ارزیابی ارتباط بین پلی مورفیسم¬های RNAهای بلند غیر کد کنندهGAS5 ، MEG3 وHOTTIP و ریسک ابتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک در جمعیتی از شهر زاهدان، ایران

سندرم تخمدان پلیکیستیک (PCOS) شایعترین بیماری آندوکرین در زنان است که با هایپرآندروژنیسم با علت نا مشخص، عدم تخمک گذاری مزمن و تخمدان­های حاوی تعداد زیادی کیست تشخیص داده می شود. صفت مشخصه سندرم تخمدان پلیکیستیک هنگامی بروز میکندکه در دوره ای از زمان، عدم تخمک گذاری وجود داشته باشد. عدم تخمک گذاری مسأله ای بسیارشایع است که در مجموعه ای از تظاهرات بالینی، از جمله آمنوره، قاعدگی­های نا منظم و هیرسوتیسم بروز میکند. عدم تخمک گذاری مزمن و میزان بالای استروژن با ناباروری، افزایش ریسک ابتلا به هایپرپلازی آندومتر، سرطان آندومتر (3 تا 4 برابر نسبت به زنان سالم) و احتمالاً سرطان پستان در ارتباط است(1, 2). این سندرم باچاقی عمومی یا شکمی، مقاومت به انسولین، خطر افزایش یافته تیپ 2 دیابت ملیتوس، خطر ابتلا به بیماریهای قلبی و عروقی همراه می باشد(1). مطالعات اپیدمیولوژیک، فراوانی این سندرم را در زنان در سنین باروری از 5% تا 15% و در زنان نابارور 15% تا 25%، بسته به معیارهای تشخیصی گزارش کرده اند(3). مشاهدات نشان میدهند که PCOS اساس ژنتیکی داشته و استعداد ابتلا به آن به صورت ژنتیکی به ارث میرسد. وجود هایپرآندروژنیسم در وابستگان درجه اول زنان مبتلا به این بیماری و دوقلوهای تک تخمکی و دو تخمکی، همچنین شیوع خانوادگی عدم تخمک گذاری و تخمدانهای پلی کیستیک، بیان کننده نقش فاکتورهای ژنتیکی در ایجاد این بیماری می باشد(4, 5). با وجود اینکه برای ایجاد سندرم تخمدان پلیکیستیک، زمینه ژنتیکی مد نظر است، هیچ نقص ژنتیکی مسئول ایجاد PCOSشناسایی نشده است و مکانیسم های ژنتیکی برای ایجاد این بیماری ناشناخته اند، اگرچه وجود الگوی اتوزومال غالب برای این بیماری پیشنهاد شده است(2). برخی از مطالعات پیشنهادکرده اند که PCOS یک بیماری الیگوژنیک است بنابراین لازم است مطالعات بیشتری جهت تعیین پایه ژنتیکی این بیماری انجام شود(4) .

PCOS ریشه خانوادگی دارد و داشتن یک فامیل درجه 1 مبتلا به این بیماری، 25 % خطر ابتلا را به لحاظ بالینی بالا می برد و همینطور 25 % اشتراک ویژگی های آن سندرم را بین خواهرها افزایش می دهد (9). نتایج مشابه چندین مطالعه در مورد دو قلو ها نشان دهنده افزایش میزان مطابقت ویژگی های این بیماری بین خواهران دوقلوی مونوزیگوتیک(تک تخمکی) در مقایسه با خواهران دو قلوی دایزیگوتیک(دو تخمکی) بود (10). در حالت کلی این داده ها به شدت بیانگر وجود یک اساس ژنتیکی پیشرفته برای سندرم تخمدان پلی کیستیک هستند. مطالعات زیادی تلاش کرده اند صرف نظر از ارتباط سندرم تخمدان پلی کیستیک  با کم باروری، شیوع بالای کلی این بیماری را بین زنان سرتاسر دنیا توضیح بدهند که یک پارادوکس تکاملی ایجاد شده است. اخیرا نشان داده شده است که چندین لوکوس ژنتیکی مرتبط با این بیماری به طور مجزایی پارامتر های باروری را در زنان و مردان تغییر می دهند. این مطالعات پیشنهاد می کنند که این متغیر های ژنتیکی منجر به اثرات معکوس روی موفقیت در بارداری مردان و زنان می شوند. تضاد جنسی بین لوکوسی به عنوان یک دلیل ماندگاری سندرم تخمدان پلی کیستیک، تایید کننده شیوع بالای آن در طول تکامل انسان ها بوده است (11).

تا امروز شمار زیادی از مطالعات ژنتیکی حدود 200 ژن مستعد که میتوانند از لحاظ عملکردی با سندرم تخمدان پلی کیستیک مرتبط باشند را شناسایی کرده اند .با این حال، اکثریت آنها طی مطالعات دیگر تکرار نشدند(12). چون به نظر می رسد که سندرم تخمدان پلی کیستیک یک بیماری مالتی فکتوریال باشد، یک رویکرد جامع و بی طرفانه و غیر فرضی شاید آموزنده تر باشد. بنابراین نیاز است مطالعات ارتباط ژنومی با بازده بالا(GWAS) انجام بگیرد تا پیش زمینه ژنتیکی سندرم تخمدان پلی کیستیک مشخص شود. مطالعات اخیر GWASتا 18 متغییر ژنی مرتبط با سندرم تخمدان پلی کیستیک را که از لحاظ ژنومی به طور معنی داری با شیوع آن مرتبط بودند را شناسایی کرده اند (13-15).

پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی(SNP)، تغییرات تک در توالی DNA می باشند که سبب ایجاد ژنوتیپ های مختلف میشوند. این تغییرات ژنتیکی ممکن است ریسک ابتلا به برخی بیماریها از جمله سرطان را در جمعیت هایی با ژنوتیپ خاص افزایش دهند (6, 7).SNPهای متعددی در ارتباط با خطر ابتلا به سرطانهای آندومتر، تخمدان، سینه و پروستات گزارش شده­اند. مطالعات  انجام شده در ارتباط با سرطان، افزایش بیان دسته ای از RNA های غیر کد شونده را نشان می دهند (8, 9). دسته بزرگی از RNA های بلند غیر کدکننده، Long Non Coding RNAها (LncRNAs) می باشند .اینRNAها بیش از 200 نوکلئوتید طول دارند و طبق مطالعات انجام شده نقش مهمی در استعداد ابتلا به سرطان ایفا می کنند (10-12). این مولکول‌ها فاقد قالب خواندنی باز (open reading frame) و ظرفیت قابل مشاهده برای کدکردن پروتئین بوده و در اغلب بافت ها بیان می شوند. LncRNA ها می­توانند فعالیت رونویسی را مورد هدف قرار دهند و همچنین بیان و عملکرد پروتئین را تعدیل می نمایند (11). نقش LncRNA ها در تنظیم پروسه های سلولی مختلف، مثل پُرتوانی (pluripotency) سلول های بنیادی، تکامل، رشد و عملکرد سلول نیز گزارش شده است. SNP های انتخاب شده دارای MAF بالاتر از 0.05 (5%) بوده یعنی خاصیت پلی مورفیسم دارد و نیز دارای اهمیت بالینی میباشد یعنی با ریسک خیلی از بیماری ها در ارتباط بوده و نیز آنزیم های برش دهنده آنها به لحاظ تجاری برای ما در دسترس بوده است.

ژن کد کننده GAS5 یا growth arrest specific 5 در موقعیت کروموزومی 1q25.1 واقع شده و 13 اگزون دارد. UTR 5 prime variant و اینترونی است که MAF rs55829688 آن بر اساس پروژه 1000 ژنوم C=0.2071 است. پیرایش اگزون های این ژن سبب ایجاد دو فرم GAS5-a و GAS5-b می شود که GAS5-b بعنوان فرم بالغ آن در اغلب بافت ها دارای بیان می باشد. حداکثر بیان این ژن در بافت تخمدان و تیروئید است ولی در بافت پانکراس و سایر بافت ها نیز بیان دارد (13)  Lin و همکاران در سال 2018 نشان دادند که سطح بیان GAS5 سرم در 46 بیمار PCOS و کنترل 30non-PCOS  برای تعیین وضعیت بیان GAS5 سرم بررسی شد.  GAS5  در بیماران PCOS مقاوم به انسولین در مقایسه با بیماران PCOS بدون مقاومت به انسولین  یا غیر PCOS به طور قابل توجهی کاهش یافته است.(14) نتایج مطالعه Yang و همکاران در سال 2017 نشان داد که بیان GAS5 اغلب در سرطان کلورکتال (CRC  ) کاهش می یابد ، که نشان می دهد GAS5  نقش اساسی در سرکوب CRC دارد.(15, 16) مطالعه Li و همکاران در سال 2018 نشان داد که  کاهش سطح GAS5 در سلولهای سرطانی دهانه رحم تکثیر سلول را تسهیل می کند و قدرت حمله / مهاجرت سلولی را که مربوط به مرحله بالینی بیمار و حمله تومور یا متاستاز است ، بهبود می بخشد.(17) مطالعه Li و همکاران در سال 2019 نشان داد که بیان کمتر LncRNA GAS5  با کارسینوم آندومتر و دیابت نوع 2 ارتباط نزدیک داشت و نیز نتایج آنها تنظیم حیاتی محور GAS5 / miR-222-3p / p27 را در تومورزایی سرطان آندومتر تایید کرد(18).  Ketabو همکاران در سال 2020 با مطالعه لوکمی حاد میلوئیدی  (AML) روی  پلی مورفیسم ژن GAS5 rs55829688  (T> C)  نشان دادند که فراوانی آلل ها و ژنوتیپ های پلی مورفیسم rs55829688 بین بیماران و افراد سالم تفاوت ندارد.(19) مطالعات Yu و همکارانش در سال 2019 نشان داد که سطح پایین بیان GAS5 با تهاجمی بودن و اندازه تومور تخمدان ارتباط دارد. همچنین SNP rs55829688  از ژنGAS5  ممکن است بتواند به عنوان شاخصی کلیدی برای تشخیص و پیش آگهی سرطان پروستات(PCa) استفاده شود(20).

