مقایسه فراوانی پلی‌مورفیسم‌های ژن mTOR ، ژن AKT1 و ژن NLRP3 در خون مادر و جفت ومیزان بیان ژنهای mTOR وAKT1 و NLPR3و miR150 و miR223 در جفت زنان باردار مبتلا به پره‌اکلامپسی و گروه کنترل

پره‌اکلامپسی یک سندرم خاص بارداری است که با افزایش فشار خون و پروتئین‌اوری شناخته می‌شود. 8-5 درصد زنان با سابقه‌ی افزایش فشار خون مزمن به این بیماری مبتلا می گردند. پره‌اکلامپسی علت اصلی مرگ و میر زنان باردار در جهان است، پره‌اکلامپسی براساس شدت افزایش فشار خون، پروتئین اوری، سایر یافته های بالینی و آزمایشگاهی اغلب به دو دسته ی ملایم وشدید تقسیم میگردد.

در حال حاضر اصطلاحات پره‌اکلامپسی زود بروز^[1]قبل از هفته 34 بارداری، و دیر بروز^[2] بعد از هفته 34 بارداری یا بعد از آن، برای تقسیم بندی این بیماری بیشتر مورد توجه قرار گرفته است. پره‌اکلامپسی شدید اغلب با افزایش همولیز، سطوح بالای آنزیم های کبدی و کاهش تعداد پلاکت ها همراه است که به نام سندرم HELLP  موسوم است که سهم بسیار مهمی در مرگ و میر مادر و نوزاد دارد(1,3).

مطالعات اپیدمیولوژیک نشان می دهد که ارتباطی بین پره‌اکلامپسی و افزایش خطر ابتلا به بیماری های قلبی – عروقی و سندرم متابولیک در زنان در سنین پیری وجود دارد(3). در مطالعات نشان داده شده است که پره‌اکلامپسی و اکلامپسی با خطر سندرم مرگ ناگهانی شیر خوار همراه است(4).

اتیولوژی پره‌اکلامپسی هنوز مشخص نشده است و به بیماری تئوری ها معروف است، تئوری های احتمالی آن شامل پاسخ ایمنی غیر طبیعی، استعداد ژنتیکی، تغییر در فعالیت پروستاگلاندین ها، صدمه سلولهای اندوتلیال و تهاجم جفتی غیر طبیعی می باشد(5).

عوامل خطر پره‌اکلامپسی شامل: بیماری کلیوی مزمن، فشار خون مزمن، سابقه خانوادگی پره‌اکلامپسی، حاملگی چند قلو، شریک جنسی جدید، سن مادرکمتر از 19 سال و بالاتر از 40 سال، دیابت، ناسازگاری RH ، چاقی، تغذیه، کمبود ویتامین ها و مواد معدنی، عفونت ها و آترواسکلروزیس ، از بین رفتن سد جفتی و ورود تروفوبلاست ها به جریان خون مادر می باشد(6,7).

میزان شیوع پره‌اکلامپسی در ایران براساس مطالعات پراکنده انجام شده، بین 1 تا 8 درصد گزارش شده است. عوارض پره‌اکلامپسی به 2 دسته مادری و جنینی تقسیم می شود. پره‌اکلامپسی منجر به جدا شدن زودرس جفت و اختلالات هماتولوژیک گردیده و باعث صدمه به ارگان های حیاتی می شود (8).

درحال حاضر درمان قطعی برای پره‌اکلامپسی وجود ندارد و زنان بارداری که پره‌اکلامپسی در آن‌ها تشخیص داده شود، تحت کنترل و مراقبت های ویژه قرار می‌گیرند تا سلامت مادر وجنین حفظ شود، در واقع پره‌اکلامپسی-اکلامپسی شدید به همراه دیگر عوارض بارداری بیش از 60 درصد موارد بستری زنان در بخش مراقبت های ویژه را به خود اختصاص می دهند(1).

مطالعات جدید نشان داده است که استرس اکسیداتیو، التهاب و اتوفاژی می تواند در بروز پره اکلامپسی نقش داشته باشد(9,10).

اتوفاژی، در لاتین به معنای خودخواری است یک سیستم تخریب بوسیله ساختارغشای دو لایه که به لیزوزوم تحویل داده می شود. این سیستم نه تنها به عنوان یک پاسخ سازگار در برابر فشارهای مختلف برای تامین موادمغذی وانرژی است بلکه ازتجمع پروتئین های بدتاخورده و ارگانل های آسیب دیده هم جلوگیری می کند. اتوفاژی را می توان در فرایند فاگوسیتوز، پاک سازی اجسام آپوپتوتیک، ترشح، اگزوسیتوز، ارائه آنتی ژن و تنظیم سیگنالینگ التهابی مستقل از تخریب لیزوزومی بسط داد.

در طی فرایند اتوفاژی یک ساختار غشایی دولایه اطراف پروتئین های سیتوپلاسمی و اندامکها را احاطه کرده واتوفاگوزوم را تشکیل می دهد. سپس اتوفاگوزوم با لیزوزوم ادغام شده ومحتویات آن بوسیله آنزیمهای هیدرولاز لیزوزومی تجزیه می شوند. اتوفاژی تحت برخی از شرایط از جمله: گرسنگی، هیپوکسی، استرس اکسیداتیو، عفونت پاتوژن وتحریک هورمونی به طرز چشمگیری تحریک می شود(9).

تنظیم اتوفاژی: یکی از پروتئین های مرکزی تنظیم کننده اتوفاژی mTOR[3] می باشد که یک سرین / ترئونین کیناز است وبا فسفریله وغیرفعال کردن سوبسترا از شروع اتوفاژی جلوگیری می کند.  در شرایط فقرغذایی این کیناز مهارشده واتوفاژی القاء می شود. مولکول های پایین دست mTOR   شامل فسفاتازها وکینازهایی است که وضعیت فسفریلاسیون Atg[4]13 راکنترل می کنند. با غیرفعال شدن mTOR ، Atg13 هیپوفسفریله میشود وکمپلکس شروع اتوفاژی تشکیل میشود. همچنین فقرغذایی منجربه فعال شدن [5]PI3K میشودکه برهمکنش P150 با غشاء را به همراه دارد ، این امر تولید PI3P که برای شکل گیری اتوفاگوزوم لازم است را سبب میشود.

 mTORبه عنوان اتصال دهنده سیگنالهای فاکتور رشد به وضعیت انرژی و سطح مواد مغذی عمل می کند ، در نتیجه متابولیسم پروتئین و رشد سلولی را تعدیل می نماید(11). از جمله تنظیم کننده های mTOR میتوان به پروتئین [6]Akt ، AMPK[7] و [8]PTEN اشاره کرد.

پروتئین Akt یک کیناز است که با فعال کردنmTOR  مانع اتوفاژی میشود.

این آنزیم به‌عنوان پروتئین کیناز B (PKB) نیز شناخته‌شده است و  یک سرین- ترئونین کیناز می‌باشد.

Akt یک جزء جدایی ناپذیر از مسیر سیگنالینگ PI3K / Akt / mTOR بوده و مسیرهای انتقال سیگنال دیگر از قبیل مسیر گیرنده فاکتور رشد اپیدرمی و آبشار سیگنالینگ Wnt را وساطت می کند.

در واقع ، شکل فعال شده Akt ( Akt فسفریله شده) می تواند فاکتورهای پایین دست بسیاری از جمله :NF-κB ، BAD ، GSK-3 ،Wee1 را تنظیم کند(64).

AKT فعال، ممکن است یک سری اثرات بیولوژیکی بر روی سلول ها ایجاد کند، از جمله: بقا، چسبندگی، تحرک، تکثیر و رشد، تحریک بدخیمی سلول ها و پیشرفت تومور

با توجه به نقش مهم AKT در سرطان زایی ، حدس زده می شود که SNP های بالقوه عملکردی در ژن های AKT ممکن است بیان آن را تغییر داده و از این طریق حساسیت ابتلا به سرطان را تغییر دهند (63).

در پستانداران سه ایزوفرم از AKT وجود دارد: AKT1،AKT2 و AKT3که بر روی سه کروموزوم مجزا رمزگذاری شده اند، یک همسانی قابل توجهی داشته و شامل سه ساختار مشترک هستند:

دامنه N- ترمینال همولوگ پلکسترین (PH) ، دامنه کاتالیتیک(KD)  و موتیف هیدروفوبیک تنظیمی C- ترمینال (HM)

دمین های کاتالیزوری وتنظیمی هر دو برای فعالیتهای پروتئین کیناز Akt حیاتی هستند(65).

ژنAKT1 بر روی بازوی بلند کروموزوم 14 (14q32.32) قرار دارد و از 14 اگزون تشکیل شده است.

پلی مورفیسمrs1130233 G/A  بر روی اگزون 8، پلی مورفیسمC/T  rs2494732 بر روی ناحیه اینترون و پلی مورفیسم G/T rs1130214 بر روی ناحیه پروموتری ژن AKT1 قرار دارند.

زمانی که میزان AMP سلول نسبت به ATP بیشتر باشد یعنی سلول در فقر غذایی به سر ببرد آدنوزین مونوفسفات کیناز ((AMPK از طریق LKB1 فعال شده و در نتیجهmTOR  غیرفعال واتوفاژی القا می گردد.

pTEN ، سرکوبگر تومور و لیپید فسفاتاز غشای پلاسمایی است که PIP3 را به PIP2 دفسفریله می کند ، فعال سازی AKT را مهار کرده، و مسیر AKT /mTOR تحت تنظیم منفی قرارمیگیرد(12,13,14).

نقایص اتوفاژی با حساسیت به استرس متابولیک ، آسیب ژنومی و تومورزایی در موش ها دیده شده است که نشان دهنده نقش اتوفاژی در سرکوب تومور است.

در حالی که اتوفاژی مکانیسم سرکوب تومور است ، تحمل استرس را ممکن میسازد، که بقای سلول توموری را در شرایط نامساعد امکان پذیر می کند.

استرس، در سلولهای توموری با متابولیک زیاد وتکثیر سریع سلول همراه است. اتوفاژی ناشی از استرس در سلولهای توموری با رشد مجدد و پیشرفت نهایی تومور می تواند منجر به مقاومت به درمان و نهفتگی تومور شود(15).

اتوفاژی به عنوان شمشیر دو لبه شناخته شده است. در یک مطالعه اخیر  نشان داده شده است که سرکوب مسیر سیگنالینگ mTOR منجر به کاهش توانایی تهاجم سلولهای تروفوبلاست و باعث بروز PE می شود(16).

در مطالعه ای نشان داده شده است که سطح پروتئین mTOR  در بافت جفت موش مبتلا به  PE در مقایسه با موش های طبیعی به طور قابل توجهی کاهش یافته است.این نتایج بیان داشت که خاموش کردن GNG7، مسیر سیگنالینگ mTOR را فعال می کند، که باعث تکثیر و تمایز سلولی و مهار آپوپتوز سیتوتروبوبلاست جفت درموش PE می شود(11). دریک  مطالعه دیگر که بر روی موش انجام گرفت،  مسیر سیگنالینگ mTOR  درموشهای پراکلمپتیک مهار گردید و مشاهده شد که، درعملکرد اندوتلیال عروقی اختلال و در جفت هیپوکسی ایجاد شد.تهاجم تروفوبلاستیک ناکافی ، مهار تکثیر و افزایش آپوپتوز سیتوتروفوبلاستها از دیگرعوارض ایجادشده بود که باعث تشدید پره اکلامپسی شد(11).

