بررسی ویژگی های فیزیکوشیمیایی و قابلیت ریزپوشانی فراکسیون های پپتیدی زیست فعال حاصل از پروتئین تفاله نارگیل (Cocos nucifera L.) به روش خشک کردن پاششی و کاربرد آنها در فرمولاسیون نان قالبی فراسودمند

سالانه بخش عمده ای از محصولات کشاورزی در طول فرآوری به محصولات جانبی[1] و ضایعات تبدیل می­شوند. اغلب این ترکیبات دور ریخته شده یا به عنوان خوراک به مصرف دام می ­رسند. بسیاری از این محصولات جانبی، غنی از ترکیبات فنولی، آنتی­ اکسیدان و دیگر ترکیبات مغذی و سلامتی­ بخش هستند که می­توان این ترکیبات را استخراج و جایگزین آنتی ­اکسیدان­های سنتزی نمود. نتایج برخی تحقیقات انجام شده در زمینه شناسایی و اندازه­ گیری ترکیبات زیست فعال موجود در برخی از این محصولات جانبی مانند پوست[2] میوه ­ها و سبزیجات (انگور، سیب، گریپ فروت، پرتقال، لیمو، هلو، گلابی و موز)، پوسته ­های[3] غلات و حبوبات (بادام، برنج، پسته و گندم سیاه)، هسته و دانه میوه ­ها و سبزیجات (انگور، انبه، آووکادو، زردآلو، سیب و گوجه) توسط بالاسوندرام و همکاران (2006) مرور شده است.

اما بخش مهمی از محصولات جانبی غنی از ترکیبات آنتی ­اکسیدان و سلامتی بخش، در طول فرآوری و استخراج روغن، از دانه ­ها و میوه ­های روغنی تولید می­شوند. از این محصولات می­توان به تفاله ­ها و ضایعات حاصل از روغن­کشی میوه و دانه ­هایی مانند زیتون، کنجد، کانولا، سویا، پالم و بزرک اشاره کرد. با توجه به اینکه در صنایع روغن کشی به ویژه روغن کشی سرد با پرس، تفاله حاصل از روغن کشی علیرغم ترکیبات تغذیه ­ای بسیار و پروتئین غنی، به عنوان ضایعات به دور ریخته یا به مصرف دام می­رسد. لذا استخراج پروتئین و استفاده مجدد آن به عنوان یک منبع ترکیبات تغذیه ­ای، آنتی­ اکسیدان و زیست فعال از اهمیت بالایی برخوردار است.

یکی از منابع با ارزش تامین روغن و غنی از ترکیبات زیست فعال، نارگیل است. تایلند اصلی ­ترین کشور تولید کننده نارگیل با تولید سالانه بیش از 1 میلیون تن می­باشد. باتوجه به شباهت آب و هوایی مناطقی از استان سیستان و بلوچستان (نواحی جنوب استان) به هند، انواع محصولات گرمسیری مانند انبه، نارگیل، گوآوا، خربزه درختی و پاپایا در آن نواحی کشت می­شوند. اما اهمیت و ویژگی­های طعمی و تغذیه ­ای نارگیل موجب شده است تا بطور گسترده در صنایع غذایی کشورهای مختلف دنیا (مانند صنعت تولید روغن و یا انواع فرمولاسیون­های غذایی و محصولات قنادی) استفاده شود. بخش مهمی از میوه نارگیل، کپرا[4] است. 

بسته به شرایط و روش استخراج، کیک نارگیل حاصل از روغن کشی حدود 25-4% پروتئین دارد. کیک یا تفاله نارگیل اصلی­ ترین محصول جانبی حاصل از استخراج روغن آن است (کامبال و همکاران، 2013). این محصول غنی از پروتئین به ویژه گلوتلین بوده و ترکیب آمینواسیدی آن موجب ایجاد ویژگی­های متعدد عملکردی می­شود. این محصول بعنوان خوراک دام استفاده می­شود. اما تحقیقات متعددی بر استخراخ و تولید ترکیبات و محصولات با ارزش افزوده از این محصول جانبی متمرکز شده­ اند (پادسامران و همکاران، 2018). یکی از اصلی­ترین عوامل موثر در فساد مواد غذایی و کاهش زمان نگهداری آن­ها، اکسایش است. این فرآیند به ویژه در فرمولاسیون­های حاوی فازهای لیپیدی یا روغنی به طور قابل مشخصی رخ می­دهد. در صنایع مختلف، برای پیشگیری از اکسایش لیپیدها در محصولات غذایی و امولسیون­ها از آنتی­ اکسیدان­های سنتزی (BHA، BHT و پروپیل گالات­ها) استفاده می­شود. اما به علت خطرات بالقوه، استفاده از این آنتی­ اکسیدان­ها در برخی محصولات غذایی و برخی کشورها محدود یا ممنوع شده است. از این رو میل به استفاده از آنتی­ اکسیدان­های طبیعی افزایش یافته است (پیلانهو و همکاران، 2006). یکی از این منابع تولید آنتی­ اکسیدان­های طبیعی، پروتئین­ها هستند. بنابراین در سال‌های اخیر مطالعات پژوهشگران در جهت شناسایی پپتیدهای زیست فعال حاصل از منابع گیاهی و حیوانی سوق پیدا کرده است. این پپتید‌ها، بخش‌های پروتئینی خاصی هستند که به سه روش سنتز شیمیایی، تخمیر میکروبی و هیدرولیز آنزیمی تولید می‌شوند دارای 20-2 آمینو‌اسید و جرم مولکولی آنها کمتر از 6000 دالتون می‌باشد، بر حسب نوع و توالی آمینو‌اسیدی خود، تأثیر مثبتی بر عملکرد و شرایط بدن و در نتیجه سلامت فرد دارند، از جمله این تأثیرات می‌توان به اثرات ایمنی بخشی، آرام بخشی، ضد میکروبی، آنتی اکسیدانی، ضد فشار خون و ضد سرطان اشاره نمود (هارتمن و میسل، 2007).

در بین شاخص­های ضروری، علاوه بر کیفیت و ارزش تغذیه­ ای، ویژگی­های عملکردی پروتئین­ها برای استفاده در فرمولاسیون­های مختلف غذایی از اهمیت بسیاری برخوردار است. با توجه به اینکه اکثر پروتئین­های طبیعی فاقد ویژگی­های عملکردی مناسب در صنایع غذایی هستند، اصلاح ساختار آن­ها با هدف بهبود ویژگی­هایی مانند حلالیت حائز اهمیت است (مور و همکاران، 2006). در بین روشهای مختلف اصلاح پروتئین­ها، هیدرولیز آنزیمی فرآیندی کارامد در بهبود ویژگیهایی مانند حلالیت، امولسیون­ کنندگی و کف­ کنندگی و تولید پپتیدهای زیست فعال است. این مزایا موجب شده تا تحقیقات زیادی در خصوص استفاده از منابع گیاهی و حیوانی غنی از پروتئین و تولید پپتیدهای آنتی­ اکسیدان با هیدرولیز آنزیمی بادام زمینی (جامدار و همکاران، 2010)، ماهیان[1] (یو و همکاران، 2009)، ماهی اویستر (اومایاپراواتیا و همکاران، 2014)، هسته خرما (آمبیگاپلن و همکاران، 2015) و کازئین شیر (سرابندی و همکاران، 2018) انجام شود. همچنین با توجه به اینکه هیدرولیزشده­ های پروتئینی شامل طیفی از انواع پپتیدهای آنتی ­اکسیدان با وزن­های مولکولی متفاوت می­باشند، لذا جداسازی این ترکیبات و ارزیابی و مقایسه قدرت و کارایی آن­ها از اهمیت زیادی برخوردار است (سرمدی و اسماعیل، 2010).اما پپتیدهای آنتی ­اکسیدان نیز همانند سایر ترکیبات زیست فعال نظیرپلی­فنل­ها و کارتنوئیدها دارای معایبی می­باشند. ازجمله این معایب میتوان به ناپایداری شیمیایی (تحت تاثیر دما، نور، اکسیژن)، طعم تلخ و جاذب­الرطوبگی[1] بالای این ترکیبات اشاره کرد (موهان و همکاران، 2015). بنابراین اینکپسولاسیون پپتیدهای زیست فعال روشی موثر برای بهبود پایداری و کاهش معایب فوق است. روشهای متعددی برای افزایش حفاظت، پایداری، بهبود زیست دسترسی و همچنین غنی­سازی فرمولاسیون­های غذایی با این ترکیبات بررسی شده­ اند. در بین روش­های مختلف ریزپوشانی، خشک ­کردن پاششی فرآیندی رایج، اقتصادی و انعطاف­ پذیر است که بوسیله آن میتوان انواع محصولات مایع را به پودرهایی با قابلیت نگهداری طولانی ­مدت، پایداری فیزیکوشیمیایی و میکروبی بالا، و ویژگی­های عملکردی مناسب تبدیل کرد (جعفری و همکاران، 2007؛ سرابندی و همکاران، 2018).

