ببررسی پلی¬مورفیسم های rs9434741، rs2273032 و rs12067480 در ناحیه پروموتور ژن CHD5 در مردان نابارور مبتلا به الیگوزوسپرمی شدید و آزواسپرمی غیر انسدادی در مقایسه با گروه کنترل

ناباروری یکی از تجربیات تلخ زندگی است و به عنوان یک بحران جدی در زندگی محسوب می­گردد که باعث اختلافات در زندگی زناشویی و افت کیفیت زندگی می‌شود.[1] این اختلال تقریباً 15% زوج‌ها را در سنین باروری درگیر می‌کندکه بر اساس تعریف سازمان بهداشت جهانی World Health Organization WHO) به حالتی اطلاق می‌شود که زوجین پس از یک سال مقاربت­های متوالی، منظم و بدون استفاده از روش­های پیشگیری،  با عدم­موفقیت در باروری مواجه می‌شوند.[2]

ناباروری دلایل مختلفی دارد که بر پایه مطالعات انجام شده، 30 تا 50% از علل ناباروری مربوط به فاکتورهای مردانه،30 تا 50% مربوط به علل زنانه، 25 تا 40% مربوط به تأثیر هم­زمان فاکتورهای مردانه و زنانه و درنهایت 10 تا 15% از موارد بدون هیچ علت مشخصی گزارش شده است.[3] بنابراین در حدود نیمی از موارد ناباروری، یک عامل مردانه دخیل است که به عوامل ژنتیکی و غیرژنتیکی مربوط می‌شود[4] شناخت کامل مسیر اصلی اسپرم­سازی و وقایع و حساسیت­های هر مرحله حائز اهمیت است. اسپرماتوژنز یکی از جالب‌ترین مکانیسم‌های تکامل سلولی است که در آن سلول­های بنیادی و دیپلوئید اسپرماتوگونی، اسپرماتوزوآی هاپلوئید را ایجاد می‌کنند که پس از بلوغ قادر به بارور کردن تخمک می‌باشد.[5]

تولیـد اسپرم در پسـتانداران شـامل سـه مرحلـه­ی تمـایزی می‌باشد. 1- میتـوز در (اسـپرماتوگونی) سلول‌های بنیادی بالغ 2- میوز یـا اسـپرماتوژنز و3- اسپرمیوژنز(گلیکوزیلـه شـدن، متراکم شدن هسته اسپرم، تبدیل اسپرماتید طویل شده به اسپرم بالغ و از دست دادن مقدار زیادی از سیتوپلاسم).[6] با وجود پیشرفت­های چشمگیر در روش­های تشخیصی و درمان،  در بیش از 25%­­ مردان، که آنالیز مایع منی غیرطبیعی دارند،  بیماری با علت و منشاء ناشناخته گزارش می‌شود، این شرایط تحت عنوان ناباروری ایدوپاتیک[1] خوانده می‌شود.[7] این افراد بر اساس معیارهای WHO در چهار دسته 1-آزواسپرمی[2]( عدم وجود کامل اسپرم در مایع­منی) که به سه گروه تقسیم می‌شود الف) پیش بیضه‌ای[3] که به دلیل اختلال در مسیر هیپوتالاموس – هیپوفیز رخ می‌دهد  2%) ، ب) غیرانسدادی[4] ( 49% تا 93%) که به دلیل اختلال در یکی از مراحل اسپرماتوژنز ایجاد می‌شود و ج) آزواسپرمی انسدادی[5] ( 7  تا 51%)که اسپرماتوژنز نرمال است ولی انسداد در مجاری تناسلی وجود دارد،[8] 2- الیگواسپرمی[6] (تعدادکمتر از 15 میلیون در میلی لیتر)[9]، که سه سطح خفیف، متوسط و الیگواسپرمی شدید،[7]( نمونه هایی که تعداد اسپرم در هر میلی لیتر مایع انزالی کمتر از 5 میلیون باشد)دارد3- آستنواسپرمی[8] (حرکت کمتر از 40٪) و 4- تراتواسپرمی[9] (کمتر از 4٪ شکل تخم مرغی نرمال) قرار می‌گیرند.[10]

از جمله دلایل ناباروی، می‌توان به نارسایی اولیه بیضه به دلیل اختلالات ژنتیکی، مادرزادی، عفونی، بدخیمی‌ها،  شیمی­درمانی، پرتو­درمانی یا عوامل ناشناخته اشاره کرد.[11]

منابع آسیب رسان متعددی از جمله گونه‌های اکسیژن فعال ROS) Reactive Oxygen Species)[10]، اختلال در تراکم کروماتین اسپرم و آپوپتوز و تغییر توالی ژن ناشی پلیمورفیسم های تک نوکلئوتیدی می‌تواند ­­­به اسپرماتوژنز آسیب برساند.[12] به عبارتی عواملی که از طریق تغییر توالی ژن ها در عملکرد و بیان ژن­های این فرآیند مانند (CHD5)  Chromodomain helicase DNA binding در اسپرماتوژنز نقص ایجاد­کنند، می‌توانند باعث ناباروری شوند [13]  و یکی از عوامل مهم و قابل‌سنجش در ناباروری مردان است. طی تولید سلول‌های جنسی، تغیرات  ­ژنتیک ،ایجاد می شود. [14, 15]