با توجه به نقش حیاتی mTOR در حفظ عملکردهای مناسب سلولی، از نظر بیولوژیکی قابل قبول است که تغییرات ژنتیکی در این ژن ممکن است با بیماری های مختلف من جمله: سرطان،صرع،دیابت ملیتوس،بیمارهای عصبی و پره اکلامپسی در ارتباط باشد. لذا پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی (SNP) ژنهای اصلی در مسیر  pTEN /AKT /mTOR  ممکن است بر رونویسی و بیان پروتئین ها تأثیر بگذارد و بنابراین ظرفیت و عملکرد مسیر را تغییر دهد، که می تواند نقش مهمی در بیماری زایی داشته باشد(21).

ژن mTOR انسانی، واقع در کروموزوم 1p36.2 بوده و طول تقریبی 156 کیلوبایت دارد و از 59 اگزون تشکیل شده است(17).

mTOR  به صورت دو کمپلکس 1و2 وجود دارد ( mTORc2، mTORc1).

در ژن mTOR پلی مورفیسم های متعددی شناسایی شده اند که ممکن است دارای اثراتی بر تنظیم فعالیت رونویسی، اتصال miRNA یا اسپلایسینگ اعمال کند. از میان آنها سه پلی مورفیسمrs2295080 (T>G ) در ناحیه پروموتور، rs2536 در ناحیه UTR 3' و rs17036508 (T>C) در ناحیه اسپلایسینگ بیشتر مورد مطالعه قرار گرفته اند(18).

اثر پلی مورفیسم rs2295080 بر تنظیم فعالیت رونویسی مورد مطالعه قرار گرفته است و نشان داده شده است که ژنوتیپ ها TT این پلی مورفیسم با افزایش سطحmRNA  همراه است (19). به علاوه در مطالعه ای دیگر نقشrs2536  در اتصال miRNA نشان داده شده است(20).

تا کنون مطالعه ای در مورد پلی مورفیسم های rs2536 ، rs17036508 و rs2295080 ژن mTOR و

rs1130233 ، rs2494732 و rs1130214 ژنAKT1  و ارتباط این پلی مورفیسم ها وبیان ژنهای مزبور در پره اکلامپسی صورت نگرفته است.

اینفلامازوم­ها[9]، کمپلکس‌های چند پروتئینی سیتوزولیک می‌باشند که معمولاً متشکل از یک مولکول حسگر (برای مثال، گیرنده‌ی شناسایی الگو[10]یا PRR)، پروتئین آداپتور (پروتئین شبه لکه‌ی مرتبط با آپوپتوز حاوی دومین‌های جذب کاسپاز[11](ASC)) کاسپاز-1 پیش التهابی هستند. مولکول‌های حسگر اینفلامازوم مسئول شناسایی و تشخیص الگوهای مولکولی متصل به پاتوژن (PAMPs) و الگوهای مولکولی مرتبط با آسیب/آلارمین ها/ سیگنال‌های خطر درون زا (DAMPs) می‌باشند. در صورت شناسایی، الیگومریزاسیون کمپلکس اینفلامازوم و فعال‌سازی کاسپاز 1 رخ می‌دهد که موجب شروع پاسخ‌های پایین‌دست ازجمله پردازش و آزادسازی IL-1b و IL-18 و نیز پیروپتوز[12]، که فرم لیتیک مرگ سلولی است می‌شود.

قبلاً تصور می‌شد که اینفلامازوم مختص سیگنالینگ ایمنی ذاتی  هستند، ولی، گزارش‌های اخیر نشان داده است که این پلتفرم‌ها موجب بهبود پاسخ‌های ایمنی تطبیقی و اکتسابی  می‌شوند. چندین عضو از خانواده‌ی پروتئین حاوی تکرار غنی از دمین الیگومریزاسیون اتصال نوکلئوتیدی (NLR) به عنوان مولکول‌های حسگر اینفلامازوم، وجود دارند. بنابراین، ابتدا تصور می‌شد که سیگنالینگ یا پیام رسانی NLR، برای فعال‌سازی اینفلامازوم استفاده می‌شود. در نتیجه، اینفلامازوم های وابسته به NLR چندگانه، یعنی پروتئین حاوی دمین پیرین و NLR(NLRP-1) ، NLRP3 و پروتئین-4 حاوی دومین (CARD) جذب و فعال‌سازی کاسپاز از خانواده‌ی NLR(NLRC4) توصیف شده‌اند. اینفلامازوم های واسته به NLR که از مولکول‌های حسگر متناوب نظیر bsent در پیرین و ملانوما-2 مشتق می‌شوند. تاکنون، ویژگی‌های پنج اینفلامازوم مجزا به‌طور دقیق شناخته‌شده‌اند به‌طوری‌که هر یک با مولکول حسگر اختصاصی خود شناسایی می‌شوند: NLRP1, NLRP3, NLRC4, AIM2 و پیرین(34).

شناخته‌شده‌ترین اینفلامازوم ها، اینفلامازوم NLRP3 هستند(35). این اینفلامازوم دارای دو مشخصه‌ی کلیدی است: اول، با طیف وسیعی از مولکول‌های غیر مرتبط فعال می‌شود ازجمله PAMPs و هر دوی DAMP های درونزا و برون‌زا یا آلارمین ها که قبلا' مرور و بررسی شدند(36). دوم، اینفلامازوم NLRP3 در سلول‌های ایمنی ذاتی نظیر ماکروفاژها، نوتروفیل ها و سلول‌های دندریتی و نیز بافت های متعدد به شدت بیان می‌شوند(37). به ویژه، فعال‌سازی کلاسیک یا متعارف اینفلامازوم NLRP3 نیازمند دو مرحله‌ی مجزا است: پرایمینگ و بازسازی.

با توجه به این‌که اجزای اینفلامازوم توسط سلول‌های جفت، که در بالا نیز بررسی شد، بیان می‌شوند، مطالعات اولیه اثبات کرده‌اند که اینفلامازوم ها در پاسخ‌های التهابی مرتبط با بیماری‌های جفتی نقش دارند(34).

Mulla و همکاران(38) و Xie و همکاران(39)، اولین بار اثبات کردند که فعال‌سازی اینفلامازوم NLRP3 در تروفوبلاست ها و خون پیرامونی (محیطی) در پاتوژنز پره اکلامپسی[13] نقش دارند. در واقع، نشان داده شده است که مونوسیت های پیرامونی زنان مبتلا به پره اکلامپسی، بهبود بیان NLRP1 و NLRP3 و پلی مورفیسم در ژن‌های کد کننده‌ی آن‌ها با توسعه‌ی این سندرم مرتبط است، را به دنبال دارد. به‌علاوه، زنان مبتلا به پره اکلامپسی دارای سطح بالایی از کلسترول کل و اسید اوریک، بودند، این‌ها متابولیک‌های سلولی هستند که به عنوان آلارمین در صورت آزادسازی برون سلولی عمل می‌کنند(40) و می‌توانند به‌طور بالقوه موجب فعال‌سازی اینفلامازوم های NLRP3 در لایه‌ی سیتوتروفوبلاست جفت شوند(41). مطالعات توصیفی نیز نشان داده‌اند که جفت [14]زنان مبتلا به پره اکلامپسی شدید، بیان بالاتر NLRP3، کاسپاز-1 و IL-1b در مقایسه با زنان باردار با فشار خون عادی[15]  را نشان می‌دهند. به‌علاوه، مطالعات درون تنی  یک رابطه بین فعال‌سازی اینفلامازوم های NLRP3 جفتی القا شده توسط آلارمین و عوارض بارداری مرتبط باالتهاب جفتی را ارائه کرده‌اند. همسو با این شواهد، مطالعه‌ی اخیر با استفاده از مدل‌های موش و بافت انسان نشان داد که وزیکول‌های برون سلولی مشتق شده از اندوتلیال ، موجب القای فعال‌سازی اینفلامازوم های NLRP3 شده و منجر به تحریک سندرم شبه پره اکلامپسی می‌شوند که این سندرم با مهار و بازدارندگی این مسیر، تضعیف می‌شوند. روی هم رفته، این یافته‌ها حاکی از آن است که فعال‌سازی اینفلامازوم های NLRP3 در فرایندهای التهاب جفت مرتبط با پاتوفیزیولوژی پره اکلامپسی می‌باشند(34).

ژن NLRP3 بر روی کروموزم 1q44 واقع شده است که در آن پلی مورفیسم ها با بیماری‌های التهابی ایمنی نظیر آرتریت روماتوئید مرتبط بوده‌اند. پلی مورفیسم rs10754558 در ̍ 3  منطقه‌ی ترجمه نشده، بر پایداری NLRP3 mRNA اثر می‌گذارد. از همه مهم‌تر این که، NLRP3 rs10754558 با افزایش ترشح IL-1b, مرتبط می باشد که بیان اینفلامازوم آن در سلول‌های ایمنی و سایر سلول‌ها نظیر فیبروبلاست ها مشاهده می‌شود(42).

از سال2007 تاکنون  مطالعات فراوانی در ارتباط با   بیان miRNA ها و بیماری پره اکلامپسی انجام گرفته است به طوریکه میزان بیان miRAN ها در افراد مبتلا به پره اکلامپسی در مقایسه با گروه کنترل متفاوت گزارش شده است.

MicroRNA  ها گروهی از RNA های غیر کد کننده هستند که حدود 25-18  نوکلئوتید طول دارند و پس از رونویسی روی بیان ژن اثر می گذارند.آنها این عمل را از طریق اتصال به توالی مکمل که اغلب در ناحیه  UTR´3  مربوط به ژن هدف واقع شده است انجام می دهند(45).

اغلب ژن های کد کننده miRNA ها در نواحی بین ژنی واقع شده اند، در حالی که برخی از آنها درنواحی درون ژنی قرار گرفته اند. رونویسی اکثر miRNA ها توسط RNA pol II انجام میگیرد در حالی که گروه کوچکی به وسیله  RNA pol III رونویسی می شوند. محصول رونویسی به وسیله هر یک از این دو، miRNA اولیه)  pri-miRNA ) نامیده می شود که شامل کلاهک در ´5 و دم پلی آدنیله می باشد. miRNA ها ابتدا در هسته پردازش می شوند. در این مرحلهpri-miRNA توسط نوعی RNase به نام Drosha و کوفاکتور پروتئینی آن DGCR8 در ناحیه سنجاق سری برش خورده و یک ساختار ساقه حلقه ای، حدودا 70 نوکلئوتیدی را آزاد می کند که miRNA نابالغ نامیده می شود. DGCR8 با قسمت تک رشته ی RNA میانکنش کرده و دروشا را به محل مورد نظر هدایت می کند. سپس miRNA برای پردازش بیشتر توسط اکسپورتین5 به سیتوپلاسم فرستاده می شود(48,49). مرحله دوم پردازش در نتیجه عملکرد(Dicer)  RNAase III انجام گرفته، MicroRNA دو رشته ای 24-21  نوکلئوتیدی تولید می شود. MicroRNA تک رشته ای بعدا در کمپلکس miRISCs قرار می گیرد(45,49,50).

 یک miRNA منفرد در کنترل فرایندهای متنوع سلولی مثل آپوپتوز، رشد و تکثیر سلولی ،تمایز سلولی، سلولهای بنیادی و تکامل نقش دارد.