در پژوهش دیگری، تولید پپتیدهای زیست فعال از پروتئین بزرک[1] با استفاده از آلکالاز[2]، پانکراتین[3]، تریپسین[4] و پپسین[5] انجام شد. ترکیب آمینواسیدی و ویژگی­های آنتی­اکسیدانی هیدرولیزشده­ها بررسی شدند. سپس، اثر فرآیند میکروانکپسولاسیون به روش پاششی[6] با استفاده از نسبت­های مختلف مالتودکسترین به هیدرولیزشده[7]  بر راندمان تولید، ویژگی­های فیزیکوشیمیایی، عملکردی، جاذب­الرطوبگی، حفظ فعالیت آنتی­اکسیدانی، ساختار شیمیایی (FTIR) و مورفولوژی ذرات خشک شده به روش پاششی ارزیابی شد. در بین هیدرولیزشده­ها، پپتیدهای تولید شده با آلکالاز از بالاترین درجه هیدرولیز (38.2%) برخوردار بودند. همچنین، شاخص­های آنتی­اکسیدانی تحت تاثیر نوع و غلظت هیدرولیزشده­ها قرار گرفتند. در بین نمونه­های خشک شده به روش پاششی[8]، پودرهای حاصل از نسبت w/w 3:1 (MD:Peptide) بالاترین درصد حفظ فعالیت مهار رادیکال­های DPPH (68.93%)، ABTS (85.62%)، هیدروکسیل (94.97%)، نیتریک اکسید (64.03%)، قدرت احیاءکنندگی (95.49%)، فعالیت آنتی­اکسیدانی کل (96.68%)، و شلاته­کنندگی یون­های آهن (95.31%) و مس (95.42%) را نشان دادند. تصاویر میکروسکوپ الکترونی (SEM) نشان­دهنده اثر نسبت­های مختلف حامل بر تولید ذراتی نامنظم[1]، چروکیده[2]، در اندازه­های مختلف و با ساختار ماتریکسی[3] بودند (اکبربگلو و همکاران، 2019).  

1- خصوصیات پروتئین استخراج شده و پپتیدهای زیست فعال ( وزن مولکولی و جزء به جزء پپتیدها ) از کپرای نارگیل روغن کشی شده با پرس سرد چگونه است؟

2- نوع آنزیم مورد استفاده در استخراج پروتئین و پپتیدهای زیست فعال از کپرای نارگیل روغن کشی شده با پرس سرد بر ویژگی­های عملکردی آنها ( حلالیت پروتئین - قدرت امولسیفیه کنندگی - ظرفیت کف کنندگی - حجم کف کنندگی )   موثر است

3- نوع آنزیم مورد استفاده در استخراج پروتئین و پپتیدهای زیست فعال از کپرای نارگیل روغن کشی شده با پرس سرد بر ویژگی­های آنتی اکسیدانی آنها ( فعالیت مهار رادیکال ABTS -  فعالیت قدرت احیا کنندگی - فعالیت مهار رادیکال هیدروکسیل - فعالیت شلاته کنندگی یون مس - فعالیت آنتی اکسیدانی در امولسیون - فعالیت آنتی اکسیدانی کل - مهار رادیکال نیترک اکسید )   موثر است

4- درجه هیدرولیز در استخراج پروتئین و پپتیدهای زیست فعال بر ویژگی­های عملکردی از کپرای نارگیل روغن کشی شده با پرس سرد بر ویژگی­های عملکردی آنها ( حلالیت پروتئین - قدرت امولسیفیه کنندگی - ظرفیت کف کنندگی - حجم کف کنندگی )  موثر است

5- درجه هیدرولیز در استخراج پروتئین و پپتیدهای زیست فعال   از کپرای نارگیل روغن کشی شده با پرس سرد بر ویژگی­های آنتی اکسیدانی آنها ( فعالیت مهار رادیکال ABTS -  فعالیت قدرت احیا کنندگی - فعالیت مهار رادیکال هیدروکسیل - فعالیت شلاته کنندگی یون مس - فعالیت آنتی اکسیدانی در امولسیون - فعالیت آنتی اکسیدانی کل - مهار رادیکال نیترک اکسید ) موثر است

6- فرآیند جزء به جزء کردن پپتیدها به فراکسیون­های با وزن مولکولی متفاوت از کپرای نارگیل روغن کشی شده با پرس سرد بر ویژگی­های آنتی اکسیدانی آنها ( فعالیت مهار رادیکال ABTS -  فعالیت قدرت احیا کنندگی - فعالیت مهار رادیکال هیدروکسیل - فعالیت شلاته کنندگی یون مس - فعالیت آنتی اکسیدانی در امولسیون - فعالیت آنتی اکسیدانی کل - مهار رادیکال نیترک اکسید ) موثر است

7- نوع حامل­های پکتین و آلژینات در ترکیب با مالتودکسترین بر ویژگی­های از کپرای نارگیل روغن کشی شده با پرس سرد بر ویژگی­های عملکردی آنها ( حلالیت پروتئین - قدرت امولسیفیه کنندگی - ظرفیت کف کنندگی - حجم کف کنندگی ) موثر است

8-نوع حامل­های پکتین و آلژینات در ترکیب با مالتودکسترین از کپرای نارگیل روغن کشی شده با پرس سرد بر ویژگی­های آنتی اکسیدانی آنها ( فعالیت مهار رادیکال ABTS -  فعالیت قدرت احیا کنندگی - فعالیت مهار رادیکال هیدروکسیل - فعالیت شلاته کنندگی یون مس - فعالیت آنتی اکسیدانی در امولسیون - فعالیت آنتی اکسیدانی کل - مهار رادیکال نیترک اکسید )موثر است

9- نوع فرآیند ریزپوشانی پپتیدها از کپرای نارگیل روغن کشی شده با پرس سرد بر ویژگی­های آنتی اکسیدانی آنها ( فعالیت مهار رادیکال ABTS -  فعالیت قدرت احیا کنندگی - فعالیت مهار رادیکال هیدروکسیل - فعالیت شلاته کنندگی یون مس - فعالیت آنتی اکسیدانی در امولسیون - فعالیت آنتی اکسیدانی کل - مهار رادیکال نیترک اکسید ) در فرمولاسیون نان قالبی غنی شده موثر است

10- نوع فرآیند ریزپوشانی پپتیدها بر نمره ارزیابی حسی آنها در فرمولاسیون نان قالبی غنی شده موثر است

