بررسی بیان نسبی انواع میکروRNA تخصصی انتخاب شده با روش بیوانفورماتیک در بیماران مبتلا به کووید-19

سندرم حاد تنفسی کروناویروس2 (SARS-CoV-2)، که به اسم کووید 19 شناخته می شود، یک بیماری عفونی جدید است که نخستین بار در اواخر دسامبر  سال 2019 در شهر Wuhan چین رویت شد و طی دو هفته طغیان­های مشابهی در بیمارستان های مختلف چین، کره جنوبی و کشورهای همسایه رخ داد . علائم بالینی عمده این بیماری شامل تب، سرف خشک، اسهال، درد عضلانی ، پنومونی و در موارد شدید مرگ است. در تاریخ 7 ژانویه 2020 محققین چینی با موفقیت ویروس را از یک بیمار جدا سازی کرده و توالی ژنوم آنرا مشخص کردند . پس از خروج بیماری از چین، تقریبا تمام کشورهای دنیا دچار این بیماری هولناک شدند و رسما سازمان جهانی بهداشت پاندمی شدن این بیماری را اعلام نمود (1, 2).

در تاریخ نگارش این پروپوزال علی رغم کاهش تعداد مبتلایان ولی همچنین احتمال می رود بسیاری از کشورها پس از عدم مشاهده مورد جدید طی چند روز، طغیان دومی را تجربه کنند و این امر چالش بزرگی برای تشخیص پیش روی خواهد آورد. طبق آمار سازمان بهداشت جهانی تا (سایت https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports)، تا این تاریخ، 3672238 نفر در سرتاسر دنیا به کووید 19 مبتلا شده که از بین این افراد 254045 جان باختند. از این بین، 101650 مبتلا در ایران تشخیص قطعی داده شده است که 6418 نفر فوت کردند. نرخ متوسط مرگ و میر کووید19 حدود 3.7 درصد عنوان شده است (3).

 با توجه به اینکه کووید 19 بیماری بسیار نوظهوری است، اطلاعات کاملی در مورد اتیولوژی، مکانیسم های سلولی و ریسک فاکتورهای احتمالی آن در دست نیست، ولی احتمال می رود کووید19 همانند دو سندرم حاد تنفسی ابتدای قرن بیست و یکم، Severe acute respiratory syndrome (SARS) و Middle East respiratory syndrome (MERS)، از الگوی مشابهی به جهت آلوده کردن میزبان و بیماری زایی خود استفاده کند (4).

میکروRNA ها مولکول های کوچک RNA ای غیر کد کننده هستند که در گیاهان، جانوران و برخی از ویروس ها یافت می شود. آنها در یوکاریوت‌ها دیده می‌شوند و حدود ۱۷–۲۳ نوکلئوتید طول دارند. وظیفه اصلی آن‌ها در تنظیم بیان ژن پس از رونویسی است؛ که با برهمکنش با mRNA و خاموش کردن آن تولید پروتئین ژن مورد نظر را سرکوب می‌کنند. آنها ۶۰ درصد ژنوم پستانداران را تشکیل می‌دهند و ژنوم انسان می‌تواند حدود ۱۰۰۰ نوع از آن‌ها را رمزدهی کند (5).

از نظر تئوری می توان گفت بعد از ورود ویروس کورونا به بدن انسان انواع سلول های ایمنی تحریک و فعال می شوند. این سلول ها با تولید انواع میکروRNA باعث هدایت پاسخ ایمنی مناسب می گردند و اینکار مسلما از طریق تنظیم بیان ژن های مختلف صورت می گیرد. البته این احتمال نیز وجود دارد که درصورتی که بدن نتواند پاسخ ایمنی مناسبی به ویروس نشان دهد پروفایل میکروRNA متفاوتی روئیت شود (6).  

طبق تحقیق های انجام شده، در انواع بیماری های ویروسی تعدادی میکروRNA تشخیص داده شده است که نسبت به کنترل افزایش بیان یا کاهش بیان داشته اند (7). میکروRNA ها به عنوان یک ابزار قدرتمند در تشخیص، پیش آگهی، درمان و پیشگیری بیماری های ویروسی قابل استفاده هستند.

در یک مطالعه نشان داده شده است که در بیماران مبتلا به آنفولانزا H1N1 سطح بیان mir-17 و mir-126 افزایش و سطح بیان mir-29 و mir-31 کاهش داشته اند. این میکروRNA ها در تشخیص زود هنگام این ویروس می تواند مفید باشد (8).

در مطالعه ای دیگر نشان داده شده است که همزمان با افزایش سطح پاسخ ایمنی بدن به ویروس آنفولانزا میزان سطح let-7 نیز به همان نسبت افزایش پیدا می کند. این میکروRNA در ارزیابی سطح سیستم ایمنی و پیش آگهی بیماری می تواند بسیار مفید باشد (9).