ژن  CHD5که یک واسطه در آبشار حوادث مولکولی اسپرماتوژنز است یکی از اعضای خانواده کرومودومین هلیکاز-DNA اتصال یابنده به  DNA است و یکی از تنظیم­کننده‌های مهم  ساختار کروماتین بوده که تقریباً  به طور انحصاری در سیستم عصبی و بیضه (6 برابر بیشتر) بیان می‌شود،[16] CHD5 بر روی کروموزوم 1 و در ناحیه p36.3، قرار گرفته و به عنوان یک نوع (TSG) Tumor suppressor gene شناخته می شود.[17]

(PHD) Plant homology domain، از دو هومودومین گیاهی پشت ­سرهم تشکیل شده است. پروتئین‌های  CHD توسط کرومودومین­های پشت­سر هم N- ترمینال با دامنه هلیکاز کاتالیزوری Snf2 (پروتئین تعدیل کننده کروماتین هلیکاز وابسته به ATP) به طرف C ترمینال مشخص می‌شوند[18]. در حال حاضر 9 عضو شناخته شده از این خانواده در انسان (CHD1-CHD9) وجود دارد که (CHD3 و CHD4) به صورت کمپلکس‌های چند پروتئینی در بازسازی کروماتین شرکت می‌کنند و  CHD5 تنها همولوگ نزدیک  به آنها است.[19]

Zhuang و همکارانش در سال   2014 نقش این ژن را در یک نژاد  موش ناک اوت knockout (KO)  بررسی کردند. خاموش شدن این ژن، منجر به نقص در اسپرم­سازی، فاگوسیتوز ناقص و باقی ماندن سیتوپلاسم  اضافی در سرِاسپرم، ناتوانی در ورود به اپیدیدیم به دلیل مورفولوژی نامناسب و­ عدم جایگزینی هیستون و تراکم کروماتین شدکه ناباروری موش های نرها هموزیگوت KO را به همراه داشت.[20] مورفولوژی غیرطبیعی اسپرم در مقایسه­ بیوپسی بیضه مردان با اسپرماتوژنز کامل و ناقص، این امر را آشکار کرد که بیان CHD5 در آنها 75%-95% کاهش یافته است.[21] در سرطان‌های متعددی از جمله گلیوما، ریه، معده، روده بزرگ، تخمدان، پروستات و کلورکتال این ژن متیله می‌شود[22] و بیان کم ژن CHD5  به دلیل متیلاسیون  باعث ایجاد سرطان پستان،  می شود.[23]

مطالعات نشان داده که CHD5 مانند یک ژن سرکوبگر تومور  TSGsرشد سلول را در نوروبلاستوما و سایر تومورها کنترل می‌کند که تغییر در عملکرد آن می‌تواند منجر به ایجاد تومور شود، TSGsدر فرآیندهای مربوط به گامتوژنز[11]نیز نقش دارند،[24] خاموش کردن  اپی­ژنتیک TSG از طریق هایپرمتیلاسیون پروموتر CpG منجر به پیشرفت تومور می‌شود، بنابراین می‌توان از میزان بیان آنها به عنوان نشانگرهای­ اپی­ژنتیکی برای تشخیص استفاده کرد.[25]

پلی مورفیسم[12]های تک ­نوکلئوتیدی Single-nucleotide polymorphism (SNP) متداول ترین واریانت های ژنتیکی بین افراد است و بین افراد تفاوتهایی را ایجاد می­کند آنها جهش در یک جفت باز موجود در ناحیه خاصی از DNA  بوده و می توانند در شناسایی ژنهایی که مسبب یا مستعد ابتلا به بیماری­های پیچیده انسانی هستند، نقش داشته باشند.  Zhuو همکارانش در سال 2018 با مطالعه بر روی ژنCHD5  نشان دادند، که rs12564469-rs9434711)) ارتباط قابل توجهی با پیش­بینی سرطان سلول­های هپاتوسیت [13] HCC دارد[26] و یک مطالعه مورد- شاهدی، ارتباط بالقوه‌ بین خطر ابتلا به HCC و پلی مورفیسم­هایCHD ، rs2273032 ،    rs12067480  و rs9434741  را درجمعیت چینی ها تأیید کرد.[27]

در مطالعه ای پلی مورفیسم های rs1883603, rs9434741, rs17436816 ژن CHD5 در اندومتریوز بررسی شد و مشخص شدکه پلی مورفیسم rs9434741 به طور قابل توجهی باآاندومتریوز ارتباط معنی داری دارد.[28]

مطالعه Hershlag  نشان داد که موتاسیون CHD5c.*3198_*3199 T, 3′[14]UTR (rs538186680به طور معنی­داری در نمونه‌های نر نابارور نسبت به کنترل ­­بیشتر بود، بنابراین ممکن است دلایل ایدیوپاتیک ناباروری با اختلالات CHD5 در ارتباط باشد.[29]

