بررسی خاصیت آنتی باکتریال و زیست سازگاری نانوالیاف پلی وینیل الکل حامل باکتریوسین ساکاسین تولید شده به روش الکتروریسی

نانوالیاف ها، رشته هایی نسبتا کوتاه با قطر کمتر از ۱۰۰۰ نانومتر هستند که روی یک صفحه به صورت یک لایه ایجاد می شوند. زمانی که قطر الیاف پلیمری از میکرومتر به نانومتر کاهش پیدا می‌کند، خصوصیات جالب توجهی در آن‌ها ظاهر می‌گردد که از آن جمله می‌توان به بزرگ شدن نسبت سطح به حجم، افزایش قابلیت انعطاف‌پذیری در گروه‌های عاملی سطحی و عملکرد مکانیکی عالی مانند سختی و قدرت کشسانی اشاره نمود (۲-۱). با توجه به این ویژگی‌های منحصر به فرد و همچنین ابعاد هندسی و طبیعت انعطاف پذیر نانو الیاف می‌توان آن‌ها را با دیگر ذرات نانویی از قبیل مولکو‌لهای کروی، مواد دارویی و غذایی تلفیق و نانوساختارهایی با ویژگی‌های جدید ایجاد نمود. نانوالیاف را می توان به روشهای مختلفی از جمله کشش، سنتز قالبی، خودآرایی، جداسازی فازی و الکتروریسی تولید نمود که در این میان این روشها، روش الکتروریسی، نسبت به دیگر فرآیندها، ارزان‌تر و ساده‌تر بوده و قابل فهم‌ترین روش برای تولید نانو الیاف می‌باشد (۳). مبنای الکتروریسی، استفاده از نیروی کششی میدان الکتریکی بین قطره معلق محلول یا مذاب در نوک سوزن و صفحه جمع کننده است. زمانی‌که شدت میدان الکتریکی بر کشش سطحی محلول پلیمری غلبه پیدا می‌کند، جریان جت گونه‌ای از سطح قطره خارج شده و به سمت صفحه هدف حرکت می‌کند و الیاف به صورت لایه‌ای آمورف شکل می‌گیرند (۵-۴). امروزه کانون توجهات زیادی به سمت استفاده از الکتروریسی در علم تغذیه و پزشکی به عنوان روشی جایگزین جهت کپسوله کردن ترکیبات فعال شکل گرفته است (6). الکتروریسی در فرآیند مواد غذایی و دارویی اصولا جهت تثبیت و کنترل رهایش ترکیبات فعال کاربرد دارد (۸-۷). با این وجود تحقیقات بسیار کم بر روی کاربرد الکتروریسی بر بسته بندی های فعال وجود دارد (۱۰-۹).

تکنیک الکتروریسی بر رنج وسیعی از پلیمرها ها با گرید غذایی برای کپسوله کردن ترکیبات فعال کاربرد دارد. در میان آنها، پلی وینیل الکل (PVA) یک پلیمر محلول در آب، زیست تجذیه پذیر و غیر سمی می باشد که توجه زیادی را به خود به دلیل ویژگی هایی مانند آبدوستی، فرآیندپذیری، زیست سازگاری و ویژگی های مکانیکی خوب به خود جلب نموده است (11). پلی وینیل الکل پلیمری است که عاری از هرگونه خطر بوده و به دلیل ویژگی های حرارتی خوب یک کاندید مناسب در میان پلیمرهای مختلف جهت کاربرد در رهایش کنترل شده ترکیبات دارویی، مهندسی بافت و کاربردهای بیوتکنولوژی می باشد. نانوالیاف پلی وینیل الکل برای انکپسوله کردن و پایداری ترکیبات فعال مغذی مانند اسانس های گیاهی (12)، ویتامین A (11)، وانیلین (13)، کافئین و ریبوفلاوین (14) کاربرد داشته است.

