تولید و پایدارسازی پپتیدهای زیست فعال و عصاره گرده گل شقایق ایرانی (Papaver bracteatum) درون میکرو و نانوحامل¬ها و کاربرد آن بعنوان منبع رنگ و آنتی¬اکسیدان طبیعی در فرمولاسیون پاستیل فراسودمند

گرده گل که توسط زنبور عسل جمع آوری می­شود، از آگلوتینه شدن گرده گل­ها با شهد آنها و بزاق زنبور عسل بدست می­آید و پس از ذخیره در کیسه گرده واقع در بند سوم پای زنبور عسل، در هنگام ورود زنبور عسل به درون کندو در تله­ی گرده که توسط زنبوردار در آنجا تعبیه شده جمع آوری می­گردد (پاسکوال، 2013). ازگذشته­های دور از گرده گلدر طب باستان استفاده شده و اکنون نیز در کشورهای پیشرفته جهان استفاده طبی از آن بر پایه تحقیقات دانشمندان در دانشگاه­ها و موسسه­های تحقیقاتی معتبر رایج است.

گرده گل حاوی پروتئین، لیپید، کربوهیدرات، ویتامین­ها و مواد معدنی هستند و با دارا بودن ترکیبات مهم و فعال زیستی مختلف دارای خواص عملکردی و درمانی فراوانی بوده و در صنایع داروسازی و آرایشی و اخیرا در صنعت غذا  بطور قابل توجهی مورد استفاده قرار گرفته است ( فاترکوا و همکاران، 2013). گرده گل  حاوی 10 تا 40 درصد پروتئین، 1 تا 13 درصد لیپید، 13 تا 55 درصد کربوهیدرات و 2 تا 6 درصد خاکستر می­باشد. ترکیبات مهم و فعال زیستی گرده گل عبارتند از: اسید آمینه­های مختلف اصلی (به ویژه اسیدهای آمینه آزاد پرولین و لیزین) و کلاژن (مورایز و همکاران، 2011؛ بوسلی و همکاران، 2003) ، اسیدهای آلی آزاد با ساختار غیر معمول و کم­یاب در طبیعت مانند مونو و هیدروکسی اسیدها و دی­هیدروکسی­کربوکسیلیک­اسیدها با 8 و 10 اتم کربن، ویتامین­ها و مواد معدنی و ترکیبات فرعی دیگر مانند  پلی­فنل­ها (آلمراز و همکاران، 2004)، نوکلئوتیدها، استیل کولین و ترکیبات هورمونی(رامادان و القمدی، 2014، سرنگوتا و همکاران، 2011)، گلیکوپروتئین­ها و پپتیدهای مختلف (میاموتو و همکاران، 2004).

حضور این ترکیبات باعث ویژگی­های عملکردی و سلامتی­بخش در گرده گل گردیده است که عبارتند از: نیرو­زا و تقویت کننده  (کاماکورا و همکاران، 2001؛ سرنگوتا و همکاران، 2011)، تحریک کننده زیستی و ضد پیری (استوینو و همکاران، 2012؛ بوگدانو، 2014)، حفاظت و کاهش اکسایش مولکول­های DNA (اینو و همکاران، 2003)، تقویت سیستم ایمنی بدن (اوه و چانگ، 2006؛ الکساندرو و مارشیتا،2013)، حفاظت از سیستم عصبی (هاشیموتو و همکاران، 2005)، پیشگیری از بیماری­های قلب و عروق (بوگدانو و همکاران، 2014)، اثرات ضد میکروبی (فونتانا و همکاران، 2004)، اثر آنتی اکسیدانی (ناگای و همکاران، 2006).

اکسیداسیون یک واکنش طبیعی است که در اندام های زنده موجودات رخ می­دهد و یکی از اثرات جانبی آن تولید رادیکال­های آزاد می­باشد. این رادیکال­های آزاد به طور طبیعی درطی واکنش­های داخلی و همچنین در جریان واکنش تنفس در اندام­های هوازی و نیز در شروع فرآیندهای طبیعی دیگری همچون تولید انرژی به وجود می­آیند که اغلب شامل رادیکال­های آنیونی سوپر اکسیداز (O-2) و رادیکال­های هیدروکسیل(OH) می­باشند. واکنش­های زنجیره­ای اکسیداسیونی که در اثر حمله این رادیکال­های آزاد به مولکول­های حاوی الکترون به وجود می­آیند، دلیل بسیاری از بیماری­هایی همچون بیماری­های قلبی، تصلب شرائین، دیابت و سرطان می­باشند.

