مقایسه فراوانی پلی مورفیسم ژن های TNF-α (rs361525, rs1800629) ،( rs909253) TNF-β (rs2069827)IL-6، IL-6R (rs2228145), IL1RN (rs419598) و TMPRSS2 (rs75603675 rs4303795, rs17854725, rs12329760) در افراد مبتلا به کووید 19 در مقایسه با گروه کنترل

سندرم حاد تنفسی کروناویروس2 (SARS-CoV-2)، که به اسم کووید [1]19 شناخته می شود، یک بیماری عفونی جدید است که نخستین بار در اواخر دسامبر  سال 2019 (آذر ماه 1398) در شهر Wuhan چین رویت شد و طی دو هفته طغیان­های مشابهی در بیمارستان های مختلف چین، کره جنوبی و کشورهای همسایه رخ داد (1). علائم بالینی عمده این بیماری شامل تب، سرف خشک، اسهال، درد عضلانی ، پنومونی و در موارد شدید مرگ است (2). در تاریخ 7 ژانویه 2020 محققین چینی با موفقیت ویروس را از یک بیمار جدا سازی کرده و توالی ژنوم آنرا مشخص کردند (3). پس از خروج بیماری از چین، مناطقی از اسیای مرکزی از جمله ایران و کشورهای ایتالیا، اسپانیا، انگلیس و آمریکا مناطق اصلی کووید19 شدند که با افزایش سریع تعداد موارد بویژه در بین کارکنان مراقبت بهداشتی و افراد در تماس نزدیک با آنها مشخص شد. در این مناطق کووید19 نخست در مناطق درمانی و پر جمعیت ریشه دواند زیرا کارکنان کادر درمانی و افراد نمی­دانستند با یک بیماری جدید روبرو هستند و بدون محافظت خود را با عامل عفونی روبرو ساختند. در نهایت، تمام طغیان­های جدید این بیماری با زنجیره ای از انتقال ثانویه در خارج از محیط مراقبت بهداشتی مشخص شدند. همچنین احتمال می رود بسیاری از کشورها پس از عدم مشاهده مورد جدید طی چند روز، طغیان دومی را تجربه کنند و این امر چالش بزرگی برای تشخیص مبتلایانی خواهد بود که کووید19 مشکوک نیستند. طبق آمار سازمان بهداشت جهانی (در تاریخ 9 آوریل 2020 موجود در سایت https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports)، 1436198 نفر در سرتاسر دنیا به کووید 19 مبتلا شده که از بین این افراد 85522 جان باختند. از این بین، 64586 مبتلا در ایران تشخیص قطعی داده شده است که 3993 نفر قادر به ادامه زندگی نبودند. نرخ متوسط مرگ و میر کووید19 حدود 3.7 درصد عنوان شده است (4).

 با توجه به اینکه کووید 19 بیماری بسیار نوظهوری است، اطلاعات کاملی در مورد اتیولوژی و ریسک فاکتورهای احتمالی آن در دست نیست، ولی از آنجا که عامل این بیماری کروناویروس است، احتمال می رود کووید19 همانند دو سندرم حاد تنفسی ابتدای قرن بیست و یکم، Severe acute respiratory syndrome (SARS) و Middle East respiratory syndrome (MERS)، از الگوی ژنتیکی مشابهی به جهت آلوده کردن میزبان خود استفاده کند (5). ریسک فاکتورهای مهمی برای  ظهور و پیشرفت بالینی کووید19 معرفی شده است، از جمله سن بالا، غلظتd-dimer greater  بیشتر از 1 میکروگرم بر میلی لیتر، و ابتلا به انواع بیماری های تضعیف کننده ی سیستم ایمنی از جمله دیابت (در 36 درصد افراد)، فشار خون و بیماری های قلبی (در 8 درصد افراد)(6, 7). همچنین اطلاعات بسیار اندکی در ارتباط با ریسک فاکتورهای ژنتیکی پیشرفت بیماری کووید 19 در دسترس می باشد.