در میان ترکیبات فعال مختلف، باکتریوسین ها، پپتیدهای غیرسمی تولید شده توسط باکتریهای اسید لاکتیک هستند که دارای فعالیت ضدمیکروبی بوده و به اسید و گرما مقاوم و به سهولت هضم می شوند. باکتریوسین می تواند ابزاری برای بهبود امنیت و کیفیت غذاهای تخمیر شده باشد. باکتریوسین بصورت یک ماده افزودنی در غذاها می تواند از رشد باکتریهای بیماریزا و اسپورهای آنها جلوگیری کند. در کشورهای صنعتی، این روشها در مقایسه با کاربرد باکتریوسیها یا سایر محافظت کننده ها، به میزان کمتری مورد استفاده قرار گرفته است و ممکن است بعنوان روشی جایگزین برای بهبود محافظت از غذاها در محیط بکار گرفته شود و منجر به کاهش مسمومیت در غذاهای تخمیری شود (15-18). در میان باکتریوسین ها، ساکاسین یک باکتریوسین است که از باکتری لاکتوباسیلوس ساکی استخراج می شود و به صورت خوشه ای همراه با سایر باکتریوسین ها قرار دارند. ساکاسین قادر به مهار رشد بسیاری از باکتری های بیماری زا منجمله لیستریا منوسایتوژنز می باشد (19). ساکاسین از لحاظ ساختاری یک پلی پپتید کوچک متشکل از ۴۱ آمینو اسید و مقاوم به حرارت می باشد. عموما از ساکاسین در کاربردهای صنعتی و به ویژه در کنار باکتریوسین ها استفاده می کنند (20). از این رو کپسوله کردن این باکتریوسین در نانوالیاف های تولیدی به روش الکتروریسی می تواند کاربردی جدید از این باکتریوسین را به اجرا بگذارد که تا به حال هیچگونه تحقیقی جهت کاربرد ساکاسین در نانوالیاف ها در هیچ کجای دنیا صورت نگرفته است و این تحقیق گامی نوین در انکپسوله کردن ساکاسین در نانوالیاف های تولیدی به روش الکتروریسی خواهد بود.

مطالعات نشان می دهد که باکتری گرم منفی لیستریا مونوسایتوژنز از مهمترین پاتوژنهای آلوده کننده مواد غذایی مانند گوشت در دمای یخچالی می باشد. این باکتری در میان سایر پاتوژن ها مقاومت بیشتری نسبت به غلظت های مختلف نمک به کار برده شده در فرآوری مواد غذایی دارد ( 21). از این رو لزوم بسته بندی محصولات گوشتی امری ضروی است. با توجه به اثر ضدباکتریایی باکتریوسین ساکاسین بر لیستریا مونوسایتوژنز، می توان از این نانوالیاف تولیدی به منظور بسته بندی گوشت به خصوص فیله ماهی بهره جست.

از این رو هدف از این مطالعه (الف) تعیین بهترین غلظت بازدارندگی باکتریوسین ساکاسین جهت ایفای نقش بازدارندگی میکروبی (ب) بررسی غلظت های مختلف باکتریوسین ساکاسین بر خصوصیات حرارتی، ساختاری و مورفولوژی نانوالیاف پلی وینیل الکل، (د) بررسی اثر باکتریوسین بر روی مهار باکتری لیستریا منوسایتوژنز به روش دیسک و در نهایت بررسی میزان بار میکروبی باکتری لیستریا مونوسایتوژنز در فیله ماهی دودی بسته بندی شده توسط پلیمر فعال مذکور می باشد.

مروری بر تحقیقات گذشته

Barbiroli و همکاران (2013) موفق به استخراج و انکپسوله کردن باکتریوسین ساکاسین در ژلاتین شدند. نتایج این محققین حاکی از کاهش باکتری لیستریا منوسایتوژنز در گوشت گوسفند در دمای یخچالی بود. همچنین رهایش کنترل شده ساکاسین سبب ایجاد هاله عدم رشد در آزمون دیسک گردید (21).

Trinetta و همکاران (2010) بیوپلیمر پلولان حاوی ساکاسین را برای اولین بار تولید نمودند. غلظت 50 میلی گرم بر لیتر از این باکتریوسین در پلیمر مذکور خاصیت ضد میکروبی قوی را نسبت به باکتری لیستریا منوسایتوژنر موجود در گوشت هایی که به طور سریع اماده طبخ می شوند نشان داد به گونه ای که در عرض سه هفته باعث کاهش Log3 از این باکتری گردید. همچنین در این مطالعه سوش های مختلف باکتری لیستریا، مقاومت مختلفی نسبت به باکتریوسین ساکاسین نشان دادند(22).

دو تحقیق مذکور تنها مطالعات جهانی انجام شده جهت لود نمودن باکتریوسین ساکاسین در پلیمر (به عنوان حامل) می باشند و سایر مطالعات بر روی سایر باکتریوسین های مشابه مانند نایسن انجام شده است.

Soto و همکاران (2016) بیان داشتند که پپتیدهای میکروبی به دلیل برهمکنش با مواد غذایی امکان افزودن مستقیم به مواد غذایی جهت کنترل رشد میکروب های پاتوژن را ندارند. از این رو در مطالعه خود به بررسی ویژگی های پلیمر ترکیبی پولولان و آمارانس (با نسبت برابر) حاوی باکتریوسین نایسین پرداختند. بررسی عکس های الکترونی نشان از یک سطح صاف در نانوکامپوزیت تولید با قطر میانگین 124 نانومتر داد. آنالیز FTIR نشان دهنده ایجاد پیوندهای هیدروژنی بین پلیمر و باکتریوسین بود. نتایج آزمون حرارتی نشان داد که روش الکتروریسی و لود نمود نایسین در پلیمر ترکیبی مذکور سبب افزایش دمای ذوب و کریستالینیتی پلیمر شد. همچنین خاصیت ضد میکروبی قوی ضد باکتری لیستریا منوسایتوژنز مشاهده شد (23).