در این تحقیق ما دنبال جواب این سوال هستیم که در مبتلایان به کووید-19 چه میکروRNA هایی دچار تغییر بیان افزایشی یا کاهشی می شوند. تا بحال چنین مطالعه ای انجام نشده است و پروفایلی از بیان نسبی میکروRNA ها در این بیماری وجود ندارد. برای جواب به این سوال می بایست از روش Microarray استفاده نمود ولی این روش نیاز به تجهیزات گرانقیمت و هزینه بالا دارد. یک راه آلترناتیو برای کاهش هزینه ها کم کردن تعداد میکروRNA های محتمل است و این کار با استفاده از نرم افزار های بیوانفورماتیک می باشد (6).

1. آیا  بیان نسبی انواع میکروRNA تخصصی در بیماران CT+ و Realtime+ نسبت به کنترل متفاوت است؟
2. آیا بیان نسبی انواع میکروRNA تخصصی در بیماران CT- و Realtime+ نسبت به کنترل متفاوت است؟
3. آیا بیان نسبی انواع میکروRNA تخصصی در بیماران CT+ و Realtime- نسبت به کنترل متفاوت است؟
4. ایا ارتباطی بین بیان نسبی انواع میکروRNA تخصصی در بیماران Realtime+ با خصوصیات دموگرافیک آنها وجود دارد؟
5. آیا ارتباطی بین ارتباط بیان نسبی انواع میکروRNA تخصصی در بیماران Realtime+ با بیماری های زمینه ای آنها وجود دارد؟

بررسی بیان نسبی انواع میکروRNA تخصصی انتخاب شده با روش بیوانفورماتیک در بیماران مبتلا به کووید-19

1. تعیین بیان نسبی انواع میکروRNA تخصصی در بیماران CT+ و Realtime+ در مقایسه با کنترل

2. تعیین بیان نسبی انواع میکروRNA تخصصی در بیماران CT- و Realtime+ در مقایسه با کنترل
3. تعیین ارتباط بیان نسبی انواع میکروRNA تخصصی در بیماران Realtime+ با خصوصیات دموگرافیک آنها
4. تعیین ارتباط بیان نسبی انواع میکروRNA تخصصی در بیماران Realtime+ با بیماری های زمینه ای آنها

5.  

مراکز تحقیقاتی

شرکت های دارو سازی

میکروRNA:

 مولکول های کوچک RNA ای غیر کد کننده هستند که در گیاهان، جانوران و برخی از ویروس ها یافت می شود. آنها در یوکاریوت‌ها یا هوهسته‌ها دیده می‌شوند و حدود ۱۷–۲۳ نوکلئوتید طول دارند. وظیفه اصلی آن‌ها در تنظیم بیان ژن پس از رونویسی است؛ که با برهمکنش با mRNA و خاموش کردن آن تولید پروتئین ژن مورد نظر را سرکوب می‌کنند.

  نوع مطالعه مورد شاهدی است.

1. معیارهای ورود شامل موارد زیر می شود:

2. نمونه خون بیماران با علایم بالینی مربوط به ویروس کرونا،  CT+ و Realtime PCR+
3. نمونه خون بیماران با علایم بالینی مربوط به ویروس کرونا، CT- و Realtime PCR+
4. نمونه خون افراد سالم بدون علایم بالینی مربوط به ویروس کرونا

5. معیارهای خروج:

   افراد دارای سایر بیماری های عفونی

    

با در نظر گرفتن 30 نفر در هر گروه و بررسی 10 نوع میکروRNA در هر گروه و انجام 2 بار تکرار آزمایشات حجم نمونه معادل 2000 خواهد بود.

روش نمونه گیری به صورت تصادفی خواهد بود

روش جمع آوری داده ها با استفاده از دستگاه realtime PCR و نرم افزار های تخصصی طراحی میکروRNA است.

جمع آوری نمونه:

در مرحله نخست جمع آوری نمونه صورت می گیرد که به 3 گروه تقسیم می شوند:

1. نمونه خون بیماران با علایم بالینی مروبط به ویروس کرونا،  CT+ و Realtime PCR+
2. نمونه خون بیماران با علایم بالینی مروبط به ویروس کرونا، CT- و Realtime PCR+
3. افراد سالم بدون علایم بالینی مربوط به ویروس کرونا

قبل از نمونه گیری فرم رضایت آگاهانه به افراد داده خواهد شد تا مطالعه کنند و در هنگام ورود به مطالعه رضایت داشته باشند. بطور جداگانه 5 میلی لیتر نمونه خون تام از هر فرد گرفته خواهد شد.

انتقال به آزمایشگاه و استخراج RNA

بعد از تهیه نمونه فورا نمونه ها به آزمایشگاه منتقل و با استفاده از بافر استخراج ، RNA آنها جدا می گردد. سپس با استفاده از کیت مخصوص میکروRNA و پرایمر تخصصی و در حضور رنگ سایبرگرین سطح بیان 10 میکروRNA مختلف با روش دلتادلتا سی تی ارزیابی می گردد.