ژن کد کننده MEG3 به عنوان یک LncRNA در موقعیت 14q32.3 ژنوم انسانی قرار گرفته است. واریانت آن اینترونی است که MAF rs4081134 آن بر اساس پروژه 1000 ژنوم A=0.2689 و MAF rs7158663 آن بر اساس پروژه 1000 ژنوم A=0.4846 است. این LncRNA قادر به ایجاد کنش و واکنش با کروماتین بوده و مطالعات مختلفی نشان داده است افزایش بیان آن، با کاهش تکثیر سلول­های سرطانی مغز و پروستات همراه است (21). همچنین Qiu و همکاران در سال 2016  بیان کردند MEG3 از طریق تنظیم PTEN بر میزان تکثیر و تهاجم سلولهای اپیتلیالی بافت تخمدان سرطانی تأثیر میگذارد(22). با این حال، مطالعه­ای ارتباط SNP­های واقع در ژن کد کننده­ی MEG3 از جمله rs4081134 G>A (با فراوانی آلل مغلوب 0.27 براساس پروژه 1000 ژنوم) و) rs7158663 A>G با فراوانی آلل مغلوب 0.48 براساس پروژه 1000 ژنوم) و ریسک ابتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک را نشان نداده است. هر دو واریانت ذکر شده در ناحیه غیر کد کننده از ژن MEG3 قرار گرفته­اند ولی مطالعات گذشته ارتباط این واریانت­ها و ریسک ابتلا به انواع سرطان از جمله سرطان ریه و نوروبلاستوما را ثابت کرده است (23, 24). داده های Chen و همکاران در سال 2019 نشان داد که ژن LncRNA MEG3 مقاومت به انسولین را افزایش می دهد.(25) Ghafouri-Fardو همکاران در سال 2019 نشان دادند که پلی مورفیسم در ژن rs7158663) ، MEG3 (rs4081134  در ریسک خطر سرطان نقش دارد.(26) همچنین Zhang و همکاران در سال 2015 نشان دادند که جفت هایی با پره اکلامپسی شدید سطح MEG3 پایینی نسبت به گروه کنترل نشان دادند. همچنین اطلاعات نشان داد که سطح پایین LncRNA MEG3 میتواند با نارسایی بازآرایی شریان رحمی در ارتباط باشد.(27) این مطالعات نشان می دهد که lncRNA MEG3 با مقاومت به انسولین در ارتباط است ولی نقش آن در پیشرفت دیابت میلیتوس بارداری (GDM) و مکانیسم های مرتبط مولکولی هنوز ناشناخته است(28). طی مطالعه Soleimanpour و همکاران در سال 2017 نشان داده شد که سطح بیان MEG3 به طور قابل توجهی در سرطان پستان کاهش پیدا کرد و این تنظیم پایین دستی و به اصطلاح خاموش شدن ژن با وضعیت بدخیمی تومور مرتبط است (29). طی مطالعات Buttarelli و همکاران در سال 2020 که ارتباط بالینی MEG3 با مجموعه هموژنوس بیماران با سرطان سروز تخمدان با بدخیمی بالا (HGSOC) را بررسی کردند. سپس عملکردش در بیولوژی سرطان تخمدان هم بررسی شد. نتایج نشان داد که MEG3 میتواند به عنوان یک مارکر پیش آگهی در بیماران HGSOC باشد ، و غیر فعال شدن آن در تنظیم رشد و پیشرفت سلول های سرطانی نقش دارد.(30)

HOTTIP به عنوان یک LncRNA تازه شناخته شده واریانت آن اینترونی است که MAF rs2023843 آن بر اساس پروژه 1000 ژنوم C=0.1649 است که می تواند باعث مهار ژن پایین دست خود (RND3) شده که بدین وسیله می تواند در پاتوژنز بیماری پره اکلامپسی دخالت داشته باشد (31). همچنین پیشنهاد شده است تغییر بیان HOTTIP با بروز ناباروری در مردان مرتبط باشد (32). مطالعه Cheng و همکاران در سال 2015 نشان داد HOTTIP باعث افزایش تکثیر و تهاجم سلولهای سرطانی مشتق شده از بافت پانکراس می شود (33). Chang و همکاران در سال 2016 نشان دادند HOTTIP به عنوان یک آنکوژن ریسک ابتلا به سرطان معده را افزایش می دهد (34). rs2023843T/C یک پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی در ژن کد کننده HOTTIP با فراوانی آلل مغلوب 0.16 طبق اطلاعات پروژه 1000 ژنوم می باشد. طی مطالعه Zou و همکاران در سال 2019 مشخص شد که بیان LncRNA HOTTIP در افرادی که سرطان تخمدان داشتند نسبت به افراد کنترل بیشتر است(35). مطالعات Shang و همکاران در سال 2019 مشخص کرد که ژن HOTTIP در بافت سرطانی تخمدان بیان زیادی پیدا کرده است. این مطالعه نشان داد که HOTTIP می تواند باعث ترشح IL-6 همچنین بیان PD-L1  در نوتروفیل ها شود ، بنابراین فعالیت سلول های(T-Cell) T  را مهار می کند و در نهایت باعث فرار از ایمنی سلول های سرطانی تخمدان(OC) میشود. مطالعات این گروه با هدف قرار دادن HOTTIP در OC یک راهبرد درمانی قوی را ارائه می دهد.(36) همچنین Wang و همکاران در سال  2018 ژن HOTTIP rs202384 را بررسی و نشان دادند که تغییرات ژنتیکی عملکردی بالقوه در این  lncRNA  نقش مهمی در پاتوژنز آرتروز زانو دارد.(37) مطالعات Guan و همکاران در سال 2018 نشان داد که HOTTIP در بیماران با سرطان اندومتر (EC) به طرز چشمگیری بیان شد و میزان بقای بیماران EC با بیان بالا HOTTIP کمتر از بیماران با بیان کم بود. به طور کلی بیان بیش از حد HOTTIP از طریق فعال کردن مسیر PI3K / AKT باعث پیشرفت سرطان آندومتر می شود.(38) Liao و همکاران در سال 2018 نشان دادند که بیان بیش از حد HOTTIP باعث فعال سازی مسیر Wnt/β-کاتنین (Wnt/β-catenin pathway) می شود. بیان خارج رحمی HOTTIP از طریق فعال سازی مسیر  -Wnt/βکاتنین باعث افزایش تکثیر و مهاجرت سلولهای اندوتلیال می شود. همچنین این نتایج نشان داد که HOTTIP  می تواند تکثیر و مهاجرت سلولهای اندوتلیال را تسریع کند(39). در همین ارتباط، Wu و همکاران در سال 2017 ضمن مطالعه بر روی جمعیتی از شمال چین نشان دادند که مسیر سیگنالینگ WNT/β-catenin منجر به فعالسازی مسیر آپوپتوز در سلولهای سلول گرانولوزا (granulosa cell)ی فولیکولهای تخمدانی بیماران مبتلا به PCOS می شود(40).

