بررسی بیان نسبی انواع میکروRNA های تخصصی (مانند mirna-17 , mirna-126 , mirna-29 ,mirna-31) در سیر بیماری مبتلایان به کووید-19

در اواخر دسامبر  سال 2019 (آذر ماه 1398) در شهر Wuhan چین بیماری جدیدی نمایان گردید که به اسم سندرم حاد تنفسی شناخته شد. عامل این بیماری عفونی کووید 19 نام گرفت و طی دو هفته طغیان­های مشابهی در بیمارستان های مختلف رخ داد. علائم بالینی عمده این بیماری شامل تب، سرف خشک، اسهال، درد عضلانی ، پنومونی و در موارد شدید مرگ است. در حال حاضر ، به تایید سازمان جهانی بهداشت این بیماری پاندمی شده و در اکثر کشورها قرنطینه خانگی و رعایت بهداشت فردی بشدت اجرا می شود (1). متاسفانه در ایران تا بحال 6418 نفر به علت کووید-19 فوت کرده اند(2).

با توجه به اینکه کووید 19 بیماری بسیار نوظهوری است، اطلاعات کاملی در مورد ابعاد سلولی و مولکولی آن وجود ندارد. اینکه در جریان بیماری تا بهبودی کامل فرد سیستم ایمنی بدن چگونه به آن واکنش نشان می دهد هنوز کاملا مشخص نیست (3). اینکه چه مارکر های در خون با ظهور و افول بیماری کم و زیاد می شوند بسیار با همیت می باشد و می تواند پیش آگهی خوبی در مورد بیماری به ما بدهد. یکی از مولکول های تشخیصی مهم در بیماری های عفونی و غیر عفونی میکروRNA ها هستند که می تواند در تشخیص زودهنگام بیماری و همچنین در پیش آگهی به ما کمک کند (4). میکروRNA ها مولکول های کوچک RNA ای غیر کد کننده هستند که در یوکاریوت‌ها دیده می‌شوند و حدود ۱۷–۲۳ نوکلئوتید طول دارند. وظیفه اصلی آن‌ها در تنظیم بیان ژن پس از رونویسی است؛ که با برهمکنش با mRNA و خاموش کردن آن تولید پروتئین ژن مورد نظر را سرکوب می‌کنند. ژنوم انسان می‌تواند حدود ۱۰۰۰ نوع از آن‌ها را رمزدهی کند (5).

ما می دانیم که در بیماری های ویروسی تعدادی میکروRNA دچار تغییر بیان شده و نسبت به کنترل افزایش و یا کاهش بیان دارند (6). مثلا نشان داده شده است که در بیماران مبتلا به آنفولانزا H1N1 سطح بیان mir-17 و mir-126 افزایش و سطح بیان mir-29 و mir-31 کاهش دارند (7). یا مثلا همزمان با افزایش سطح پاسخ ایمنی بدن به ویروس آنفولانزا میزان سطح let-7 نیز به همان نسبت افزایش پیدا می کند. این میکروRNA در ارزیابی سطح سیستم ایمنی و پیش آگهی بیماری می تواند بسیار مفید باشد (8). در مطالعه ای که توسط زانگ و همکاران در سال 2018 انجام شد، نشان داده شده است که افزایش سطح بیان mir-203  باعث جلوگیری از تکثیر ویروس انفولانزا  با هدف قرار گرفتن ژن DR1 می گردد. (9). 

هدف از این مطالعه بررسی بیان نسبی انواع میکروRNA های تخصصی در سیر بیماری مبتلایان به کووید-19 است. به زبان  ساده تر ما میخواهیم بدانیم کدام میکروRNA در طول بیماران مبتلا به کووید-19 از آغاز تا پایان دچار تغییر بیان می شوند.

1. آیا بیان نسبی انواع میکروRNA تخصصی در بیماران مبتلا به کووید-19 در ابتدای بیماری (در هفته صفر) متفاوت است؟
2. آیا بیان نسبی انواع میکروRNA تخصصی در بیماران مبتلا به کووید-19 در اواسط بیماری (در هفته 2) متفاوت است؟
3. آیا بیان نسبی انواع میکروRNA تخصصی در بیماران مبتلا به کووید-19 در انتهای بیماری (در هفته 4) متفاوت است؟
4. آیا ارتباطی بین بیان نسبی انواع میکروRNA تخصصی در بیماران مبتلا به کووید-19 با زمان نمونه گیری (دوره بیماری) وجود دارد؟

بررسی بیان نسبی انواع میکروRNA های تخصصی (مانند mirna-17 , mirna-126 , mirna-29 ,mirna-31) در سیر بیماری مبتلایان به کووید-19