MicroRNA ها نقش ضروری در توسعه بافتی و پاتوژنز جفت ایفا می کنند. چندین miRNA اختصاصی تروفوبلاست هستند که قادر به تنظیم تهاجم بافتی، تکثیر تروفوبلاست،آنژیوژنز و متابولیسم آهن هستند(46).

از آنجایی که کنترل و تنظیم اتوفاژی نقش مهمی در بروز پره اکلامپسی دارد، مطالعه miRNA هایی که بر روی ژن mTOR اثر می گذارند اهمیت بسزایی در شناخت و کنترل این مسیر دارند. از بین اکثر miRNA هایی که ژن هدفشان mTOR   می باشد، miR150 در سالهای اخیر مورد توجه قرار گرفته است.

موقعیت ژن miR150 19q13.33, و دارای 1 اگزون می باشد.

در مطالعه ای که در سال 2016 توسط Zhi Hong Fang و همکاران انجام گرفت، نشان داده شد که miR150 می تواند به عنوان سرکوبگر تومور از طریق مهار رشد و القای آپوپتوز و کاهش تومورزایی سلولهای لوسمی در مدل موشی عمل نماید(51). 

در مطالعه ای نشان داده شده است که این MicroRNA  با اتصال به جایگاه  3´UTR ژن mTOR ، از بیان این ژن جلوگیری کرده و باعث خاموشی این مسیر می شود.همچنین در این مطالعه نشان داده شده است که پلی مورفیسم rs2536 در این جایگاه ژنی در میزان اتصال miR150 به ژن هدف موثر است(52).

در مطالعه ای بیان پایین این miR در جفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی در مقایسه با زنان باردار طبیعی گزارش شده است(53).

یکی از MicroRNA هایی که در تنظیم بیان مولکولهای دخیل در فرایند التهاب نقش دارند miR223  است که به عنوان تنظیم کننده منفی التهاب از طریق عدم بیان ژن NLRP3 شناخته شده است.

موقعیت ژن miR223، بر روی کروموزوم Xq12 می باشد و دارای 1 اگزون است.

در مطالعه ای بیان پایینmiR223  در جفت و خون زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی در مقایسه با زنان باردار سالم گزارش شده است(53).

مروری بر مطالعات انجام شده

در مطالعه ای که در سال 2017 در چین بر روی 71 بافت هیپوفیز با آدنومای تهاجمی و 66 بافت هیپوفیزی بدون آدنومای تهاجمی انجام شد، نشان داده شده است که فعال شدن مسیر سیگنالینگ mTOR باعث تقویت سلولهای آدنوما تهاجمی هیپوفیز می شود (22). علاوه بر این درمطالعه ای دیگر که در سال 2016 در چین بروی  50 بافت توموری از بیمار مبتلا به گلیوما و 5 بافت طبیعی مغز انجام شد، نشان داده شده است که ، مسیر سیگنالینگ mTOR در تکثیر و آپوپتوز سلولهای گلیوما دخیل است(23).

همچنین ارتباط پلی مورفیسمTOR rs2295080  با ریسک ابتلا به سرطان‌های کلیه(19)، پروستات(20) سینه(24) مشاهده گردید. در مطالعه ای که توسط Xu M و همکاران ( 2013)انجام شد ارتباط آلل G در این جایگاه با کاهش ریسک ابتلا به سرطان معده گزارش گردید.

در مطالعه ای که توسطQiaoxin Li  وهمکاران( 2013) در چین برروی 1004 مورد بیمار و 1051 نمونه کنترل  انجام شد نشان داد که ژنوتیپ CT/CC در این جایگاه ژنی rs2536 با افزایش خطر ابتلا به سرطان پروستات مرتبط است(20) و در مطالعه ای دیگر،که در چین (2016) توسط Zhao وهمکاران بروی 560 بیمار مبتلا به سرطان پستان و 583 فرد سالم انجام شد شواهد نشان داد ارتباطی معنا داری بین این جایگاه ژنی وسرطان سینه وجود ندارد(24).

در متاآنالیزکه  Jianbo Shao وهمکاران(2014) انجام دادند نشان داده شد که پلی مورفیسمهای rs2295080  و rs11121704   ژنmTOR  با خطر سرطان و نتایج بالینی بیماران سرطانی ارتباط وجوددارد و هیچ ارتباطی برای پلی مورفیسم rs2536 یافت نشد(18).

مطالعه ای که توسط Piao وهمکاران(2015) بر روی 1842 نفر جهت  پلی مورفیسم rs1130233 G/A ژن AKT1 انجام شده دیده شدکه این جایگاه ژنی، ریسک ابتلا به سرطان معده را افزایش می دهد(25). همچنین در مطالعه ای که توسط  Zhang وهمکاران (2014) در چین روی 593 بیمارمیتلا به سرطان نازوفارنکس و 480 نفر سالم  انجام شد نشان داد که ژنوتیپ AA، rs1130233 ژن AKT1 با افزایش ریسک ابتلا به سرطان حنجره مرتبط است(26)

در مطالعه‌ای که در سال(2015) در چین برروی 182 بیمار و 207 فرد بدون سابقه بیماری جهت تعیین پلی مورفیسم rs1130214 ژن AKT1 انجام شد دیده شد که ژنوتیپ GT/TT وآللT در این جایگاه با افزایش ریسک ابتلا به سرطان سلول های سنگفرشی مری مرتبط است(27).

در مطالعه ای که YUE Xin و همکاران در سال (2015) در چین روی 116 کودک مبتلا و 503 کودک سالم انجام دادند، ارتباط معنی داری بین  پلی مورفیسم  rs2295080 ژنmTOR  و بیماری صرع مشاهده نشد. همچنین اختلاف معنی داری بین پلی مورفیسم rs2536 و صرع  مشاهده نشد ، اما فراوانی آلل G  rs2536 در کودکان مبتلا به صرع نسبت به گروه کنترل بیشتر بود(28).

در مطالعه ای که Zhu AN و همکاران در سال (2015) در چین روی 89 فرد دیابتی نوع II بدون نفروپاتی و134 فرد دیابتی نوع II همراه با نفروپاتی و 120 فرد سالم  انجام دادند بین پلی مورفیسم های rs9674559 و rs7211818  ژن mTOR و دیابت نوع II ارتباط معنی داری مشاهده نگردید. اما بین پلی مورفیسم rs7212142  ژن mTOR  ونفروپاتی دیابتی نوع II ارتباط معنی داری وجود داشت(29).

در مطالعه ای که Yang C و همکاران در سال (2012) در چین روی 401 مبتلا به اختلال افسردگی انجام دادند، نتایج نشان داد که بین علائم اضطراب وفکر خودکشی در بیماران افسرده و پلی مورفیسم rs2494746 ژن AKT1  ارتباط معنی داری وجود داشت(30).

در مطالعه ای که Arámbul-Carrillo CE و همکاران در سال (2015) در مکزیکو روی 70 بیمار دیابت نوع II و 129 فرد سالم انجام دادند بین پلی مورفیسم rs1130214 ژن AKT1 و دیابت نوع II ارتباط معنی داری مشاهده کردند(31).

در مطالعه ای که توسط Weel و همکاران در کشور چین و در سال 2017 انجام گرفت نتایج حاصله نشان داد که میزان بیان NLRP3 در جفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی بالاتر بود که نشان دهنده نقش NLRP3 در حالت التهابی بیش از حد، در پره اکلامپسی می باشد(43).

 در مطالعه ای که توسط Xu و همکاران که بر روی 1024 فرد مبتلا به پره اکلامپسی و 1194 گروه کنترل در کشور چین انجام گرفت نتایج حاصله نشان دهنده وجود تفاوت معنی داری در فراوانی ژنوتیپی پلی مورفیسم NLRP3 rs10754558  بین بیماران مبتلا به پره اکلامپسی و زنان باردار سالم بود.(42)

در مطالعه ای که توسط Pontillo و همکاران بر روی 286 بیمار برزیلی مبتلا به پره اکلامپسی و 309 فرد سالم انجام گرفت نتایج حاصله نشان دهنده عدم وجود رابطه معنا دار بین پلی مورفیسم NLRP3 rs10754558 و ریسک ابتلا به بیماری پره اکلامپسی بود(44).

تا کنون مطالعه ای در مورد پلی مورفیسم های  rs10754558و rs4612666 ژن  NLRP3و ارتباط این پلی مورفیسم ها وبیان ژن مزبور در پره اکلامپسی صورت نگرفته است.

مطالعه ای که در سال 2018 Shao Jie Wu و همکاران انجام دادند دریافتند که بیانmiR150  در سلولهای NK/T بافتهای لنفوم به طور قابل توجهی کاهش یافته که با مقاومت درمانی و افزایش حساسیت به درمان با اشعه همراه است(54).

در مطالعه ای که در سال 2018 توسط Lei Cheng و همکارانش بر روی  1002بیمار سرطان معده در چین  انجام گرفت، بین پلی مورفیسم rs2536 ژن mTOR و خطر مرگ برای بیماران ارتباط معنی داری مشاهده کردند (p=.022). همچنین در این مطالعه ارتباط معنی داری بین پلی مورفیسمrs2536  و میزان اتصال بهmiR150  مشاهده کردند(52).

مطالعات دیگری بر روی اثرmiR150  و بیماری هایی مثل لوسمی (رده سلولی T)، لنفوم (55) و بیولوژی آدیپوسیت(56) انجام شده است.

تاکنون مطالعه ای در مورد ارتباط میزان بیان miR150 در بافت جفت و پلی مورفیسم rs2536 ژن mTOR در پره اکلامپسی صورت نگرفته است.

در مطالعه ای که در سال 2019 توسط Liangqi Chen و همکاران صورت گرفت نشان داده شد که بیان miR223 در موشهای میوکاردیت خودایمنی تجربی به طور قابل توجهی از موشهای عادی کمتر بود و نقش miR223 را درتنظیم تحمل میوکاردیت خود ایمنی نشان داد(57).

در مطالعه ای دیگر در سال 2019 Bin Wang و همکاران اثر miR223 را در جلوگیری از آسیب مغزی پس از تشنج تب، را در موش نشان دادند(58).

اثرmiR223  در بیماری های دیگری مثل سرطان پستان (59)، آسیب حاد ریه (60)، آسم(61)، التهاب کبد(62)  بررسی شده است.

تا کنون مطالعه ای در مورد ارتباط میزان بیانmiR223  در بافت جفت و پلی مورفیسم rs10754558 ژن NLRP3 در پره اکلامپسی صورت نگرفته است.

فراوانی پلی مورفیسم های  rs2295080،  rs17036508 و rs2536 ژن mTOR درجفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد متفاوت است

فراوانی پلی مورفیسم های  rs2295080،  rs17036508 و rs2536 ژن mTOR در خون زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد متفاوت است

فراوانی پلی مورفیسم rs1130214 ، rs2494732  و rs1130233   ژن AKT1 درجفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد متفاوت است

فراوانی پلی مورفیسم rs1130214 ، rs2494732  و rs1130233   ژن AKT1 در خون  زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد متفاوت است

میزان بیان ژن mTOR درجفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد متفاوت است

میزان بیان ژن AKT1 در جفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد متفاوت است

میزان بیان ژن mTORبا پلی مورفیسم های  rs17036508 ،  rs2295080 و rs2536 ژن mTOR در جفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد ارتباط دارد.

میزان بیان ژن AKT1 با پلی مورفیسم های rs1130214  ، rs2494732 و rs1130233   ژن AKT1 در جفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد ارتباط دارد.