Dheraprasart و همکاران (2009) موفق به تولید نانوالیاف ژلاتین حاوی غلظت های مختلف (0 تا 24%) باکتریوسن نایسین به روش الکتروریسی شدند. نانوالیاف تولیدی سبب معار رشد باکتری لیستریا پلانتارم گردید. هر چند ناوالیاف ها شکننده و محلول در آب بودند. از این رو یک اتصال دهنده عرضی به منظور استحکام نانوالیاف اضافه گردید. افزایش دما سبب افزایش رهاش نایسین گردید اما بر فعالیت آبی تاثیری نشان نداد. همچنی این نانوالیاف سبب مهار رشد استافیلوکوکوس و لیستریا منوسایتوژنز گردید (24).

1. بهترین غلظت باکتریوسین ساکاسین جهت مقاوم سازی حرارتی نانوالیاف پلی وینیل الکل چقدر است؟
2. بهترین غلظت باکتریوسین ساکاسین جهت حفظ مورفولوژیکی مناسب نانوالیاف پلی وینیل الکل چقدر است ؟
3. آیا بین باکتریوسین ساکاسین و پلیمر پلی وینیل الکل پیوند شیمیایی برقرار میگردد؟
4. میزان درصد بارگذاری و بازده باکتریوسین در داخل نانوالیاف پلی وینیل الکل چه مقدار خواهد بود؟
5. حداقل غلظت باکتریوسین ساکاسین کپسوله شده با نانو الیاف پلی وینیل الکل جهت بازدارندگی رشد میکروبی چقدر است؟
6. آیا غلظت های مختلف باکتریوسین سبب ایجاد هاله عدم رشد باکتریایی به روش آزمون دیسک می شود؟
7. آیا بسته بندی گوشت توسط نانوالیاف مذکور باعث کاهش رشد جمعیت باکتری لیستریا منوسایتوژنز می شود؟

تعیین خاصیت آنتی باکتریال و زیست سازگاری نانوالیاف پلی وینیل للکل حامل باکتریوسین تولید شده به روش الکتروریسی

1. تعیین اثر باکتریوسین بر مقاوت حررارتی نانوالیاف
2. تعیین اثر غلظت های مختلف باکتریوسین بر مورفولوژی نانوالیاف
3. بررسی پیوند شیمیایی بین باکتریوسین ساکاسین و پلیمر پلی وینیل الکل
4. تعیین درصد بارگذاری و بازده باکتریوسین در داخل نانوالیاف پلی وینیل الکل
5. تعیین حداقل غلظت بازدارندگی باکتریوسین جهت تعیین درصد به کار بردن باکتریوسین در نانوالیاف
6. ایجاد هاله بازدارندگی به منظور جلوگیری از رشد باکتری لیستریا منوسایتوژنز
7. بسته بندی فعال گوشت توسط نانوالیاف به منظور کاهش بار میکروب لیستریا منوسایتوژنز

نتایج حاصله از این مطالعه می تواند در خصوص صنعتگران به خصوص صنعتگران فعال در زمینه محصولات گوشتی به منظور تولید بسته بندی فعال جهت افزایش زمان ماندگاری گوشت و کاهش بار میکروبی آن مفید واقع شود

باکتریوسین ساکاسین: ساکاسین یک باکتریوسین است که از باکتری لاکتوباسیلوس ساکی استخراج می شود و به صورت خوشه ای همراه با سایر باکتریوسین ها قرار دارند. ساکاسین از لحاظ ساختاری یک پلی پپتید کوچک متشکل از ۴۱ آمینو اسید و مقاوم به حرارت می باشد.

الکتروریسی: مبنای الکتروریسی، استفاده از نیروی کششی میدان الکتریکی بین قطره معلق محلول یا مذاب در نوک سوزن و صفحه جمع کننده است. زمانی‌که شدت میدان الکتریکی بر کشش سطحی محلول پلیمری غلبه پیدا می‌کند، جریان جت گونه‌ای از سطح قطره خارج شده و به سمت صفحه هدف حرکت می‌کند و الیاف به صورت لایه‌ای آمورف شکل می‌گیرند

پلی وینیل الکل: پلی وینیل الکل (PVA) یک پلیمر محلول در آب، زیست تجذیه پذیر و غیر سمی می باشد که توجه زیادی را به خود به دلیل ویژگی هایی مانند آبدوستی، فرآیندپذیری، زیست سازگاری و ویژگی های مکانیکی خوب به خود جلب نموده است.