بازنگری متون:

• در سال 2016 Xiangming Cao وهمکاران مطالعاتی را بر روی ژن MEG3 و ارتباط آن با سرطان روده بزرگ انجام دادند. این مطالعه برروی 518 کیس و 527 کنترل و rs10144253،rs4081134 ،rs7158663،rs11160608،rs 3087918 انجام شد و نتیجه گرفتند SNP در MEG3 ممکن است بر فنوتیپ های سلولی اثر بگذارد و خطر ابتلا به سرطان کولون را ایجاد کند (34)
• در سال 2018 Yang و همکاران  مطالعاتی را بر روی ژن MEG3 انجام دادند این مطالعه بر روی 526 کیس و 526 کنترل انجام شد که نتایج نشان داد پلی مورفیسم MEG3 rs 4081134 به طور قابل توجهی با حساسیت به سرطان ریه در جمعیت چین همراه بوده است. (27)
• در سال 2019 Yajie Wang و همکاران مطالعاتی را بر روی ژن GAS5 و سرطان روده بزرگ انجام دادند که در این مطالعه از 1078 کیس سرطان و 1175 کنترل استفاده شد که نتایج آن نشان داد که افراد با ژنوتیپ CT / TT rs 55829688 خطر قابل توجهی در ابتلا به سرطان روده بزرگ در مقایسه با کسانی که دارای ژنوتیپ CC هستند را دارند. مطالعه عملکردی بیشتر نشان داد که پلی مورفیسم T> C rs 55829688 ممکن است میل اتصال عوامل رونویسی به منطقه جهش rs 55829688 را تغییر داده و منجر به بیان کمتر GAS5 شود. علاوه بر این ، مهاجرت ، تهاجم و فلوسیتومتری جریان نشان داد که GAS5 آپاپتوز را مهار می کند و تکثیر ، تهاجم و توانایی مهاجرت سلول های CRC را تقویت می کند. (35).
• سال2020 wei-chun weng و همکاران مطالعاتی را با موضوع تاثیر پلی مورفیسم ژن GAS5 بر پیشرفت سرطان  سلول های لوله ادراری و خصوصیات بالینی آن انجام دادند که از rs 145204276 rs 55829688 و در مجموع از 430 بیمار و 860 کنترل سالم استفاده کردند ، نتایج مطالعه  نشان داد انواع پلی مورفیسم ژن GAS5 با وضعیت کلینیکوپاتولوژیک زنان مبتلا به UCC همراه بود و تغییرات ژنتیکی در GAS5 ممکن است به عنوان  یک پیش بینی کننده مهم از وضعیت بالینی زنان مبتلا به UCC باشد (36).
• در سال 2018Zhuo,zhen-jianو همکاران مطالعات خود را در 392 کودک نوروبلاستوما و 783کنترل با روشTagman   بر روی دو پلی مورفیسم از ژن MEG3 ،  rs7158663 G>A ، rs 4081134 G>A انجام دادند ، نتایج نشان داد نه جایگاه منفرد و نه آنالیز ترکیبی ارتباطی بین پلی مورفیسم MEG3 و خطر نوروبلاستوما را پشتیبانی نمیکند (28).
• درسال 2019 Yajie Wang  و همکاران مطالعات خود را بر روی ارتباط پلی مورفیسم GAS5 و خطر سرطان روده بزرگ به صورت یک مطالعه موردی شاهدی در 1078 بیمار مبتلا به CRC و 1175 شاهد سالم برای ارزیابی ارتباط ژنتیکی عملکردی بالقوه در GAS5 و خطر CRC انجام دادند . نتایج نشان داد که افراد دارای ژنوتیپ CT/TT در rs55829688 خطر ابتلا به CRC در مقایسه با ژنوتیپ CC، به طور قابل توجهی بالاتر دارند(35).

ژن های بسیاری به عنوان کاندید معرفی شده­اند که وقوع چند شکلی تک نوکلئوتیدی در آنها می تواند از نظر آماری ریسک ابتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک را تغییر دهد. با توجه به شیوع نسبتاً بالای سندرم تخمدان پلی کیستیک در بین زنان، بر آن شدیم تا 4 پلی مورفیسم­ تک نوکلئوتیدی واقع در 3 ژنMEG3 ،GAS5  و HOTTIP را در جمعیتی از بیماران مراجعه کننده به کلنیک ناباروری مولود واقع در بیمارستان علی بن ابیطالب شهر زاهدان بسنجیم. بدیهی است شناخت جایگاه­های ژنی موثر در بروز این بیماری، کمک شایان توجهی به روند درمان و تشخیص به موقع این اختلال تهدید کننده­ی سلامت زنان در آینده خواهد نمود.

توزیع فراوانی پلی مورفیسم rs4081134 ژن  MEG3در زنان مبتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک و افراد سالم متفاوت است.

توزیع فراوانی پلی مورفیسم rs7158663 ژن MEG3 در زنان مبتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک و افراد سالم متفاوت است.

توزیع فراوانی پلی مورفیسم rs55829688 ژن GAS5 زنان مبتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک و افراد سالم متفاوت است.

توزیع فراوانی پلی مورفیسم rs2023843 ژن  HOTTIP در زنان مبتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک و افراد سالم متفاوت است.

ریسک ابتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک در افراد دارای پلی مورفیسم های HOTTIP rs2023843،GAS5 rs55829688 ، MEG3 rs4081134، rs7158663 MEG3 در مقایسه با افراد سالم متفاوت است.

تعیین ارتباط بین پلی مورفیسم­های RNAهای بلند غیر کد کنندهGAS5 ، MEG3 وHOTTIP  و ریسک ابتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک در جمعیتی از شهر زاهدان ، ایران

تعیین و مقایسه فراوانی پلی مورفیسم rs4081134 ژن  MEG3در زنان مبتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک و افراد سالم.