 در مطالعه انجام شده توسط Asselta  در جمعیت ایتالیایی، مشاهده شد تغییرات تک نوکلئوتیدی (SNP)[2] در ژن کد کننده آنزیم مبدل آنژیوتانسین 2 (ACE2) و همینطور ژنTMPRSS2  می توانند شدت بیماری کووید19 را افزایش داده و همینطور بر میزان بیان این دو ژن اثر گذار باشند (8). TMPRSS2 یک ژن پاسخ به آندروژن است که به ژن ERG الحاق یافته و باعث افزایش بیان آن در سلولهای سرطانی پروستات می شود(9). بر اساس اطلاعات GEO و GTX پیشنهاد شده است افراد بالای 60 سالی که میزان بیان TMPRSS2 در ریه آنها بالاست، شانس بیشتری برای ابتلا به کووید19 دارند (8). اطلاعات مستخرج شده از GnomAD نشان داده است واریانت های ژنی TMPRSS2، از جمله به عنوان 4 واریانت قرار گرفته در ناحیه کد کننده، می توانند بر میزان بیان سرین پروتئاز ریوی و فعالیت کاتالیتیک آن اثر گذار باشند (10). همچنین Delanghe و همکاران ادعا کردند یک الحاق/حذف نوکلئوتیدی واقع شده در ژنACE1 می­تواند ریسک ابتلا به کووید19 را در طیفی از جمعیت­های اروپایی تحت تاثیر قرار دهد (11). بر خلاف این فرضیات، مطالعه بیوانفورماتیکی دیگر انجام شده توسط Othman و همکاران در آفریقای جنوبی نشان داده است 8 پلی مورفیسم­ واقع در گیرنده آنزیم ACE2 بر میزان اتصال spike ویروس کووید19 به این گیرنده تاًثیری نخواهند داشت و شاید ریسک ابتلا و پیامد درمان را در بیماران مبتلا به کووید19 تغییر ندهند (12). همچنینJakovac و تیم تحقیقاتی وی عنوان کردند واریانت­های مختلف ACE2 تأثیری در ابتلا به کووید19 و شدت بیماری نخواهند داشت (13). بر خلاف ACE2 و گیرنده ی آن، مطالعات توالی یابی نشان داده است بیان نسبی Furin در خون تام و همینطور تمامی بافت­هایی همچون کبد، کلیه، کلون و غدد (که ویروس کووید19 قادر به درگیر کردن آنهاست) بالاتر از ACE2 می باشد و تنها در بافت ریه بیان Furin کمتر از ACE2 می باشد. طی مطالعه Jin و همکاران مشخص شد پلی مورفیسم های واقع در دومین قابل برش از پروتئین Furin می­توانند توانایی اتصال پروتئین S از کووید19 به سلول را تحت تأثیر قرار دهند و این برش آنزیمی توسط پروتئازی به نام TMPRSS2 اتفاق می افتد که پیشنهاد شده است می تواند بر ورود این  ویروس به سلول اثر گذار باشد (14). جایگاه­های ژنی rs75603675C/A، rs12329760C/T و rs4303795A/G در نواحی کد کننده ژن TMPRSS2 قرار دارند (با فراوانی آللی به ترتیب 0.24، 0.26 و 0.25بر اساس پروژه 1000 ژنوم) و مطالعه بسیار جدیدی توسط Asselta و همکاران تاثیر معنی دار این واریانت­ها و ریسک ابتلا به کووید19 را در جمعیت ایتالیایی مشخص کرده است (8) ولی این واریانت­ها در سایر جمعیت­ها بررسی نشده­اند. همچنین جایگاه دیگری (rs17854725) با فراوانی آللی 0.36 در ناحیه پروموتری این ژن واقع شده و اکنون تصور می شود تغییر نوکلئوتیدی آن (G/A) می تواند باعث تغییر در بیان ژن TMPRSS2 شود.

از طرف دیگر، پس از ورود کووید19 به سلول، مشابه وقایع رخ داده در سایر عفونت­های تنفسی، طوفان سایتوکاینی رخ می دهد (15). پروفایل سایتوکاینی افراد مبتلا به کووید19 نشان داده است که مقادیر اینترلوکین1، اینترلوکین 4، اینترلوکین 6، اینترلوکین7، فاکتور نکروز دهنده توموری آلفا (TNF-α)[3]، فاکتور محرک کلونی گرانولوسیت[4]، اینترفورن گاما، پروتئین 10 القاء شده[5]، پروتئین 1 جذب کننده منوسین (MCP-1)[6] افزایش چشمگیری میابد که این افزایش علاوه بر ارتباط داشتن با ریسک ابتلا به بیماری، می تواند در پیامد درمان نیز موثر باشد (16-18). سلول­های T در بدن، نقش حائز اهمیتی را در دفاع ضد ویروسی علیه کووید19 ایفا می­کنند، با این حال مطالعات نشان داده است میزان T-cell در گردش در افراد مبتلا به کووید19 تا 82 درصد کاهش میابد ولی تعداد میانگین این سلول­های ایمنی در مبتلایانی که با موفقیت بهبود یافته­اند، افزایش داشته است. مطابق با این نتایج، و همکاران گزارش دادند افزایش سطح سرمی اینترلوکین 4 و TNF-α ارتباط معنی داری تعداد سلول­های T در افراد مبتلا به کووید19 داشته است (19).

فاکتور نکروز دهنده توموری آلفا (TNF-α) یک سایتوکاین پیش التهابی است که می­تواند باعث آپوپتوز سلول­های T از طریق تعامل با گیرنده­ی خود ((TNFR1 شود. به این دلیل که در افراد بالای 60 سال تعداد سلول­های T در گردش کمتر است، پیشنهاد شده است TNF-α نقش اصلی را در القاء مرگ سلول­های T داشته باشد (19, 20). سه جایگاه ژنی 308G/A (rs1800629) و 238G/A (rs361525) با فراوانی آللی به ترتیب ،0.09 و 0.06 (طبق اطلاعات پروژه 1000 ژنوم) در نواحی پروموتر ژن  TNF-αقرار گرفته و مطالعات متعددی ارتباط آماری بین این جایگاه­ها و ریسک ابتلا به انواع بیماری­های عفونی از جمله  sepsis  و پنومونی را نشان داده است (21, 22).همچنین مطالعه Wang و همکاران در سال 2008 نشان داد پلی مورفیسم­های واقع در ناحیه تنظیمی ژن TNF-α ارتباطی با پیشرفت بیماریSARS-CoV در 75 مبتلا و 92 فرد سالم نداشته است، ولی تغییرات تک نوکلئوتیدی واقع در این ژن (-1031 CT/CC  و  -863 AC) با ریسک نکروز ناحیه فمور سر مرتبط بوده است (23). در حال حاضر، اثر محافظتی یا ریسک فاکتوری این واریانت­های ژنی در مورد بیماری کووید19 مشخص نشده است. از طرفی در مطالعه جدید انجام شده توسط Liu و همکاران نشان داده شد سطح سرمی 21 سایتوکاین/کموکاین التهابی دیگر از جمله TNF-β در مبتلایان به آسیب های ریوی ناشی از ویروس کووید19 افزایش معنی داری داشته است (24). جایگاه ژنیrs909253 با تغییر نوکلئوتیدی آدنین به گوانین و فراوانی آلل مغلوب 0.39 در فاصله ی 252 جفت باز از اولین اینترون ژن کد کننده TNF-β واقع شده است و مطالعات بسیاری ارتباط این جایگاه با تغییر سطح سرمی TNF-α و افزایش ریسک ابتلا به آنفولانزا H1N1 شدید و بسیاری از اختلالات خود ایمنی را گزارش کرده اند (25, 26).