فراوانی پلی مورفیسم rs10754558 و rs4612666 ژن NLRP3 درجفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد متفاوت است

فراوانی پلی مورفیسم rs10754558 و rs4612666 ژن NLRP3 درخون زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد متفاوت است

میزان بیان ژن NLRP3 درجفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد متفاوت است

میزان بیان ژن NLRP3 با پلی مورفیسم rs10754558 و rs4612666 ژن NLRP3 در جفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد ارتباط دارد.

میزان بیان ژن miR150  در جفت زنان باردار مبتلا به پراه اکلامپسی و گروه شاهد متفاوت است

میزان بیان ژن miR150 با میزان بیان ژن mTOR در جفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی ارتباط دارد.

میزان بیان ژن miR150 با میزان بیان ژن mTOR در جفت زنان باردار گروه شاهد ارتباط دارد.

میزان بیان ژن miR223  در جفت زنان باردار مبتلا به پراه اکلامپسی و گروه شاهد متفاوت است

میزان بیان ژن miR223 با میزان بیان ژن NLRP3 در جفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی ارتباط دارد.

میزان بیان ژن miR223 با میزان بیان ژن NLRP3 در جفت زنان باردار گروه شاهد ارتباط دارد.

مقایسه فراوانی پلی‌مورفیسم‌های ژن mTOR  ، AKT1  و NLRP3 در خون  مادر و جفت ومیزان بیان ژنهای  mTOR وAKT1 و NLPR3وmiR150 و miR223 در جفت زنان باردار مبتلا به پره‌اکلامپسی و گروه کنترل

مقایسه  فراوانی پلی مورفیسم های  rs2295080،  rs17036508 و rs2536 ژن mTOR درجفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد

مقایسه  فراوانی پلی مورفیسم های  rs2295080،  rs17036508 و rs2536 ژن mTOR درخون زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد

مقایسه فراوانی پلی مورفیسم rs1130214 ، مورفیسمrs2494732  و rs1130233   ژن AKT1 درجفت  زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد

مقایسه فراوانی پلی مورفیسم rs1130214 ، مورفیسمrs2494732  و rs1130233   ژن AKT1 در خون  زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد

مقایسه میزان بیان ژن mTOR درجفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد

مقایسه میزان بیان ژن AKT1 در جفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد

تعیین ارتباط بین بیان ژن  mTOR با پلی مورفیسم های rs17036508 ،  rs2295080 و rs2536 ژن mTOR در جفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد

تعیین ارتباط بین بیان ژن AKT1با پلی مورفیسم های rs1130214  ، rs2494732 و rs1130233   ژن AKT1 در جفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد

مقایسه فراوانی پلی مورفیسم rs10754558 و rs4612666 ژن NLRP3 درجفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد

مقایسه فراوانی پلی مورفیسم rs10754558 و rs4612666 ژن NLRP3 درخون زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد

مقایسه میزان بیان ژن NLRP3 درجفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد

تعیین ارتباط پلی مورفیسم rs10754558 و rs4612666 ژن NLRP3 با بیان این ژن در جفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد

مقایسه میزان بیان ژن miR150  درجفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد

تعیین ارتباط میزان بیان ژن miR150 با میزان بیان ژن mTOR در جفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی

تعیین ارتباط میزان بیان ژن miR150 با میزان بیان ژن mTOR در جفت زنان باردار گروه شاهد

مقایسه میزان بیان ژن miR223 درجفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد

تعیین ارتباط میزان بیان ژن miR223 با میزان بیان ژن NLRP3 در جفت زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی

تعیین ارتباط میزان بیان ژن miR223 با میزان بیان  ژن NLRP3 در جفت زنان باردار گروه شاهد

دانشگاه علوم پزشکی زاهدان

پره اکلامپسی: سندرم خاص بارداری است که با افزایش فشار خون و پروتئین اوری شناخته می شود

پلی مورفیسم: چند شکلی تک نوکلئوتیدی، جایگزینی از یک نوکلئوتید منفرد است که در یک موقعیت خاص در ژنوم رخ می دهد.

اتوفاژی: در لاتین به معنای خودخواری است، مکانیسم طبیعی تنظیم شده سلول است که اجزای غیر ضروری یا آسیب دیده آن را از بین می برد.

اینفلامازوم: سیستم های چند پروتئینی سیتوپلاسمی که منجر به مرگ سلولی (پیروپتوز) می شوند.

موردی- شاهدی(case –control  (

کلیه زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی مراجعه کننده به بیمارستان علی ابن ابیطالب زاهدان پس از شروع طرح به عنوان گروه بیمار و زنان باردار سالم مراجعه کننده به عنوان گروه شاهد انتخاب و وارد مطالعه می شوند. افراد مبتلا به پره اکلامپسی و گروه شاهد از نظر سن و BMI   همسان سازی می گردند.

شرایط خروج از مطالعه در گروه بیمار و شاهد:  کلیه افراد مبتلا به هریک از بیماری های سیستمیک، دیابت، کبدی، عفونی ، قلبی، کلیوی، لوپوس از مطالعه حذف می شوند.

افراد مبتلا به حاملگی 2 یا چند قلو و یا جنین مبتلا به مول هیداتیدیفرم و هیدروپس جنینی، از مطالعه حذف می گردند . پس از توجیه بیماران در مورد مطالعه و کسب رضایت آگاهانه از ایشان ابتدا اطلاعات مربوط در فرم اطلاعاتی ثبت می شود .

 برای بررسی بیان ژن و بررسی ارتباط پلی مورفیسم ها با بیان ، جفت حداقل 120 بیمار مبتلا به پره اکلامپسی و حداقل به همان تعداد گروه کنترل در نظر گرفته شده است .

برای بررسی پلی مورفیسم ژنهای  mTOR وAKT1 وNLRP3  درخون مادران ،حداقل 250 نمونه خون تام برای هر گروه بیمار و کنترل در نظر گرفته شده است.

با توجه به محدودیت های موجود در نمونه گیری ، نمونه گیری در مدت یک سال از کلیه زنان باردار مبتلا به پره اکلامپسی مراجعه کننده به بیمارستان علی ابن ابی طالب (ع) زاهدان انجام خواهد گرفت.

نمونه گیری آسان و در دسترس برای نمونه های شاهد و کنترل

از طریق تشخیص بالینی و انجام آزمایشات واقدامات پاراکلینیک وپرکردن فرم اطلاعاتی مربوطه برای هر فرد، برای تعیین ژنوتیپ ها از روش PCR_RFLP  و سنجش بیان ژن از روش Real Time PCR

این مطالعه مورد شاهدی بر روی مراجعین به بیمارستان علی ابن ابیطالب شهر زاهدان انجام می گیرد. کلیه زنان زایمان کرده که جهت ایشان تشخیص پره اکلامپسی گذاشته شده وارد گروه مورد مطالعه، و کلیه زنان با نتیجه طبیعی حاملگی وارد گروه شاهد می شوند . تشخیص پره اکلامپسی براساس فشار خون مساوی یا بیشتر از 90/140 میلی متر جیوه بعد از هفته بیست حاملگی و پروتئینوری 300 میلی گرم یا بیشتر در 24 ساعت یا +1 یا بیشتر ( در تست نواری ادرار) در نمونه تصادفی ادرار می باشد .

افراد مبتلا به حاملگی 2 یا چند قلو و بیماران مبتلاء به دیابت، بیماری کلیوی، بیماری کبدی ، کلیه بیماریهای سیستماتیک و لوپوس و غیره و یا جنین مبتلا به مول هیداتیدیفرم و هیدروپس جنینی از مطالعه حذف می شوند. پس از توجیه بیماران در مورد مطالعه و کسب رضایت آگاهانه از ایشان ابتدا اطلاعات مربوط در فرم اطلاعاتی ثبت می شود.

1- از بافت جفت هر فرد mRNA  با استفاده از کیت  ، استخراج می شود و سپس با استفاده از کیت اختصاصی، سنتز cDNA صورت می گیرد. همچنین بیان ژن های mTOR وAKT1 وNLRP3  با روشReal Time PCR  بررسی می شود و نسبت بیان آن در گروه ها ارزیابی می گردد. برای استخراجmRNA  و سنتزcDNA  miR150 و miR223 از کیت اختصاصی استخراج و سنتز cDNA برای miRNA ها استفاده می شود و سپس بیان آن دو با روشReal Time PCR  بررسی می شود.

استخراج RNA به صورت زیر انجام خواهدگرفت:

حدود 80 میلی گرم بافت را وزن کرده و پس از 3 بار شست‌و‌شو با بافرPBS  تا حدی که خون داخل بافت خارج گردد،به صورت دستی کاملا هموژن خواهیم کرد.

  1 سی‌سی محلول RNX- PLUS سرد را به تیوب‌های حاوی بافت هموژن اضافه و حدود 30 ثانیه ورتکس کرده و حدود 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه خواهد شد.

200 میکرولیتر کلروفورم را به نمونه اضافه و ورتکس کوتاهی انجام خواهیم داد.

تیوب‌ها را 15 دقیقه در دور12000RPM  سانتریفیوژ خواهیم کرد.(سانتریفیوژ 4درجه سلسیوس)

دوسوم فاز رویی را به یک میکروتیوب5/1 RNase-free منتقل کرده و هم حجم آن محلول ایزوپروپانول به تیوب‌ها اضافه و مخلوط کرده و به مدت 1 ساعت در دمای 20-درجه سلسیوس قرار خواهدگرفت.

تیوب‌ها به مدت 15 دقیقه در دور 12000RPM سانتریفیوژ خواهدگردید. (سانتریفیوژ 4درجه سلسیوس) محلول رویی را دور ریخته و به میزان 1سی‌سی اتانول 75 درصد به تیوب‌ها اضافه و رسوب ته تیوب‌ها جدا خواهد شد.

 تیوب‌ها به مدت 8 دقیقه در دورRPM  8000 سانتریفیوژ خواهدگردید. (سانتریفیوژ 4درجه سلسیوس) محلول رویی را دور ریخته و تیوب‌ها را به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق قرار خواهیم داد تا اتانول ته تیوب‌ها کاملا حذف گردد.

10-50  میکرولیتر آب فاقد نوکلئاز(DEPC)  به تیوب‌ها اضافه خواهدگرد. DNA  موجود با اضافه کردن DNaseI حذف خواهد شد.

2- از خون هر فرد مورد مطالعهDNA  به روش salting out استخراج گردیده و سپس با استفاده از تکنیک PCR-RFLP، ژنوتیپ های پلی مورفیسم های ژنهای mTOR و AKT1  و NLRP3  تعیین می گردد

حدود 80 میلی گرم بافت را وزن کرده و پس از 3 بار شست‌و‌شو با بافرPBS تا حدی که خون داخل بافت خارج گردد،به صورت دستی کاملا هموژن خواهیم کرد.

بافت خرد شده را به میکروتیوب 5/1 میلی لیتر انتقال داده و به هر میکروتیوب 180 میکرولیتر بافر تخریب اضافه نموده سپس در هر میکروتیوب 20 میکرولیتر پروتئینازK خواهیم ریخت. ابتدا حدود20 ثانیه کاملا ورتکس و اسپین نموده و به مدت 3 ساعت در بن‌ماری 56 درجه سلسیوس خواهیم گذاشت. در این مدت هر15 دقیقه تیوب‌ها را به مدت 15 ثانیه ورتکس نموده تا بافت در این مدت کاملا تخریب گردد.