  (بنیادی-کاربردی)

با توجه به اینکه این طرح آزمایشگاهی می باشد و اثر باکتریوسین ساکاسین در سه غلظت مختلف بر روی خواص ساختاری نانوالیاف زئین بررسی خواهد شد بنابراین بر خلاف پژوهش های بیمارستانی یا پژوهش هایی که نیاز به انتخاب جامعه آماری دارد که در انها از بین افراد یا جامعه ای خاص تعداد محدودی انتخاب می شوند در این پژوهش جامعه خاصی مد نظر نیست بلکه پس از یافتن مناسبترین غلظت موجود از باکتریوسین با استفاده از آزمون حداقل غلظت کشندگی، در ادامه اثر آن در تولید نانوالیاف بررسی خواهد شد.

نمونه مورد آزمایش نانوالیاف پلیمری است که در ابعاد تقریبی ۳ در ۳ توسط دستگاه الکتروریسی تولید می شود. در ارتباط با روش محاسبه حجم ان باید ذکر نمود که تنظیمات دستگاه الکتروریسی مشهد به گونه ای است که نانوالیاف تولیدی در این ابعاد را تولید می کند و با توجه به ازمونهای در پیش رو، حدود حداقل ۳۰ نانوالیاف با ابعاد ۳ در ۳ ضروری می باشد

تهیه باکتریوسین ساکاسین از باکتری لاکتوباسیلوس ساکی صورت خواهد گرفت و استخراج آن در بخش روش اجرای طرح در قسمت استخراج باکتریوسین ذکر گردیده است.

توسط چک لیست اطلاعات ثبت می شود.

تشخیص حداقل غلظت بازدارنده (Minimum Inhibitory Concentration) (MIC) :

برای تعیین حداقل غلظت بازدارنده ( (MICباکتریوسین استخراج شده از باکتری لاکتوباسیلوسساکی (PTCC 1712) (خریداری شده از شرکت کلکسیون قارچ­ها و باکتری‌ها، مشهد) برحسب واحد باکتریوسین^[1](BU) در برابر باکتری مولد فساد لیستریا منوسایتوژنز (خریداری شده از شرکت کلکسیون قارچ­ها و باکتری‌ها، مشهد) از روش میکرودایلوشن^[2] استفاده خواهد شد. در این روش نخست یک غلظت مادر از باکتریوسین (100 میلی­گرم بر میلی­لیتر) با استفاده از آب مقطر دوبار تقطیر تهیه و محلول پس از عبور از فیلتر غشایی با قطر منافذ 45/0 میکرون استریل خواهد گردید. جهت تهیه سوسپانسیون نیم مک فارلند از باکتری لیستریا منوسایتوژنز، مطابق دستور العمل ارسالی توسط شرکت کلکسیون قارچ­ها و باکتری‌ها به ویال لیوفیلیزه حاوی باکتری میزان 5/0 میلی­لیتر محلول رینگر استریل اضافه و پس از انحلال کامل، محلول بر روی سطح پلیت حاوی محیط کشت نوترینت آگار تلقیح و پس از انجام کشت سطحی در دمای 37 درجه سلسیوس به مدت 24 ساعت جهت مشاهده رشد باکتریایی انکوبه خواهد گردید. با استفاده از لوپ سترون به میزانی از باکتری رشد یافته به لوله حاوی محلول رینگر استریل اضافه خواهد گردید که در طول موج 625 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر جذبی معادل 13/0-08/0 یا کدورتی معادل محلول استاندارد نیم مک فارلند حاوی Cfu/ml10⁸ × 5/1 از باکتری لیستریا منوسایتوژنز ایجاد گردد. در ادامه در میکروپلیت‌های 96 خانه، نخست درون چاهک‌های 12 عددی هر ردیف، میزان 95 میکرولیتر محیط کشت مولر هینتون براث استریل با غلظت مضاعف اضافه خواهد شد. سپس 100 میکرولیتر از غلظت مادر 100 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر باکتریوسین به چاهک اول منتقل و غلظت 50 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر از باکتریوسین تهیه خواهد گردید. سپس 100 میکرولیتر از چاهک اول به چاهک دوم منتقل و غلظت 25 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر از باکتریوسین تهیه خواهد شد. این ترتیب برای همه چاهک‌ها به جز چاهک شماره 12 که به عنوان کنترل مثبت در نظر گرفته می­شود، ادامه خواهد یافت. چاهک شماره 11 به عنوان شاهد و کنترل منفی در نظر گرفته می­شود. در انتها 100 میکرولیتر از چاهک شماره 11 برداشته و دور ریخته خواهد شد. در ادامه 5 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتریایی معادل کدورت استاندارد نیم مک فارلند به هر یک از چاهک‌ها به جز چاهک شماره 11 اضافه خواهد گردید سپس میکروپلیت به مدت 7 ثانیه در شیکر الایزا تکان داده خواهد شد و میزان کدورت اولیه چاهک‌ها در طول موج 625 نانومتر قرائت خواهد گردید. در ادامه میکروپلیت در انکوباتور 37 درجه سلسیوس به مدت 24 ساعت گرمخانه گذاری خواهد شد و پس از گذشت این زمان، میزان جذب یا کدورت چاهک‌ها مجددا توسط دستگاه الایزا قرائت و مقایسه خواهند گردید. کمترین غلظت باکتریوسین (از بین غلظت­های سریالی یک دوم ایجاد شده در چاهک­های اول تا دهم هر ردیف میکروپلیت به ترتیب 50، 25، 5/12، 25/6، 12/3، 56/1، 78/0، 39/0، 19/0، 1/0) که سبب ممانعت از رشد باکتری خواهد گردید به عنوان حداقل غلظت بازدارندگی در نظر گرفته خواهد شد. تیمارها در سه تکرار انجام خواهند گردید ( 25).