1- تعیین خصوصیات پروتئین استخراج شده و پپتیدهای زیست فعال ( وزن مولکولی و جزء به جزء پپتیدها )از کپرای نارگیل روغن کشی شده با پرس سرد 

2- مقایسه نوع آنزیم مورد استفاده در استخراج پروتئین و پپتیدهای زیست فعال از کپرای نارگیل روغن کشی شده با پرس سرد بر ویژگی­های عملکردی آنها ( حلالیت پروتئین - قدرت امولسیفیه کنندگی - ظرفیت کف کنندگی - حجم کف کنندگی )  

3- مقایسه نوع آنزیم مورد استفاده در استخراج پروتئین و پپتیدهای زیست فعال از کپرای نارگیل روغن کشی شده با پرس سرد بر ویژگی­های آنتی اکسیدانی آنها ( فعالیت مهار رادیکال ABTS -  فعالیت قدرت احیا کنندگی - فعالیت مهار رادیکال هیدروکسیل - فعالیت شلاته کنندگی یون مس - فعالیت آنتی اکسیدانی در امولسیون - فعالیت آنتی اکسیدانی کل - مهار رادیکال نیترک اکسید )   

4- مقایسهدرجه هیدرولیز در استخراج پروتئین و پپتیدهای زیست فعال بر ویژگی­های عملکردی از کپرای نارگیل روغن کشی شده با پرس سرد بر ویژگی­های عملکردی آنها ( حلالیت پروتئین - قدرت امولسیفیه کنندگی - ظرفیت کف کنندگی - حجم کف کنندگی )  

5- مقایسه درجه هیدرولیز در استخراج پروتئین و پپتیدهای زیست فعال   از کپرای نارگیل روغن کشی شده با پرس سرد بر ویژگی­های آنتی اکسیدانی آنها ( فعالیت مهار رادیکال ABTS -  فعالیت قدرت احیا کنندگی - فعالیت مهار رادیکال هیدروکسیل - فعالیت شلاته کنندگی یون مس - فعالیت آنتی اکسیدانی در امولسیون - فعالیت آنتی اکسیدانی کل - مهار رادیکال نیترک اکسید ) 

6- مقایسه فرآیند جزء به جزء کردن پپتیدها به فراکسیون­های با وزن مولکولی متفاوت از کپرای نارگیل روغن کشی شده با پرس سرد بر ویژگی­های آنتی اکسیدانی آنها ( فعالیت مهار رادیکال ABTS -  فعالیت قدرت احیا کنندگی - فعالیت مهار رادیکال هیدروکسیل - فعالیت شلاته کنندگی یون مس - فعالیت آنتی اکسیدانی در امولسیون - فعالیت آنتی اکسیدانی کل - مهار رادیکال نیترک اکسید ) 

7- مقایسه نوع حامل­های پکتین و آلژینات در ترکیب با مالتودکسترین بر ویژگی­های از کپرای نارگیل روغن کشی شده با پرس سرد بر ویژگی­های عملکردی آنها ( حلالیت پروتئین - قدرت امولسیفیه کنندگی - ظرفیت کف کنندگی - حجم کف کنندگی ) 

8-مقایسه نوع حامل­های پکتین و آلژینات در ترکیب با مالتودکسترین از کپرای نارگیل روغن کشی شده با پرس سرد بر ویژگی­های آنتی اکسیدانی آنها ( فعالیت مهار رادیکال ABTS -  فعالیت قدرت احیا کنندگی - فعالیت مهار رادیکال هیدروکسیل - فعالیت شلاته کنندگی یون مس - فعالیت آنتی اکسیدانی در امولسیون - فعالیت آنتی اکسیدانی کل - مهار رادیکال نیترک اکسید )

9- مقایسه نوع فرآیند ریزپوشانی پپتیدها از کپرای نارگیل روغن کشی شده با پرس سرد بر ویژگی­های آنتی اکسیدانی آنها ( فعالیت مهار رادیکال ABTS -  فعالیت قدرت احیا کنندگی - فعالیت مهار رادیکال هیدروکسیل - فعالیت شلاته کنندگی یون مس - فعالیت آنتی اکسیدانی در امولسیون - فعالیت آنتی اکسیدانی کل - مهار رادیکال نیترک اکسید ) در فرمولاسیون نان قالبی غنی شده 

10- مقایسه نوعفرآیند ریزپوشانی پپتیدها بر نمره ارزیابی حسی آنها در فرمولاسیون نان قالبی غنی شده 

وزارت بهداشت و درمان ، صنایع غذایی، صنایع تبدیلی ، دانشگاهها

پپتید زیست فعال: پپتیدهای بدست آمده از پروتئین که خصوصیات آنتی اکسیدانی و سلامتی پخش هستند

توصیفی تحلیلی

جامعه مورد مطالعه تفاله حاصل از روغن کشی تفاله نارگیل از مراکز روغن کشی موجود در سطح شهرستان تبریز تهیه خواهد بود

با توجه به این نوع مطالعه با در نظر گرفتن حداقل سه تکرار برای هر نوع آزمون نیاز به 10 کیلوگرم تفاله پودر  تفاله نارگیل  است

نمونه پودر ( تفاله ) روغن گیری شده نارگیل از مراکز روغن گیری نارگیل در سطح شهر تبریز که به روش پرس سرد اقدام به روغن گیری می کنند بدست آمده و مشخصات آن ثبت می گردد.

چک لیست و ثبت نتایج آزمایشگاهی 

پس از تایید طرح که بصورت مشترک بین دانشگاه علوم پزشکی زاهدان و دانشگاه تبربز انجام خواهد شد مراحل و آزمون های مورد نیاز به شرح زیر خواهد بود.

مواد اولیه

تفاله حاصل از روغن کشی کپرا از مراکز روغن کشی موجود در سطح شهرستان تبریز تهیه خواهند شد، آنزیم­های آلکالاز و پانکراتین، پپسین و تریپسین، تری­کلرواستیک اسید (TCA)، کوماسی بلو (G250)، DPPH، ABTS، پتاسیم پرسولفات، ترولوکس، پتاسیم فری­سیانید، فریک کلراید، آلفا-داکسی ریبوز، سولفات آهن، EDTA، پراکسید هیدروژن، دی­کلرید آهن، فروزین، سولفات مس، پیریدین، پیروکاتکول ویولت، تویین 20، اسکوربیک اسید، تیوباربیتوریک اسید (TBA)، سدیم دودسیل سولفات (SDS) از سیگما، اتانول، سود، اسیدکلریدریک، پتاسیم کلراید، پتاسیم دی هیدروژن فسفات، اسید فسفریک (مرک، آلمان).

استخراج پروتئین

به منظور چربی زدایی، تفاله خشک  حاصل به نسبت 1:4 (وزنی/ حجمی) با هگزان مخلوط می‌شود و به مدت 3 ساعت در دمای اتاق همزده می‌شود. سپس با استفاده از قیف بوخنر هگزان جدا شده و آرد حاصل در دمای اتاق خشک می­گردد و از الک با مش 40 عبور داده می‌شود. عملیات استخراج پروتئین از پودر چربی زدایی شده به اینصورت خواهد بود که پودر چربی گیری شده به نسبت 1:10 با محلول  NaCl0.33مولار، 9.25pH= مخلوط شده و به مدت 2 ساعت همزده می‌شود، سپس محلول حاصل در ×g4500 به مدت 30 دقیقه سانتریفوژ خواهد شد. در مرحله بعد pH سوپرناتانت در 4.5pH = (pH ایزوالکتریک پروتئین) تنظیم خواهد شد. سپس در جهت رسوب پروتئین‌ها، محلول حاصل درg×4500 به مدت 20 دقیقه سانتریفوژ می‌شود. در ادامه رسوب پروتئین با آب مقطر دو بار شسته شده و درg ×4500، به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ می‌شود و با تنظیم7.2pH = با افزودن NaOH 1 مولار، دوباره به حالت محلول تبدیل خواهد شد. سپس کنسانتره پروتئین حاصل با فریز درایر خشک شده و در دمایC°4 نگهداری می‌شود. تمامی فرآیندها در دمای اتاق انجام می‌شود (فیضی و همکاران، 2015).