ازدیاد اینترلوکین 6 (IL-6) یکی از مکانیسم­های اصلی میزبان در مواجهه با عفونت­ها و آسیب بافتی است. مشخص شده است کاهش بیان و یا کاهش سنتز IL-6 ارتباط تنگاتنگی با فرایندهای پاتولوژیک رخ داده طی التهاب مزمن یا عفونت دارد (27). این در حالیست که مهار گیرنده IL-6 توسط آنتی بادی­های منوکلونال به عنوان مکانیسم مهمی در سرکوب کردن علائم بیماری کووید19 پیشنهاد شده است. با وجود اینکه مطالعات قبلی نشان داده است دلیل افزایشIL1-RN، TNF-α و IL-6 در فرایندهای التهابی و عفونی ترشح بیش از حد آن­ها از سلول­های T، منوسیت ها و ماکروفاژ ها بوده، مطالعات فعلی افزایش این سایتوکاین­های التهابی را مستقل از میزان سلول­های T میدانند (19). در حال حاضر شواهدی مبنی بر اینکه ویروس کووید19 می­تواند به طور مستقل باعث تحریک سنتز TNF-α و IL-6 از ماکروفاژ و منوسیت­ها شود در دسترس نیست، اما مطالعاتی در حال انجام است. مطالعه García-Ramírez و همکاران در سال 2015  نشان داد سطح سرمی IL-6 و TNF-α در افراد مبتلا به آنفولانزا H1N1 از افراد غیر بیمار بیشتر است، لذا بررسی ارتباط آماری واریانت های ژنی این سایتوکاین­ها و ریسک ابتلا به این سندرم تنفسی توجیه پذیر است. نتایج مطالعه این تیم تحقیقاتی نشان داد وجود آلل­های مغلوب در پلی مورفیسم­های واقع شده در نواحی غیر کد کننده ژن­های IL-6 و IL1Bمی توانند با ریسک ابتلا به این بیماری ارتباط داشته باشد هر چند واریانت­های و فاکتور نکروز دهنده توموری آلفا شدت بیماری را تعیین می کنند (25). این تیم تحقیقاتی در سال 2012 ارتباط مشابهی را بین ابتلا به آنفولانزا A/H1N1 و تغییرات تک نوکلئوتیدی در ژن­های ذکر شده در جمعیتی از بیماران Hispanic در کشور مکزیک نشان دادند (28). Cussigh و همکاران در سال 2011 گزارش دادند واریانت rs2069827G/T (با فراوانی آلل مغلوب 0.36) واقع شده در 1363 نوکلئوتید بالادست نقطه شروع رونویسی از ژن IL-6 با ریسک ابتلا به هپاتیت ویروسی ارتباط دارد (29). همچنین طی مطالعه Flores و همکارانش مشخص شد هاپلوتایپ از واریانت­های پروموتری  IL-6(در ناحیه -1363 تا +4835 )، ریسک ابتلا به نارسایی حاد ریه را تا 2.73 برابر افزایش می­دهند (30).  واریانت های واقع شده در گیرنده­ی IL-6 (IL-6R) نیز با افزایش ریسک ابتلا به انواع بیماری­های انسدادی ریه در ارتباط بوده است (31). مطالعه Rantala و همکاران نشان داد واریانت­های واقع شده در ناحیه 5’ از ژن IL-6R ریسک ابتلا به عفونت­های تنفسی را در مردان فنلاندی افزایش می­دهد (32). rs2228145A/C یک پلی مورفیسم واقع شده در 358 نوکلئوتید پایین دست ناحیه شروع رونویسی ژن IL-6R با فراوانی آلل مغلوب  0.29است که باعث جایگزینی آمینواسید آسپارتات با آلانین می­شود و مطالعات قبلی ارتباط این جایگاه را با بیماری­های حاد تنفسی از جمله آسم به اثبات رسانیده است (33). طی مطالعه Mamoor مشخص شد بیان نسبی دو ژن IL-1RN و IL-6 طی ابتلا به ویروس های خانواده SARS، از جمله کووید19، افزایش معنی داری دارد که میتواند نشانگر نقش حائز اهمیت هر دو ژن در پاتوژنز کووید19 باشد (34). در هیمن رابطه،rs419598  یک تغییر تک نوکلئوتیدی تیمین به سیتوزین با فراوانی آلل مغلوب 0.19 می باشد. این واریانت در ناحیه کد کننده ژن IL-1RN قرار گرفته و باعث تبدیل دو کدون از آمینواسید آلانین به هم می­شود.