تشخیص حداقل غلظت باکتری‌کشی  (Minimum Bactericidal Concentration) (MBC)

حداقل غلظت باکتری‌کشی با توجه به مقادیر حداقل غلظت بازدارندگی باکتریوسین تعیین خواهد گردید به طوری که میزان 5 میکرولیتر از چاهک‌هایی که رشد باکتری در آنها متوقف شده است به پلیت‌های حاوی محیط کشت مولر هینتون آگار تلقیح و به طور یکنواخت پخش گردیده و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس انکوبه خواهند شد. پایین‌ترین غلظت باکتریوسین که در آن 9/99 درصد باکتری‌ها رشد نکرده (فاقد رشد باکتری) باشند به عنوان حداقل غلظت باکتری‌کشی در نظر گرفته خواهد شد. به منظور تایید نتایج، آزمون‌ها سه بار تکرار خواهند گردید ( 25).

روش تولید نانوالیاف پلی وینیل الکل حاوی باکتریوسین ساکاسین

الکتروریسی محلول پلی وینیل الکل در حضور و عدم حضور باکتریوسین ساکاسین با استفاده از دستگاه الکتروریسی مدل Electroris ES1000 (شرکت نانوفن آوران مقیاس، ایران) انجام خواهد گرفت. محلول 5% مورد نظر (5 گرم از پودر پلی وینیل الکل در 100 سی سی محلول آبی) در سرنگ پلاستیکی ۵ میلی لیتری ریخته شده و به یک سوزن (نازل) از جنس فولاد ضد زنگ نوک صاف متصل می شود (22). فاصله سوزن تا صفحه جمع کننده ۱۰ سانتی متر و و سرعت تزریق ϻL/h ۳/۰ در نظر گرفته خواهد شد. الکتروریسی به مدت ۱ ساعت و با اعمال ولتاژ Kv۲۰ صورت خواهد گرفت. در آخر به منظور حذف حلال باقی مانده، فویل آلومینیومی حاوی نانوالیاف به مدت دو ساعت در دمای اتاق نگهداری خواهد شد (Trinetta et al., 2010).

آزمون های مربوط به نانوالیاف زئین حاوی باکتریوسین ساکاسین

بررسی خصوصیات حرارتی نانوالیاف تولیدی:

خصوصیات حرارتی نانوالیاف مورد نظر با استفاده از دستگاه کالریمتری اسکنی افتراقی (DSC) (شیاموی، چین) با سرعت ^°C/min۱۰ و در گستره دمایی ۵۰- تا ^°C۲۰۰ اندازه گیری خواهد شد و در ادامه نقطه ذوب (T_m) و دمای انتقال شیشه ای(T_g) نانوالیاف های تولیدی از روی ترموگرام به دست خواهد آمد. دمای انتقال شیشه ای (T_g) در منحنی حرارتی به عنوان نقطه وسط، شروع و پایان تغییرات منحنی در جریان گرمایی در نظر گرفته شد.

طیف سنجی فرو سرخ:

از دستگاه طیف سنج مادون قرمز تبدیل فوریه مدل (Jasco-680) به منظور بررسی تشکیل پیوند بین پلیمر پلی وینیل الکل و باکتریوسین ساکاسین در فرکانس بین 400 cm^-1 تا 4000 cm^-1 با وضوح 4 cm^-1 استفاده خواهد شد. برای این منظور قطعه مشخصی از نانوالیاف مورد نظر در قسمت سل دستگاه قرار گرفته و در فرکانس ذکر شده آنالیز صورت خواهد گرفت.