تیوب‌ها را به مدت 10 ثانیه کاملا اسپین کرده،به هرتیوب به میزان200 میکرولیتر بافر اتصال کیت را ریخته و آن‌ها را به مدت 15 دقیقه در آون 70درجه سلسیوس قرار خواهیم داد.

 بعد از این مرحله تیوب‌ها از حالت کلوئیدی به حالت شفاف و رنگ زرد تا نارنجی در‌خواهندآمد. در ادامه به هر تیوب 200 میکرولیتر اتانول مطلق اضافه و به مدت 10 ثانیه ورتکس خواهیم کرد.

 به تعداد تیوب‌ها ستون‌های اتصال که در تیوب‌های 2 میلی لیتر قرار دارند،برداشته و با دقت محتویات هر تیوب را به داخل ستون منتقل خواهیم کرد.

 ستون‌ها را به مدت یک دقیقه با دور RPM 8000 ،سانتریفوژ کرده در ادامه ستون‌ها را یکی یکی و با دقت به تیوب‌ها2 میلی لیتری جدید منتقل کرده و تیوب‌های قبلی را دور خواهیم انداخت.

10-200 میکرولیتر بافر شست‌و‌شوی 1 را به ستون‌ها اضافه خواهیم کرد.

ستون‌ها را مدت 1 دقیقه در دور RPM 8000 سانترفیوژ کرده در ادامه دوباره ستون‌ها را یکی یکی و با دقت به تیوب‌ها2 میلی لیتری جدید منتقل کرده و تیوب‌های قبلی را دور انداخته و 500 میکرولیتر بافر شست‌و‌شوی 2 را به ستون‌ها اضافه خواهیم کرد.

ستون‌ها را 3 دقیقه در RPM 14000 سانترفیوژ کرده در ادامه ستون‌ها را یکی یکی و با دقت به تیوب‌ها5/1 میلی لیتری جدید منتقل کرده و تیوب‌های قبلی را دور خواهیم انداخت.

 200میکرولیتر بافر رهاسازی را داخل ستون(حتی المقدور وسط ستون) ریخته در تیوب‌ها را بسته و حدود 5 دقیقه در دمای اتاق قرار داده تا بافر کاملا جذب ستون گردد.

ستون ها را 1 دقیقه در RPM 13000 سانتریفیوژ کرده در پایان ستون‌ها را دور انداخته و محلول زیر ستون که در تیوب‌های 5/1 هست حاوی DNA می‌باشد.

 DNA استخراج شده را به مدت 12 ساعت (یک شب) در انکوباتور37درجه سلسیوس قرار داده تا DNA کاملا حل گردد DNA حاصل را در دمای 20- درجه نگهداری خواهیم کرد.

برای انجام آزمون های آماری از نرم افزار SPSS-23  استفاده می گردد. ابتدا آماره های توصیفی شامل فراوانی ، درصد، میانگین و انحراف معیار مورد بررسی قرار می گیرند . برای مقایسه متغیرهای کمی بین دو گروه در صورت نرمال بودن داده ها ، از آزمون T-test ودر صورت غیرنرمال بودن داده ها از تست Mann Whitney استفاده می شود. برای مقایسه متغیرهای کیفی از آزمون کای اسکوئر/ دقیق فیشر استفاده می شود. جهت بررسی اثر ژنوتیپ ها بر ریسک ابتلا به بیماری ، آزمون Binary logistic regression  انجام می شود( محاسبه پارامتر OR Odds Ratios با فاصله اطمینان 95% و P value  کمتر از 0.05 معنی دار در نظر گرفته می شود).

راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش‌های علوم پزشکی 

دارای آزمودنی انسانی

1. هدف اصلی هر پژوهش‌باید ارتقای سلامت انسان‌ها توأم با رعایت کرامت و حقوق ایشان باشد.
2. در پژوهش بر آزمودنی انسانی، سلامت و ایمنی فرد فرد آزمودنی‎ها در طول و بعد از اجرای پژوهش، بر تمامی مصالح دیگر اولویت دارد. هر پژوهشی که بر روی آزمودنی انسانی انجام می‌گیرد، باید توسط افرادی طراحی و اجرا شود که تخصص و مهارت بالینی لازم و مرتبط را داشته باشند. در کارآزمایی‌های بالینی  بر روی بیماران یا داوطلب‌های سالم نظارت پزشک دارای مهارت و دانش متناسب الزامی است.
3. پژوهش بر انسان فقط در صورتی توجیه‌پذیر است که منافع بالقوه‌ی آن برای هر فرد آزمودنی بیش‌تر از خطرهای  آن باشد. در پژوهش‌های دارای ماهیت غیر درمانی، سطح آسیبی که آزمودنی در معرض آن قرار می‌گیرد نباید بیش‌تر از آن‌چه باشد که مردم عادی در زندگی روزمره‌ی خود با آن مواجه می‌شوند. حصول اطمینان از این امر برعهده‌ی طراحان، مجریان و همکاران پژوهش و تمامی شوراهای بررسی یا پایش‌کننده‌ی پژوهش از جمله کمیته‌ی اخلاق در پژوهش‌ است.

4. مواردی از قبیل سرعت، سهولت کار، راحتی پژوهشگر، هزینه‌ی پایین‌تر و/ یا صرفاً عملی بودن آن به هیچ وجه نباید موجب قرار دادن آزمودنی در معرض خطر یا زیان افزوده یا تحمیل هر گونه محدودیت اختیار اضافی به وی شود.
5. قبل از آغاز هر پژوهش پزشکی ، باید اقدامات  اولیه جهت به حداقل رساندن زیان احتمالی وارده به آزمودنی‌ها و تامین سلامت آن‌ها انجام گیرد.

7-        اگر در حین اجرای پژوهش مشخص شود که خطرات شرکت در این پژوهش برای آزمودنیها بیش از فواید بالقوهی آن است، باید آن پژوهش بلافاصله متوقف شود.

9-         در پژوهشهای پزشکی که ممکن است به محیط زیست آسیب برسانند، باید احتیاطهای لازم در جهت حفظ و نگهداری و عدم آسیب رسانی به محیط ریست انجام گیرد.

11-       کمیته ی اخلاق در پژوهش علاوه بر بررسی و تصویب طرحنامه و دستورالعمل، این حق را دارد که طرحها را در حین و بعد از اجرا را از نظر رعایت ملاحظات اخلاقی مورد پایش قرار دهد. اطلاعات و مدارکی که برای پایش از سوی کمیتهی اخلاق درخواست میشود، باید از سوی پژوهشگران در اختیار این کمیته گذاشته شود.   

12-       انتخاب آزمودنیهای بالقوه از میان جمعیت بیماران یا هر گروه جمعیتی دیگر، باید منصفانه باشد، بهنحوی که توزیع بارها (خطرات یا هزینهها) و منافع شرکت در پژوهش، در آن جمعیت و کل جامعه، تبعیضآمیز نباشد.

13-       کسب رضایت آگاهانه و آزادانه در هر پژوهشی که بر روی آزمودنی انسانی اجرا میشود، الزامی است. این رضایت باید به شکل کتبی باشد. در مواردی که اخذ رضایت آگاهانهی کتبی غیر ممکن یا قابل صرفنظر باشد، باید موضوع با ذکر دلایل به کمیتهی اخلاق منتقل شود. در صورت تأیید کمیتهی اخلاق، اخذ رضایت کتبی قابل تعویق یا تبدیل به رضایت شفاهی یا ضمنی خواهد بود.

14-       اگر در طول اجرای پژوهش تغییری در نحوه اجرای پژوهش داده شود یا اطلاعات جدیدی به دست آید که احتمال داشته باشد که بر تصمیم آزمودنی مبنی بر ادامهی شرکت در پژوهش تاثیر گذار باشد، باید موضوع به اطلاع کمیتهی اخلاق رسانده شود و در صورت موافقت کمیته با ادامهی پژوهش، مراتب به اطلاع آزمودنی رسانده شود و رضایت آگاهانه مجددا اخذ گردد.

15-       پژوهشگر باید از آگاهانه بودن رضایت اخذشده اطمینان حاصل کند. برای این منظور، در تمامی پژوهشهای پزشکی، اعم از درمانی و غیردرمانی، پژوهشگر موظف است فرد در نظر گرفته شده بهعنوان آزمودنی را از تمامی اطلاعاتی که میتوانند در تصمیمگیری او مؤثر باشند، بهنحو مناسبی آگاه سازد. این اطلاعات مشتملند بر: عنوان و اهداف پژوهش، طول مدت پژوهش، روشی که قرار است بهکار گرفته شود (شامل احتمال تخصیص تصادفی به گروهمورد یا شاهد)، منابع تأمین بودجه، هر گونه تعارض منافع احتمالی، وابستگی  سازمانی پژوهشگر، و فواید و زیانهایی که انتظار میرود مطالعه در بر داشته باشد. همچنین، هر آزمودنی باید بداند که میتواند هر لحظه که بخواهد از مطالعه خارج شود و باید دربارهی خطرات و زیانهای بالقوهی ناشی از ترک زودرس پژوهش آگاه و پشتیبانی شود. پژوهشگر همچنین باید به تمامی سؤالات و دغدغههای این افراد، با حوصله و دقت پاسخ بدهد. این موارد باید در رضایتنامهی آگاهانه منعکس شود.

16-       پژوهشگر باید از آزادانه بودن رضایت اخذ شده اطمینان حاصل کند. رفتارهایی که به هر نحوی متضمن تهدید، اغوا، فریب و یا اجبار باشد موجب ابطال رضایت آزمودنی میشود. به فرد باید فرصت کافی برای مشاوره با افرادی که مایل باشد – نظیر اعضای فامیل یا پزشک خانواده - داده شود. همچنین، در پژوهشهایی که پژوهشگر مقام سازمانی بالاتری نسبت به آزمودنی  داشته باشد، دلایل این شیوهی جذب آزمودنی، باید توسط کمیتهی اخلاق  تأیید شود، در این موارد شخص ثالث و معتمدی باید رضایت را دریافت کند.

17-       پژوهشگر ارشد مسؤول مستقیم ارائهی اطلاعات کافی و به زبان قابل فهم برای آزمودنی ، اطمینان از درک اطلاعات ارائه شده، و اخذ رضایت آگاهانه است. در مواردی که بنا بهدلیلی، نظیر زیاد بودن تعداد آزمودنیها، این اطلاعرسانی از طریق شخص دیگری انجام میگیرد، این پژوهشگر ارشد است که مسؤول انتخاب فردی آگاه و مناسب برای این کار و حصول اطمینان از تأمین شرایط مذکور در این بند است.

18-       در پژوهشهایی که از مواد بدنی (شامل بافتها و مایعات بدن انسان)  یا دادههایی استفاده میشود که هویت صاحبان آنها معلوم یا قابل کشف و ردیابی است، باید برای جمعآوری، تحلیل، ذخیره‎سازی و /یا استفادهی مجدد از آنها رضایت آگاهانه گرفته شود. در مواردی که اخذ رضایت غیرممکن باشد یا اعتبار پژوهش را خدشهدار کند، میتوان در صورت بررسی مورد و تصویب کمیتهی اخلاق ، از دادهها یا مواد بدنی ذخیره شده، بدون اخذ رضایت آگاهانه استفاده کرد.