در رابطه با پلی مورفیسم های مختلف این ژن تحقیقات زیادی انجام شده ولی تاکنون مطالعه ای برروی ارتباط این ژن با ناباروری مردان گزارش نشده است.  ژنوتیپ CHD5 rs7513548 SNP با ملانوم پراکنده به طور معنی داری در ارتباط بود.این مطالعه نشان داد که ژن CHD5 می تواند در تنظیم چرخه سلولی نقش داشته باشد.[30]

rs11121295 در ژن CHD5 با خطر ابتلا به بیماری آلزایمر در تبار چینی همراه بود. محصول این ژن یک پروتئین هسته ای است که در بازسازی و داستیلاسیون نوکلئوزوم (NuRD) نقش داشته  و ممکن است را در سطح بازسازی کروماتین و رونویسی ژنها تحت تأثیر قرار دهد. [31, 32]

از آنجایی که آسیب به ترکیبات ژنتیکی اسپرماتوزوآ نقش بسیار حیاتی در باروری جنس مذکر بازی می کند هرگونه نقص در این ترکیبات می تواند، از دلایل اصلی ناباروری در مردان باشد. بررسی ها نشان می دهند که بعضی پلی مورفیسم های ژنتیکی احتمالا با آسیب به روند اسپرماتوژنز در مردان نابارور همراه بوده و می تواند به نقص هایی همچون الیگواسپرمی و آزوسپرمی ناشناخته منجر شود. [33]

با توجه به  شیوع بالای ناباروری در جهان، ایران و استان سیستان و بلوچستان،که نیمی از دلایل آن مربوط به مردان است و اهمیت ونقش فرزندآوری درحفظ بنیان خانواده، تلاش جهت پیدا کردن روشهای  شناسایی سریع و دقیق علل حائز اهمیت است.

بر اساس نظر کارشناسان، در نتایج  اسپرموگرام مردان نابارو، الیگواسپرمی شدید و آزواسپرمی غیر انسدادی  فراوان بوده و این افراد در مرحله بعد به پزشک، برای انجام  تست بالینی، اندازه گیری هورمونها، بیوپسی بیضه  و سایر  روشهای تشخیصی مراجعه می­کنند.انجام روشهای تهاجمی، هزینه­های بالا جهت تشخیص، دوره طولانی، موفقیت های نسبی درمان و استرس های وارد شده به فرد، معمولا باعث عدم پیگیر ی و ادامه درمان در مردان می­شود. لذا نیاز مبرمی به انجام مطالعات گسترده در زمینه روشهای تشخیص غیر تهاجمی و بدون استرس،کارآامد، ارزان و زود هنگام برایناباروری احساس می­شود. انجام آزمایش های ژنتیک بر روی نمونه خون، به دلیل غیر تهاجمی، آسان، در دسترس بودن و دقت بالا می­تواند، پزشک را در انتخاب  روش درمان  صحیح،  یاری کند.

با توجه  به مطالعات و اهمیت ژن CHD5 در فرآیند تراکم کروماتین طی  بلوغ  اسپرم و پارامترهای کیفی و کمی آن، تعیین و مقایسه پلی مورفیسم های نواحی تنظیم کننده ژن که بر فرآیندهای اسپرماتوژنز اثردارد و فعالیت ژن را تغییر می­دهد در افراد سالم و الیگواسپرمی شدید، می تواند کاندید مناسبی برای تشخیص و پیش آگاهی  باشد. همچنین می­توان با تعیین واریانت های ژنتیکی پلی­مورفیسم های تک نوکلئوتیدی rs2273032 و rs12067480 rs9434741  ژن CHD5،  خطر ابتلا به الیگواسپرمی شدید و آزواسپرمی غیر انسدادی ، را در افراد مستعد حامل ژنوتیپ های خاص،  تخمین زد. مطالعه پلی مورفیسم های  پروموتور ژن CHD5 نیز احتمالا با اثرتنظیمی بر بیان آن، می تواند یک بیومارکر اپی­ژنتیک  باشد.

بنابراین بررسی عوامل ژنتیک می­تواند ما را با سرعت و دقت بیشتر و مطمئن تر از گذشته  با بکارگیری، مارکر های اختصاصی و دقیق به تشخیص صحیح  الیگواسپرمی شدید و آزواسپرمی غیر انسدادی رسانده  و

1- توزیع فراوانی  پلی مورفیسم rs9434741،  ژن CHD5  در مردان نابارور الیگواسپرمی شدید و آزواسپرمی غیر انسدادی با گروه کنترل متفاوت است.

  2- توزیع فراوانی  پلی مورفیسم rs2273032 ،  ژن CHD5  در مردان نابارور الیگواسپرمی شدید و آزواسپرمی غیر انسدادی با گروه کنترل متفاوت است.

3- توزیع فراوانی  پلی مورفیسم rs12067480 ،  ژن CHD5 در مردان نابارور الیگواسپرمی شدید و آزواسپرمی غیر انسدادی با گروه کنترل متفاوت است.

4- پلی­مورفیسم های rs9434741، rs2273032  و rs12067480  با استعداد ابتلا به الیگواسپرمی و آزواسپرمی غیر انسدادی ارتباط دارند.