میکروسکوپ الکترونی (FE-SEM):

از میکروسکوپ الکترونی به منظور تعیین خصوصیات مورفولوژیکی و ساختاری نانوالیاف و مشاهده نحوه پراکنش باکتریوسین ساکاسین در داخل آن استفاده خواهد شد. بدین منظور نانوالیاف ها دز ابعاد  mm۱ × mm۵ بریده و با لایه ای از طلا پوشانده خواهند شد. جهت تصویربرداری از سیستم تحلیل تصویری با شتاب ولتاژ kV۲۰ (دستگاه مونوتوآ، ژاپن) استفاده می شود (26).

آزمون میکروبی نانوالیاف زئین حاوی باکتریوسین ساکاسین

روش انتشار دیسک:

تعیین فعالیت ضدمیکروبی نمونه ها تحت شرایط آزمایشگاهی با روش انتشار دیسکی انجام خواهد گردید. روش کار بدین طریق می­باشد که تعداد Cfu/ml 10⁸ × 1 باکتری لیستریا منوسایتوژنز به محیط کشت مولر هینتون آگار (مرک، آلمان)  تلقیح شده و فیلم های بریده شده به قطر 6 میلی­متر بر روی محیط کشت حاوی باکتریهای تلقیح شده قرار خواهد گرفت و سپس به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد نگهداری خواهند شد. پس از 24 ساعت گرمخانه گذاری، نواحی روشن بازدارندگی اطراف دیسکها بر حسب میلیمتر انداز گیری خواهند شد ( 26).

فعالیت ضدمیکروبی نانوالیاف پوشش داده شده بر روی فیله ماهی دودی:

بدین منظور در ابتدا نمونه گوشت ماهی دودی شده را  از بازار محلی شهر مشهد خریداری نموده و آن را از لحاظ شمارش کلی بار میکروبی و وجود آنتی­بیوتیک مورد بررسی قرار داده و پس از حصول اطمینان از عاری بودن گوشت از نظر آلودگی میکروبی و وجود آنتی­بیوتیک، اقدام به آلوده­سازی مصنوعی گوشت ماهی دودی با باکتری لیستریا منوسایتوژنز می نمائیم. بدین منظور با استفاده از لوپ سترون از سویه خالص لیستریا منوسایتوژنز به لوله حاوی 10 میلی­لیتر محیط کشت نوترینت براث تلقیح نموده و پس از گرمخانه­گذاری لوله به مدت 18 ساعت و تهیه کشت شبانه که معمولا حاوی Cfu/ml10⁸× 6 از باکتری کشت داده شده است اقدام به شمارش بار کشت شبانه از طریق تهیه رقت­های متوالی با استفاده از محلول رینگر و کشت پورپلیت با استفاده از محیط کشت پلیت کانت آگار و گرمخانه گذاری به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس می­نمائیم. در طی این 24 ساعت کشت شبانه را به منظور جلوگیری از تغییر میزان بار میکروبی در یخچال نگهداری می­کنیم. پس از تعیین بار میکروبی کشت شبانه اقدام به تهیه رقت­های متوالی جهت حصول رقت Cfu/ml10⁴ جهت آلوده­سازی نمونه گوشت می نمائیم. جهت آلوده­سازی به 9 گرم از نمونه گوشت ماهی دودی یک میلی لیتر از رقت Cfu/ml10⁴ تهیه شده اضافه نموده و پس از همگن سازی هر گرم از نمونه گوشت حاوی 10³ باکتری لیستریا منوسایتوژنز خواهد بود. پس از تلقیح باکتری به منظور اتصال بهتر باکتری ها به گوشت نمونه­ها را به مدت 30 دقیقه دردمای اتاق قرار می­دهیم ( 21). پس از 30 دقیقه گوشت را درون فیلم حاوی باکتریوسین پیچیده و روی سینی شیشه­ای قرار می­دهیم و سپس در دمای 4 درجه سلسیوس (دمای یخچال) جهت بررسی خواص ضدمیکروبی فیلم قرار می­دهیم. در روزهای 0، 4، 8، 12 و 16(21) مقدار 5 گرم از نمونه ماهی دودی را به 45 میلی­لیتر آب پپتونه استریل درون کیسه استومیکر اضافه نموده و به مدت 3 دقیقه توسط استومیکر هموژن می­کنیم، سپس رقت­های مورد نیاز را تهیه نموده و 1 میلی­لیتر از هر رقت برای کشت باکتری­ها به روش پورپلیت در محیط کشت پلیت کانت آگار (مرک،آلمان) یا پالکام آگار (مرک،آلمان) قرار می­دهیم. سپس پلیت­ها را به مدت 48 ساعت در انکوباتور 37 سلسیوس انکوبه نموده و مورد شمارش باکتریایی قرار می­دهیم. جهت شمارش باکتریایی و حصول اطمینان از اینکه کلنی­های رشد یافته درون پلیت­ها لیستریا منوسایتوژنز هستند نخست 5 کلنی از هر پلیت را انتخاب نموده و تست های تاییدی باکتری لیستریا منوسایتوژنز شامل آزمون گرم، همولیز، واکنش با قندها، تست کمپ و آزمون هنری