تعیین و مقایسه فراوانی پلی مورفیسم rs7158663 ژن MEG3 در زنان مبتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک و افراد سالم.

تعیین و مقایسه فراوانی پلی مورفیسم rs55829688 ژن GAS5 زنان مبتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک و افراد سالم.

تعیین و مقایسه فراوانی پلی مورفیسم rs2023843 ژن  HOTTIP در زنان مبتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک و افراد سالم.

تعیین ریسک ابتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک در افراد دارای پلی مورفیسم های HOTTIP rs2023843،GAS5 rs55829688 ، MEG3 rs4081134، rs7158663 MEG3 در مقایسه با افراد سالم.

1. دانشگاه علوم پزشکی زاهدان، دانشکده پزشکی و معاونت تحقیقات و فن آوری
2. افراد مبتلا به PCOS

سندرم تخمدان پلی کیستیک: شایع‌ترین اختلالات غدد درون‌ریز (آندوکرینوپاتی) در زنان و شایع‌ترین علت نازایی ناشی از عدم تخمک‌گذاری می‌باشد. نامگذاری این سندرم به دلیل وجود تخمدان‌های بزرگ محتوی تعداد زیادی کیست کوچک (در اغلب زنان مبتلا و نه در همه) است که در لایه بیرونی هر تخمدان قرار گرفته‌است.

پلی‌مورفیسم: اختلاف توالی بازهای DNA در افراد یا گروه­های مختلف

پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی (single nucleotide polymorphism: SNP): به صورت یک جایگاه ژنومی تعریف می شود که در آن یک یا چند باز جایگزین با فراوانی محسوس ( بیشتر از 1% ) ظاهر می شود.

موردی-شاهدی

گروه مورد و معیارهای ورود آن: زنان مبتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک (PCOS) (41)  مراجعه کننده که با هم نسبت فامیلی نداشته و به کلینیک زنان  یا مرکز ناباروری مولود بیمارستان علی بن ابیطالب (ع) مراجعه می نمایند. تشخیص بیماری بر اساس تاریخچه پزشکی، معاینات فیزیکی و لگنی، براساس داشتن 2 معیار از 3 معیار روتردام شامل الیگومنوره یا آمنوره : معیار O ، هایپر آندورژنیسم بالینی همراه با سطوح افزایش یافته تستوسترون / ایندکس آندروژن آزاد : معیار H و نمای سونوگرافیک از مورفولوژی PCOS در تخمدان ها : معیار P (مطابق کرایتریای اصلاح شده روتردام Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS Consensus Workshop ) تشخیص داده شده و در 4 فنوتیپ A (دارای معیار های H+P+O ) فنوتیپ B (دارای معیار های H+P ) فنوتیپ C (دارای معیار های O+P ) و فنوتیپ D (دارای معیار های H+O ) و پس از حذف سایر بیماری های مرتبط انجام می­شود.

گروه کنترل: شامل زنان سالم با چرخه قاعدگی طبیعی (بین 28 الی 32 روز) که از لحاظ شاخص توده بدنی (BMI) و سن با بیماران مورد بررسی باشند و مبتلا به هیچگونه اختلال اندوکرینی به جز چاقی(BMI>30Kg/m2)  و افزایش وزن و (BMI>25Kg/m2)  نباشند (42). این افراد از نظر تاریخچه پزشکی، آزمایشات بیوشیمیایی و معاینات فیزیکی سالم بوده و برای معاینات دوره ای  یا به دلایل دیگر به کلینیک زنان یا مرکز ناباروری مولود بیمارستان علی بن ابیطالب (ع)  مراجعه می کنند. ضمنا گروه مورد و کنترل از نظر BMI در محدوده اختلاف واحد2 BMI±  همسان سازی خواهند شد.

معیار های خروج از مطالعه: زنان دارای بیماری­های سیستمیک، انواع بدخیمی از جمله تخمدان و آدرنال، آکرومگالی، دیابت ملیتوس، مقاومت به انسولین، فشار خون، بیماری های تیروئید، هایپرپرولاکتینمی، آکنه شدید، سندرم کوشینگ، Premature ovarian failure، Virilizing و نقص­های خود ایمنی و انواع بیماری های دیگر مانند بیماری کبدی و همچنین داشتن نسبت خانوادگی.

برای بررسی پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی از افراد مبتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک در زاهدان که هم اکنون تحت درمان می باشند به تعداد حداقل 200 نفر خون گرفته می شود. گروه شاهد از نمونه های خون افراد سالم هم به تعداد حداقل 200 انتخاب می شوند.

به صورت در دسترس

مشاهده و بررسی های آزمایشگاهی

بعد از کسب رضایت از بیماران و گروه کنترل برای بررسی  پلی مورفیسم  نمونه خون تام تحت شرایط استریل به مقدار 5 سی سی گرفته و 2 سی سی در لوله حاوی ماده ضد انعقادEDTA ریخته و در 20- درجه سانتیگراد نگهداری می‌شود و همچنین 3 سی سی جهت آنالیزهای بیوشیمیایی استفاده خواهد شد. DNA نمونه خون افراد گروه شاهد و مورد به روش salting out تخلیص می‌شود. پرایمرهای اختصاصی جهت تعیین پلی مورفیسم ژنی به روش PCR-RFLP طراحی می شود. DNA استخراج شده در حضور پرایمر­های اختصاصی تکثیر دهنده­ی توالی مورد نظر PCR شده و قطعه­ای با طول اختصاصی ایجاد می شود. در مرحله بعد، محصولات PCR حدود 16 ساعت توسط آنزیم­های محدود کننده (NdeI  برش دهنده­ rs4081134 ، BtsCI برش دهنده­ ازrs7158663 ، MspI برش دهنده­ی rs2023843 و HhaI برش دهنده rs55829688) انکوبه شده و سپس قطعات حاصل از انکوباسیون بر حسب جفت باز (bp) بر روی ژل آگارز 1.5 درصد بررسی می شود و فراوانی ژنوتیپ­های مختلف برای هر 4 جایگاه  ژنی بدین طریق مورد ارزیابی قرار می‌گیرد.