با توجه به ویژگی­های ذکر شده در مورد گرده زنبور عسل و با در نظر گرفتن اینکه در کشور ما ایران، علیرغم اینکه کیفیت محصولات جانبی زنبور عسل نسبت به سایر کشورهای تولید کننده بسیار بالاتر است، توجه اندکی به آنها می­شود و این محصولات با ارزش جایگاه خود در صنایع غذایی و دارویی بطور کامل بدست نیاورده­اند. بنابراین لازم است با بررسی ویژگی­های کاربردی آنها و قابلیت کاربردشان در مواد غذایی به عنوان یک افزودنی طبیعی و سلامتی بخش و جلوگیری کننده از بسیاری از بیماری­ها، توجه بسیاری از متخصصان در صنعت غذا، زنبورداری و داروسازی به این محصولات معطوف گردد. همانطور که در بالا ذکر شد، یکی از ویژگی­های عملکردی و سلامتی بخش گرده گل، ویژگی آنتی­اکسیدانی آناست. مشخص شده است که ویژگی آنتی­اکسیدانی گرده گل­ها مربوط به پروتئین­های اصلی و ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی آنها بوده (ناگای و اینو، 2004) و دی و تری پپتیدهای حاصل از هیدرولیز پروتئینی فعالیت آنتی­اکسیدانی قوی­تری از خود نشان می­دهند (کاواشیما و همکاران، 1979؛ گیو و همکاران، 2009). دلایل مربوط به عملکردآنتی­اکسیدانی این پپتیدها  شامل موارد زیر می­باشد: قابلیت احیاء وفعالیت پاک­کنندگی رادیکال­های آزاد، خاصیت خنثی­کنندگی برخی از  ترکیبات سمی همانند رادیکال­های هیدروکسیل و خاصیت شلاته کنندگی کاتیون­های فلزی پراکسیدان (سرمدی و اسماعیل، 2010).

اما پپتیدهای آنتی­اکسیدان نیز همانند سایر ترکیبات زیست فعال نظیر پلی­فنل­ها و کارتنوئیدها دارای معایبی می­باشند. ازجمله این معایب میتوان به ناپایداری شیمیایی (تحت تاثیر دما، نور، اکسیژن)، طعم تلخ و جاذب­الرطوبگی[1] بالای این ترکیبات اشاره کرد (موهان و همکاران، 2015). بنابراین انکپسولاسیون پپتیدهای زیست فعال روشی موثر برای بهبود پایداری و کاهش معایب فوق است. روشهای متعددی برای افزایش حفاظت، پایداری، بهبود زیست دسترسی و همچنین غنی­سازی فرمولاسیون­های غذایی با این ترکیبات بررسی شده­اند. در بین روش­های مختلف ریزپوشانی ترکیبات زیست فعال در مقیاس میکرو، خشک­کردن پاششی فرآیندی رایج، اقتصادی و انعطاف­پذیر است که بوسیله آن میتوان انواع محصولات مایع را به پودرهایی با قابلیت نگهداری طولانی­مدت، پایداری فیزیکوشیمیایی و میکروبی بالا، و ویژگی­های عملکردی مناسب تبدیل کرد (جعفری و همکاران، 2007؛ سرابندی و همکاران، 2018). از تحقیقات انجام شده با این فرآیند میتوان به میکروانکپسولاسیون به روش خشک کردن پاششی روغن گردو (ژو و همکاران، 2017)، آنتوسیانین­های گلبرگ زعفران[2] (مهدوی خزائی و همکاران، 2014)، هیدرولیزشده کازئین (سرابندی و همکاران، 2018)، هیدرولیزشده پروتئین آب پنیر (یانگ و همکاران، 2012) و هیدرولیزشده بزرک (اکبربگلو و همکاران، 2019) اشاره کرد.

در بین روش­های ریزپوشانی ترکیبات زیست فعال در ابعاد نانو نیز، نانولیپوزوم­ها از اهمیت بسیار زیادی برخوردارند. در بین انواع سیستمهای رسانش، نانولیپوزوم­ها به­علت استفاده از ترکیبات و اجزای خوراکی در فرمولاسیون تولید خود، قابلیت هدفمندسازی[3] و حمل همزمان هر دو نوع ترکیبات زیست فعال هیدروفیل و لیپوفیل از اهمیت ویژه­ای برخوردارند (کاتوزیان، 2016). این ویژگی­ها موجب شده تا بارگیری انواع ترکیبات رنگی، طعمی، غذا-دارو، ویتامین­ها، اسیدهای چرب، فیتواسترول­ها، آنزیم­ها، پروبیوتیک­ها، پپتیدهای دارویی و هیدرولیزشده­های پروتئینی، پلی­فنل­ها و آنتوسیانین­ها در ساختار نانولیپوزوم­ها مطالعه شده است (اسدپور و جعفری، 2018).

تاجائیکه میدانیم، مطالعات چندانی در خصوص استخراج عصاره و پروتئین از گرده گل شقایق ایرانی (Papaver bracteatum) و تولید پپتیدهای زیست فعال از آن و همچنین بارگیری عصاره و ترکیبات در نانو و میکروحامل­ها صورت نپذیرفته است. در نهایت، عصاره آنتی­اکسیدان گرده گل بعنوان منبع رنگ و ترکیبات سلامتی بخش طبیعی در شکل ریزپوشانی شده در فرمولاسیون محصولات غذایی بکار نرفته است.

