya, A., et al., Clinical factors associated with sperm DNA fragmentation in male patients with infertility. The scientific world journal, 2014. 2014.

23.          Akhtarkhavari, T. and F. Behjati, Role of Epigenetics in Male Infertility. Sarem Journal of Reproductive Medicine, 2018. 2(4): p. 177-183.

24.          Stuppia, L., et al., Epigenetics and male reproduction: the consequences of paternal lifestyle on fertility, embryo development, and children lifetime health. Clinical epigenetics, 2015. 7(1): p. 120.

25.          Esteller, M., Epigenetics in cancer. New England Journal of Medicine, 2008. 358(11): p. 1148-1159.

26.          Ramsahoye, B.H., et al., Non-CpG methylation is prevalent in embryonic stem cells and may be mediated by DNA methyltransferase 3a. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2000. 97(10): p. 5237-5242.

27.          Paz, M.F., et al., A systematic profile of DNA methylation in human cancer cell lines. Cancer research, 2003. 63(5): p. 1114-1121.

28.          Saxonov, S., P. Berg, and D.L. Brutlag, A genome-wide analysis of CpG dinucleotides in the human genome distinguishes two distinct classes of promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2006. 103(5): p. 1412-1417.

29.          Khazaie, Y. and M.H.N. Esfahani, MicroRNA and male infertility: a potential for diagnosis. International journal of fertility & sterility, 2014. 8(2): p. 113.

30.          Popp, C., et al., Genome-wide erasure of DNA methylation in mouse primordial germ cells is affected by AID deficiency. Nature, 2010. 463(7284): p. 1101-1105.

31.          Zhou, Y., et al., Comparative whole genome DNA methylation profiling of cattle sperm and somatic tissues reveals striking hypomethylated patterns in sperm. GigaScience, 2018. 7(5): p. giy039.

32.          Laqqan, M., E.-F. Solomayer, and M. Hammadeh, Aberrations in sperm DNA methylation patterns are associated with abnormalities in semen parameters of subfertile males. Reproductive biology, 2017. 17(3): p. 246-251.

33.          Qin, L., et al., Genome-wide DNA methylation analysis of oligospermia and asthenozoospermia in a Chinese population. Int J Clin Exp Med, 2019. 12(4): p. 3168-3184.

34.          Sarkar, S., et al., Array-based DNA methylation profiling reveals peripheral blood differential methylation in male infertility. 2019. 112(1): p. 61-72. e1.

35.          Li, W. and A.A. Mills, Packing for the journey: CHD5 remodels the genome. Cell cycle, 2014. 13(12): p. 1833-1834.

36.          Thompson, P.M., et al., CHD5, a new member of the chromodomain gene family, is preferentially expressed in the nervous system. Oncogene, 2003. 22(7): p. 1002-1011.

37.          Bagchi, A., et al., CHD5 is a tumor suppressor at human 1p36. Cell, 2007. 128(3): p. 459-475.

38.          Bagchi, A. and A.A. Mills, The quest for the 1p36 tumor suppressor. Cancer research, 2008. 68(8): p. 2551-2556.

39.          Hong, W., et al., FOG‐1 recruits the NuRD repressor complex to mediate transcriptional repression by GATA‐1. The EMBO journal, 2005. 24(13): p. 2367-2378.

40.          Zhuang, T., et al., CHD5 is required for spermiogenesis and chromatin condensation. Mechanisms of development, 2014. 131: p. 35-46.

41.          Fujita, T., et al., CHD5, a tumor suppressor gene deleted from 1p36. 31 in neuroblastomas. JNCI: Journal of the National Cancer Institute, 2008. 100(13): p. 940-949.

42.          Kolla, V., et al., Role of CHD5 in human cancers: 10 years later. Cancer research, 2014. 74(3): p. 652-658.

43.          Wu, X., et al., Chromodomain helicase DNA binding protein 5 plays a tumor suppressor role in human breast cancer. Breast Cancer Research, 2012. 14(3): p. R73.

44.          Wang, J., et al., The involvement of CHD5 hypermethylation in laryngeal squamous cell carcinoma. Oral oncology, 2011. 47(7): p. 601-608.

45.          Fatemi, M., et al., Epigenetic silencing of CHD5, a novel tumor‐suppressor gene, occurs in early colorectal cancer stages. Cancer, 2014. 120(2): p. 172-180.

46.          Josien, C. and F. René, The role of small noncoding RNAs in genome stability and chromatineorganization. J Cell Sci, 2010. 123: p. 1825-39.

47.          Almeida, M.I., R.M. Reis, and G.A. Calin, MicroRNA history: discovery, recent applications, and next frontiers. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 2011. 717(1-2): p. 1-8.

48.          Deng, J.H., et al., Gene silencing in vitro and in vivo using intronic microRNAs, in RNA Interference. 2015, Springer. p. 321-340.