پس از گردآوری اطلاعات لازم، یافته ھا در نرم افزار آماری SPSS16 وارد شده و آنالیز می شود. تعادل Hardy Weinberg در گروه کنترل برای ھر سه  پلی مورفیسم توسط آزمون chi square بررسی می شود. سپس داده ھا با استفاده از آزمون آماری independent sample T test ، Chi square در صورت نیاز مورد تجزیه  و تحلیل قرار خواھند گرفت. ریسک ابتلا به بیماری سندرم تخمدان پلی کیستیک ضمن محاسبه Odds Ratio و فاصله اطمینان 95 % تخمین زده می شود. ھمچنین ھمبستگی بین پارامترھای دموگرافیک بیماران و ژنوتایپ ھای پلی مورفیسم ھای مورد مطالعه توسط آزمون unconditional logistic regression بررسی خواھد شد. در تمامی آزمونها ، P<0.05 معنی دار در نظر گرفته می شود.

در این مطالعه کدهای 1,2,3,8,10, 11,12,13,14,15,17,19,22,25,28و31 از راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش‌های علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی در جمهوری اسلامی ایران به شرح زیر استفاده می شود.

1. هدف پژوهش ارتقاء سلامت انسان خواهد بود 2- سلامت و ایمنی فرد آزمودنی اولویت دارد 3- منافع پژوهش برای فرد آزمودنی بیشتر از خطرهای آن است 8- روش انجام پژوهش منطبق بر اصول علمی است 10- پژوهش به صورت پروپوزال ارائه می شود 11- کمیته اخلاق طرح حاضر را مورد پایش قرار می دهد 12- انتخاب آزمودنی ها از بین بیماران منصفانه خواهد بود  13- رضایت آگاهانه از افراد مورد پژوهش اخذ می شود 14- تغییر احتمالی در نحوه انجام پژوهش به اطلاع کمیته اخلاق دانشگاه خواهد رسید 15- پژوهشگر از آگاهانه بودن رضایت اخذ شده اطمینان حاصل می کند 17 پژوهشگر اطلاعات کافی را در مورد مطالعه در اختیار آزمودنی قرار خواهد داد 19- عدم شرکت در پژوهش هیچ تآثیری در میزان خدمات درمانی دریافتی توسط آزمودنی نخواهد داشت 22- از گروههای آسیب پذیر نمونه گیری انجام نمی شود 25- پژوهشگر اصول راز داری را رعایت خواهد کرد 28- نتایج پژوهش به طور صادقانه منتشر خواهد شد 

 همچنین کد­های 1,2,3,4,6,8,12 از راهنمای ‌عمومی اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی مد نظر قرار میگیرد

1. پژوهشگر توجه دارد که نمونه خون فرد مورد استفاده، دارای منشأ انسانی‌اند و کرامت انسانی اقتضا می‌کند که جمع‌آوری، نگه‌داری، استفاده و نابودسازی آن‌ها توأم با رعایت ملاحظات و شؤون مرتبط باشد.

2. از نمونه خون فرد دارای منشأ انسانی باید تنها در پژوهشی استفاده می شود که اهداف ارزشمندی را در راستای مبارزه با بیماری‌ها و ارتقای سلامت انسان‌ها دنبال کند.

3. پژوهش فعلی انجام شده بر روی نمونه خون افراد پیش از اجرا مورد تأیید کمیته‌ی اخلاق در پژوهش مرتبط قرار می گیرد.

4. رضایت آگاهانه‌ی فرد دهنده‌ی نمونه خون، یا جانشین قانونی او، شرط اساسی در تأیید اخلاقی هر پژوهش بر روی نمونه انسانی می باشد.

8. - پژوهشگر باید از اعضاء و بافت‌هایی که به منظور پژوهش در اختیار او قرار می‌گیرد استفاده‌ی بهینه خواهد کرد.

12- در صورت کمبود نمونه خون، باید استفاده‌های درمانی بر استفاده‌های پژوهشی اولویت داده می شود.

به این دلیل که نمونه خون نوعی بافت سیال در نظر گرفته می شود، کد های 1 و 2 از فصل چهارم (زیست بانک) راهنمای اختصاصی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی نیز لحاظ می شوند

1- ذخیره‌سازی نمونه خون یا اجزای بدنی با منشأ انسانی باید با اخذ رضایت آگاهانه باشد.

2- فرد حق دارد هر وقت که بخواهد درخواست کند که نمونه‌هایش از زیست‌بانک خارج شوند. 

به علاوه، کد­های 11 و 14 از  راهنمای پژوهشهای ژنتیک پزشکی در طرح فعلی رعایت می گردد.
کد 11- داده های ژنتیکی جمع آوری شده برای هدف دیگری به کار گرفته نمی شوند
کد 14- مطالعه بر روی ژنوم انسانی منجر به کسب منافع اقتصادی نمیشود 

- عدم همکاری بیماران

- مشکل تهیه مواد و امکان طولانی شدن زمان دریافت آنها که میبایستی ثبت سفارشات مواد در کوتاهترین زمان ممکن پس از تأمین بودجه انجام شود.