• تعیین بیان نسبی انواع میکروRNA تخصصی در بیماران مبتلا به کووید-19 در ابتدای بیماری (در هفته صفر)
• تعیین بیان نسبی انواع میکروRNA تخصصی در بیماران مبتلا به کووید-19 در اواسط بیماری (در هفته 2 )
• تعیین بیان نسبی انواع میکروRNA تخصصی در بیماران مبتلا به کووید-19 در انتهای بیماری (در هفته 4)
• تعیین ارتباط بیان نسبی انواع میکروRNA تخصصی در بیماران مبتلا به کووید-19 با دوره بیماری

مراکز تحقیقاتی

شرکت های دارو سازی

میکروRNA:

 مولکول های کوچک RNA ای غیر کد کننده هستند که در گیاهان، جانوران و برخی از ویروس ها یافت می شود. آنها در یوکاریوت‌ها یا هوهسته‌ها دیده می‌شوند و حدود ۱۷–۲۳ نوکلئوتید طول دارند. وظیفه اصلی آن‌ها در تنظیم بیان ژن پس از رونویسی است؛ که با برهمکنش با mRNA و خاموش کردن آن تولید پروتئین ژن مورد نظر را سرکوب می‌کنند.

  نوع مطالعه مورد شاهدی است.

1. افراد بیمار دارای علایم بالینی و Realtime PCR+ و بستری
2. افراد بیمار دارای علایم بالینی و Realtime PCR+ و سرپایی
3. افراد بیمار دارای علایم بالینی و Realtime PCR- و سی تی + و بستری
4. افراد بیمار دارای علایم بالینی و Realtime PCR- و سی تی + و سرپایی
5. افراد بیمار دارای علایم بالینی و Realtime PCR- و سی تی - و سرپایی
6. افراد بدون علامت و Realtime PCR+

با در نظر گرفتن 20 نفر در هر 6 گروه و بررسی 10 عدد میکروRNA برای هر فرد و دوبار تکرار آزمایشات حجم نمونه 2400 خواهد شد.

روش نمونه گیری به صورت تصادفی خواهد بود

روش جمع آوری داده ها با استفاده از دستگاه realtime PCR و نرم افزار های تخصصی میکروRNA است.

جمع آوری نمونه:

در مرحله نخست جمع آوری نمونه صورت می گیرد که به چند گروه تقسیم می شوند:

1. افراد بیمار دارای علایم بالینی و Realtime PCR+ و بستری
2. افراد بیمار دارای علایم بالینی و Realtime PCR+ و سرپایی
3. افراد بیمار دارای علایم بالینی و Realtime PCR- و سی تی + و بستری
4. افراد بیمار دارای علایم بالینی و Realtime PCR- و سی تی + و سرپایی
5. افراد بیمار دارای علایم بالینی و Realtime PCR- و سی تی - و سرپایی
6. افراد بدون علامت و Realtime PCR+

 بطور جداگانه 5 میلی لیتر نمونه خون تام از هر فرد گرفته خواهد شد.

از بیماران طی 3 مرحله خونگیری انجام خواهد شد که شامل هفته صفر، هفته 2 و هفته 4 می باشد.

مسلما قبل از نمونه گیری فرم رضایت آگاهانه به افراد داده خواهد شد تا مطالعه کنند و در هنگام ورود به مطالعه رضایت داشته باشند.

انتقال به آزمایشگاه و استخراج RNA

بعد از تهیه نمونه فورا نمونه ها به آزمایشگاه منتقل و با استفاده از بافر استخراج ، RNA آنها جدا می گردد. سپس با استفاده از کیت مخصوص میکروRNA و پرایمر تخصصی و در حضور رنگ سایبرگرین سطح بیان 10 میکروRNA مختلف با روش دلتادلتا سی تی ارزیابی می گردد.

تعیین ارتباط

در این مطالعه ارتباط بین بیان نسبی انواع میکروRNA تخصصی در بیماران Realtime+ با زمان نمونه گیری نیز سنجیده می شود که اینکار با استفاده از ضریب همبستگی و رگرسیون خواهد بود.