1. آیا هیدرولیز آنزیمی پروتئین­های استخراج شده موجب بهبود ویژگی­های عملکردی محصول می­شود؟

2. اثر هر یک از آنزیم­های مورد استفاده و زمان هیدرولیز بر شاخص­های درجه هیدرولیز و فعالیت آنتی­اکسیدانی پپتیدهای حاصل چگونه است؟

3. آیا پپتیدهای حاصل از هیدرولیز آنزیمی پروتئین گردهه گل شقایق وحشی ایرانی از قابلیت شلاته­کنندگی یون­های فلزی پرواکسیدان برخوردارند؟

4. کدامیک از آنزیم­های مورد بررسی نقش موثرتری در تولید ترکیبات هیدرولیز شده با ویژگی­های عملکردی و آنتی­اکسیدانی ایفا می­کنند؟

5. تاثیر فرآیند جزء به جزء کردن پپتیدها به فراکسیون­های با وزن مولکولی مختلف بر فعالیت  آنتی­اکسیدانی آنها چگونه است؟

6. آیا ریزپوشانی عصاره گرده گل شقایق وحشی موجب بهبود پایداری و ویژگیهای فیزیکوشیمیایی آن می­شود؟

7. آیا عصاره ریزپوشانی شده را میتوان بعنوان منبع رنگ و آنتی اکسیدان طبیعی در فرمولاسیون پاستیل استفاده کرد؟

ی-  فرضیه‏های تحقیق:

1. فرض می­شود هیدرولیز آنزیمی پروتئین­های حاصل از گرده گل­ شقایق وحشی ایرانی موجب بهبود ویژگی­های عملکردی و حلالیت آن­ها می­شود

2. پروتئین­های هیدرولیز شده از حلالیت بالاتری در pH های اسیدی نسبت به پروتئین اولیه برخوردارند

3. قابلیت امولسیون کنندگی و کف کنندگی پروتئین­ها در اثر هیدرولیز آنزیمی به ویژه در شرایط اسیدی بهبود می­یابد

4. هیدرولیز آنزیمی موجب بهبود فعالیت آنتی­اکسیدانی پروتئین اولیه می­شود

5. هیدرولیز شده­های حاصل از آنزیم­های پروتئاز از قابلیت شلاته کنندگی کارامد و بالاتری در مقایسه با پروتئین اولیه برخوردارند

6. استفاده از ریزپوشانی به روش خشک کردن پاششی منجر به پایدارسازی و بهبود ویژگیهای فیزیکوشیمیایی عصاره گرده گل شقایق در طول خشک کردن پاششی می­شود.

7. عصاره ریزپوشانی شده از قابلیت بالایی در غنی سازی فرمول پاستیل بعنوان منبع رنگ و آنتی اکسیدان طبیعی برخوردار است.

تولید و پایدارسازی پپتیدهای زیست فعال و عصاره گرده گل شقایق ایرانی (Papaver bracteatum) درون میکرو و نانوحامل­ها و کاربرد آن بعنوان منبع رنگ و آنتی­اکسیدان طبیعی در فرمولاسیون پاستیل فراسودمند

1. استخراج پروتئین و تولید پپتیدهای زیست فعال از پروتئین گرده گل شقایق وحشی ایرانی

2. ارزیابی تاثیر نوع آنزیم و درجه هیدرولیز بر ویژگی­های عملکردی و مقایسه فعالیت آنتی­اکسیدانی پپتیدها

3. تاثیر فرآیند جزء به جزء کردن پپتیدها به فراکسیون­های با وزن مولکولی متفاوت بر شاخص­های آنتی­اکسیدانی

4.  بررسی تاثیر فرآیند ریزپوشانی با خشک کردن پاششی بر ویژگیهای فیزیکی و پایداری آنتی اکسیدانی و مورفولوژی عصاره

5. بررسی تاثیر بارگیری پپتیدهای حاصل از هیدرولیز پروتئین گرده گل شقایق وحشی بر ویژگیهای فیزیکوشیمیایی، پایداری و رهایش نانولیپوزومها

مراکز تحقیقات و کارخانجات تولیدی صنایع غذایی و دانشکده ها و آموزشگاههای علوم تغذیه و صنایع غذایی

-گرده گل بعنوان منبع تغذیه زنبور عسل

-پپتیدهای زیست فعال بعنوان ترکیبات سلامتی بخش و انتی اکسیدان

-نانولیپوزوم بعنوان سامانه رسانش هدفمند ترکیبات زیست فعال در فرمولاسیون های غذایی و دارویی

تحلیلی-توصیفی

پاستیل های غنی شده با پپتیدهای زیست فعال ریزپوشانی شده حاصل از گرده گل درون نانولیپوزوم ها

مقدار 500 گرم گرده گل

گرده های گل از مزارع و باغات پرورش گل و تولید کنندگان عسل واقع در آذربایجان غربی تهیه و جمع آوری خواهند شد. 