کووید 19 ، به عنوان سومین بیماری شدید عفونی قرن بیست و یکم، از فرصت­های انتشار بین المللی از طریق مسافرت­های زیاد و سریع هوایی جهت گسترش خود استفاده کرده است. با توجه به پاندمی شدن بیماری کووید 19 و شیوع نسبتاً بالای این بیماری در زاهدان به عنوان مرکز استان سیستان و بلوچستان و اثبات نقش پر رنگ ژنتیک در اتیولوژی سندرم­ های حاد تنفسی از جمله SARS و MERS، بر آن شدیم تا جایگاه های ژنی حائز اهمیت بالینی واقع شده در 6 ژنIL-1RN، IL-6، IL-6R  TNF-α, TNF-β و TMPRSS2 را در جمعیتی از بیماران مراجعه کننده و بستری شده در بیمارستان های وابسته به دانشگاه علوم پزشکی زاهدان بسنجیم. بدیهی است شناخت پلی مورفیسم های موثر در بروز این بیماری، کمک شایان توجهی به روند درمان و تشخیص به موقع این اختلال شایع در آینده خواهد نمود.

فراوانی پلی مورفیسمrs1800629   ژن TNF-α  در خون افراد مبتلا به کووید19 و گروه کنترل متفاوت است.

فراوانی  پلی مورفیسمrs909253  ژن TNF-β در خون افراد مبتلا به کووید19 و گروه کنترل متفاوت است.

فراوانی پلی مورفیسم  rs361525 ژن TNF-α در خون افراد مبتلا به کووید19 و گروه کنترل متفاوت است.

فراوانی پلی مورفیسمrs2069827  ژن IL-6  در خون افراد مبتلا به کووید19 و گروه کنترل متفاوت است.

فراوانی پلی مورفیسم rs419598  ژن IL-1RN  در خون افراد مبتلا به کووید19 و گروه کنترل متفاوت است.

فراوانی پلی مورفیسمrs2228145  ژن IL-6R  در خون افراد مبتلا به کووید19 و گروه کنترل متفاوت است.

فراوانی پلی مورفیسم rs2228145  ژن  TMPRSS2در خون افراد مبتلا به کووید19 و گروه کنترل متفاوت است.

فراوانی پلی مورفیسم rs75603675 ژن TMPRSS2 در خون افراد مبتلا به کووید19 و گروه کنترل متفاوت است.

فراوانی پلی مورفیسم rs12329760 ژن TMPRSS2 در خون افراد مبتلا به کووید19 و گروه کنترل متفاوت است.

فراوانی پلی مورفیسم rs4303795 ژن TMPRSS2  در خون افراد مبتلا به کووید19 و گروه کنترل متفاوت است.

تعیین فراوانی پلی مورفیسم ژن­های TNF-α (rs361525, rs1800629)  ،( rs909253)  TNF-β (rs2069827)IL-6، IL-6R (rs2228145), IL1RN (rs419598) و TMPRSS2  (rs75603675 rs4303795, rs17854725, rs12329760) در افراد مبتلا به کووید 19 در مقایسه با گروه کنترل

مقایسه فراوانی پلی مورفیسمrs1800629  ژن TNF-α  در خون افراد مبتلا به کووید19 و گروه کنترل.

مقایسه فراوانی  پلی مورفیسم rs909253  ژن TNF-β در خون افراد مبتلا به کووید19 و گروه کنترل.

مقایسه فراوانی پلی مورفیسم   rs361525ژن TNF-α در خون افراد مبتلا به کووید19 و گروه کنترل.

مقایسه فراوانی پلی مورفیسم  rs2069827 ژن IL-6  در خون رمبتلا به کووید19 و گروه کنترل.

مقایسه پلی مورفیسمrs419598  ژن IL-1RN  در خون افراد مبتلا به کووید19 و گروه کنترل .

مقایسه فراوانی پلی مورفیسمrs2228145  ژن IL-6R  در خون افراد مبتلا به کووید19 و گروه کنترل.

مقایسه فراوانی پلی مورفیسم rs2228145  ژن  TMPRSS2در خون افراد مبتلا به کووید19 و گروه کنترل.

مقایسه فراوانی پلی مورفیسم rs75603675 ژن TMPRSS2 در خون افراد مبتلا به کووید19 و گروه کنترل.

مقایسه فراوانی پلی مورفیسم rs12329760 ژن TMPRSS2 در خون افراد مبتلا به کووید19 و گروه کنترل .

مقایسه فراوانی پلی مورفیسم rs4303795 ژن TMPRSS2  در خون افراد مبتلا به کووید19 و گروه کنترل .

دانشگاه علوم پزشکی زاهدان، مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی

کووید19: بیماری عفونی است که بر اثر کرونای جدید، یک ویروس در ارتباط نزدیک با کروناویروس سارس، ایجاد می‌شود و علایم معمول آن تب، سرفه، و تنگی نفس هستند. درد عضلانی، تولید خلط، و گلودرد از جمله نشانه‌های کمتر معمول این بیماریست.