تعیین میکروRNA مختلف در ارتباط با ویروس کووید-19

برای اینکه بفهمیم کدام میکروRNA در بیماری ویروسی نقش دارد یا نه می بایست از روش Microarray استفاده نمود.  این روش نیاز به تجهیزات گرانقیمت و کارشناس خبره دارد. با این روش دقیق حدودا قیمت بررسی 1000 میکروRNA مهم انسانی نزدیک به یک میلیارد تومان می شود. یک راه آلترناتیو برای کاهش هزینه ها کم کردن تعداد میکروRNA های محتمل است و این کار با استفاده از نرم افزار های بیوانفورماتیک می باشد. در این مطالعه از مجموعه نرم افزاری TargetScan ، miRanda، PicTar  برای پیدا کردن میکروRNA  مناسب استفاده می گردد (10). در این نرم افزار ها با دادن سکانس قسمت های مختلف ژنوم ویروس میکروRNA  هایی که در سطح ژنوم ویروس جایگاه اتصال دارند، انتخاب می شوند. در گام بعدی برای کم کردن تعداد میکروRNA انتخابی، در دیتابیس گوگل اسکولار نیز مجدد تک تک آنها سرچ می شود و نهایتا میکروRNA هایی انتخاب می شوند که در این دیتابیس نیز گزارشی مبنی بر حضور آنها در بیماری های ویروسی وجود داشته باشد. انتظار بر این است که میکروRNA های مختلف انتخاب شود (مانند mirna-17 , mirna-126 , mirna-29 ,mirna-31)

آزمایشات بصورت سه بار تکرار انجام و سپس میانگین گرفته می شود. برای پی بردن به اختلاف معنی دار بین گروه ها از آزمون ANOVA استفاده خواهد شد. در این مطالعه ارتباط بین بیان نسبی انواع میکروRNA تخصصی در بیماران Realtime+ با زمان نمونه گیری نیز سنجیده می شود که اینکار با استفاده از ضریب همبستگی و رگرسیون خواهد بود.

در این مطالعه از افراد بیمار و سالم رضایت نامه کتبی طبق رعایت کدهای اخلاقی گرفته خواهد شد.

دفترچه ژن/ فصل 1/کدهای 2 وهمچنین کدهای 5 تا 14

دفترچه عضو و بافت/ فصل 4/کدهای 1 تا 4 و همچنین کدهای راهنمای عمومی از این دفترچه  شامل کدهای 1 تا 12

دفترچه آزمودنی انسانی/ فصل 1/کدهای 1-31

محدودیت خاصی ندارد

میکروRNA ، بیان نسبی، سیر بیماری، کووید-19

1.            Rothan HA, Byrareddy SN. The epidemiology and pathogenesis of coronavirus disease (COVID-19) outbreak. Journal of autoimmunity. 2020:102433.

2.            Surveillances V. The epidemiological characteristics of an outbreak of 2019 novel coronavirus diseases (COVID-19)—China, 2020. China CDC Weekly. 2020;2(8):113-22.

3.            Prompetchara E, Ketloy C, Palaga T. Immune responses in COVID-19 and potential vaccines: Lessons learned from SARS and MERS epidemic. Asian Pac J Allergy Immunol. 2020;38(1):1-9.

4.            Cho WC. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. The international journal of biochemistry & cell biology. 2010;42(8):1273-81.

5.            O'Brien J, Hayder H, Zayed Y, Peng C. Overview of microRNA biogenesis, mechanisms of actions, and circulation. Frontiers in endocrinology. 2018;9:402.

6.            Girardi E, López P, Pfeffer S. On the importance of host microRNAs during viral infection. Frontiers in genetics. 2018;9:439.

7.            Nguyen TH, Liu X, Su ZZ, Hsu AC-Y, Foster PS, Yang M. Potential role of MicroRNAs in the regulation of antiviral responses to influenza infection. Frontiers in immunology. 2018;9:1541.

8.            Li Y, Chan EY, Li J, Ni C, Peng X, Rosenzweig E, et al. MicroRNA expression and virulence in pandemic influenza virus-infected mice. Journal of virology. 2010;84(6):3023-32.

9.            Zhang S, Li J, Li J, Yang Y, Kang X, Li Y, et al. Up-regulation of microRNA-203 in influenza A virus infection inhibits viral replication by targeting DR1. Scientific reports. 2018;8(1):1-15.

10.          Watanabe Y, Tomita M, Kanai A. Computational methods for microRNA target prediction. Methods in enzymology. 2007;427:65-86.

بررسی بیان نسبی انواع میکروRNA های تخصصی در سیر بیماری مبتلایان به کووید-19

دارد

کمک به اطلاعات مولکولی در مورد بیماری کووید-19

ندارد

در این تحقیق چون مداخله ی خاصی روی بیمار صورت نمیگیرد 

لذا عوارضی برای مریض ندارد

هیچگونه هزینه ای بابت شرکت در طرح از آزمودنی دریافت نمی گردد.

چون هدف بررسی سیر بیماری است روش جایگزین ندارد 

کلیه اطلاعات فردی و بالینی فردی که وارد مطالعه می گردد کاملا محرمانه برای مدت نامحدود خواهد بود.

مجری و همکاران این طرح بر خود لازم می دانند که به هرگونه سوال که توسط فرد شرکت کننده در این مطالعه مطرح می شود جواب دهدند.

دارد

در این مطالعه فرد با رضایت کامل وارد مطالعه می شود و هر موقعی خواست می تواند از مطالعه خارج شود

پیوست شده است