تعیین فراوانی پلی­مورفیسم های rs9434741، rs2273032  و rs12067480  در ناحیه پروموتور ژن CHD5 در مردان نابارور مبتلا به الیگواسپرمی شدید و آزواسپرمی غیر انسدادی در مقایسه با گروه کنترل

1- تعیین ومقایسه  فراوانی  پلی مورفیسم rs9434741  ژنCHD5   در مردان نابارور الیگواسپرمی شدید و آزواسپرمی غیر انسدادی باگروه کنترل

2- تعیین و مقایسه فراوانی  پلی مورفیسم rs2273032   ژنCHD5   در مردان نابارور الیگواسپرمی شدید وو آزواسپرمی غیر انسدادی گروه کنترل

3- تعیین و مقایسه  فراوانی  پلی مورفیسم rs12067480   ژنCHD5   در مردان نابارور الیگواسپرمی شدید و آزواسپرمی غیر انسدادی باگروه کنترل

4- تعیین ارتباط پلی­مورفیسم های rs9434741، rs2273032  و rs12067480  با استعداد ابتلا به ناباروری به علت الیگواسپرمی شدید و آزواسپرمی غیر انسدادی

• مراکز تحقیقاتی
• مراکز درمان ناباروری
• دانشگاه های علوم پزشکی و گروه های مرتبط وزات علوم، تحقیقات و فناوری

آزواسپرمی غیر انسدادی ( Azooespermia ) عدم وجود اسپرم در مایع منی به دلیل مشکلات ژنتیکی و غیر ژنتیکی

الیگواسپرمی شدید  ( aSever Oligoespermi) بیماری است که در هر میلی لیتر مایع منی، کمتر از 5 میلیون اسپرم وجود داشته باشد

پلی مورفیسم ( Polymorphism)  متداول ترین واریانت های ژنتیکی بین افراد و تغییر در یک باز منفرد در ناحیه خاصی از DNA  است که اگر در نواحی تنظیم کننده اتفاق افتد، توالی آمینواسیدی پلی پپتید مربوطه یا روش تنظیم بیان ژن را تغییر می دهد.

Polymerase Chain Reaction) PCR) واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، تکنیکی در زیست‌شناسی مولکولی است، به منظور تکثیر یک نسخه منفرد یا نسخه‌های کمی از یک قطعه DNA با توالی خاص به تعداد هزار یا میلیون‌ها نسخه به کار می‌رود.

مورد- شاهدی(case-control)

مردان نابارور مبتلا به الیگواسپرمی شدید و مردان با آزواسپرمی غیر انسدادی مراجعه کننده به مرکز ناباروری مولود بیمارستان علی ابن ابیطالب زاهدان برای انجام تست اسپرموگرام

معیارهای ورودبه مطالعه:

1. آزمایش تعیین سطح هورمون FSH  که در افراد نرمال میزان آن  ( mIU/mL 9/10تا4/1 ) است و معمولا در افرادا آزواسپرمی غیر انسدادی(عدم وجود اسپرم در مایع سمن) افزایش سطح این هورمون مشاهده می شود[34]

  2- نتیجه آنالیزهای آزمایش اسپرموگرام آنها تعداد کمتر از 5 میلیون اسپرم در مایع منی را نشان دهد و الیگواسپرم شدید باشند.

    3- مدت  یک سال بدون استفاده از روشهای جلوگیری از بارداری ، تلاش مکرر برای بارداری همسرشان انجام داده و نتیجه ای حاصل نشده باشد .

معیارهای خروج  از مطالعه:

1. آزو اسپرمی غیر انسدادی نباشند (آزمایش تعیین سطح هورمون FSH  )

2- نتیجه آنالیزهای آزمایش اسپرموگرام آنها تعداد کمتر از 5 میلیون اسپرم در مایع منی را نشان ندهد و الیگواسپرم شدید نباشند.

    3- حداقل دارای یک فرزند باشند

1. مردانی که طبق آنالیزهای اسپرموگرام، تراتواسپرمی  و آستنواسپرمی و الیگواسپرمی خفیف و متوسط  باشند.  

5- مردان الیگو اسپرمی شدید،که دیابت یا فشار خون بالا داشته باشند ویا از داروی خاصی مانند، داروهای زیبایی اندام (تستوسترون) استفاده کنند.

6-مردان الیگواسپرشدید که اطلاعات پرونده کاملی نداشته باشند و شماره تماسی از آنها نداشته باشیم.

7- مردان الیگواسپرمی شدیدکه سیگاری شدید با استعمال بیش از بیست و پنج سیگار در روز باشند).