آنالیزهای آزمایشگاهی و دستگاهی

استخراج پروتئین

به منظور چربی زدایی، هر یک از گرده­های گل پس از آسیاب کردن و تولید پودر  به نسبت 1:4 (وزنی/ حجمی) با هگزان مخلوط می‌شود و به مدت 3 ساعت در دمای اتاق همزده می‌شود. سپس با استفاده از قیف بوخنر هگزان جدا شده و آرد حاصل در دمای اتاق خشک می­گردد و از الک با مش 40 عبور داده می‌شود. عملیات استخراج پروتئین از پودر چربی زدایی شده به اینصورت خواهد بود که پودر چربی گیری شده به نسبت 1:10 با محلول  NaCl33/0مولار، 25/9pH= مخلوط شده و به مدت 2 ساعت همزده می‌شود، سپس محلول حاصل در ×g4500 به مدت 30 دقیقه سانتریفوژ خواهد شد. در مرحله بعد pH سوپرناتانت در 5/4pH = (pH ایزوالکتریک پروتئین) تنظیم خواهد شد. سپس در جهت رسوب پروتئین‌ها، محلول حاصل درg×4500 به مدت 20 دقیقه سانتریفوژ می‌شود. در ادامه رسوب پروتئین با آب مقطر دو بار شسته شده و درg ×4500، به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ می‌شود و با تنظیم2/7pH = با افزودن NaOH 1 مولار، دوباره به حالت محلول تبدیل خواهد شد. سپس کنسانتره پروتئین حاصل با فریز درایر خشک شده و در دمایC°4 نگهداری می‌شود. تمامی فرآیندها در دمای اتاق انجام می‌شود (فیضی و همکاران، 2015).

تهیه پروتئین هیدرولیز شده

برای فرآیند هیدرولیز آنزیمی، پروتئین­های استخراج شده از گرده گل­ها را در غلظت  (W/V)5% در بافر فسفات M2/0 مولار (4/7pH=) حل نموده و امکان هیدراته شدن کامل آن در حین هم­زدن مداوم به مدت min30 در دمای محیط محیاء خواهد شد. سپس محلول اولیه آنزیم پانکراتین و تریپسین در بافر فوق و در نسبت آنزیم به پروتئین سوبسترا  (W/W) 2% به محلول حاوی پروتئین افزوده می­شود. دمای واکنش Cº 40 و زمان واکنش در شرایط هم­زدن مداوم با دور rpm 200 ، 150 دقیقه در نظر گرفته خواهد شد. پس از اتمام فرآیند هیدرولیز، برای غیرفعال کردن واکنش و فعالیت آنزیم، محیط واکنش در حمام آب Cº 90 به مدت  min15 قرار داده می­شود. پس از آن، محلول تا دمای محیط خنک می­شود. محلول در دور rpm 5000 به مدت  min10 سانتریفیوژ خواهد شد. سوپرناتانت جدا، لیوفیلیزه و تا زمان استفاده در دمای Cº 20- نگهداری می­شود. تمام مراحل فوق برای هدرولیز آنزیمی با آلکالاز در بافر با 8pH= و دمایCº 50  و برای پپسین در2 pH= در دمای Cº  37 انجام خواهد شد (چن و همکاران، 2011).

حلالیت

برای تعیین حلالیت پروتئین‌های هیدرولیز شده از روش جامدار و همکاران (2010) با مقداری اصلاحات استفاده خواهد شد. بدین ترتیب که، 200 میلی‌گرم پروتئین هیدرولیز شده در 20 میلی‌لیتر آب مقطر پراکنده و pH مخلوط با استفاده از سود یا اسیدکلریدریک 1 نرمال روی 1 تا 12 تنظیم می­شود. محلول در g 10000 برای 10 دقیقه سانتریفوژ می­شود. سپس مقدار پروتئین موجود در محلول رویی با استفاده از روش بردفورد (1976) تعیین و درصد حلالیت بر اساس مقدار پروتئین محلول بر پروتئین کل نمونه تعیین خواهد شد.

ویژگی‌های امولسیفیه‌کنندگی

ویژگی‌های امولسیفیه کنندگی پروتئین‌های هیدرولیز شده بر‌طبق روش کلامپانگ و همکاران (2007) با اندکی اصلاحات تعیین خواهد گردید. ابتدا 5 میلی‌لیتر روغن هسته انگور و 15 میلی‌لیتر محلول 1% پروتئین با هم مخلوط و  pHبا استفاده از سود یا اسید کلریدریک 1 نرمال به 3، 5، 6، 7 و 9 تنظیم می­شود. مخلوط با استفاده از هموژنایزر در سرعت rpm20000 به‌مدت 1 دقیقه هموژن می­شود. سپس، 50 میکرولیتر نمونه امولسیون در زمان 0 و 10 دقیقه پس از هموژنیزاسیون از انتهای ظرف برداشته و با 5 میلی‌لیتر محلول 1/0 درصد سدیم دودسیل سولفات (SDS) مخلوط می­شود. جذب محلول رقیق شده در 500 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر خوانده می­شود. مقدار جذب در زمان اولیه (A₀) و 10 دقیقه پس از تشکیل امولسیون (A₁₀) برای محاسبه فعالیت امولسیون کنندگی (EAI) و شاخص پایداری امولسیون (ESI) با استفاده از معادلات زیر محاسبه می‌شوند:

EAI (m²/g) = (2 × 2.303 × A₀)/ 0.25 × protein weight (g)                              (معادله 1)

ESI (%) = (A₀ - A₁₀/A₀) × 100                                                                             (معادله 2)

ویژگی‌های کف‌کنندگی

ظرفیت و پایداری کف‌کنندگی پروتئین هیدرولیز شده بر‌طبق روش کلامپانگ و همکاران (2007) با اندکی اصلاحات تعیین می­شود. حجم 15 میلی‌لیتر محلول 5/0 درصد نمونه با استفاده از سود یا اسیدکلریدریک 1 نرمال،  pHآن به 3، 5، 6، 7 و 9 تنظیم و هموژنیزاسیون در سرعت rpm16000 به‌مدت 2 دقیقه با هدف ورود هوا به درون محلول در دمای محیط انجام می­شود. نمونه زده شده به سرعت به استوانه مدرج 25 میلی‌لیتر منتقل و حجم کل پس از 1 دقیقه خوانده می­شود. ظرفیت کف کنندگی (FC) بر طبق معادله زیر محاسبه خواهد شد:

FC (%) = (A /B) × 100                                                                                         (معادله 3)

در اینجا، A حجم کف پس از زدن (میلی‌لیتر) و B حجم اولیه قبل از زدن (میلی‌لیتر) می‌باشد.

نمونه‌های زده شده در دمای Cº 25 برای 10 دقیقه نگهداری، سپس حجم کف خوانده می­شود. پایداری کف (FS) با معادله زیر محاسبه می­شود:

FS (%) = (A /B) × 100                                                                                         (معادله 4)

در اینجا، A حجم کف پس از نگهداری (میلی‌لیتر) و B حجم اولیه قبل از زدن (میلی‌لیتر) می‌باشد.

تعیین درجه هیدرولیز

سوسپانسیون پروتئین هیدرولیز شده و تری کلرواستیک اسید (M 44/0) در نسبت حجمی 1:1 مخلوط و به مدت 15 دقیقه در دمای Cº 4 انکوبه می­شود. سپس، مخلوط در rpm 10000 و به مدت  min10 سانتریفوژ می­شود. مقدار پروتئین موجود در سوپرناتانت حاوی تری کلرواستیک اسید M 22/0 با روش بردفورد (بردفورد، 1976) تعیین می­گردد.

جزء به جزء کردن پپتیدها

هر یک از سوپرناتانت­های حاوی هیدرولیزشده­ها با آنزیم­های مختلف بصورت مجزا در چند مرحله از سیستم غشایی اولترافیلتراسیون با قابلیت­های جداسازی متفاوت (molecular weight cutoff = 100, 30, 10 kDa, Millipore, UK) بر حسب وزن مولکولی بمدت 20 دقیقه و در g  × 2500 عبور داده خواهند شد. بدین شکل که ابتدا سوپرناتانت از فیلتر 100 عبور سپس بخش عبور کرده از فیلتر از فیلتر30 و 10 عبور داده می­شوند و در هر مرحله پپتیدها و هیدرولیزشده­های مانده در فیلترها جداسازی و به روش انجمادی خشک خواهند شد. سپس برای انجام دیگر آزمون­ها در فریزر نگهداری خواهند شد (لیناریس و همکاران، 2015).

آنالیز اسید آمینه کل و آزاد

ترکیب آمینواسیدی هیدرولیزشده­ها با استفاده از روش آلاشی و همکاران (2019) و با دستگاه HPLC مجهز به ستون با فاز معکوس (Novapack C18, 4μm, Waters, Milford, MA) تعیین گردید. در ابتدا هر یک از هیدرولیزشده­ها بمدت 24 ساعت در اسید کلریدریک 6 نرمال در دمای С˚ 110 هضم می­شوند. تعیین اسیدهای آمینه آزاد نیز پس از انحلال هر یک از هیدرولیزشده­ها در آب دوبار تقطیر انجام می­شود.

فعالیت مهار رادیکال DPPH

درصد مهار رادیکال آزاد DPPH با استفاده از روش وو و همکاران (2003) با کمی اصلاحات تعیین می­شود. ابتدا پودرهای پروتئین هیدرولیز شده در آب مقطر (mg/ml40) حل می­شوند. سپس، ml 5/1 از هر نمونه با ml 5/1 از محلول اتانولی DPPH (mM 15/0) مخلوط و بمدت 20 ثانیه ورتکس می­شود. سپس، مخلوط حاصل در rpm 2500 به مدت  min10 سانتریفوژ و بمدت  min20 در تاریکی نگهداری می­شود. جذب محلول سوپرناتانت در طول موج nm 517 خوانده می­شود.