تعیین میکروRNA مختلف در ارتباط با ویروس کووید-19

در این مطالعه از مجموعه نرم افزاری TargetScan ، miRanda، PicTar  برای پیدا کردن میکروRNA  مناسب استفاده می گردد (10). در این نرم افزار ها با دادن سکانس قسمت های مختلف ژنوم ویروس میکروRNA  هایی که در سطح ژنوم ویروس جایگاه اتصال دارند، انتخاب می شوند. در گام بعدی برای کم کردن تعداد میکروRNA انتخابی، در دیتابیس گوگل اسکولار نیز مجدد تک تک آنها سرچ می شود و نهایتا میکروRNA هایی انتخاب می شوند که در این دیتابیس نیز گزارشی مبنی بر حضور آنها در بیماری های ویروسی و یا نقش تنظیم سلول های ایمنی وجود داشته باشد. انتظار بر این است که لیست ده تایی از میکروRNA های مختلف انتخاب شود.

تعیین ارتباط

در این مطالعه ارتباط بین بیان نسبی انواع میکروRNA تخصصی در بیماران Realtime+ با خصوصیات دموگرافیک آنها نیز انجام می شود. همچنین ارتباط بین بیان نسبی انواع میکروRNA تخصصی در بیماران Realtime+ با بیماری های زمینه ای آنها نیز سنجیده می شود که برای اینکار از ضریب همبستگی رگرسیون  استفاده خواهد شد.

آزمایشات بصورت 2 بار تکرار انجام و سپس میانگین گرفته می شود. برای پی بردن به اختلاف معنی دار بین گروه ها از آزمون ANOVA استفاده خواهد شد. همچنین برای پی بردن به میزان ارتباط از ضریب رگرسیون استفاده خواهد شد.

در این مطالعه از افراد بیمار و سالم رضایت نامه کتبی طبق رعایت کدهای اخلاقی گرفته خواهد شد.

دفترچه ژن/ فصل 1/کدهای 2 وهمچنین کدهای 5 تا 14

دفترچه عضو و بافت/ فصل 4/کدهای 1 تا 4 و همچنین کدهای راهنمای عمومی این دفترچه  شامل کدهای 1 تا 12

دفترچه آزمودنی انسانی/ فصل 1/کدهای 1-31

محدودیت خاصی ندارد

بیان نسبی، میکروRNA ، بیوانفورماتیک، کووید-19

1.            Rothan HA, Byrareddy SN. The epidemiology and pathogenesis of coronavirus disease (COVID-19) outbreak. Journal of autoimmunity. 2020:102433.

2.            Zu ZY, Jiang MD, Xu PP, Chen W, Ni QQ, Lu GM, et al. Coronavirus disease 2019 (COVID-19): a perspective from China. Radiology. 2020:200490.

3.            Surveillances V. The epidemiological characteristics of an outbreak of 2019 novel coronavirus diseases (COVID-19)—China, 2020. China CDC Weekly. 2020;2(8):113-22.

4.            Peeri NC, Shrestha N, Rahman MS, Zaki R, Tan Z, Bibi S, et al. The SARS, MERS and novel coronavirus (COVID-19) epidemics, the newest and biggest global health threats: what lessons have we learned? International journal of epidemiology. 2020.

5.            O'Brien J, Hayder H, Zayed Y, Peng C. Overview of microRNA biogenesis, mechanisms of actions, and circulation. Frontiers in endocrinology. 2018;9:402.

6.            Gottwein E, Cullen BR. Viral and cellular microRNAs as determinants of viral pathogenesis and immunity. Cell host & microbe. 2008;3(6):375-87.

7.            Girardi E, López P, Pfeffer S. On the importance of host microRNAs during viral infection. Frontiers in genetics. 2018;9:439.

8.            Nguyen TH, Liu X, Su ZZ, Hsu AC-Y, Foster PS, Yang M. Potential role of MicroRNAs in the regulation of antiviral responses to influenza infection. Frontiers in immunology. 2018;9:1541.

9.            Li Y, Chan EY, Li J, Ni C, Peng X, Rosenzweig E, et al. MicroRNA expression and virulence in pandemic influenza virus-infected mice. Journal of virology. 2010;84(6):3023-32.

10.          Watanabe Y, Tomita M, Kanai A. Computational methods for microRNA target prediction. Methods in enzymology. 2007;427:65-86.

بررسی بیان نسبی انواع میکروRNA تخصصی انتخاب شده با روش بیوانفورماتیک در بیماران مبتلا به کووید-19

دارد

کمک به اطلاعات مولکولی در مورد بیماری کووید-19

ندارد

در این تحقیق چون مداخله ی خاصی روی بیمار صورت نمیگیرد 

لذا عوارضی برای مریض ندارد

هیچگونه هزینه ای بابت شرکت در طرح از آزمودنی دریافت نمی گردد.

نمونه های جمع آوری شده در بیوبانک ها

کلیه اطلاعات فردی و بالینی فردی که وارد مطالعه می گردد کاملا محرمانه برای مدت نامحدود خواهد بود.

مجری و همکاران این طرح بر خود لازم می دانند که به هرگونه سوال که توسط فرد شرکت کننده در این مطالعه مطرح می شود جواب دهدند.

دارد

در این مطالعه فرد با رضایت کامل وارد مطالعه می شود و هر موقعی خواست می تواند از مطالعه خارج شود

ندارد