تهیه پروتئین هیدرولیز شده

برای فرآیند هیدرولیز آنزیمی، پروتئین استخراج شده از پودر نارگیل را در غلظت  (W/V)5% در بافر فسفات M0.2 مولار (7.4pH=) حل نموده و امکان هیدراته شدن کامل آن در حین هم­زدن مداوم به مدت min30 در دمای محیط محیاء خواهد شد. سپس محلول اولیه آنزیم پانکراتین و تریپسین در بافر فوق و در نسبت آنزیم به پروتئین سوبسترا  (W/W) 2% به محلول حاوی پروتئین افزوده می­شود. دمای واکنش Cº 40 و زمان واکنش در شرایط هم­زدن مداوم با دور rpm 200 ، 150 دقیقه در نظر گرفته خواهد شد. پس از اتمام فرآیند هیدرولیز، برای غیرفعال کردن واکنش و فعالیت آنزیم، محیط واکنش در حمام آب Cº 90 به مدت  min15 قرار داده می­شود. پس از آن، محلول تا دمای محیط خنک می­شود. محلول در دور rpm 5000 به مدت  min10 سانتریفیوژ خواهد شد. سوپرناتانت جدا، لیوفیلیزه و تا زمان استفاده در دمای Cº 20- نگهداری می­شود. تمام مراحل فوق برای هدرولیز آنزیمی با آلکالاز در بافر با 8pH= و دمایCº 50  و برای پپسین در2 pH= انجام خواهد شد (چن و همکاران، 2011).

حلالیت

برای تعیین حلالیت پروتئین‌های هیدرولیز شده از روش جامدار و همکاران (2010) با مقداری اصلاحات استفاده خواهد شد. بدین ترتیب که، 200 میلی‌گرم پروتئین هیدرولیز شده در 20 میلی‌لیتر آب مقطر پراکنده و pH مخلوط با استفاده از سود یا اسیدکلریدریک 1 نرمال روی 1 تا 12 تنظیم می­شود. محلول در g 10000 برای 10 دقیقه سانتریفوژ می­شود. سپس مقدار پروتئین موجود در محلول رویی با استفاده از روش بردفورد (1976) تعیین و درصد حلالیت بر اساس مقدار پروتئین محلول بر پروتئین کل نمونه تعیین خواهد شد.

ویژگی‌های امولسیفیه‌کنندگی

ویژگی‌های امولسیفیه کنندگی پروتئین‌های هیدرولیز شده بر‌طبق روش کلامپانگ و همکاران (2007) با اندکی اصلاحات تعیین خواهد گردید. ابتدا 5 میلی‌لیتر روغن هسته انگور و 15 میلی‌لیتر محلول 1% پروتئین با هم مخلوط و  pHبا استفاده از سود یا اسید کلریدریک 1 نرمال به 3، 5، 6، 7 و 9 تنظیم می­شود. مخلوط با استفاده از هموژنایزر در سرعت rpm20000 به‌مدت 1 دقیقه هموژن می­شود. سپس، 50 میکرولیتر نمونه امولسیون در زمان 0 و 10 دقیقه پس از هموژنیزاسیون از انتهای ظرف برداشته و با 5 میلی‌لیتر محلول 0.1 درصد سدیم دودسیل سولفات (SDS) مخلوط می­شود. جذب محلول رقیق شده در 500 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر خوانده می­شود. مقدار جذب در زمان اولیه (A₀) و 10 دقیقه پس از تشکیل امولسیون (A₁₀) برای محاسبه فعالیت امولسیون کنندگی (EAI) و شاخص پایداری امولسیون (ESI) با استفاده از معادلات زیر محاسبه می‌شوند:

EAI (m²/g) = (2 × 2.303 × A₀)/ 0.25 × protein weight (g)                            (معادله 1)

ESI (%) = (A₀ - A₁₀/A₀) × 100                                                                          (معادله 2)

ویژگی‌های کف‌کنندگی

ظرفیت و پایداری کف‌کنندگی پروتئین هیدرولیز شده بر‌طبق روش کلامپانگ و همکاران (2007) با اندکی اصلاحات تعیین می­شود. حجم 15 میلی‌لیتر محلول 0.5 درصد نمونه با استفاده از سود یا اسیدکلریدریک 1 نرمال،  pHآن به 3، 5، 6، 7 و 9 تنظیم و هموژنیزاسیون در سرعت rpm16000 به‌مدت 2 دقیقه با هدف ورود هوا به درون محلول در دمای محیط انجام می­شود. نمونه زده شده به سرعت به استوانه مدرج 25 میلی‌لیتر منتقل و حجم کل پس از 1 دقیقه خوانده می­شود. ظرفیت کف کنندگی (FC) بر طبق معادله زیر محاسبه خواهد شد:

FC (%) = (A /B) × 100                                                                                       (معادله 3)

در اینجا، A حجم کف پس از زدن (میلی‌لیتر) و B حجم اولیه قبل از زدن (میلی‌لیتر) می‌باشد.

نمونه‌های زده شده در دمای Cº 25 برای 10 دقیقه نگهداری، سپس حجم کف خوانده می­شود. پایداری کف (FS) با معادله زیر محاسبه می­شود:

FS (%) = (A /B) × 100                                                                                       (معادله 4)

در اینجا، A حجم کف پس از نگهداری (میلی‌لیتر) و B حجم اولیه قبل از زدن (میلی‌لیتر) می‌باشد.

تعیین درجه هیدرولیز

سوسپانسیون پروتئین هیدرولیز شده و تری کلرواستیک اسید (M 0.44) در نسبت حجمی 1:1 مخلوط و به مدت 15 دقیقه در دمای Cº 4 انکوبه می­شود. سپس، مخلوط در rpm 10000 و به مدت  min10 سانتریفوژ می­شود. مقدار پروتئین موجود در سوپرناتانت حاوی تری کلرواستیک اسید M 0.22 با روش بردفورد (بردفورد، 1976) تعیین می­گردد.

جزء به جزء کردن پپتیدها

هر یک از سوپرناتانت­های حاوی هیدرولیزشد ه ­ها با آنزیم­های مختلف بصورت مجزا در چند مرحله از سیستم غشایی اولترافیلتراسیون با قابلیت­های جداسازی متفاوت (molecular weight cutoff = 100, 30, 10 kDa, Millipore, UK) بر حسب وزن مولکولی بمدت 20 دقیقه و در g  × 2500 عبور داده خواهند شد. بدین شکل که ابتدا سوپرناتانت از فیلتر 100 عبور سپس بخش عبور کرده از فیلتر از فیلتر30 و 10 عبور داده می­شوند و در هر مرحله پپتیدها و هیدرولیزشده­های مانده در فیلترها جداسازی و به روش انجمادی خشک خواهند شد. سپس برای انجام دیگر آزمون­ها در فریزر نگهداری خواهند شد (لیناریس و همکاران، 2015).

آنالیز اسید آمینه کل و آزاد

ترکیب آمینواسیدی هیدرولیزشده ­ها با استفاده از روش آلاشی و همکاران (2019) و با دستگاه HPLC مجهز به ستون با فاز معکوس (Novapack C18, 4μm, Waters, Milford, MA) تعیین می گردد. در ابتدا هر یک از هیدرولیزشده­ ها بمدت 24 ساعت در اسید کلریدریک 6 نرمال در دمای С˚ 110 هضم می­شوند. تعیین اسیدهای آمینه آزاد نیز پس از انحلال هر یک از هیدرولیزشده ­ها در آب دوبار تقطیر انجام می­شود.