49.          Schickel, R., et al., MicroRNAs: key players in the immune system, differentiation, tumorigenesis and cell death. Oncogene, 2008. 27(45): p. 5959-5974.

50.          Cai, C., et al., MicroRNA-211 expression promotes colorectal cancer cell growth in vitro and in vivo by targeting tumor suppressor CHD5. PLoS One, 2012. 7(1): p. e29750.

51.          Naraparaju, K., et al., Role of microRNAs in epigenetic silencing of the CHD5 tumor suppressor gene in neuroblastomas. Oncotarget, 2016. 7(13): p. 15977-85.

52.          Han, L., et al., DNA methylation regulates MicroRNA expression. 2007. 6(8): p. 1290-1294.

53.          Martin-du-Pan, R. and P.J.H.R. Bischop, Increased follicle stimulating hormone in infertile men. 1995. 10: p. 1940-1950.

54.          Ghorbian, S. and R.J.J.o.B.U.o.M.S. Kian Bostanabad, Association the Study of Between Cpeb1 (Rs230846 C> T) Gene Polymorphism And Azoospermia/Severe Oligospermia. 2018. 20(9): p. 20-27.

ناباروری یکی از تجربیات تلخ زندگی است و به عنوان یک بحران جدی در زندگی محسوب می­گردد که باعث اختلافات در زندگی زناشویی و افت کیفیت زندگی می‌شود. با توجه  به مطالعات و اهمیت ژن CHD5 در فرآیند تراکم کروماتین طی  بلوغ  اسپرم و پارامترهای کیفی و کمی آن، تعیین و مقایسه بیان miR-211 (که بر فرآیندهای پس از ترجمه اثردارد و فعالیت ژن را تغییر می­دهد) در افراد سالم و الیگواسپرمی شدید، می تواند کاندید مناسبی برای تشخیص و پیش آگاهی  باشد.  مطالعه مکانیسم  متیلاسیون  پروموتور ژن CHD5 نیز  با اثرتنظیمی بر بیان آن، می تواند یک بیومارکر اپی­ژنتیک  باشد.

بنابراین بررسی عوامل ژنتیک و اپی ژنتیک  می­تواند ما را با سرعت و دقت بیشتر و مطمئن تر از گذشته  با بکارگیری، مارکر های اختصاصی و دقیق به تشخیص صحیح  الیگواسپرمی شدید، رسانده  و انتخاب روش درمانی موثر، زود هنگام و سودمند، امید به درمان و بهبودی را افزایش خواهد داد.

دارد. براساس اصول کلی مطالعات ژنتیک و مولکولی قبل، حداقل 100 نمونه از هر گروه مورد نیاز است. 100 نمونه  خون مردان بارو و سالم در گروه کنترل، 100 نمونه  خون از مردان نابارور که  بر طبق آزمایش آنالیز اسپرم الیگواسپرمی شدید باشند، وارد خواهد شد.

ندارد

ندارد

ندارد

هزینه  آزمایشات  این طرح به عهده مجریان خواهد بود.

ندارد

نتایج بصورت کاملاً محرمانه و صرفاً جهت مقاصد پژوهش به کار خواهد رفت و هویت بیماری افراد در چارچوب قانون و جامعه و خانواده محرمانه خواهد ماند.

آدرس مجریان طرح جهت پاسخ گویی به سوالات بیماران شرکت کننده در مطالعه:

زاهدان، بزرگراه خلیج فارس، روبروی بیمارستان علی ابن  ابیطالب(ع) مجتمع پزشکی پردیس، گروه بافت شناسی

شرکت من در مطالعه کاملاً اختیاری است و آزاد خواهم بود که از شرکت در مطالعه امتناع نموده یا هر زمان  که مایل بودم بدون آنکه تغییری در نحوه رفتار پزشک درمانگر یا نحوه درمان و مراقبت از بیماری اینجانب ایجاد شود از پژوهش مذکور خارج شوم.

با توجه به اطلاعات موجود در این فرم و توضیحات حضوری مجری یا همکاران طرح موافقت خود را با شرکت در این مطالعه اعلام می نمایم. یک نسخه از این فرم به من داده شده و فرصت خواندن آن را داشته ام.

فرم اطلاعات  طرح پژوهشی (اطلاعات دموگرافیک)

فرم ثبت اطلاعات نمونه  ها

بررسی ارتباط بیان  miR-211  و متیلاسیون پروموتور ژن CHD5  در مردان نابارور مبتلا به الیگواسپرمی شدید در مقایسه با گروه کنترل

کد بیمار ............

گروه بیمار                        مورد............                  کنترل............................

سن ..........

نوع نمونه...........      

میزان بروز miR-211 

سطح بیان در گروه بیمار   .............. %  (درصد)                        سطح بیان در گروه کنترل   ........%(درصد)

 میزان متیلاسیون ،  ژن CHD5

…………………UU                   UM ..................                MM..........................