پلی مورفیسم: تغییری در دنباله DNA که در یک نوکلئوتید(T،G،C،A) در ژنوم بین افراد یک گونه بیولوژیکی یا بین یک جفت کروموزم در یک فرد این نوکلئوتید فرق دارد.

موردی – شاهدی (case –control)

معیار ورود: گروه مورد شامل هر فرد بیمار مراجعه کننده یا بستری شده با علائم و معیارهای WHO برای تشخیص کووید19 (4) که نتیجه ی تست Real-time PCR وی مثبت شده باشد و کمتر از 12 روز از شروع علائم (گوارشی، تنفسی، سرفه، تب، درد های عضلانی و ...) گذشته باشد، افراد دارای درگیری ریوی که با CT scan تأیید شده باشد و درصد اشباع اکسیژن آنها کمتر از 94 % باشد. گروه شاهد شامل افرادی که نتیجه ی تست Real-time PCR آنها منفی شده باشد.

معیار خروج: افراد دارای سایر بیماری­های حاد تنفسی و بیماریهای عفونی مثل پنومونی، سل، آنفولانزا، بیماریهای کبدی و کلیوی شدید و افرادی که هر گونه درمانی برای بیماری کووید 19 دریافت کرده باشند.

برای بررسی پلی مورفیسم ژنی کلیه بیماران مبتلا به کووید19 و افراد سالم در طول سه ماه پس از تصویب طرح و به همان تعداد افراد کنترل در نظر گرفته خواهد شد (150 نفر بیمار و 150 نفر کنترل).

افراد گروه کیس و کنترل بر حسب سن و جنس همسان سازی خواهند شد.

همچنین افرادی که دارای بیماریهای زمینه ای، سیستمیک یا سایر بیماری های تنفسی یا ویروسی باشند، می توانند ریسک ابتلا به کووید 19 را تغییر دهند که به عنوان یک متغیر مخدوش کننده به حساب می آید. لذا با شناسایی این متغیر ها و آنالیز مجدد نتایج با در نظر گرفتن آنها می تواند نتیجه ی قابل قبولتری حاصل شود.

از طریق تشخیص بالینی و انجام آزمایشات واقدامات پاراکلینیک برای تشخیص بیماری و انجام تست PCR بر روی DNA استخراج شده از خون  افراد و شناسایی آلل­های موردنظر. اطلاعات بیماران در پرسشنامه ضمیمه شده قید خواهد شد

کلیه بیمارانی که با علائم کووید19 به بیمارستان­های وابسته به دانشگاه علوم پزشکی زاهدان (خاتم الأنبیاء، علی بن ابیطالب (ع)، بو علی) و مراکز 16 ساعته مراجعه نموده اند یا بستری شده اند چنانچه معیارهای ورود به مطالعه را داشته باشند و تست realtime-PCR آنها مثبت شده باشد وارد مطالعه می­شوند و اگر جواب این تست منفی شده باشد بعنوان گروه مورد در نظر گرفته می­شوند. اطلاعات بیماران شامل سابقه هر گونه بیماری زمینه ای یا سیستمیک، علائم بیماری، شدت بیماری و پارامتر های خونی و آزمایشگاهی از طریق پرسشنامه یا مشاهدات آزمایشگاهی جمع آوری خواهد شد. ازکلیه افرادی که در مطالعه وارد شده اند 2 میلی لیتر خون در لوله های حاوی  جمع آوری میگردد. نمونه های خون که در 20- درجه سانتیگراد نگهداری شده بودند، DNA با استفاده از روش salting out  تخلیص می‌شود. استخراج DNA از نمونه های CBC در محل آزمایشگاه جامع تحقیقات با استفاده از تجهیزاتی از جمله هود لامینار کلاس 2 و استفاده از وسائل محافظت شخصی (گان و شیلد) انجام خواهد شد. سپس با استفاده از پرایمرهای اختصاصی قطعات واجد ناحیه پلی مورفیک با روش  PCR  تکثیر گردیده و سپس توسط آنزیم های حدساز (MspI، NcoI ، TaqI و HinfI) و با استفاده از تکنیکهایPCR-RFLP  و ARMS-PCR تعیین ژنوتیپ شده و با روش توالی یابی (sequencing) نتایج ژنوتایپینگ تأیید می­گردد.

پس از گردآوری اطلاعات لازم، یافته ها در نرم افزار آماری SPSS  وارد گشته و داده ها با استفاده از آزمون­های آماری χ2  و تی تست مستقل و Regression Logistic مورد تجزیه و تحلیل قرار خواهند گرفت.

• در این مطالعه کدهای 1,2,3,8,10, 11,12,13,14,15,17,19,22,25,28و31 از راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش‌های علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی در جمهوری اسلامی ایران به شرح زیر استفاده می شود.