فعالیت مهار رادیکال DPPH

درصد مهار رادیکال آزاد DPPH با استفاده از روش وو و همکاران (2003) با کمی اصلاحات تعیین می­شود. ابتدا پودرهای پروتئین هیدرولیز شده در آب مقطر (mg/ml40) حل می­شوند. سپس، ml 1.5 از هر نمونه با ml 1.5 از محلول اتانولی DPPH (mM 0.15) مخلوط و بمدت 20 ثانیه ورتکس می­شود. سپس، مخلوط حاصل در rpm 2500 به مدت  min10 سانتریفوژ و بمدت  min20 در تاریکی نگهداری می­شود. جذب محلول سوپرناتانت در طول موج nm 517 خوانده می­شود.

فعالیت مهار رادیکال ABTS

فعالیت مهار رادیکال ABTS پودرهای پروتئین هیدرولیز شده با استفاده از روش تشریح شده توسط یو و همکاران (2010) با کمی اصلاحات تعیین می­شود. محلول رادیکال ⁺ABTS با ترکیب نسبت حجمی یکسانی از ABTS در غلظت mM 7 و mM 2.45 پتاسیم پرسولفات تهیه می­گردد. مخلوط در تاریکی و در دمای محیط به مدت h 16-12 قبل از مصرف قرار داده می­شود. در این مدت، اکسیداسیون و تولید رادیکال ⁺ABTS به وسیله پتاسیم پرسولفات انجام می­گیرد. قبل از آزمون، محلول ⁺ABTS با استفاده از (M, pH 7.4 0.2) [1]PBS تا جذب 0.02 ± 0.7 در nm 734 رقیق می­شود. سپس µl 40 از هر نمونه (حاوی  mg protein/mL4) به ml 4 محلول رقیق شده ⁺ABTS افزوده شد. مخلوط برای 30 ثانیه به شدت ورتکس و به مدت  min6 در تاریکی قرار داده می­شود. جذب محلول نهایی در nm 734 اندازه­گیری می­شود. منحنی استاندارد با واکنش µl 40 ترولوکس[2] (μM 1000، 750، 500، 250، 100، 50) با ml 4 محلول رقیق شده ⁺ABTS تهیه می­شود. درصد مهار رادیکال ⁺ABTS نمونه­ ها بر اساس معادله زیر محاسبه خواهد شد. همچنین، فعالیت مهار رادیکال ⁺ABTS بر اساس منحنی استاندارد ترولوکس به شکل ظرفیت آنتی ­اکسیدانی معادل ترولوکس[3] (TEAC, mM) بیان می­شود.

فعالیت قدرت احیاءکنندگی

برای تعیین قدرت احیاءکنندگی نمونه ­های هیدرولیز شده، ml 0.5 نمونه حل شده در آب مقطر (در غلظت mg/ml40) با ml 0.5 بافرفسفات M0.2  (pH 6.6) و ml 0.5پتاسیم فری­ سیانید (W/V) 1% مخلوط می­شود. مخلوط در دمای Cº 50 برای min 20 دقیقه انکوبه می­شود. سپس، ml 0.5 محلول تری ­کلرو استیک اسید 10% به مخلوط اضافه و به ­مدت min 10 در rpm 2500 سانتریفوژ می­شود. در نهایت، ml 1 سوپرناتانت با ml 1 آب مقطر و ml 0.2 فریک کلراید  (W/V)1/0% مخلوط می­شود. جذب نمونه در nm 700 پس از min 10 نگهداری مخلوط در دمای محیط، خوانده می­شود. حجم یکسانی آب مقطر به جای نمونه برای تهیه نمونه کنترل استفاده می­شود. افزایش جذب مخلوط واکنش نشان دهنده افزایش قدرت احیاءکنندگی است (احمدی و همکاران، 2007).

فعالیت مهار رادیکال هیدروکسیل

فعالیت مهار رادیکال هیدروکسیل با استفاده از اکسیداسیون 2-داکسی ریبوز[4] بر طبق روش کیم و مینامیکاوا (1997) و با اندکی اصلاحات تعیین می­شود. برای این آزمون، ml 0.2 از مخلوط mM 10 (FeSO₄-EDTA)، ml 0.5 (mM 10) آلفاداکسی ریبوز، ml 0.2 نمونه هیدرولیز شده، ml 0.9 سدیم فسفات بافرM 0.2 (pH 7.4) و ml 0.2 پراکسید هیدروژن (mM 10) با هم مخلوط می­شوند. مخلوط در Cº 37 برای h 1 انکوبه می­شود. سپس، ml 1 تری کلرواستیک اسید (TCA) 2.8% برای توقف واکنش به مخلوط افزوده می­شود. مخلوط برای min 15 در حمام آب جوش قرار، در یخ سرد شده، سپس جذب آن در nm 532 با اسپکتروفتومتر اندازه­گیری می­شود. حجم یکسانی آب مقطر به جای نمونه برای تهیه شاهد استفاده می­گردد. فعالیت مهارکنندگی رادیکال هیدروکسیل به شکل سرعت مهار اکسیداسیون آلفاداکسی ریبوز به ­وسیله رادیکال­های هیدروکسیل ارزیابی می­شود.

فعالیت شلاته ­کنندگی یون آهن

فعالیت شلاته­ کنندگی یون آهن بر طبق روش دکر و ولچ (1990) اندازه ­گیری می­شود. ابتدا، ml 1 نمونه حل شده در آب مقطر (در غلظت mg/ml40) با ml 0.05 محلول دی کلرید آهن (mM 2) و ml 1.85آب دوبار تقطیر مخلوط می­شود. سپس، ml 0.1 محلول فروزین[5] (mM 5) افزوده و مخلوط به شدت هم­زده می­شود. جذب پس از min 10 نگهداری مخلوط در دمای محیط در nm 562 خوانده می­شود. آب دوبار تقطیر به عنوان نمونه شاهد مورد استفاده قرار می­گیرد.

فعالیت شلاته کنندگی یون مس

فعالیت شلاته ­کنندگی یون مس پروتئین­های هیدرولیز شده با استفاده از روش کانگ و ژیانگ (2006) اندازه­گیری می­شود. در ابتدا، ml 1 محلول mM 0.2 سولفات مس[6] با ml 1 هیدرولیز شده در فالکون ml 15 مخلوط و برای min 5 در دمای اتاق انکوبه می­شود. سپس، ml 1 محلول تری کلرواستیک اسید 11.3% افزوده و نمونه­ها در rpm 2500 برای min 10 سانتریفوژ می­شوند. پس از آن، ml 2 از سوپرناتانت به ml 1 محلول 10% پیریدین[7] و µl 20 پیروکاتکول ویولت[8] افزوده و مخلوط ورتکس و برای min 5 در دمای اتاق انکوبه می­شود. جذب نمونه ­ها در nm 632 خوانده و فعالیت شلاته­ کنندگی یون مس تعیین می­گردد.