19-       عدم قبول شرکت در پژوهش، یا ادامه ندادن به همکاری، نباید هیچگونه تأثیری بر خدمات درمانی که در همان مؤسسه – نظیر بیمارستان – به فرد ارائه میشود، داشته باشد. این موضوع باید در فرایند اخذ رضایت آگاهانه، به آزمودنی اطلاع داده شود.

20-       در مواردی که آگاه کردن آزمودنی دربارهی جنبهای از پژوهش باعث کاهش اعتبار پژوهش می شود، ضرورت اطلاعرسانی ناکامل از طرف پژوهشگر باید توسط کمیتهی اخلاق تأیید شود. بعد از رفع عامل این محدودیت، باید اطلاعرسانی کامل به آزمودنی انجام گیرد.

21-       برخی از افراد یا گروههایی از مردم، نظیر ناتوانان ذهنی، کودکان، جنین و نوزاد، بیماران اورژانسی، یا زندانیانکه ممکن است بهعنوان آزمودنی در پژوهش شرکت کنند، نمیتوانند برای دادن رضایت، آگاهی یا آزادی لازم را داشته باشند. این افراد یا گروهها آسیبپذیر دانسته میشوند و باید مورد حفاظت ویژه قرار گیرند.

22-       از گروههای آسیبپذیر هیچگاه نباید (به دلایلی چون سهولت دسترسی ) به عناون آزمودنی ترجیحی استفاده شود. پژوهش پزشکی با استفاده از گروهها یا جوامع آسیبپذیر تنها در صورتی موجه است که با هدف پاسخگویی به نیازهای سلامت و اولویتهای همان گروه یا جامعه طراحی و اجرا شود و احتمال معقولی وجود داشته باشد که همان گروه یا جامعه از نتایج آن پژوهش سود خواهد برد.

23-       در پژوهش بر روی گروههای آسیبپذیر، وظیفهی اخذ رضایت آگاهانه مرتفع نمیشود. در مورد افرادی که سرپرست قانونی دارند، پژوهشگر موظف است که علاوه بر اخذ رضایت آگاهانه از سرپرست قانونی، متناسب با ظرفیت خود فرد، از وی رضایت آگاهانه اخذ کند. در هر حال، باید به امتناع این افراد از شرکت در پژوهش احترام گذاشته شود.

24-       اگر در حین اجرای پژوهش، آزمودنی دارای ظرفیت، ظرفیت خود را از دست بدهد یا آزمودنی فاقد ظرفیت، واجد ظرفیت شود، باید با توجه به تغییر حاصله، رضایت آگاهانه برای ادامهی پژوهش از سرپرست قانونی یا خود فرد اخذ شود. 

25-       پژوهشگر مسؤول رعایت اصل رازداری و حفظ اسرار آزمودنیها و اتخاذ تدابیر مناسب برای جلوگیری از انتشار آن است. همچنین، پژوهشگر موظف است که از رعایت حریم خصوصی آزمودنیها در طول پژوهش اطمینان حاصل کند. هرگونه انتشار دادهها یا اطلاعات بهدست آمده از بیماران باید بر اساس رضایت آگاهانه انجام گیرد.

26-       هر نوع آسیب یا خسارت ناشی از شرکت در پژوهش باید بر طبق قوانین مصوب جبران خسارت شود. این امر باید در هنگام طراحی پژوهش لحاظ شده باشد. نحوهی تحقق این امر ترجیحاً بهصورت پوشش بیمهای نامشروط باشد.

27-       در پایان پژوهش، هر فردی که بهعنوان آزمودنی به آن مطالعه وارد شده است، این حق را دارد که دربارهی نتایج مطالعه آگاه شود و از مداخلات یا روشهایی که سودمندیشان در آن مطالعه نشان داده شده است، بهرهمند شود.

28-       پژوهشگران موظفند که نتایج پژوهشهای خود را صادقانه ، دقیق، و کامل منتشر کنند. نتایج، اعم از منفی یا مثبت، و نیز منابع تأمین بودجه، وابستگی  سازمانی، و تعارض منافع – در صورت وجود – باید کاملاً آشکارسازی شوند. پژوهشگران نباید در هنگام عقد قرارداد انجام پژوهش، هیچ  گونه شرطی را مبنی بر حذف یا عدم انتشار یافتههایی که از نظر حمایت کنندهی پژوهش  مطلوب نیست، بپذیرند.

29-       نحوهی گزارش نتایج پژوهش باید ضامن حقوق مادی و معنوی تمامی اشخاص مرتبط با پژوهش، از جمله خود پژوهشگر یا پژوهشگران، آزمودنیها و مؤسسهی حمایت کنندهی  پژوهش باشد.

30-       گزارشها و مقالات حاصل از پژوهشهایی که مفاد این راهنما را نقض کردهاند، نباید برای انتشار پذیرفته شوند.

31-       روش پژوهش نباید با ارزشهای احتماعی، فرهنگی و دینی  جامعه در تناقض باشد.

راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی

راهنمای عمومی

1- پژوهشگر باید به این امر مهم توجه داشته باشد که بافت‌ها و اعضای مورد استفاده، دارای منشأ انسانی‌اند و کرامت انسانی اقتضا می‌کند که جمع‌آوری، نگه‌داری، استفاده و نابودسازی آن‌ها توأم با رعایت ملاحظات و شؤون مرتبط باشد.

2- از اجزای بدنی دارای منشأ انسانی باید تنها در پژوهش‌هایی استفاده شود که اهداف ارزشمندی را در راستای مبارزه با بیماری‌ها و ارتقای سلامت انسان‌ها دنبال می‌کنند.

3- تمامی پژوهش‌ها بر روی عضو و بافت انسانی، پیش از اجرا، باید مورد تأیید کمیته‌ی اخلاق در پژوهش مرتبط قرار گیرد. کمیته‌ی اخلاق در پژوهش حق دارد که در تمامی مراحل پژوهش بر آن نظارت داشته باشد. پژوهشگران باید در این زمینه با کمیته‌ی اخلاق در پژوهش همکاری کنند.

4- رضایت آگاهانه‌ی فرد دهنده‌ی عضو یا بافت، یا جانشین قانونی او، شرط اساسی در تأیید اخلاقی هر پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی است. رضایت‌نامه باید با رعایت تمامی اصول مرتبط تهیه و هنگام ارسال طرح‌نامه برای تصویب، به آن پیوست شده باشد.

5- در مواردی که اخذ رضایت آگاهانه از دهنده‌ی نمونه‌ی ذخیره‌شده یا جانشین قانونی او امکان‌پذیر نباشد، به‌شرط وجود رضایت کلی اولیه بر استفاده‌ی پژوهشی، در صورت تأیید کمیته‌ی اخلاق در پژوهش می‌توان از آن نمونه برای پژوهش استفاده کرد. در چنین مواردی باید از نمونه‌هایی استفاده شود که به ‌نحو برگشت‌ناپذیر بی‌نام ‌شده باشد. ‌

6- تمامی اطلاعاتی که از صاحبان عضو یا بافت مورد پژوهش، جمع‌آوری و ثبت می‌شود، راز حرفه‌ای تلقی می‌‌شود؛ از این ‌رو، تمامی اصول و ملاحظات مربوط به رازداری و حفظ حریم شخصی، باید در مورد آن‌ها مراعات شود.

7- مرکز انجام دهنده‌ی پژوهش بر روی عضو و بافت باید مهارت و امکانات لازم برای حفظ رازداری را داشته باشد؛ در غیر این صورت، اطلاعات باید به شکل بی‌نام و غیرقابل ردیابی ثبت و ذخیره شود.

8- پژوهشگر باید از اعضاء و بافت‌هایی که به منظور پژوهش در اختیار او قرار می‌گیرد استفاده‌ی بهینه کرده، از هدر رفتن آن‌ها جلوگیری کند

9- پژوهشگر موظف است که تمهیدات لازم ایمنی، از جمله آزمون‌های غربالگری و وسایل محافظت‌کننده را برای جلوگیری از انتقال آلودگی از اجزای بدنی مورد استفاده به هر فرد دیگر، اعم از پژوهشگران، آزمودنی‌ها یا سایر افرادی که در فرایند پژوهش با این مواد سروکار خواهند داشت، پیش‌بینی و تأمین کند.

10- پژوهش بر روی عضو و بافت ممکن است به ایجاد روش‌ها و محصولاتی منجر شود که به استفاده‌ی تجاری از آن‌ها بینجامد. حقوق مالکیت معنوی نتایج حاصل از این‌گونه پژوهش‌ها باید مورد تأیید و حمایت قرار گیرد. احتمال استفاده‌ی تجاری از نتایج پژوهش و اشخاصی که احتمالاً از آن منتفع خواهند شد باید در رضایت‌نامه‌آورده شود.

11- زمان، نحوه و میزان اطلاع آزمودنی‌ها از نتایج پژوهش باید در رضایت‌نامه آورده شود. در هر حال، آزمودنی یا نماینده‌ی قانونی او باید به تمامی اطلاعاتی که در طول پژوهش درباره‌ی او به‌دست می‌آید، دسترسی داشته باشد.

12- در صورت کمبود بافت یا عضو، باید استفاده‌های درمانی بر استفاده‌های پژوهشی اولویت داده شود. 

راهنمای اخلاقی پژوهش‌های ژنتیک پزشکی

1- پژوهش‌های ژنتیک بر روی آزمودنی انسانی تنها در صورتی از نظر اخلاقی مجاز به‌شمار می‌آیند که با هدف ارتقا یا پیشرفتِ حداقل یکی از موارد زیر طراحی شده باشند:

1-1ـ تشخیص، طبقه‌بندی یا غربالگری بیماری‌ها یا ناتوانی‌هایی که منشأ ژنتیک دارند.

2-1 ـ بررسی یا تشخیص استعداد ابتلا به بیماری‌.

-1 ـ پژوهش‌های ژنتیک جمعیت‌شناختی

2- انجام هر گونه پژوهش که دربردارنده‌ی موارد یا با اهداف زیر باشد، از نظر اخلاقی نادرست است:

1-2- به‌نژادی (یوژنیکز)

2-2 - شبیه‌سازی تولید مثلی انسان

2 - نقض کرامت انسانی یا حقوق و آزادی‌های بنیادین انسان

3- هر گونه مطالعه یا دستکاری بر روی ژنوم انسان باید بعد از بررسی دقیق و جامع خطرات و عوارض احتمالی آن برای فرد آزمودنی و نسل‌های بعد و حصول اطمینان از فقدان عوارض جدی و غالب بودن منافع احتمالی به خطرات احتمالی به انجام برسد.

4- هر گونه دستکاری ژنتیک در انسان‌که قابل انتقال به نسل‌های آتی باشد از نظر اخلاقی نادرست است، مگر مواردی که ماهیت درمانی (شامل پیشگیری، درمان، یا توانبخشی) داشته باشند.

5- اخذ رضایت آزادانه و آگاهانه از آزمودنی- یا نماینده‌ی قانونی او در موارد لزوم - باید همانند دیگر انواع پژوهش‌ها بر روی آزمودنی انسانی، منطبق با مندرجات راهنمای عمومی و سایر راهنماهای اختصاصی اخلاق در پژوهش کشور انجام گیرد.

6- در مواردی که داده‌های ژنتیک انسانی یا نمونه‌های بیولوژیک با هدف پژوهشی جمع‌آوری شده باشند، آزمودنی این اختیار را دارد که رضایت اولیه‌ی خود را لغو کند، مگر آن‌که این اطلاعات به‌طور غیر قابل بازگشت به هیچ فرد مشخصی قابل استناد نباشد. لغو رضایت نباید موجب خسارت یا جریمه‌ای برای آزمودنی شود.