1. هدف پژوهش ارتقاء سلامت انسان خواهد بود 2- سلامت و ایمنی فرد آزمودنی اولویت دارد 3- منافع پژوهش برای فرد آزمودنی بیشتر از خطرهای آن است 8- روش انجام پژوهش منطبق بر اصول علمی است 10- پژوهش به صورت پروپوزال ارائه می شود 11- کمیته اخلاق طرح حاضر را مورد پایش قرار می دهد 12- انتخاب آزمودنی ها از بین بیماران منصفانه خواهد بود  13- رضایت آگاهانه از افراد مورد پژوهش اخذ می شود 14- تغییر احتمالی در نحوه انجام پژوهش به اطلاع کمیته اخلاق دانشگاه خواهد رسید 15- پژوهشگر از آگاهانه بودن رضایت اخذ شده اطمینان حاصل می کند 17 پژوهشگر اطلاعات کافی را در مورد مطالعه در اختیار آزمودنی قرار خواهد داد 19- عدم شرکت در پژوهش هیچ تآثیری در میزان خدمات درمانی دریافتی توسط آزمودنی نخواهد داشت 22- از گروههای آسیب پذیر نمونه گیری انجام نمی شود 25- پژوهشگر اصول راز داری را رعایت خواهد کرد 28- نتایج پژوهش به طور صادقانه منتشر خواهد شد

• همچنین کد های از  1,2,3,4,6,8,12از راهنمای ‌عمومی اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی به همراه کد­های 1 و 2 از فصل چهارم (زیست بانکها) این راهنما در پژوهش فعلی رعایت می گردد.

1. پژوهشگر توجه دارد که نمونه خون فرد مورد استفاده، دارای منشأ انسانی‌اند و کرامت انسانی اقتضا می‌کند که جمع‌آوری، نگه‌داری، استفاده و نابودسازی آن‌ها توأم با رعایت ملاحظات و شؤون مرتبط باشد.
2. از نمونه خون فرد دارای منشأ انسانی باید تنها در پژوهشی استفاده می شود که اهداف ارزشمندی را در راستای مبارزه با بیماری‌ها و ارتقای سلامت انسان‌ها دنبال کند.
3. پژوهش فعلی انجام شده بر روی نمونه خون افراد پیش از اجرا مورد تأیید کمیته‌ی اخلاق در پژوهش مرتبط قرار می گیرد.
4. رضایت آگاهانه‌ی فرد دهنده‌ی نمونه خون، یا جانشین قانونی او، شرط اساسی در تأیید اخلاقی هر پژوهش بر روی نمونه انسانی می باشد.

8. - پژوهشگر باید از اعضاء و بافت‌هایی که به منظور پژوهش در اختیار او قرار می‌گیرد استفاده‌ی بهینه خواهد کرد.

12- در صورت کمبود نمونه خون، باید استفاده‌های درمانی بر استفاده‌های پژوهشی اولویت داده می شود.

فصل 4 از راهنمای ‌عمومی اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی - زیست‌بانک‌ها:

1. ذخیره‌سازی نمونه خون با منشأ انسانی با اخذ رضایت آگاهانه صورت میگیرد. در رضایت‌نامه باید نحوه و مدت نگه‌داری و استفاده‌های احتمالی آتی آورده می شود.
2. فرد آزمودنی حق دارد هر وقت که بخواهد درخواست کند که نمونه‌هایش از زیست‌بانک خارج شوند.

•  به علاوه، کد های ذیل از دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش­های ژنتیک پزشکی در جمهوری اسلامی ایران در پژوهش فعلی رعایت می شوند

پژوهش‌ فعلی بر روی آزمودنی انسانی با هدف بررسی یا تشخیص استعداد ابتلا به بیماری‌ انجام خواهد شد (کد 1-2-)

پژوهش حاضر در بر دارنده اهداف به‌نژادی (کد 2-1)، شبیه سازی (2-2-)، تبعیض (2-3-) و نقض کرامت انسانی یا حقوق و آزادی‌های بنیادین انسان (2-4) نخواهد بود. در این پژوهش رضایت آگاهانه از آزمودنی کسب خواهد شد (کد 5) و در مواردی که داده‌های ژنتیک انسانی یا نمونه‌های بیولوژیک با هدف پژوهشی جمع‌آوری شده باشند، آزمودنی این اختیار را دارد که رضایت اولیه‌ی خود را لغو کند (کد 6) و در صورت نیاز مشاوره‌ی‌ ژنتیکی مناسب برای آزمودنی  فراهم می شود (کد 7) و همچنین نتایج پژوهش به صورت محرمانه با اطلاع آزمودنی خواهد رسید (کد 8) و فرد آزمودنی از دسترسی به داده‌های ژنتیکی خودش منع نخواهد شد ( کد 10). همچنین داده‌های ژنتیک و نمونه‌های بیولوژیک جمع‌آوری شده، برای هدف دیگری که با مفاد رضایت کسب شده مغایرت دارد به‌کار گرفته نخواهد شد (کد 11) و نتایج آن در اختیار جامعه قرار می گیرد (کد 13).

استخراج DNA از نمونه ها با شرایط استخراج از سایر نمونه ها متفاوت است که با فراهم آوردن تجهیزات به سهولت قابل انجام است.

مشکل تهیه مواد وامکان طولانی شدن زمان دریافت آنها که میبایستی سفارشات در کوتاهترین زمان پس از تأمین بودجه ی طرح ثبت شوند.

COVID19, cytokine, TMPRSS2, Polymorphism

کووید 19، سایتوکاین،TMPRSS2 ، پلی مورفیسم

1.           Zhang T, Wu Q, Zhang Z. Probable pangolin origin of SARS-CoV-2 associated with the COVID-19 outbreak. Current Biology. 2020.