فعالیت آنتی­ اکسیدانی در امولسیون

امولسیون روغن در آب با هموژن کردن g 1 روغن هسته انگور و µl 100 تویین 20 با ml 100 آب مقطر با استفاده از هموژنایزر با سرعت rpm 22000 برای min 2 در حمام یخ تهیه می­شود. نمونه­ها برای ارزیابی اکسیداسیون لیپیدی با مخلوط نمودن ml 8 امولسیون روغن، ml 0.5 محلول 0.2% اسکوربیک اسید، ml 0.5 محلول ppm 200 سولفات آهن (FeSO₄) و ml 1 محلول پروتئین هیدرولیز شده (در غلظت mg/ml40) تهیه می­شوند. سپس، نمونه­ها در Cº 37 برای h 16 انکوبه می­شوند. پس از انکوباسیون، ml 1 از هر نمونه به ml 2 محلول تیوباربیتوریک اسید[9]/ تری کلرواستیک اسید (mM TBA 20/TCA  15%) و µl 50 محلول BHA 10% در اتانول 90% افزوده و سپس ورتکس می­شود. مخلوط حاصل برای توسعه رنگ در حمام آب Cº 90 برای min 15 انکوبه می­شود. نمونه ­ها در حمام آب یخ برای min 10 خنک و در rpm 3000 برای min 15 و در دمای Cº 5 سانتریفوژ می­شوند. جذب محلول در طول موج nm 532 اندازه­ گیری می­شود. برای تهیه نمونه شاهد از مخلوط ml 1 آب مقطر با ml 2  محلول TBA/TCA استفاده می­شود. مقدار TBARS (ترکیبات حاصل از واکنش تیوباربیتوریک اسید) به شکل mg مالون آلدهید (MDA) بر لیتر امولسیون بیان می­شود (آبیران و همکاران، 2016).

فعالیت آنتی ­اکسیدانی کل (TAA)

این روش بر مبنای احیاء (VI) Mo به مولیبدن (V) Mo می­باشد که با تشکیل کمپلکس سبز رنگ فسفومولیبدن[10] در محیط اسیدی همراه است. در این روش ml 0.1 از نمونه حل شده در آب مقطر (2.5-20 mg/mL) به ml1 از معرف[11] (اسیدسولفوریک 0.6 مولار، فسفات سدیم[12] 28 میلی مولار و آمونیوم مولیبدات 4 میلی مولار) افزوده شده و به­مدت 90 دقیقه در حمام آب 90 درجه سانتی گراد انکوبه می­شود. پس از سرد شدن، جذب نمونه­­ ها در 695 نانومتر خوانده می­شود. از آب مقطر دوبار تقطیر به عنوان نمونه شاهد استفاده خواهد شد. جذب بیشتر نشان دهنده­ی ظرفیت آنتی اکسیدانی کل بیشتر است (اومایاپراواتیا و همکاران، 2014).

مهار رادیکال نیتریک اکسید (NO)

مهار رادیکال نیتریک اکسید بر اساس روش تشریح شده توسط تسایی و همکاران (2007) تعیین خواهد شد. برای این فرآیند در ابتدا 200 میکرولیتر نمونه در غلظت­های مختلف با 200 میکرولیتر سدیم نیتروپروساید 10 میلی مولار تهیه شده در بافر فسفات نمکی مخلوط شده و بمدت 150 دقیقه در زیر نور و در دمای محیط نگهداری خواهند شد. سپس حجم یکسانی از معرف گریس (ترکیب 1% سولفانیل آمید و 0.1 نفتیل اتیلن دی کلرید دی­آمین حل شده در محلول 2.5 درصد اسید فسفریک) به مخلوط اضافه خواهد شد. سپس جذب در طول موج 546 نانومتر خوانده و مشابه فرمول 1، درصد مهار رادیکال نیتریک اکسید محاسبه خواهد شد.

ریزپوشانی به روش خشک کردن پاششی

فرآیند انحلال پپتیدها و هر یک از حامل­های پکتین، آلژینات و مالتودکسترین درآب مقطر انجام خواهد شد. نسبت ماده دیواره به هسته 3:1 و جایگزینی مالتودکسترین با پکتین و آلژینات در نسبت 2:1:1 انجام خواهد گرفت. سپس فرآیند از یک خشک ‌کن پاششی در مقیاس آزمایشگاهی استفاده می­شود. محفظه خشک ‌کن به صورت استوانه‌ای با قسمت تحتانی مخروطی شکل با قطر قسمت استوانه‌ای 28 سانتی­متر و ارتفاع کل محفظه 80 سانتی­متر است. دستگاه مجهز به یک پمپ تغذیه حجمی پریستالتیک با دبی تغذیه متغیر با فشار 1 بار برای ارسال خوراک به نازل است. فرآیند پاشش توسط اتمایزر فشاری با قطر  cm2 و قابلیت عمل توسط کمپرسور هوا انجام می­شود. متغیرهای فرآیند بر طبق روش تشریح شده توسط اکبربگلو و همکاران (2019) تنظیم خواهند شد. بدین شکل که، از هوای ورودی با دمای (C˚130) و بصورت هم جهت با خوراک‎های از قبل تهیه شده برای خشک کردن استفاده می­شود. برای همه تیمارها، دبی خوراک ورودی 3 میلی­لیتر در دقیقه و دمای هوای خروجی در فرآیند C˚ 75 ثابت نگه­داشته می­شوند. پودرهای جمع شده در محفظه شیشه­ای تا رسیدن به دمای ثابت و ممانعت از تغییرات رطوبت در دسیکاتور نگهداری می­شوند. سپس محصولات ریزپوشانی شده در شیشه‌های تیره و دور از نور تا زمان انجام آزمایشات نگهداری خواهند گردید.

ویژگی­های فیزیکوشیمیایی پودرهای خشک شده به روش پاششی

بازده تولید با محاسبه نسبت جرمی پودر تولید شده به ماده جامد کل در خوراک تعیین می­شوند. سایر ویژگی­های فیزیکی پودرها مانند مقدار رطوبت، فعالیت آبی، دانسیته توده، زاویه ریپوز، حلالیت و جاذب­الرطوبه­بودن با استفاده از روشهای تشریح شده توسط سرابندی و همکاران (2018) محاسبه می­شوند.

حفظ فعالیت آنتی­اکسیدانی

درصد حفظ فعالیت آنتی­اکسیدانی (AA) در هیدرولیزشده­های خشک شده به روش پاششی با تعیین فعالیت آنتی­ اکسیدانی هیدرولیزشده­ ها قبل و بعد از فرآیند ریزپوشانی محاسبه خواهند شد.

طیف سنجی فروسرخ (FTIR)

طیف سنجی فروسرخ در دستگاه FTIR مدل Shimadzu 8400، انجام می گیرد. روش آماده ­سازی نمونه برای اندازه­ گیری طیف IR، به ­این صورت است که در دستگاه FTIR، پپتیدهای خالص خشک شده به روش انجمادی و ذرات خشک شده به روش پاششی هر کدام جداگانه با نسبت 100:1 با برومید پتاسیم (KBr) مخلوط شده و از این مخلوط در طیف­سنجی استفاده می­شوند (سرابندی و همکاران، 2018).

مورفولوژی ذرات

ساختار ذرات پودر با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی (مدل هیتاچی PS-230، ژاپن) مورد ارزیابی قرار خواهند گرفت. نمونه‌ها به طور مجزا با استفاده از نوار چسب‌های دوسویه بر صفحه‌های آلومینیومی قرار می­گیرند. سپس عمل روکش‌دهی ذرات با استفاده از لایه نازکی از طلا انجام می­شود. در نهایت هر نمونه پوشش‌دهی شده به میکروسکوپ منتقل و مشاهده ساختار سطحی ذرات انجام می­شود.

غنی سازی فرمولاسیون نان قالبی

فرمول پایه خمیر نان شامل 100 گرم آرد گندم، 1 درصد شکر، 1 درصد بهبود دهنده، 2 درصد مخمر، 0.7 درصد نمک، 60 میلی لیتر آب، افزودن پپتید خالص، پپتیدها ریزپوشانی شده با مالتودکسترین و ترکیب مالتودکسترین پکتین به ترتیب به نسبت 2%، 4% و 4% درصد وزنی آرد انجام خواهد شد. به­ منظور تهیه خمیر ابتدا کلیه مواد خشک در مخزن همزن خانگی با یکدیگر مخلوط می­شود سپس مایعات اضافه شده و به مدت 10 دقیقه عمل همزدن ادامه خواهد یافت. سپس تخمیر اولیه در C˚ 30 و به مدت 30 دقیقه انجام می­شود. در ادامه خمیر به قطعات 100 گرمی تقسیم و درون قالب­های مخصوص قرار داده می­شود و قالب­ها به­مدت 90 دقیقه در انکوباتور با رطوبت نسبی 80 درصد و دمای C˚ 40 استراحت داده می­شود. در نهایت فرآیند پخت در فر با دمای C˚ 180 به مدت 15 دقیقه انجام خواهد شد (فیتزجرارد و همکاران، 2014).