( 21) را انجام داده و از کلنی­های تایید شده پس از آزمون تاییدی جهت گزارش میزان لیستریا منوسایتوژنز در نمونه­ها استفاده می­نمائیم.

محیط کشت تریپتیک سوی براث (TSB)  و محیط کشت مولر هینتون آگار (MHA)، محیط کشت نوترینت براث (NB)، محیط کشت پلیت کانت آگار (PCA)، محیط کشت پالکام آگار (PAL) محیط کشت هایی هستند که در این پروژه مورد استفاده قرار خواهند گرفت.

نتایج بصورت توصیفی با استفاده از آماره های توصیفی میانگین ، انحراف معیار و درصد بیان خواهند شد.

بر اساس  دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهشهای علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی  در جمهوری اسلامی ایران

و بندهای 1-  9- 10- 11 – 30 –و 31

1- هدف اصلی هر پژوهش‌باید ارتقای سلامت انسان‌ها توأم با رعایت کرامت و حقوق ایشان باشد.

9-در پژوهش‌های پزشکی که ممکن است به محیط زیست آسیب برسانند، باید احتیاط‌های لازم در جهت حفظ و نگهداری و عدم آسیب رسانی به محیط ریست انجام گیرد.

10- هر پژوهشی باید بر اساس و منطبق بر یک طرح‌نامه (پروپوزال) به انجام برسد. طرح‌نامه و دستورالعمل باید شامل تمامی اجزای ضروری باشد. از جمله بخش ملاحظات اخلاقی، اطلاعات مربوط به بودجه، حمایت کننده‌ها، وابستگی‌های سازمانی، موارد تعارض منافع بالقوه‌ی دیگرپیش از تصویب یا تأیید طرح‌نامه از سوی کمیته‌ی مستقل اخلاق در پژوهش، نباید اجرای پژوهش شروع شود.

11- کمیته‌ی اخلاق در پژوهش علاوه بر بررسی و تصویب طرح‌نامه و دستورالعمل، این حق را دارد که طرح‌‌ها را در حین و بعد از اجرا را از نظر رعایت ملاحظات اخلاقی مورد پایش قرار دهد. اطلاعات و مدارکی که برای پایش از سوی کمیته‌ی اخلاق درخواست می‌شود، باید از سوی پژوهشگران در اختیار این کمیته گذاشته شود.    

30 -گزارش‌ها و مقالات حاصل از پژوهش‌هایی که مفاد این راهنما را نقض کرده‌اند، نباید برای انتشار پذیرفته شوند.

31-روش پژوهش نباید با ارزش های اجتماعی، فرهنگی و دینی  جامعه در تناقض باشد.