2.           Chen N, Zhou M, Dong X, Qu J, Gong F, Han Y, et al. Epidemiological and clinical characteristics of 99 cases of 2019 novel coronavirus pneumonia in Wuhan, China: a descriptive study. The Lancet. 2020;395(10223):507-13.

3.           Lu R, Zhao X, Li J, Niu P, Yang B, Wu H, et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. The Lancet. 2020;395(10224):565-74.

4.           Organization WH. Coronavirus disease 2019 (COVID-19): situation report, 67. 2020.

5.           Li X, Geng M, Peng Y, Meng L, Lu S. Molecular immune pathogenesis and diagnosis of COVID-19. Journal of Pharmaceutical Analysis. 2020.

6.           Zhou F, Yu T, Du R, Fan G, Liu Y, Liu Z, et al. Clinical course and risk factors for mortality of adult inpatients with COVID-19 in Wuhan, China: a retrospective cohort study. The Lancet. 2020.

7.           Chen C, Yan J, Zhou N, Zhao J, Wang D. Analysis of myocardial injury in patients with COVID-19 and association between concomitant cardiovascular diseases and severity of COVID-19. Zhonghua xin xue guan bing za zhi. 2020;48:E008-E.

8.           Asselta R, Paraboschi EM, Mantovani A, Duga S. ACE2 and TMPRSS2 variants and expression as candidates to sex and country differences in COVID-19 severity in Italy. 2020.

9.           Kron KJ, Murison A, Zhou S, Huang V, Yamaguchi TN, Shiah Y-J, et al. TMPRSS2–ERG fusion co-opts master transcription factors and activates NOTCH signaling in primary prostate cancer. Nature genetics. 2017;49(9):1336.

10.         Karczewski KJ, Francioli LC, Tiao G, Cummings BB, Alföldi J, Wang Q, et al. Variation across 141,456 human exomes and genomes reveals the spectrum of loss-of-function intolerance across human protein-coding genes. BioRxiv. 2019:531210.

11.         Delanghe JR, Speeckaert MM, De Buyzere ML. The host’s angiotensin-converting enzyme polymorphism may explain epidemiological findings in COVID-19 infections. Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry. 2020.

12.         Othman H, Bouslama Z, Brandenburg J-T, Da Rocha J, Hamdi Y, Ghedira K, et al. In silico study of the spike protein from SARS-CoV-2 interaction with ACE2: similarity with SARS-CoV, hot-spot analysis and effect of the receptor polymorphism. BioRxiv. 2020.

13.         Jakovac H. COVID-19-is the ACE2 just a foe? American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 2020.

14.         Xi J, Xu K, Jiang P, Lian J, Hao S, Jia H, et al. Virus strain of a mild COVID-19 patient in Hangzhou representing a new trend in SARS-CoV-2 evolution related to Furin cleavage site. medRxiv. 2020.

15.         Mehta P, McAuley DF, Brown M, Sanchez E, Tattersall RS, Manson JJ. COVID-19: consider cytokine storm syndromes and immunosuppression. The Lancet. 2020.

16.         Huang C, Wang Y, Li X, Ren L, Zhao J, Hu Y, et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. The Lancet. 2020;395(10223):497-506.

17.         Xiong Y, Liu Y, Cao L, Wang D, Guo M, Jiang A, et al. Transcriptomic characteristics of bronchoalveolar lavage fluid and peripheral blood mononuclear cells in COVID-19 patients. Emerging Microbes & Infections. 2020;9(1):761-70.

18.         Ruan Q, Yang K, Wang W, Jiang L, Song J. Clinical predictors of mortality due to COVID-19 based on an analysis of data of 150 patients from Wuhan, China. Intensive care medicine. 2020:1-3.

19.         Diao B, Wang C, Tan Y, Chen X, Liu Y, Ning L, et al. Reduction and functional exhaustion of T cells in patients with coronavirus disease 2019 (COVID-19). Medrxiv. 2020.

20.         Aggarwal S, Gollapudi S, Gupta S. Increased TNF-α-induced apoptosis in lymphocytes from aged humans: changes in TNF-α receptor expression and activation of caspases. The Journal of Immunology. 1999;162(4):2154-61.

21.         Kothari N, Bogra J, Abbas H, Kohli M, Malik A, Kothari D, et al. Tumor necrosis factor gene polymorphism results in high TNF level in sepsis and septic shock. Cytokine. 2013;61(2):676-81.

22.         GÜNAL Ö, Yalcin D, ÇELİK B, RÜSTEMOĞLU A, Demir O, BARUT Ş, et al. TNF-alpha 308 SNP Rs3091256 GG Genotype is Strongly Associated with Fibrosis in Patients with Chronic Hepatitis C. Viral Hepatit Dergisis. 2017;23(2):39.

23.         Wang S, Wei M, Han Y, Zhang K, He L, Yang Z, et al. Roles of TNF-α gene polymorphisms in the occurrence and progress of SARS-Cov infection: A case-control study. BMC infectious diseases. 2008;8(1):27.

24.         Liu Y, Zhang C, Huang F, Yang Y, Wang F, Yuan J, et al. Elevated plasma level of selective cytokines in COVID-19 patients reflect viral load and lung injury. National Science Review.

25.         García-Ramírez RA, Ramírez-Venegas A, Quintana-Carrillo R, Camarena ÁE, Falfán-Valencia R, Mejía-Aranguré JM. TNF, IL6, and IL1B polymorphisms are associated with severe influenza A (H1N1) virus infection in the Mexican population. PloS one. 2015;10(12).