ویژگی­های نان

مقدار رطوبت، فعالیت آبی، سفتی بافت (در روزهای اول و سوم نگهداری)، حجم مخصوص و تخلخل، شاخص­های رنگی و ویژگی­های آنتی­اکسیدانی بر اساس روشهای تشریح شده توسط فیتزجرارد و همکاران (2014) و فرانکو میراندا و همکاران (2017) ارزیابی خواهند شد.

ارزیابی حسی

ارزیابی حسی نان­های تولید شده توسط 12 ارزیابی نیمه آموزش دیده انجام خواهد شد. امتیازدهی بر اساس روش هدونیک 5 نقطه ­ای (1 حداقل امتیاز و امتیاز 5 حداکثر مطلوبیت) بر اساس شاخص­های رنگ، عطر و طعم، بافت، قابلیت جویدن و امتیاز کلی انجام خواهند شد (فیتزجرارد و همکاران، 2014).

از آمار تصیفی شامل فراونی و درصد برای توصیف داده های کیفی و از میانگین و انحراف معیار برای توصیف داده های کمی استفاده خواهد شد. برای تحلیل داده ها در بررسی  اثر آنزیم­های مختلفدر هیدرولیز پروتئین در (نسبت آنزیم به سوبسترای 2 درصد) و وزن­های مولکولی پپتیدها و همچنین تاثیر نوع و ترکیبب حامل بر ویژگی­های عملکردی و فعالیت آنتی ­اکسیدانی و شلاته ­کنندگی پروتئین هیدرولیز شده و همچنین تاثیر افزودن هیدرولیزشده به فرمول نان و ویژگی­های محصول غنی شده از آنالیز واریانس و استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 19 استفاده خواهد شد.  بررسی معنی ­دار بودن اثر متغیرها در (P< 0.05) انجام خواهد گردید

بر اساس  دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهشهای علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی  در جمهوری اسلامی ایران

و بندهای 1-  9- 10- 11 – 30 –و 31

1- هدف اصلی هر پژوهش‌باید ارتقای سلامت انسان‌ها توأم با رعایت کرامت و حقوق ایشان باشد.

9-در پژوهش‌های پزشکی که ممکن است به محیط زیست آسیب برسانند، باید احتیاط‌های لازم در جهت حفظ و نگهداری و عدم آسیب رسانی به محیط ریست انجام گیرد.

10- هر پژوهشی باید بر اساس و منطبق بر یک طرح‌نامه (پروپوزال) به انجام برسد. طرح‌نامه و دستورالعمل باید شامل تمامی اجزای ضروری باشد. از جمله بخش ملاحظات اخلاقی، اطلاعات مربوط به بودجه، حمایت کننده‌ها، وابستگی‌های سازمانی، موارد تعارض منافع بالقوه‌ی دیگرپیش از تصویب یا تأیید طرح‌نامه از سوی کمیته‌ی مستقل اخلاق در پژوهش، نباید اجرای پژوهش شروع شود.

11- کمیته‌ی اخلاق در پژوهش علاوه بر بررسی و تصویب طرح‌نامه و دستورالعمل، این حق را دارد که طرح‌‌ها را در حین و بعد از اجرا را از نظر رعایت ملاحظات اخلاقی مورد پایش قرار دهد. اطلاعات و مدارکی که برای پایش از سوی کمیته‌ی اخلاق درخواست می‌شود، باید از سوی پژوهشگران در اختیار این کمیته گذاشته شود.    

30 -گزارش‌ها و مقالات حاصل از پژوهش‌هایی که مفاد این راهنما را نقض کرده‌اند، نباید برای انتشار پذیرفته شوند.

با توجه به شرایط موجود محدودیت هایی در خصوص دسترسی به تجهیزات ازمایشگاهی ممکنست وجود داشته باشد که با بررسی امکان جایگزینی مشک بر طرف خواهد شد

 ریزپوشانی فراکسیون­های پپتیدی زیست فعال ،  تفاله نارگیل، خشک­ کردن پاششی ،  نان قالبی فراسودمند

Abeyrathne, E. D. N. S., Lee, H. Y., Jo, C., Suh, J. W., & Ahn, D. U. (2016). Enzymatic hydrolysis of ovomucin and the functional and structural characteristics of peptides in the hydrolysates. Food chemistry, 192, 107-113.

Ahmadi, F., Kadivar, M., & Shahedi, M. (2007). Antioxidant activity of Kelussia odoratissima Mozaff. in model and food systems. Food chemistry, 105(1), 57-64.

Akbarbaglu, Z., Mahdi Jafari, S., Sarabandi, K., Mohammadi, M., Khakbaz Heshmati, M., Pezeshki, A., 2019. Influence of spray drying encapsulation on the retention of antioxidant properties and microstructure of flaxseed protein hydrolysates. Colloids Surfaces B Biointerfaces. doi:10.1016/j.colsurfb.2019.03.038

Akhavan Mahdavi, S., Jafari, S.M., Assadpoor, E., Dehnad, D., 2016. Microencapsulation optimization of natural anthocyanins with maltodextrin, gum Arabic and gelatin. Int. J. Biol. Macromol. 85. doi:10.1016/j.ijbiomac.2016.01.011

Alashi, A. M., Blanchard, C. L., Mailer, R. J., Agboola, S. O., Mawson, A. J., He, R., ... & Aluko, R. E. (2014). Antioxidant properties of Australian canola meal protein hydrolysates. Food Chemistry, 146, 500-506.

Ambigaipalan, P., Al-Khalifa, A. S., & Shahidi, F. (2015). Antioxidant and angiotensin I converting enzyme (ACE) inhibitory activities of date seed protein hydrolysates prepared using Alcalase, Flavourzyme and Thermolysin. Journal of Functional Foods, 18, 1125-1137.

Balasundram, N., Sundram, K., & Samman, S. (2006). Phenolic compounds in plants and agri-industrial by-products: Antioxidant activity, occurrence, and potential uses. Food chemistry, 99(1), 191-203.

Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry, 72(1-2), 248-254.

Chambal, B. (2013). Coconut Press Cake Alkaline Extract—Protein Solubility and Emulsification Properties.

Chen, L., Chen, J., Ren, J., & Zhao, M. (2011). Modifications of soy protein isolates using combined extrusion pre-treatment and controlled enzymatic hydrolysis for improved emulsifying properties. Food Hydrocolloids, 25(5), 887-897.

Collins, A.R., 2005. Antioxidant intervention as a route to cancer prevention. Eur. J. Cancer 41, 1923–1930.

Cumby, N., Zhong, Y., Naczk, M., & Shahidi, F. (2008). Antioxidant activity and water-holding capacity of canola protein hydrolysates. Food Chemistry, 109(1), 144-148.

Decker, E. A. (1998). Strategies for manipulating the prooxidative/antioxidative balance of foods to maximize oxidative stability. Trends in Food Science & Technology, 9(6), 241-248.

Decker, E. A., & Welch, B. (1990). Role of ferritin as a lipid oxidation catalyst in muscle food. Journal of Agricultural and food Chemistry, 38(3), 674-677.