7- اگر پژوهش شامل انجام آزمون‌(ها)یی باشد که ممکن است نتایج پیش‌گویی‌کننده‌ای در ارتباط با سلامت یا سایر جنبه‌های زندگی آزمودنی داشته باشند، علاوه بر حصول اطمینان از درک مناسب ماهیت و پی‌آمدهای آزمون از سوی آزمودنی در طی فرایند اخذ رضایت، باید مشاوره‌ی‌ ژنتیکی مناسب برای او فراهم شود. مشاوره‌ی ژنتیک ‌باید غیرجهت‌دار، بدون پیش‌داوری، بدون قضاوت‌، شامل رهنمود‌های متناسب با شرایط فرهنگی فرد و دربرگیرنده‌ی حداکثر منافع وی باشد.

8- هنگامی که پژوهش شامل آزمون‌(ها)یی باشد که ممکن است نتایج پیش‌گویی‌کننده‌ای در ارتباط با سلامت یا سایر جنبه‌های زندگی بستگان یا نزدیکان آزمودنی داشته باشد، باید نحوه‌ی اطلاع‌رسانی احتمالی به ایشان –یا محرمانه ماندن نتایج – در طی فرایند اخذ رضایت مورد بحث قرار گیرد و در رضایت‌نامه درج شود.

9- به بیمارانی که دچار معلولیت یا بیماری ارثی هستند و هم‌چنین به حاملان بدون علامت بیماری، یا افراد مستعد (ثابت‌شده یا مشکوک) ‌باید در زمان مناسب و به روش مناسب، آگاهی لازم در مورد امکانات موجود در زمینه‌ی بیماری داده شود. ضمناً اگر به دلایلی، درمان یکی از بستگان بیمار لازم باشد، پزشک ‌باید پس از اخذ رضایت فرد مورد مطالعه یا نماینده‌ی قانونی وی, به بستگان او اطلاعات لازم را ارائه کند.

10- هیچ فردی را نباید از دسترسی به داده‌های ژنتیکی خود منع کرد.

11- داده‌های ژنتیک و نمونه‌های بیولوژیک جمع‌آوری شده، نباید برای هدف دیگری که با مفاد رضایت کسب شده مغایرت دارد به‌کار گرفته شوند.

12- اگر ارتباط داده‌های ژنتیک انسانی با فرد به‌طور برگشت‌ناپذیر قطع شده باشد، این داده‌ها را مشروط به کسب مجوز کمیته‌ی اخلاق می‌توان مورد استفاده قرار داد.

13- دستاوردهای حاصل از پژوهش بر داده‌های ژنتیکی انسانی باید در اختیار جامعه قرار گیرد.

14- مطالعه بر روی ژنوم انسانی در شکل طبیعی آن نباید منجر به کسب منافع انحصاری فردی شود.

15- تشخیص ژنتیکی پیش از تولد باید تنها در صورتی انجام ‌شود که برای سلامت جنین یا مادر سودمند باشد.

- عدم همکاری بیمار

 -مشکل تهیه مواد وامکان طولانی شدن زمان دریافت آنها

Preeclampsia; polymorphism; gene expression;Inflammation;Inflammasomes; MICRORNA;mTOR;AKT1;NLRP3;miR150;miR223

1. Student ZCP, Student BOEM, Student ZMB, Student RSNB. Prevalence of Preeclampsia and Eclampsia in Iran. Archives of Iranian medicine. 2016;19(1):50.

2. Harmon QE, Huang L, Umbach DM, Klungsøyr K, Engel SM, Magnus P, et al. Risk of fetal death with preeclampsia. Obstetrics & Gynecology. 2015;125(3):628-35.

3. Rodríguez-Sureda V, Crovetto F, Triunfo S, Sánchez O, Crispi F, Llurba E, et al. Increased secretory sphingomyelinase activity in the first trimester of pregnancy in women later developing preeclampsia: a nested case-control study. Biological chemistry. 2016.

4. Nerenberg K, Daskalopoulou SS, Dasgupta K. Gestational diabetes and hypertensive disorders of pregnancy as vascular risk signals: an overview and grading of the evidence. Canadian Journal of Cardiology. 2014;30(7):765-73.

5. Mandò C, Pileri P, Mazzocco MI, Lattuada D, Zolin A, Plebani M, et al. Maternal and fetal HLA-G 14 bp gene polymorphism in pregnancy-induced hypertension, preeclampsia, intrauterine growth restricted and normal pregnancies. The Journal of Maternal-Fetal & Neonatal Medicine. 2015:1-6.

6. Connealy BD, Carreno CA, Kase BA, Hart LA, Blackwell SC, Sibai BM. A history of prior preeclampsia as a risk factor for preterm birth. American journal of perinatology. 2014;31(6):483-8.

7. Villar J, Belizan JM. Same nutrient, different hypotheses: disparities in trials of calcium supplementation during pregnancy. The American journal of clinical nutrition. 2000;71(5 Suppl):1375S-9S.

8. Rajkovic A, Mahomed K, Rozen R, Malinow MR, King IB, Williams MA. Methylenetetrahydrofolate reductase 677 C --> T polymorphism, plasma folate, vitamin B(12) concentrations, and risk of preeclampsia among black African women from Zimbabwe. Molecular genetics and metabolism. 2000;69(1):33-9.

9. Nakashima A, Aoki A, Kusabiraki T, Shima T, Yoshino O, Cheng SB, Sharma S, Saito S. Role of autophagy in oocytogenesis, embryogenesis, implantation, and pathophysiology of pre‐eclampsia. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 2017 Apr;43(4):633-43.

10. Tenório MB, Ferreira RC, Moura FA, Bueno NB, de Oliveira AC, Goulart MO. Cross-Talk between Oxidative Stress and Inflammation in Preeclampsia. Oxidative medicine and cellular longevity. 2019;2019.

11. Lai WS, Ding YL. GNG7 silencing promotes the proliferation and differentiation of placental cytotrophoblasts in preeclampsia rats through activation of the mTOR signaling pathway. International journal of molecular medicine. 2019 May 1;43(5):1939-50.

12. Gonzalez E, McGraw TE. The Akt kinases: isoform specificity in metabolism and cancer. Cell cycle. 2009;8(16):2502-8

13. Xing M. Genetic alterations in the phosphatidylinositol-3 kinase/Akt pathway in thyroid cancer. Thyroid. 2010;20(7):697-706

14. Cicenas J. The potential role of Akt phosphorylation in human cancers. International Journal of Biological Markers. 2008;23(1):1-9.

15. Yang ZJ, Chee CE, Huang S, Sinicrope FA. The role of autophagy in cancer: therapeutic implications. Molecular cancer therapeutics. 2011 Sep 1;10(9):1533-41.

16. Wu D, Hong H, Huang X, Huang L, He Z, Fang Q, Luo Y. CXCR2 is decreased in preeclamptic placentas and promotes human trophoblast invasion through the Akt signaling pathway. Placenta. 2016 Jul 1;43:17-25.

17. Zining J, Xu Lu HC, Yuan Y. Genetic polymorphisms of mTOR and cancer risk: A systematic review and updated meta-analysis. Oncotarget. 2016 Aug 30;7(35):57464.

18. Shao J, Li Y, Zhao P, Yue X, Jiang J, Liang X, He X. Association of mTOR polymorphisms with cancer risk and clinical outcomes: a meta-analysis. PloS one. 2014 May 9;9(5):e97085.

19. Cao Q, Ju X, Li P, Meng X, Shao P, et al. (2012) A functional variant in the
MTOR promoter modulates its expression and is associated with renal cell
cancer risk. PLoS One 7(11):e50302.

20. Li Q, Gu C, Zhu Y, Wang M, Yang Y, et al. (2013) Polymorphisms in the
mTOR gene and risk of sporadic prostate cancer in an Eastern Chinese
population. PLoS On 8(8):e71968

21. Zhang Z, Chen Q, Zhang J, Wang Y, Hu X, Yin S, He M, Guan S, Qin W, Xiao Q, Zhao H. Associations of genetic polymorphisms in pTEN/AKT/mTOR signaling pathway genes with cancer risk: A meta-analysis in Asian population. Scientific reports. 2017 Dec 19;7(1):17844.

22. Zhou K, Fan YD, Wu PF, Duysenbi S, Feng ZH, Du GJ, Zhang TR. MicroRNA-145 inhibits the activation of the mTOR signaling pathway to suppress the proliferation and invasion of invasive pituitary adenoma cells by targeting AKT3 in vivo and in vitro. OncoTargets and therapy. 2017;10:1625.

23. Wang G, Liu M, Wang H, Yu S, Jiang Z, Sun J, Han K, Shen J, Zhu M, Lin Z, Jiang C. Centrosomal protein of 55 regulates glucose metabolism, proliferation and apoptosis of glioma cells via the Akt/mTOR signaling pathway. Journal of Cancer. 2016;7(11):1431.

24.Zhao Y, Diao Y, Wang X, Lin S, Wang M, Kang H, et al. Impacts of the mTOR gene polymorphisms rs2536 and rs2295080 on breast cancer risk in the Chinese population. Oncotarget. 2016;7(36):58174.

25.Piao Y, Li Y, Xu Q, Liu J-w, Xing C-z, Xie X-d, et al. Association of MTOR and AKT gene polymorphisms with susceptibility and survival of gastric cancer. PloS one. 2015;10(8):e0136447

26.Zhang X, Chen X, Zhai Y, Cui Y, Cao P, Zhang H, et al. Combined effects of genetic variants of the PTEN, AKT1, MDM2 and p53 genes on the risk of nasopharyngeal carcinoma. PloS one. 2014;9(3):e92135.

27.Wang Y, Lin L, Xu H, Li T, Zhou Y, Dan H, et al. Genetic variants in AKT1 gene were associated with risk and survival of OSCC in Chinese Han Population. Journal of Oral Pathology & Medicine. 2015;44(1):45-50.

28. Yue X, Zhao PW, Liu ZS, Wu GF, Tu F, Hu JS, He XL. Association of mammalian target of rapamycin gene polymorphisms with the risk of pediatric epilepsy. Zhongguo dang dai er ke za zhi= Chinese journal of contemporary pediatrics. 2015 Jun;17(6):560-4.

29. Zhu AN, Yang XX, Sun MY, Zhang ZX, Li M. Associations between INSR and MTOR polymorphisms in type 2 diabetes mellitus and diabetic nephropathy in a Northeast Chinese Han population. Genet Mol Res. 2015 Jan 1;14(1):1808-18.

30. Yang C, Sun N, Ren Y, Sun Y, Xu Y, Li A, Wu K, Zhang K. Association between AKT1 gene polymorphisms and depressive symptoms in the Chinese Han population with major depressive disorder. Neural regeneration research. 2012 Jan 25;7(3):235.

31. Arámbul-Carrillo CE, Ramos-Márquez ME, a del Carmen Carrillo-Pérez M. Association between polymorphism in the AKT1 gene and type 2 diabetes mellitus in a mexican population.

32. Kianpour M, Norozi S, Bahadoran P, Azadbakht L. The relationship between metabolic syndrome criteria and preeclampsia in primigravid women. Iranian journal of nursing and midwifery research. 2015 Mar;20(2):263.