26.         de Medeiros FA, Alfieri DF, Iriyoda TMV, Costa NT, de Almeida ERD, Lozovoy MAB, et al. TNF-β+ 252 A> G (rs909253) polymorphism is independently associated with presence of autoantibodies in rheumatoid arthritis patients. Clinical and experimental medicine. 2019;19(3):347-56.

27.         Gabay C. Interleukin-6 and chronic inflammation. Arthritis research & therapy. 2006;8(2):S3.

28.         Morales-García G, Falfán-Valencia R, García-Ramírez RA, Camarena Á, Ramirez-Venegas A, Castillejos-López M, et al. Pandemic influenza A/H1N1 virus infection and TNF, LTA, IL1B, IL6, IL8, and CCLpolymorphisms in Mexican population: a case–control study. BMC infectious diseases. 2012;12(1):299.

29.         Cussigh A, Falleti E, Fabris C, Bitetto D, Cmet S, Fontanini E, et al. Interleukin 6 promoter polymorphisms influence the outcome of chronic hepatitis C. Immunogenetics. 2011;63(1):33-41.

30.         Flores C, Ma S-F, Maresso K, Wade MS, Villar J, Garcia JG. IL6 gene-wide haplotype is associated with susceptibility to acute lung injury. Translational research. 2008;152(1):11-7.

31.         Farahi N, Paige E, Balla J, Prudence E, Ferreira RC, Southwood M, et al. Neutrophil-mediated IL-6 receptor trans-signaling and the risk of chronic obstructive pulmonary disease and asthma. Human molecular genetics. 2017;26(8):1584-96.

32.         Rantala A, Lajunen T, Juvonen R, Silvennoinen-Kassinen S, Peitso A, Vainio O, et al. Association of IL-6 and IL-6R gene polymorphisms with susceptibility to respiratory tract infections in young Finnish men. Human immunology. 2011;72(1):63-8.

33.         Hawkins GA, Robinson MB, Hastie AT, Li X, Li H, Moore WC, et al. The IL6R variation Asp358Ala is a potential modifier of lung function in subjects with asthma. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2012;130(2):510-5. e1.

34.         Mamoor S. IL6 and IL1RN is differentially expressed and transcriptionally induced in models of SARS coronavirus infection. 2020.

تاریخ:.....................                                                                                        شماره پرونده:....................

گروه:.....................                                                                                      نام تکمیل کننده فرم:...............

پرسشنامه طرح تحقیقاتی کووید19                         

نام :.................نام خانوادگی:............. سن:.....................:شغل:...... قومیت:.............

مدت زمان بستری شدن در بیمارستان (بر حسب روز): ..........

سابقه اختلالات مزمن:

فشار خون □        دیابت □      بیماریهای مزمن قلب   □      بیماری انسدادی ریه □     انفارکتوس مغزی □    

بیماری مزمن کلیه □     فیبریلاسیون دهلیزی □      برونشکتازی □

علائم:

تب □      سرفه □      خلط □      خستگی □     تنگی نفس □     تهوع □     آبریزش بینی □     درد قفسه سینه □

شدت بیماری :

شدید □   متوسط □    خفیف □

پیامد بیماری:

در حال بستری □       ترخیص از بیمارستان □        فوت شده □

میزان درگیری ریه بر اساس رادیوگرافی:    درگیری یکطرفه □       درگیری دو طرفه □

نتایج آزمایشات:

نتایج شمارش سلولهای خونی:

WBC count: …… RBC count:…….. Platelet count:…….. MCV:……. MCH:……… MCHC:……….Hb:……. Htc:…..

CRP:…………. ESR:…………. D-dimer:…….

تغییرات پارامترهای بیوشیمیایی:

LDH:…..ALT:…….AST:……..ALP:…….CK:……. Alb:……. Bilirubin:…..

در این پژوهش فراوانی تعدادی از تغییرات تک نوکلئوتیدی واقع شده بر روی ژنهای کد کننده سایتوکاینهای التهابی و یا گیرنده ی ورود ویروس کووید19 به سلول بین گروه کیس و کنترل مقایسه می شوند.

حداقل 2 سی سی خون داخل لوله های CBC از هر فرد جمع آوری می شود تا جهت استخراج DNA مورد استفاده قرار گیرد.

شناسایی این عوامل ژنتیکی مستعد کننده ابتلا به ویروس کووید19 به درک مکانیسم مولکولی دخیل در پاتوژنز این بیماری عفونی کمک خواهد کرد.

ندارد

ندارد

تمامی هزینه های مربوط به پژوهش فعلی توسط مجری پرداخت شده و بیمار هیچ هزینه ای پرداخت نخواهد کرد.

ندارد

اطلاعات بیماران به صورت کاملاً محرمانه حفظ شده و به هیچ عنوان در اختیار شخص ثالثی قرار نخواهد گرفت.

جهت هر گونه سوال با شماره زیر (مجری طرح) تماس گرفته شود:

09103161030
(دکتر سرگزی)

بیمار حق دارد از شرکت در پژوهش فعلی امتناع کند.

کلیه اطلاعات مربوط به بیماران پس از کسب رضایت کتبی در پژوهش فعلی استفاده می شود.