فعالیت مهار رادیکال ABTS

فعالیت مهار رادیکال ABTS پودرهای پروتئین هیدرولیز شده با استفاده از روش تشریح شده توسط یو و همکاران (2010) با کمی اصلاحات تعیین می­شود. محلول رادیکال ⁺ABTS با ترکیب نسبت حجمی یکسانی از ABTS در غلظت mM 7 و mM 45/2 پتاسیم پرسولفات تهیه می­گردد. مخلوط در تاریکی و در دمای محیط به مدت h 16-12 قبل از مصرف قرار داده می­شود. در این مدت، اکسیداسیون و تولید رادیکال ⁺ABTS به وسیله پتاسیم پرسولفات انجام می­گیرد. قبل از آزمون، محلول ⁺ABTS با استفاده از (M, pH 7.4 2/0) [1]PBS تا جذب 02/0 ± 7/0 در nm 734 رقیق می­شود. سپس µl 40 از هر نمونه (حاوی  mg protein/mL4) به ml 4 محلول رقیق شده ⁺ABTS افزوده شد. مخلوط برای 30 ثانیه به شدت ورتکس و به مدت  min6 در تاریکی قرار داده می­شود. جذب محلول نهایی در nm 734 اندازه­گیری می­شود. منحنی استاندارد با واکنش µl 40 ترولوکس[2] (μM 1000، 750، 500، 250، 100، 50) با ml 4 محلول رقیق شده ⁺ABTS تهیه می­شود. درصد مهار رادیکال ⁺ABTS نمونه­ها بر اساس معادله زیر محاسبه خواهد شد. همچنین، فعالیت مهار رادیکال ⁺ABTS بر اساس منحنی استاندارد ترولوکس به شکل ظرفیت آنتی­اکسیدانی معادل ترولوکس[3] (TEAC, mM) بیان می­شود.

فعالیت قدرت احیاءکنندگی

برای تعیین قدرت احیاءکنندگی نمونه­های هیدرولیز شده، ml 5/0 نمونه حل شده در آب مقطر (در غلظت mg/ml40) با ml 5/0 بافرفسفات M2/0 (pH 6.6) و ml 5/0پتاسیم فری­سیانید (W/V) 1% مخلوط می­شود. مخلوط در دمای Cº 50 برای min 20 دقیقه انکوبه می­شود. سپس، ml 5/0 محلول تری­کلرو استیک اسید 10% به مخلوط اضافه و به­مدت min 10 در rpm 2500 سانتریفوژ می­شود. در نهایت، ml 1 سوپرناتانت با ml 1 آب مقطر و ml 2/0 فریک کلراید  (W/V)1/0% مخلوط می­شود. جذب نمونه در nm 700 پس از min 10 نگهداری مخلوط در دمای محیط، خوانده می­شود. حجم یکسانی آب مقطر به جای نمونه برای تهیه نمونه کنترل استفاده می­شود. افزایش جذب مخلوط واکنش نشان دهنده افزایش قدرت احیاءکنندگی است (احمدی و همکاران، 2007).

فعالیت مهار رادیکال هیدروکسیل

فعالیت مهار رادیکال هیدروکسیل با استفاده از اکسیداسیون 2-داکسی ریبوز[4] بر طبق روش کیم و مینامیکاوا (1997) و با اندکی اصلاحات تعیین می­شود. برای این آزمون، ml 2/0 از مخلوط mM 10 (FeSO₄-EDTA)، ml 5/0 (mM 10) آلفاداکسی ریبوز، ml 2/0 نمونه هیدرولیز شده، ml 9/0 سدیم فسفات بافرM 2/0 (pH 7.4) و ml 2/0 پراکسید هیدروژن (mM 10) با هم مخلوط می­شوند. مخلوط در Cº 37 برای h 1 انکوبه می­شود. سپس، ml 1 تری کلرواستیک اسید (TCA) 8/2% برای توقف واکنش به مخلوط افزوده می­شود. مخلوط برای min 15 در حمام آب جوش قرار، در یخ سرد شده، سپس جذب آن در nm 532 با اسپکتروفتومتر اندازه­گیری می­شود. حجم یکسانی آب مقطر به جای نمونه برای تهیه شاهد استفاده می­گردد. فعالیت مهارکنندگی رادیکال هیدروکسیل به شکل سرعت مهار اکسیداسیون آلفاداکسی ریبوز به­وسیله رادیکال­های هیدروکسیل ارزیابی می­شود.