33. Eiland E, Nzerue C, Faulkner M. Preeclampsia 2012. Journal of pregnancy. 2012 Oct;2012.

34. Gomez-Lopez N, Motomura K, Miller D, Garcia-Flores V, Galaz J, Romero R. Inflammasomes: Their Role in Normal and Complicated Pregnancies. J Immunol. 2019;203(11):2757-69.

35. Franchi L, Eigenbrod T, Núñez G. Cutting edge: TNF-alpha mediates sensitization to ATP and silica via the NLRP3 inflammasome in the absence of microbial stimulation. J Immunol. 2009;183(2):792-6.

36. Swanson KV, Deng M, Ting JP. The NLRP3 inflammasome: molecular activation and regulation to therapeutics. Nat Rev Immunol. 2019;19(8):477-89.

37. Goldberg EL, Asher JL, Molony RD, Shaw AC, Zeiss CJ, Wang C, et al. beta-Hydroxybutyrate Deactivates Neutrophil NLRP3 Inflammasome to Relieve Gout Flares. Cell Rep. 2017;18(9):2077-87.

38. Mulla MJ, Myrtolli K, Potter J, Boeras C, Kavathas PB, Sfakianaki AK, et al. Uric acid induces trophoblast IL-1β production via the inflammasome: implications for the pathogenesis of preeclampsia. Am J Reprod Immunol. 2011;65(6):542-8.

39. Xie F, Hu Y, Turvey SE, Magee LA, Brunham RM, Choi KC, et al. Toll-like receptors 2 and 4 and the cryopyrin inflammasome in normal pregnancy and pre-eclampsia. Bjog. 2010;117(1):99-108.

40. Jiang D, Chen S, Sun R, Zhang X, Wang D. The NLRP3 inflammasome: Role in metabolic disorders and regulation by metabolic pathways. Cancer Lett. 2018;419:8-19.

41. Stodle GS, Silva GB, Tangeras LH, Gierman LM, Nervik I, Dahlberg UE, et al. Placental inflammation in pre-eclampsia by Nod-like receptor protein (NLRP)3 inflammasome activation in trophoblasts. Clin Exp Immunol. 2018;193(1):84-94.

42. Xu L, Li S, Liu Z, Jiang S, Wang J, Guo M, et al. The NLRP3 rs10754558 polymorphism is a risk factor for preeclampsia in a Chinese Han population. J Matern Fetal Neonatal Med. 2019;32(11):1792-9.

43. I CW, Romao-Veiga M, Matias ML, Fioratti EG, Peracoli JC, Borges VT, et al. Increased expression of NLRP3 inflammasome in placentas from pregnant women with severe preeclampsia. J Reprod Immunol. 2017;123:40-7.

44. Pontillo A, Reis EC, Bricher PN, Vianna P, Diniz S, Fernandes KS, et al. NLRP1 L155H Polymorphism is a Risk Factor for Preeclampsia Development. Am J Reprod Immunol. 2015;73(6):577-81.

45. Wahid F, Shehzad A, Khan T, Kim YY. MicroRNAs: synthesis, mechanism, function, and recent clinical trials. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 2010;1803(11):1231-43.

46. Lee D-C, Romero R, Kim J-S, Tarca AL, Montenegro D, Pineles BL, et al. miR-210 targets iron-sulfur cluster scaffold homologue in human trophoblast cell lines: siderosis of interstitial trophoblasts as a novel pathology of preterm preeclampsia and small-for-gestational-age pregnancies. The American journal of pathology. 2011;179(2):590-602.

47. Fabian MR, Sonenberg N, Filipowicz W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annual review of biochemistry. 2010 Jul 7;79:351-79.

48. Huang Y, Shen XJ, Zou Q, Wang SP, Tang SM, Zhang GZ. Biological functions of microRNAs: a review. Journal of physiology and biochemistry. 2011;67(1):129-39.

49. Sotillo E, Thomas-Tikhonenko A. Shielding the messenger (RNA): microRNA-based anticancer therapies. Pharmacology & therapeutics. 2011;131(1):18-32

50. Doridot L, Houry D, Gaillard H, Chelbi ST, Barbaux S, Vaiman D. miR-34a expression, epigenetic regulation, and function in human placental diseases. Epigenetics. 2014;9(1):142-51.

51. Fang ZH, Wang SL, Zhao JT, Lin ZJ, Chen LY, Su R, Xie ST, Carter BZ, Xu B. miR-150 exerts antileukemia activity in vitro and in vivo through regulating genes in multiple pathways. Cell death & disease. 2016 Sep;7(9):e2371-.

52. Cheng L, Qiu L, Zhang R, Qian D, Wang M, Sun M, Zhu X, Wang Y, Guo W, Wei Q. Functional variant of MTOR rs2536 and survival of Chinese gastric cancer patients. International journal of cancer. 2019 Jan 15;144(2):251-62.

53. Jairajpuri DS, Almawi WY. MicroRNA expression pattern in pre-eclampsia. Molecular medicine reports. 2016 Mar 1;13(3):2351-8.

54. Wu SJ, Chen J, Wu B, Wang YJ, Guo KY. MicroRNA-150 enhances radiosensitivity by inhibiting the AKT pathway in NK/T cell lymphoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 2018 Dec;37(1):1-0.

55. Podshivalova K, Wang EA, Hart T, Salomon DR. Expression of the miR-150 tumor suppressor is restored by and synergizes with rapamycin in a human leukemia T-cell line. Leukemia research. 2018 Nov 1;74:1-9.

56. Kang M, Liu X, Fu Y, Garvey WT. Improved systemic metabolism and adipocyte biology in miR-150 knockout mice. Metabolism. 2018 Jun 1;83:139-48.

57. Chen L, Hou X, Zhang M, Zheng Y, Zheng X, Yang Q, Li J, Gu N, Zhang M, Sun Y, Wu J. MicroRNA-223-3p modulates dendritic cell function and ameliorates experimental autoimmune myocarditis by targeting the NLRP3 inflammasome. Molecular immunology. 2020 Jan 1;117:73-83.

58. Wang B, Cao X, Lin J, Qian Q, Yu L, Qian Q. Up-regulation of microRNA-223 inhibits brain injury and hippocampal neuron apoptosis of rats after febrile seizure through the NLRP3-Caspase-1 signaling pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 2019 Jun 1;114:108683.

59. Zhang L, Li H, Zang Y, Wang F. NLRP3 inflammasome inactivation driven by miR‑223‑3p reduces tumor growth and increases anticancer immunity in breast cancer. Molecular medicine reports. 2019 Mar 1;19(3):2180-8.

60. Yan Y, Lu K, Ye T, Zhang Z. MicroRNA‑223 attenuates LPS‑induced inflammation in an acute lung injury model via the NLRP3 inflammasome and TLR4/NF‑κB signaling pathway via RHOB. International journal of molecular medicine. 2019 Mar 1;43(3):1467-77.

61. Xu W, Wang Y, Ma Y, Yang J. MiR-223 plays a protecting role in neutrophilic asthmatic mice through the inhibition of NLRP3 inflammasome. Respiratory Research. 2020 Dec;21(1):1-3.

62. Calvente CJ, Tameda M, Johnson CD, Del Pilar H, Lin YC, Adronikou N, Du Jeu XD, Llorente C, Boyer J, Feldstein AE. Neutrophils contribute to spontaneous resolution of liver inflammation and fibrosis via microRNA-223. The Journal of clinical investigation. 2019 Aug 26;129(10).

63. Zhu J, Wang M, He J, Zhu M, Wang JC, Jin L, Wang XF, Yang YJ, Xiang JQ, Wei Q. Polymorphisms in the AKT 1 and AKT 2 genes and oesophageal squamous cell carcinoma risk in an Eastern Chinese population. Journal of cellular and molecular medicine. 2016 Apr;20(4):666-77.

64. Jin Y, Yuan Y, Yi M, Han H, Liu B, Li Q. Phosphorylated-Akt overexpression is associated with a higher risk of brain metastasis in patients with non-small cell lung cancer. Biochemistry and biophysics reports. 2019 Jul 1;18:100625.

65. Khan I, Ansari IA. Prediction of a highly deleterious mutation E17K in AKT-1 gene: An in silico approach. Biochemistry and biophysics reports. 2017 Jul 1;10:260-6.

مقایسه فراوانی پلی‌مورفیسم‌های rs2536، rs17036508 و rs2295080 ژن mTOR  و rs1130233 ، rs2494732 و rs1130214  ژن AKT1 و rs10754558 و rs4612666 ژن NLRP3 و rs1143627 و rs16944 ژن  IL-1β در خون  مادر و جفت ومیزان بیان ژنهای  mTOR وAKT1 و NLPR3و IL-1β وmiR150 و miR223 در جفت زنان باردار مبتلا به پره‌اکلامپسی و گروه کنترل

2cc  خون به منظور استخرا ج  DNAو استفاده از آن در RLFP –PCRو تعیین توالی DNA

کمک به فهمیدن علت های ژنتیکی دخیل در ایجاد بیماری

عوارض جانبی برای بیمار ندارد.

عوارض جانبی برای بیمار ندارد.

انجام این طرح هیچ هزینه ای برای بیمار نخواهد داشت

نیاز به روش جایگزین ندارد

نتایج بصورت کاملاً محرمانه و صرفاً جهت مقاصد پژوهش به کار خواهد رفت و هویت بیماری

وی در چارچوب قانون و جامعه و خانواده محرمانه خواهد ماند.

دکترسعیده سلیمی 09123003175- sasalimi@yahoo.com  زاهدان

دانشگاه علوم پزشکی زاهدان- گروه بیوشیمی بالینی

شرکت من در مطالعه کاملاً اختیاری است و آزاد خواهم بود که از شرکت در مطالعه امتناع

نموده یا هر زمان که مایل بودم بدون آنکه تغییری در نحوه رفتار پزشک درمانگر یا نحوه درمان

و مراقبت از بیماری اینجانب ایجاد شود از پژوهش مذکور خار ج  شوم

با توجه به اطلاعات موجود در این فرم و توضیحات حضوری مجری یا همکاران طرح موافقت

خود را با شرکت در این مطالعه اعلان می نمایم. یک نسخه از این فرم به من داده شده و فرصت

خواندن آن را داشته ام

فرم اطلاعاتی طرح پژوهشی 

نام و نام خانوادگی:                            شماره پرونده :                                         شماره تلفن: 

گروه شاهد:         شماره  :                                                       گروه مورد:           شماره: 

سن ( سال):         

قومیت:       بلوچ                                فارس                                   افغان 

وضعیت زایمانهای قبلی : 

G                             P                          Ab                            LC                             Deh   

سن حاملگی(هفته): 

افزایش وزن طی بارداری (کیلوگرم):       

وزن چنین هنگام تولد (گرم):  

سابقه فشار خون در خانواده:       بله                                               خیر                                  نمی داند   

سابقه قبلی فشار خون :           بله                                                   خیر                               نمی داند 

سابقه فشار خون در حاملگی قبلی :        بله                                        خیر                             نمی داند 

پروتئینوری : 

Trace                             +                                 ++                             +++                               ++++

وزن مادر (کیلوگرم):                                     قدمادر(متر):                                                           BMI(کیلوگرم برمترمربع): 

فشار خون سیستولیک(mmHg): 

فشار خون دیاستولیک (mmHg): 

فشار خون متوسط شریانی (mmHg): 

Early onset preeclampsia                                                        Late onset preeclampsia                                             None   

Mild preeclampsia                                                                      Sever preeclampsia                                                None