(معیار 'سیگاری شدید' بودن بر اساس اظهارات بیمار در پرسشنامه و به افراد با مصرف سیگار بیش از 25 نخ سیگار در روز اطلاق می شود.) [35]

8-مردانی که واریکوسل داشته باشند

9-آزمایش ژنتیک کاریوتیپ غیر نرمال (کلاین فلترXXY 47)، وجود ریز حذفی کروموزوم Y،آنومالی بیضه

     گروه کنترل:

1-مردانی که حداقل یک  فرزند داشته باشند

2-تست اسپرموگرام آنها نرمال باشد

3-بیماری زمینه ای مانند فشار خون ،دیابت، سرطان یا مصرف داروهای خاص و ایمنی نداشته باشند

4-اطلاعات پرونده آنها کامل باشد

5-مکمل های پروش اندام استفاده نکرده باشند

6-در محدوده سنی باروری قرار داشته باشند

7-دوری از مقاربت به مدت 3 - 5 شبانه روز

8-مصرف دخانیات ، الکل و داروهای پروش اندام نداشته باشند

براساس اصول کلی مطالعات ژنتیک و مولکولی قبل، با استفاده از روش های آماری و با توجه به فراوانی متغیر مورد بررسی، حداقل 100 نمونه از هر گروه مورد نیاز است. 100 نمونه  خون مردان بارو و سالم در گروه کنترل، 100 نمونه  خون از مردان نابارور که  بر طبق آزمایش آنالیز اسپرم الیگواسپرمی شدید یا آزوسپرمی غیر انسدادی باشند، وارد خواهد شد.

تعیین حجم نمونه با استفاده از فرمول کوکران با در نظر گرفتن 1/0=p ( نسبتی از جمعیت دارای صفت معین)، مقدار متغیر نرمال واحد استاندارد در میزان اطمینان 95 درصد (96/1=Z ) و میزان خطای قابل تحمل (04/0=d) به تعداد 200 نمونه (100 نمونه مردان بارور و100 نمونه مردان نابارورآزواسپرم/ الیگواسپرم شدید) با علل نامعلوم برآورد شد[36]

نمونه گیری به صورت آسان و در دسترس است. 

دو گروه ازنظر سن،BMI، تحصیلات، وضعیت شغلی و قومیت همسان سازی خواهند شد.با توجه به تعداد افراد مبتلا به آزواسپرمی در صورت استفاده از از روشهای نمونه گیری احتمالاتی با کمبود حجم نمونه مواجه خواهیم شد. در مورد همسان سازی سن جهت پیشگیری از مواجهه با مشکلات overmatching، از همسان سازی گروهی استفاده خواهد شد. 

5 میلی لیتراز خون محیطی افراد نابارور الیگواسپرمی شدید و آزواسپرمی غیر انسدادی ، گرفته و درداخل  میکروتیوب حاوی  محلول  EDTA ریخته و برای انجام مراحل  بعدی در فریزر c °80- نگهداری خواهیم کرد.

نمونه­های مورد نظراز بین افراد مبتلا به الیگواسپرمی شدید/ آزواسپرمی غیرانسدادی و افراد سالم طبق شاخص های ورود و خروج از مطالعه، انتخاب می شوند.. تست های مولکولی شامل اندازه گیری پلی مورفیسم ها در مرکز تحقیقات بیماری های عفونی وگرمسیری و آزمایشگاه جامع تحقیقات انجام خواهد شد.

پس از خون گیری از مردان با الیگواسپرمی شدید و آزواسپرمی غیر انسدادی و گروه کنترل استخراج  DNA  با استفاده از تکنیک های مختلف  PCR ژنوتیپ های پلی­مورفیسم های rs9434741، rs2273032  و rs12067480  ژن CHD5  ثبت می شود که فرم اطلاعاتی در پیوست ضمیمه شده است.

فرم اطلاعات دموگرافیک (ضمیمه)

فرم  ثبت اطلاعات نمونه (ضمیمه)

پس از اخذ تائیدیه کمیته اخلاق و رضایتنامه از مردان نابارور با الیگواسپرمی شدید و گروه کنترل که معیارهای ورد به مطالعه را داشته باشند، 5 میلی لیتر خون محیطی را در  لوله های حاوی  محلول  EDTA ریخته وبرای استخراج  DNA در دمای c °80-  نگهداری خواهیم کرد. جهت آزمایش های مولکولی بر روی نمونه، DNA از خون تام  با استفاده از روشSalting out  ( استخراج نمکی ) جدامی­شود. برای ارزیابی کمی وتعیین غلظتDNA ،(از نظر الودگی به پروتئین و RNA) نسبت جذب طول  موج 260 به 280  نانومتر  را با کمک دستگاه اسپکتوفتومتر نانودراپ  بعد از کالیبره کردن با آب مقطر طبق دستور، اندازه گیر ی می­کنیم و جذب بین (2>280/260 OD >8/1 ) مطلوب خواهد بود .

بررسی کیفی نمونه نیز به کمک ژل آگارز  ساخته شده طبق دستور وروش الکتروفورزکه  باعث حرکت  ذرات شده و تحت میدان الکتریکی و براساس وزن مولکولی و بار آنها را جدا می­کند انجام می شود، سپس در دستگاه ژل داک، تصویر باندهای تشکیل شده را مشاهده،  عکس گرفته و کیفیت نمونه را بررسی خواهیم کرد.