فعالیت شلاته­کنندگی یون آهن

فعالیت شلاته­کنندگی یون آهن بر طبق روش دکر و ولچ (1990) اندازه­گیری می­شود. ابتدا، ml 1 نمونه حل شده در آب مقطر (در غلظت mg/ml40) با ml 05/0 محلول دی کلرید آهن (mM 2) و ml 85/1 آب دوبار تقطیر مخلوط می­شود. سپس، ml 1/0 محلول فروزین[5] (mM 5) افزوده و مخلوط به شدت هم­زده می­شود. جذب پس از min 10 نگهداری مخلوط در دمای محیط در nm 562 خوانده می­شود. آب دوبار تقطیر به عنوان نمونه شاهد مورد استفاده قرار می­گیرد.

فعالیت شلاته کنندگی یون مس

فعالیت شلاته­کنندگی یون مس پروتئین­های هیدرولیز شده با استفاده از روش کانگ و ژیانگ (2006) اندازه­گیری می­شود. در ابتدا، ml 1 محلول mM 2/0 سولفات مس[6] با ml 1 هیدرولیز شده در فالکون ml 15 مخلوط و برای min 5 در دمای اتاق انکوبه می­شود. سپس، ml 1 محلول تری کلرواستیک اسید 3/11% افزوده و نمونه­ها در rpm 2500 برای min 10 سانتریفوژ می­شوند. پس از آن، ml 2 از سوپرناتانت به ml 1 محلول 10% پیریدین[7] و µl 20 پیروکاتکول ویولت[8] افزوده و مخلوط ورتکس و برای min 5 در دمای اتاق انکوبه می­شود. جذب نمونه­ها در nm 632 خوانده و فعالیت شلاته­کنندگی یون مس تعیین می­گردد.

فعالیت آنتی­اکسیدانی در امولسیون

امولسیون روغن در آب با هموژن کردن g 1 روغن هسته انگور و µl 100 تویین 20 با ml 100 آب مقطر با استفاده از هموژنایزر با سرعت rpm 22000 برای min 2 در حمام یخ تهیه می­شود. نمونه­ها برای ارزیابی اکسیداسیون لیپیدی با مخلوط نمودن ml 8 امولسیون روغن، ml 5/0 محلول 2/0% اسکوربیک اسید، ml 5/0 محلول ppm 200 سولفات آهن (FeSO₄) و ml 1 محلول پروتئین هیدرولیز شده (در غلظت mg/ml40) تهیه می­شوند. سپس، نمونه­ها در Cº 37 برای h 16 انکوبه می­شوند. پس از انکوباسیون، ml 1 از هر نمونه به ml 2 محلول تیوباربیتوریک اسید[9]/ تری کلرواستیک اسید (mM TBA 20/TCA  15%) و µl 50 محلول BHA 10% در اتانول 90% افزوده و سپس ورتکس می­شود. مخلوط حاصل برای توسعه رنگ در حمام آب Cº 90 برای min 15 انکوبه می­شود. نمونه­ها در حمام آب یخ برای min 10 خنک و در rpm 3000 برای min 15 و در دمای Cº 5 سانتریفوژ می­شوند. جذب محلول در طول موج nm 532 اندازه­گیری می­شود. برای تهیه نمونه شاهد از مخلوط ml 1 آب مقطر با ml 2  محلول TBA/TCA استفاده می­شود. مقدار TBARS (ترکیبات حاصل از واکنش تیوباربیتوریک اسید) به شکل mg مالون آلدهید (MDA) بر لیتر امولسیون بیان می­شود (آبیران و همکاران، 2016).

فعالیت آنتی­اکسیدانی کل (TAA)

این روش بر مبنای احیاء (VI) Mo به مولیبدن (V) Mo می­باشد که با تشکیل کمپلکس سبز رنگ فسفومولیبدن[10] در محیط اسیدی همراه است. در این روش ml 1/0 از نمونه حل شده در آب مقطر (2.5-20 mg/mL) به ml1 از معرف[11] (اسیدسولفوریک 6/0 مولار، فسفات سدیم[12] 28 میلی مولار و آمونیوم مولیبدات 4 میلی مولار) افزوده شده و به­مدت 90 دقیقه در حمام آب 90 درجه سانتی گراد انکوبه می­شود. پس از سرد شدن، جذب نمونه­­ها در 695 نانومتر خوانده می­شود. از آب مقطر دوبار تقطیر به عنوان نمونه شاهد استفاده خواهد شد. جذب بیشتر نشان دهنده­ی ظرفیت آنتی اکسیدانی کل بیشتر است (اومایاپراواتیا و همکاران، 2014).