EVANGELHO, J. A. D., Berrios, J. D. J., Pinto, V. Z., Antunes, M. D., Vanier, N. L., & Zavareze, E. D. R. (2016). Antioxidant activity of black bean (Phaseolus vulgaris L.) protein hydrolysates. Food Science and Technology, 36, 23-27.

F. Gibbs, Selim Kermasha, Inteaz Alli, Catherine N. Mulligan, B. (1999). Encapsulation in the food industry: a review. International journal of food sciences and nutrition, 50(3), 213-224.

Fitzgerald, C., Gallagher, E., Doran, L., Auty, M., Prieto, J., & Hayes, M. (2014). Increasing the health benefits of bread: Assessment of the physical and sensory qualities of bread formulated using a renin inhibitory Palmaria palmata protein hydrolysate. LWT-Food Science and Technology, 56(2), 398-405.

Hartmann, R., & Meisel, H. (2007). Food-derived peptides with biological activity: from research to food applications. Current opinion in biotechnology, 18(2), 163-169.

Jafari, S. M., Assadpoor, E., He, Y., & Bhandari, B. (2008). Encapsulation efficiency of food flavours and oils during spray drying. Drying Technology, 26(7), 816-835.

Jamdar, S. N., Rajalakshmi, V., Pednekar, M. D., Juan, F., Yardi, V., & Sharma, A. (2010). Influence of degree of hydrolysis on functional properties, antioxidant activity and ACE inhibitory activity of peanut protein hydrolysate. Food Chemistry, 121(1), 178-184.

Khazaei, K. M., Jafari, S. M., Ghorbani, M., & Kakhki, A. H. (2014). Application of maltodextrin and gum Arabic in microencapsulation of saffron petal's anthocyanins and evaluating their storage stability and color. Carbohydrate polymers, 105, 57-62.

Kim, J. W., & Minamikawa, T. (1997). Hydroxyl radical-scavenging effects of spices and scavengers from brown mustard (Brassica nigra). Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 61(1), 118-123.

Klompong, V., Benjakul, S., Kantachote, D., & Shahidi, F. (2007). Antioxidative activity and functional properties of protein hydrolysate of yellow stripe trevally (Selaroides leptolepis) as influenced by the degree of hydrolysis and enzyme type. Food chemistry, 102(4), 1317-1327.

Kong, B., & Xiong, Y. L. (2006). Antioxidant activity of zein hydrolysates in a liposome system and the possible mode of action. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54(16), 6059-6068.

Lee, S. K., Han, J. H., & Decker, E. A. (2002). Antioxidant activity of phosvitin in phosphatidylcholine liposomes and meat model systems. Journal of food science, 67(1), 37-41.

LI, W., BOWERS, J. A., CRAIG, J. A., & PERNG, S. K. (1993). Sodium tripolyphosphate stability and effect in ground turkey meat. Journal of Food Science, 58(3), 501-504.

Mancuso, J. R., McClements, D. J., & Decker, E. A. (1999). The effects of surfactant type, pH, and chelators on the oxidation of salmon oil-in-water emulsions. Journal of agricultural and food chemistry, 47(10), 4112-4116.

 McClements DJ, Decker EA. Lipid oxidation in oil‐in‐water emulsions: Impact of molecular environment on chemical reactions in heterogeneous food systems. Journal of Food Science. 2000; 65(8):1270-82.

Mohan, A., McClements, D. J., & Udenigwe, C. C. (2016). Encapsulation of bioactive whey peptides in soy lecithin-derived nanoliposomes: Influence of peptide molecular weight. Food chemistry, 213, 143-148.

Mohan, A., Rajendran, S. R., He, Q. S., Bazinet, L., & Udenigwe, C. C. (2015). Encapsulation of food protein hydrolysates and peptides: a review. RSC Advances, 5(97), 79270-79278.

Pihlanto, A. (2006). Antioxidative peptides derived from milk proteins. International Dairy Journal, 16(11), 1306-1314.

Rodsamran, P., & Sothornvit, R. (2018). Physicochemical and functional properties of protein concentrate from by-product of coconut processing. Food chemistry, 241, 364-371.

Sarabandi, K., Gharehbeglou, P., & Jafari, S. M. (2020). Spray-drying encapsulation of protein hydrolysates and bioactive peptides: Opportunities and challenges. Drying Technology, 38(5-6), 577-595.

Sarabandi, K., Mahoonak, A. S., Hamishehkar, H., Ghorbani, M., & Jafari, S. M. (2019). Protection of casein hydrolysates within nanoliposomes: Antioxidant and stability characterization. Journal of Food Engineering, 251, 19-28.

Sarabandi, K., Mahoonak, A. S., Hamishekar, H., Ghorbani, M., & Jafari, S. M. (2018). Microencapsulation of casein hydrolysates: Physicochemical, antioxidant and microstructure properties. Journal of food engineering, 237, 86-95.

Sarabandi, K., Peighambardoust, S. H., Mahoonak, A. S., & Samaei, S. P. (2017). Effect of carrier types and compositions on the production yield, microstructure and physical characteristics of spray dried sour cherry juice concentrate. Journal of Food Measurement and Characterization, 11(4), 1602-1612.

Sarmadi, B. H., & Ismail, A. (2010). Antioxidative peptides from food proteins: a review. Peptides, 31(10), 1949-1956.

Shahidi, F., Rubin, L. J., Diosady, L. L., Kassam, N., Fong, J. L. S., & Wood, D. F. (1986). Effect of sequestering agents on lipid oxidation in cooked meats. Food chemistry, 21(2), 145-152.

Sofos, J. N. (1986). Use of phosphates in low-sodium meat products. Food technology (USA).

Tong, L. M., Sasaki, S., McClements, D. J., & Decker, E. A. (2000). Mechanisms of the antioxidant activity of a high molecular weight fraction of whey. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48(5), 1473-1478.

Tsai, P. J., Tsai, T. H., Yu, C. H., & Ho, S. C. (2007). Comparison of NO-scavenging and NO-suppressing activities of different herbal teas with those of green tea. Food Chemistry, 103(1), 181-187.

Udenigwe, C. C., Lu, Y. L., Han, C. H., Hou, W. C., & Aluko, R. E. (2009). Flaxseed protein-derived peptide fractions: Antioxidant properties and inhibition of lipopolysaccharide-induced nitric oxide production in murine macrophages. Food Chemistry, 116(1), 277-284.

Umayaparvathi, S., Meenakshi, S., Vimalraj, V., Arumugam, M., Sivagami, G., & Balasubramanian, T. (2014). Antioxidant activity and anticancer effect of bioactive peptide from enzymatic hydrolysate of oyster (Saccostrea cucullata). Biomedicine & Preventive Nutrition, 4(3), 343-353.

Wu, H. C., Chen, H. M., & Shiau, C. Y. (2003). Free amino acids and peptides as related to antioxidant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus). Food research international, 36(9), 949-957.

Xie, J., Du, M., Shen, M., Wu, T., & Lin, L. (2019). Physico-chemical properties, antioxidant activities and angiotensin-I converting enzyme inhibitory of protein hydrolysates from Mung bean (Vigna radiate). Food chemistry, 270, 243-250.

Yang, S., Mao, X. Y., Li, F. F., Zhang, D., Leng, X. J., Ren, F. Z., & Teng, G. X. (2012). The improving effect of spray-drying encapsulation process on the bitter taste and stability of whey protein hydrolysate. European Food Research and Technology, 235(1), 91-97.

You, L., Zhao, M., Cui, C., Zhao, H., & Yang, B. (2009). Effect of degree of hydrolysis on the antioxidant activity of loach (Misgurnus anguillicaudatus) protein hydrolysates. Innovative food science & emerging technologies, 10(2), 235-240.

نوع آنزیم :                  مدت زمان هیدرولیز.................    نوع حامل ...........     نسبت حامل.............

ظرفیت آنتی اکسیدانی