 به رسوب  DNAاستخراج شده آب مقطر استریل اضافه کرده و برای انجام کارهای بعدی در دمای c °20- نگهداری می­کنیم. سپس پرایمر اختصاصی در سایت NCBI  با نرم افزار Blast  طراحی کرده و سفارش می دهیم .طبق اصول کلی واکنش زنجیره ای پلی مراز PCR))،  برای تکثیر قطعه  هدف، مواد لازم (چهار نوکلئوتید ،DNA الگو،پرایمر اختصاصی ،انزیم DNA پلی مراز (Tag –DNA polymerase)، بافر و کاتیونهای یک و دو ظرفیتی با غلظتهای مشخص) طبق دستور در میکروتیوب دستگاه ترموسایکلر قرارگرفته و طی مراحل واسرشتگی  قطعه DNA به وسیله حرارت، اتصال پرایمر به توالی هدف با تشکیل پیوندهای هیدروژنی، گسترش و طویل سازی ژن CHD5 ، انجام خواهد شد. البته دمای مناسب برای اتصال اختصاصی و بهینه پرایمرها در هر مرحله، از طریق شیب دمایی PCRتعیین می­شود وکنترل کیفی و کمی محصول بررسی خواهد شد.

در این مطالعه، برای  بررسی 3 پلی مورفیسم rs9434741، rs2273032 و rs12067480  در ژن CHD5

پرایمرهای اختصاصی   Forwarde , Reverseجهت تکثیر ناحیه پلیمورفیک  برای هر rs ، طراحی شده، در حضور قطعه تکثیر شده و با استفاده  از روش ARMS-PCR   tetra ، که به طور همزمان 4 پرایمر (دو پرایمر داخلی برای هریک از آللها  و دو پرایمر خارجی برای ناحیه کنترل ) در یک واکنش PCR   به کار می رود، می توان دو آلل را دریک جایگاه SNP در صورت وجود مشاهده کرد. پس از انجام  مراحل طبق دستور ،محصول بر روی ژل آگارز الکتروفورز می­شود و فراوانی ژنوتیپ های هموزیگوت و هتروزیگوت تفسیرخواهد شد.

روش پیشنهادی دیگر برای بررسی پلی مورفیسم ها در این مطالعه، RFLP-PCR  با استفاده از آنزیمهای محدود گر مناسب برای برش جایگا ه های مورد نظر DNA است که پس از هضم با آنزیم، قطعات با طولهای مختلف با الکتروفورز مشاهده و بررسی خواهد شد. تغییر یک نوکلئوتید می تواند جایگاه اثری برای یک آنزیم بوجود آورد وسبب تغییر این  قطعات در ژن CHD5باشد.

نتایج حاصل  از پلی­مورفیسم های rs9434741، rs2273032 و rs12067480 ، CHD5 ، پروموتور ژن CHD5 و ارتباط هریک از این متغییرها باهم، در این تحقیق در افراد سالم و الیگواسپرمی شدید، بررسی و تفسیر خواهد شد.

بـرای ثبـت داده هـا و آنـالیز آمـاری از نــرم افــزار SPSS استفاده و در تمام آنالیزها p< 0.05   بـه عنـوان سـطح معنـی دار آمـاری در نظر گرفته خواهد شد. اطلاعات کمی به صورت میانگین  ± انحراف معیار ارائه می­شود. تفاوت های آماری بین متغیرهـای کیفی دو گروه بیمار و کنترل بعد از بررسی نرمال بودن داده ها با اسـتفاده از آزمون chi-square   یا  Fisher Exact Test و مقایسه داده های کمی  باindependent sample t- test  انجام خواهد شد. مقایسه داده ها در افراد گروه های سالم و بیمار از نظر فراوانی ژنوتیپی،  با آزمون(مجذور کای دو) x² ، تجزیه و تحلیل شده، جهت مقایسه پارامترهای بالینی با نوع ژنوتیپ از آزمونt- test  و برای ارتباط پلی مورفیسم بین دو گروه کنترل  و بیمار از رگرسیون لاجستیک استفاده خواهد شد.

کدهای (1و2و3و4و5وو811و12و13و14و15و16و17و18و25و26و28و29و30و31) مصوب کمیته کشوری اخلاق در پژوهش  های علوم پزشکی که در دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهشهای علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی در جمهوری اسلامی ایران، در بردارنده اصول و مقررات  اخلاقی مطرح و در سال 1392  در 31 بند تصویب شده است در این طرح رعایت می شود .تمامی بیماران تحت مطالعه آگاهانه و برای مقاصد علمی اقدام به دادن خون خواهند کرد شرکت در این طرح ، هیچ گونه هزینه ای برای بیماران ندارد و نام ومشخصات آنها گزارش نخواهد شد.

همچنین کدهای(1و2و4و6و7و8) مصوب کمیته کشوری  اخلاق درپژوهش های  علوم پزشکی که در دفترچه راهنمای عمومی، دفترچه راهنمای اخلاق پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی، تصویب شده است در این طرح رعایت می گردد.

عدم همکاری بیمار

مشکل تهیه مواد وتجهیزات آزمایشگاهی مورد نیاز و امکان طولانی شدن زمان دریافت که می توان زودتر آنها را سفارش داد یا از تجهیزات مراکز و دانشگاههای دیگر استفاده کرد.

نقص اطلاعاتی بعضی پرونده ها که با بررسی و پیگیری بیشتر تعداد مواردی که  دارای اطلاعات کامل باشند  ،انتخاب خواهد شد

Oligospermia- Infertility–CHD5-Gene-Polymorphism

1.            Dabo, K., International Conference on Population and Development (ICPD). Follow-up to the Cairo and Ouagadougou programs of action. Pop Sahel: bulletin d'information sur la population et le developpement, 1999(28): p. 33.