Long non-coding RNA, Gene polymorphism, Polycystic ovarian syndrome

آر ان ای بلند غیر کد کننده، پلی مورفیسم ژنی، سندرم تخمدان پلی کیستیک

1.            Shannon M, Wang Y. Polycystic ovary syndrome: a common but often unrecognized condition. Journal of midwifery & women’s health. 2012;57(3):221-30.

2.            Azziz R, Carmina E, Dewailly D, Diamanti-Kandarakis E, Escobar-Morreale HF, Futterweit W, et al. Criteria for defining polycystic ovary syndrome as a predominantly hyperandrogenic syndrome: an androgen excess society guideline. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 2006;91(11):4237-45.

3.            Fauser BC, Tarlatzis BC, Rebar RW, Legro RS, Balen AH, Lobo R, et al. Consensus on women’s health aspects of polycystic ovary syndrome (PCOS): the Amsterdam ESHRE/ASRM-Sponsored 3rd PCOS Consensus Workshop Group. Fertility and sterility. 2012;97(1):28-38. e25.

4.            Amato P, Simpson JL. The genetics of polycystic ovary syndrome. Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology. 2004;18(5):707-18.

5.            Bond GL, Hu W, Levine A. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 gene: from a molecular and cellular explanation to clinical effect. Cancer research. 2005;65(13):5481-4.

6.            Yan R, Cao J, Song C, Chen Y, Wu Z, Wang K, et al. Polymorphisms in lncRNA HOTAIR and susceptibility to breast cancer in a Chinese population. Cancer epidemiology. 2015;39(6):978-85.

7.            Zhu L, Wang Y, Jie G, Chi Q, Zhou J, Cui B, et al. Association between Toll-like receptor 4 and interleukin 17 gene polymorphisms and colorectal cancer susceptibility in Northeast China. Medical Oncology. 2014;31(10):73.

8.            Du M, Wang W, Jin H, Wang Q, Ge Y, Lu J, et al. The association analysis of lncRNA HOTAIR genetic variants and gastric cancer risk in a Chinese population. Oncotarget. 2015;6(31):31255.

9.            Bayram S, Sümbül AT, Dadaş E. A functional HOTAIR rs12826786 C> T polymorphism is associated with breast cancer susceptibility and poor clinicopathological characteristics in a Turkish population: a hospital-based case–control study. Tumor Biology. 2016;37(4):5577-84.

10.          Ponting CP, Oliver PL, Reik W. Evolution and functions of long noncoding RNAs. Cell. 2009;136(4):629-41.

11.          Wang KC, Chang HY. Molecular mechanisms of long noncoding RNAs. Molecular cell. 2011;43(6):904-14.

12.          Hashemi M, Moazeni-Roodi A, Sarabandi S, Karami S, Ghavami S. Association between genetic polymorphisms of long noncoding RNA H19 and cancer risk: a meta-analysis. Journal of genetics. 2019;98(3):81.

13.          Fagerberg L, Hallström BM, Oksvold P, Kampf C, Djureinovic D, Odeberg J, et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 2014;13(2):397-406.

14.          Lin H, Xing W, Li Y, Xie Y, Tang X, Zhang Q. Downregulation of serum long noncoding RNA GAS5 may contribute to insulin resistance in PCOS patients. Gynecological Endocrinology. 2018;34(9):784-8.

15.          Yang Y, Shen Z, Yan Y, Wang B, Zhang J, Shen C, et al. Long non‑coding RNA GAS5 inhibits cell proliferation, induces G0/G1 arrest and apoptosis, and functions as a prognostic marker in colorectal cancer. Oncology letters. 2017;13(5):3151-8.

16.          Li J, Yang C, Li Y, Chen A, Li L, You Z. LncRNA GAS5 suppresses ovarian cancer by inducing inflammasome formation. Bioscience reports. 2018;38(2).

17.          Li Y, Wan Y, Bai Y. Correlation between long strand non-coding RNA GASS expression and prognosis of cervical cancer patients. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2018;22(4):943-9.

18.          Li Z, Yu Z, Meng X, Zhou S, Xiao S, Li X, et al. Long noncoding RNA GAS5 impairs the proliferation and invasion of endometrial carcinoma induced by high glucose via targeting miR-222-3p/p27. American journal of translational research. 2019;11(4):2413.

19.          Ketab FNG, Gharesouran J, Ghafouri-Fard S, Dastar S, Mazraeh SA, Hosseinzadeh H, et al. Dual biomarkers long non-coding RNA GAS5 and its target, NR3C1, contribute to acute myeloid leukemia. Experimental and Molecular Pathology. 2020;114:104399.

20.          Yu Y, Hann SS. Novel tumor suppressor lncRNA growth arrest-specific 5 (GAS5) in human cancer. OncoTargets and therapy. 2019;12:8421.

21.          Luo G, Wang M, Wu X, Tao D, Xiao X, Wang L, et al. Long non-coding RNA MEG3 inhibits cell proliferation and induces apoptosis in prostate cancer. Cellular physiology and biochemistry. 2015;37(6):2209-20.

22.          Wang J, Xu W, He Y, Xia Q, Liu S. LncRNA MEG3 impacts proliferation, invasion, and migration of ovarian cancer cells through regulating PTEN. Inflammation Research. 2018;67(11-12):927-36.

23.          Yang Z, Li H, Li J, Lv X, Gao M, Bi Y, et al. Association between long noncoding RNA MEG3 polymorphisms and lung cancer susceptibility in chinese northeast population. DNA and cell biology. 2018;37(10):812-20.

24.          Zhuo Z-J, Zhang R, Zhang J, Zhu J, Yang T, Zou Y, et al. Associations between lncRNA MEG3 polymorphisms and neuroblastoma risk in Chinese children. Aging (Albany NY). 2018;10(3):481.