محدودیت خاصی وجود ندارد

الکتروریسی، پلی وینیل الکل، باکتریوسین، ساکاسین،

Electrospun, polyvinyl alcohol, Sakacin bacteriocin

1. Ghorani B, Russell S.J, & Goswami, P. Controlled morphology and mechanical characterisation of electrospun cellulose acetate fibre webs. International Journal of Polymer Science. 2013.
2. Reneker D.H. & Chun, I. Nanometre diameter fibres of polymer, produced by electrospinning. Nanotech. 1996, 7: 216-223.
3. Ramakrishna S. An introduction to electrospinning and nanofibers. World Scientific. 2005.
4. Doshi J, & Reneker D.H. Electrospinning process and applications of electrospun fibers. Journal of electrostatics. 1995, 35: 151-160.
5. Frenot A, & Chronakis I.S. Polymer nanofibers assembled by electrospinning. Current opinion in colloid & interface science. 2003, 8: 64-75.
6. Drosou C.G, Krokida M.K. & Biliaderis C.G. Encapsulation of bioactive compounds through electrospinning/electrospraying and spray drying: A comparative assessment of food-related applications. Drying Technology. 2017, 35: 139-162.
7. Li K.K, Yin SW, Yin Y.C, Tang CH, Yang X.Q, & Wen S.H. Preparation of water-soluble antimicrobial zein nanoparticles by a modified antisolvent approach and their characterization. Journal of Food Engineering. 2013, 119: 343-352.
8. Kayaci F, & Uyar T. Encapsulation of vanillin/cyclodextrin inclusion complex in electrospun polyvinyl alcohol (PVA) nanowebs: Prolonged shelf life and high temperature stability. Food Chemistry. 2012, 133: 641-649.
9. Wen P, Zhu D.H, Wu H, Zong M.H, Jing Y.R, & Han S.Y. Encapsulation of cinnamon essential oil in electrospun nanofibrous film for active food packaging. Food Control. 2016, 59:366-376.
10. Aytac Z, Keskin N.O.S, Tekinay T, & Uyar T. Antioxidantα-tocopherol/g- cyclodextrin–inclusion complex encapsulated poly(lactic acid) electrospun nanofibrous web for food packaging. Journal of Applied Polymer Science. 2017, 134: 44-58.
11. Fahami, Arezoo, and Milad %J Food Hydrocolloids Fathi. 2018. 'Development of cress seed mucilage/PVA nanofibers as a novel carrier for vitamin A delivery', 81: 31-38.
12. Rezaeinia, Hassan, Behrouz Ghorani, Bahareh Emadzadeh, and Nick %J Food Hydrocolloids Tucker. 2019. 'Electrohydrodynamic atomization of Balangu (Lallemantia royleana) seed gum for the fast-release of Mentha longifolia L. essential oil: Characterization of nano-capsules and modeling the kinetics of release', 93: 374-85.
13. Rezaei, Atefe, Hossein Tavanai, and Ali %J International journal of biological macromolecules Nasirpour. 2016. 'Fabrication of electrospun almond gum/PVA nanofibers as a thermostable delivery system for vanillin', 91: 536-43.
14. Li, Xiaoqiang, Muzafar A Kanjwal, Lin Lin, Ioannis S %J Colloids Chronakis, and Surfaces B: Biointerfaces. 2013. 'Electrospun polyvinyl-alcohol nanofibers as oral fast-dissolving delivery system of caffeine and riboflavin', 103: 182-88.
15. Chen H. Bacteriocins and their food applications. CRFSFS, 2003, 82-100.
16. Guinane C.M. Microbial solutions to microbial problems; lactococcal bacteriocins for the control of undesirable biota in food. J Appl Microbiol. 2005, 1316-1325.
17. Olasapo N.A. Occurrence of nisin z production in Lactococcus lactis BFE 1500 isolated from wara, a traditional Nigerian cheese product. Int J Food Microbiol. 1999, 141-152.
18. Nandakumar R. Quantification of nisin in flow-injection immunoassay system. Biosens Bioelec. 1999, 241-247
19. Schillingeur & Lucke F.K. Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated from meat. Applied and Environmental Microbiology. 1989, 55: 190 1-1 906
20. Aasen IM, Markussen S, Møretrø T, Katla T, Axelsson L, & Naterstad K. 'Interactions of the bacteriocins sakacin P and nisin with food constituents'. Int. J. Food Microbiol. 2003, 87: 35–43.
21. Barbiroli A, Musatti A, Capretti G, Iametti S, Rollini M. (2017). Sakacin-A antimicrobial packaging for decreasing Listeria contamination in thincut meat: preliminary assessment. J Sci Food Agric. 97(3):1042-1047.
22. Trinetta, V.,   Floros, JD. (2010). Sakacin A‐containing pullulan film: an active packaging system to control epidemic clones of listeria monocytogenes in ready‐to‐eat foods. Journal of Food Safety. 30(2) 366-381.
23. Soto, KM., ndez-Iturriaga, MH., Loarca-Pin, G., Luna-Ba´rcenas, G., Go´mez-Aldapa, CA., Mendoza, S. (2016). Stable nisin food-grade electrospun fibers. J Food Sci Technol. 53(10). 3787-3794.
24. Dheraprasart, CH., Rengpipat, S., Supaphol, P., AND Tattiyakul, J. (2009). Morphology, Release Characteristics, and Antimicrobial Effect of Nisin-Loaded Electrospun Gelatin Fiber Mat. Journal of Food Protection, 72 (11) 2293–2300.
25. CLSI, “Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically”, Approved Standard, 9th ed., CLSI document M07-A9. Clinical and Laboratory Standards Institute, 950 West Valley Road, Suite 2500, Wayne, Pennsylvania 19087, USA, 2012.
26. Ojagh SM, Rezaei M, Razavi SH. & Hosseini, SMH. Development and evaluation of a novel biodegradable film made from chitosan and cinnamon essential oil with low affinity toward water. Food Chemistry.2010, 122: 161–166.

-

-

-

-

-

-

-

-

-

بررسی نانوالیاف فعال پلی وینیل الکل بر خاصیت ماندگاری فیله ماهی دودی در طی زمان ماندگاری در دمای یخچالی و ارزیابی ویژگیهای ظاهری و امتیاز دهی