2.            Luo, L.-F., C.-C. Hou, and W.-X. Yang, Small non-coding RNAs and their associated proteins in spermatogenesis. Gene, 2016. 578(2): p. 141-157.

3.            Agarwal, A., C. Ong, and D. Durairajanayagam, Contemporary and future insights into fertility preservation in male cancer patients. Translational andrology and urology, 2014. 3(1): p. 27-40.

4.            Wein AJ, K.L., Novick AC, Partin AW, Peters CA.,

Campbel–Walsh Urology. 10th Edition. Philadelphia: W, 2010: p. 25-30.

5.            ARYA, M. and T. VANHA‐PERTTULA, Lectin‐binding pattern of bull testis and epididymis. Journal of andrology, 1985. 6(4): p. 230-242.

6.            Meistrich, M.L. and R.A. Hess, Assessment of spermatogenesis through staging of seminiferous tubules, in Spermatogenesis. 2013, Springer. p. 299-307.

7.            Kara, E. and M. Simoni, Genetic screening for infertility: When should it be done? Middle East Fertility Society Journal, 2010. 15(3): p. 139-145.

8.            Poongothai, J., T. Gopenath, and S. Manonayaki, Genetics of human male infertility. Singapore Med J, 2009. 50(4): p. 336-347.

9.            Menkveld, R., Clinical significance of the low normal sperm morphology value as proposed in the fifth edition of the WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. Asian journal of andrology, 2010. 12(1): p. 47.

10.          Rowe, P.J., et al., WHO manual for the standardized investigation and diagnosis of the infertile male. 2000: Cambridge University Press.

11.          Ezeh, U., H. Moore, and I. Cooke, Correlation of testicular sperm extraction with morphological, biophysical and endocrine profiles in men with azoospermia due to primary gonadal failure. Human reproduction (Oxford, England), 1998. 13(11): p. 3066-3074.

12.          Sakkas, D., E. Mariethoz, and J.C.S. John, Abnormal sperm parameters in humans are indicative of an abortive apoptotic mechanism linked to the Fas-mediated pathway. Experimental cell research, 1999. 251(2): p. 350-355.

13.          Gunes, S., et al., Epigenetics, Spermatogenesis, and Male Infertility, in Reproductomics. 2018, Elsevier. p. 171-187.

14.          Ingram, N., Waddington, Holmyard and Alchemy: Perspectives on the Epigenetic Landscape. Endeavour, 2019. 43(3): p. 100690.

15.          Jablonka, E. and G. Raz, Transgenerational epigenetic inheritance: prevalence, mechanisms, and implications for the study of heredity and evolution. The Quarterly review of biology, 2009. 84(2): p. 131-176.

16.          Thompson, P.M., et al., CHD5, a new member of the chromodomain gene family, is preferentially expressed in the nervous system. Oncogene, 2003. 22(7): p. 1002-1011.

17.          Bagchi, A., et al., CHD5 is a tumor suppressor at human 1p36. Cell, 2007. 128(3): p. 459-475.

18.          Bagchi, A. and A.A. Mills, The quest for the 1p36 tumor suppressor. Cancer research, 2008. 68(8): p. 2551-2556.

19.          Hong, W., et al., FOG‐1 recruits the NuRD repressor complex to mediate transcriptional repression by GATA‐1. The EMBO journal, 2005. 24(13): p. 2367-2378.

20.          Zhuang, T., et al., CHD5 is required for spermiogenesis and chromatin condensation. Mechanisms of development, 2014. 131: p. 35-46.

21.          Fujita, T., et al., CHD5, a tumor suppressor gene deleted from 1p36. 31 in neuroblastomas. JNCI: Journal of the National Cancer Institute, 2008. 100(13): p. 940-949.

22.          Kolla, V., et al., Role of CHD5 in human cancers: 10 years later. Cancer research, 2014. 74(3): p. 652-658.

23.          Wu, X., et al., Chromodomain helicase DNA binding protein 5 plays a tumor suppressor role in human breast cancer. Breast Cancer Research, 2012. 14(3): p. R73.

24.          Wang, J., et al., The involvement of CHD5 hypermethylation in laryngeal squamous cell carcinoma. Oral oncology, 2011. 47(7): p. 601-608.

25.          Fatemi, M., et al., Epigenetic silencing of CHD5, a novel tumor‐suppressor gene, occurs in early colorectal cancer stages. Cancer, 2014. 120(2): p. 172-180.

26.          Zhu, X., et al., The single-nucleotide polymorphisms in CHD5 affect the prognosis of patients with hepatocellular carcinoma. Oncotarget, 2018. 9(17): p. 13222.

27.          Xiao, Q., et al., A rare CHD5 haplotype and its interactions with environmental factors predicting hepatocellular carcinoma risk. BMC cancer, 2018. 18(1): p. 658.

28.          Falconer, H., et al., Analysis of common variations in tumor-suppressor genes on chr1p36 among Caucasian women with endometriosis. Gynecologic oncology, 2012. 127(2): p. 398-402.