25.          Chen D, Shen D, Han C, Tian Y. LncRNA MEG3 aggravates palmitate-induced insulin resistance by regulating miR-185-5p/Egr2 axis in hepatic cells. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2019;23(12):5456-67.

26.          Ghafouri-Fard S, Taheri M. Maternally expressed gene 3 (MEG3): A tumor suppressor long non coding RNA. Biomedicine & Pharmacotherapy. 2019;118:109129.

27.          Zhang Y, Zou Y, Wang W, Zuo Q, Jiang Z, Sun M, et al. Down‐regulated long non‐coding RNA MEG3 and its effect on promoting apoptosis and suppressing migration of trophoblast cells. Journal of cellular biochemistry. 2015;116(4):542-50.

28.          Zhang H. Mechanism associated with aberrant lncRNA MEG3 expression in gestational diabetes mellitus. Experimental and therapeutic medicine. 2019;18(5):3699-706.

29.          Soleimanpour E, Hosseinpourfeizi M, Babaei E, Montazeri V. The study of long noncoding RNA, MEG3, expression level and its association with clinicopathologic features in breast cancer. Journal of Babol University of Medical Sciences. 2017;19(11):14-20.

30.          Buttarelli M, De Donato M, Raspaglio G, Babini G, Ciucci A, Martinelli E, et al. Clinical Value of lncRNA MEG3 in High-Grade Serous Ovarian Cancer. Cancers. 2020;12(4):966.

31.          Li L, Zhang X, Hong S, Chen Y, Ren G. Long non-coding HOTTIP regulates preeclampsia by inhibiting RND3. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2018;2018:3277-96.

32.          Su Y, Zhou LL, Zhang YQ, Ni LY. Long noncoding RNA HOTTIP is associated with male infertility and promotes testicular embryonal carcinoma cell proliferation. Molecular genetics & genomic medicine. 2019;7(9):e870.

33.          Cheng Y, Jutooru I, Chadalapaka G, Corton JC, Safe S. The long non-coding RNA HOTTIP enhances pancreatic cancer cell proliferation, survival and migration. Oncotarget. 2015;6(13):10840.

34.          Chang S, Liu J, Guo S, He S, Qiu G, Lu J, et al. HOTTIP and HOXA13 are oncogenes associated with gastric cancer progression. Oncology reports. 2016;35(6):3577-85.

35.          Zou T, Wang PL, Gao Y, Liang WT. Long noncoding RNA HOTTIP is a significant indicator of ovarian cancer prognosis and enhances cell proliferation and invasion. Cancer Biomarkers. 2019;25(2):133-9.

36.          Shang A, Wang W, Gu C, Chen C, Zeng B, Yang Y, et al. Long non-coding RNA HOTTIP enhances IL-6 expression to potentiate immune escape of ovarian cancer cells by upregulating the expression of PD-L1 in neutrophils. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 2019;38(1):411.

37.          Wang K, Chu M, Ding W, Jiang Q. Putative functional variants of lncRNA identified by RegulomeDB were associated with knee osteoarthritis susceptibility. BMC musculoskeletal disorders. 2018;19(1):284.

38.          Guan Q, Zhang Q, Zhang C, Liu Q, Ren Q. HOTTIP regulates progression of endometrial cancer via activating PI3K/AKT pathway. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2018;22(12):3727-33.

39.          Liao B, Chen R, Lin F, Mai A, Chen J, Li H, et al. Long noncoding RNA HOTTIP promotes endothelial cell proliferation and migration via activation of the Wnt/β‐catenin pathway. Journal of Cellular Biochemistry. 2018;119(3):2797-805.

40.          Wu X-q, Wang Y-q, Xu S-m, Liu J-f, Bi X-y, Wang Z-q, et al. The WNT/β-catenin signaling pathway may be involved in granulosa cell apoptosis from patients with PCOS in North China. Journal of gynecology obstetrics and human reproduction. 2017;46(1):93-9.

41.          Group REASPCW. Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long‐term health risks related to polycystic ovary syndrome (PCOS). Human reproduction. 2004;19(1):41-7.

42.          Hosseini AH, Kohan L, Aledavood A, Rostami S. Association of miR-146a rs2910164 and miR-222 rs2858060 polymorphisms with the risk of polycystic ovary syndrome in Iranian women: A case–control study. Taiwanese Journal of Obstetrics and Gynecology. 2017;56(5):652-6.

پرسشنامه طرح تحقیقاتی بیماران سندرم تخمدان پلی کیستیک (polycystic ovarian syndrome)

نام و نام خانوادگی:

شماره تماس:                                                                             گروه:  case □                  control □

سایر پارامترها:

شناخت جهش های ژنتیکی دخیل در بروز بیماری حاضر می تواند به پیش بینی مکانیسم مولکولی بروز این اختلال و انتخاب درمان مناسب کمک کند

ندارد

تمامی هزینه های طرح حاضر توسط مجری طرح پرداخت شده و در هیچ مرحله ای از پژوهش از بیمار هزینه ای اخذ نمیگردد

اطلاعات بیماران به صورت کاملاً محرمانه حفظ شده و در اختیار هیچ شخص ثالثی قرار نخواهد گرفت

در صورت هر گونه سوال در مورد روند انجام پژوهش با شماره ی زیر تماس حاصل شود:

دکتر رامین سراوانی (استاد راهنمای اول): 09155432609

بیمار حق دارد در هر مرحله از خون دادن امتناع کرده و از مطالعه خارج شود

توضیحات حضوری مجری یا همکاران طرح بابت موافقت بیمار در جهت شرکت در این مطالعه اعلان می شود. و پس از موافقت شفاهی بیمار یک نسخه از این فرم به وی  داده شده و فرصت خواندن آن را دارد