29.          Hershlag, A., et al., The potential impact of tumor suppressor genes on human gametogenesis: a case-control study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 2019: p. 1-6.

30.          Lang, J., E. Tobias, and R.J.B.J.o.D. Mackie, Preliminary evidence for involvement of the tumour suppressor gene CHD5 in a family with cutaneous melanoma. 2011. 164(5): p. 1010-1016.

31.          Zhu, X., et al., Genetic variations in chromodomain helicase DNA-binding protein 5, gene-environment interactions and risk of sporadic Alzheimer’s disease in Chinese population. 2018. 9(38): p. 24872.

32.          Paul, S., et al., Chd5 requires PHD-mediated histone 3 binding for tumor suppression. 2013. 3(1): p. 92-102.

33.          O'Brien, K.L.F., et al., The genetic causes of male factor infertility: a review. 2010. 93(1): p. 1-12.

34.          Martin-du-Pan, R. and P.J.H.R. Bischop, Increased follicle stimulating hormone in infertile men. 1995. 10: p. 1940-1950.

35.          Wilson, D., et al., Characteristics of heavy smokers. 1992. 21(3): p. 311-319.

36.          Ghorbian, S. and R.J.J.o.B.U.o.M.S. Kian Bostanabad, Association the Study of Between Cpeb1 (Rs230846 C> T) Gene Polymorphism And Azoospermia/Severe Oligospermia. 2018. 20(9): p. 20-27.

ناباروری یکی از تجربیات تلخ زندگی است و به عنوان یک بحران جدی در زندگی محسوب می­گردد که باعث اختلافات در زندگی زناشویی و افت کیفیت زندگی می‌شود با توجه  به مطالعات و اهمیت ژن CHD5 در فرآیند تراکم کروماتین طی  بلوغ  اسپرم و پارامترهای کیفی و کمی آن، تعیین و مقایسه بپلیمورفیسم های نواحی تنظیم کننده ژن که بر فرآیندهای اسپرماتوژنز اثردارد و فعالیت ژن را تغییر می­دهد در افراد سالم و الیگواسپرمی شدید، می تواند کاندید مناسبی برای تشخیص و پیش آگاهی  باشد. همچنین می­توان با تعیین واریانت های ژنتیکی پلی­مورفیسم های تک نوکلئوتیدی rs2273032 و rs12067480 rs9434741  ژن CHD5،  خطر ابتلا به الیگواسپرمی شدید، را در افراد مستعد حامل ژنوتیپ های خاص،  تخمین زد. مطالعه پلیمورفیسم های  پروموتور ژن CHD5 نیز احتمالا با اثرتنظیمی بر بیان آن، می تواند یک بیومارکر اپی­ژنتیک  باشد.

بنابراین بررسی عوامل ژنتیک می­تواند ما را با سرعت و دقت بیشتر و مطمئن تر از گذشته  با بکارگیری، مارکر های اختصاصی و دقیق به تشخیص صحیح  الیگواسپرمی شدید، رسانده  و انتخاب روش درمانی موثر، زود هنگام و سودمند، امید به درمان و بهبودی را افزایش خواهد داد.

دارد

ندارد

ندارد

ندارد

هزینه  آزمایشات  این طرح به عهده مجریان خواهد بود.

ندارد

آدرس مجریان طرح جهت پاسخ گویی به سوالات بیماران شرکت کننده در مطالعه:

زاهدان، بزرگراه خلیج فارس، روبروی بیمارستان علی ابن  ابیطالب(ع) مجتمع پزشکی پردیس، گروه بافت شناسی

مرکز تحقیقات آزمایشگاه جامع

شرکت من در مطالعه کاملاً اختیاری است و آزاد خواهم بود که از شرکت در مطالعه امتناع نموده یا هر زمان  که مایل بودم بدون آنکه تغییری در نحوه رفتار پزشک درمانگر یا نحوه درمان و مراقبت از بیماری اینجانب ایجاد شود از پژوهش مذکور خارج شوم.

با توجه به اطلاعات موجود در این فرم و توضیحات حضوری مجری یا همکاران طرح موافقت خود را با شرکت در این مطالعه اعلام می نمایم. یک نسخه از این فرم به من داده شده و فرصت خواندن آن را داشته ام.

فرم اطلاعات  طرح پژوهشی (اطلاعات دموگرافیک)

فرم ثبت اطلاعات نمونه  ها

بررسی ارتباط پلی­مورفیسم های rs9434741، rs2273032  و rs12067480  در ناحیه پروموتور ژن CHD5 در مردان نابارور مبتلا به الیگواسپرمی شدید در مقایسه با گروه کنترل

کد بیمار ............

گروه بیمار                        مورد............                  کنترل............................

سن ..........

نوع نمونه...........      

نوع پلی مورفیسم rs9434741،  ژن CHD5

AG               ………….. GG                    ………..AA      ...................

نوع پلی مورفیسم  rs2273032   ژن CHD5

GA                     ….……….   GG    ……………  A       .................

نوع پلی مورفیسم  rs12067480  ژن CHD5

CT           ……….. TT              ……………. CC      ...................