مهار رادیکال نیتریک اکسید (NO)

مهار رادیکال نیتریک اکسید بر اساس روش تشریح شده توسط تسایی و همکاران (2007) تعیین خواهد شد. برای این فرآیند در ابتدا 200 میکرولیتر نمونه در غلظت­های مختلف با 200 میکرولیتر سدیم نیتروپروساید 10 میلی مولار تهیه شده در بافر فسفات نمکی مخلوط شده و بمدت 150 دقیقه در زیر نور و در دمای محیط نگهداری خواهند شد. سپس حجم یکسانی از معرف گریس (ترکیب 1% سولفانیل آمید و 0.1 نفتیل اتیلن دی کلرید دی­آمین حل شده در محلول 2.5 درصد اسید فسفریک) به مخلوط اضافه خواهد شد. سپس جذب در طول موج 546 نانومتر خوانده و مشابه فرمول 1، درصد مهار رادیکال نیتریک اکسید محاسبه خواهد شد.

ریزپوشانی به روش خشک کردن پاششی

فرآیند انحلال عصاره گرده گل و مالتودکسترین درآب مقطر انجام خواهد شد. از مالتودکسترین در غلظت های 10، 20 و 30 درصد وزنی-حجمی بعنوان حامل در محلول عصاره استفاده خواهد شد. سپس فرآیند از یک خشک‌کن پاششی در مقیاس آزمایشگاهی استفاده می­شود. محفظه خشک‌کن به صورت استوانه‌ای با قسمت تحتانی مخروطی شکل با قطر قسمت استوانه‌ای 28 سانتی­متر و ارتفاع کل محفظه 80 سانتی­متر است. دستگاه مجهز به یک پمپ تغذیه حجمی پریستالتیک با دبی تغذیه متغیر با فشار 1 بار برای ارسال خوراک به نازل است. فرآیند پاشش توسط اتمایزر فشاری با قطر  cm2 و قابلیت عمل توسط کمپرسور هوا انجام می­شود. متغیرهای فرآیند بر طبق روش تشریح شده توسط اکبربگلو و همکاران (2019) تنظیم خواهند شد. بدین شکل که، از هوای ورودی با دمای (C˚130) و بصورت هم جهت با خوراک‎های از قبل تهیه شده برای خشک کردن استفاده می­شود. برای همه تیمارها، دبی خوراک ورودی 3 میلی­لیتر در دقیقه و دمای هوای خروجی در فرآیند C˚ 75 ثابت نگه­داشته می­شوند. پودرهای جمع شده در محفظه شیشه­ای تا رسیدن به دمای ثابت و ممانعت از تغییرات رطوبت در دسیکاتور نگهداری می­شوند. سپس محصولات ریزپوشانی شده در شیشه‌های تیره و دور از نور تا زمان انجام آزمایشات نگهداری خواهند گردید.

ویژگی­های فیزیکوشیمیایی پودرهای خشک شده به روش پاششی

بازده تولید با محاسبه نسبت جرمی پودر تولید شده به ماده جامد کل در خوراک تعیین می­شوند. سایر ویژگی­های فیزیکی پودرها مانند مقدار رطوبت، فعالیت آبی، دانسیته توده، زاویه ریپوز، حلالیت و جاذب­الرطوبه­بودن با استفاده از روشهای تشریح شده توسط سرابندی و همکاران (2018) محاسبه می­شوند.

حفظ فعالیت آنتی­اکسیدانی

درصد حفظ فعالیت آنتی­اکسیدانی (AA) در نمونه خشک شده به روش پاششی با تعیین فعالیت آنتی­اکسیدانی هیدرولیزشده­ها قبل و بعد از فرآیند ریزپوشانی محاسبه خواهند شد.

طیف سنجی فروسرخ (FTIR)

طیف سنجی فروسرخ در دستگاه FTIR مدل Shimadzu 8400، انجام گرفت. روش آماده­سازی نمونه برای اندازه­گیری طیف IR، به ­این صورت بود که در دستگاه FTIR، پپتیدهای خالص خشک شده به روش انجمادی و ذرات خشک شده به روش پاششی هر کدام جداگانه با نسبت 100:1 با برومید پتاسیم (KBr) مخلوط شده و از این مخلوط در طیف­سنجی استفاده می­شوند (سرابندی و همکاران، 2018).

مورفولوژی ذرات

ساختار ذرات پودر با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی (مدل هیتاچی PS-230، ژاپن) مورد ارزیابی قرار خواهند گرفت. نمونه‌ها به طور مجزا با استفاده از نوار چسب‌های دوسویه بر صفحه‌های آلومینیومی قرار می­گیرند. سپس عمل روکش‌دهی ذرات با استفاده از لایه نازکی از طلا انجام می­شود. در نهایت هر نمونه پوشش‌دهی شده به میکروسکوپ منتقل و مشاهده ساختار سطحی ذرات انجام می­شود.

نانولیپوزوم و ارزیابی ویژگی­ها

بارگیری پپتیدها و فراکسیون­های پپتیدی در نانولیپوزوم­ها

نانولیپوزوم با استفاده از روش هیدراسیون لایه نازک و بر اساس روش تشریح شده توسط سرابندی و همکاران (2019) تولید می گردند. فرآیند تولید لیپوزوم شامل انحلال به ترتیب، 09/0 و 01/0 گرم لیستین سویا و کلسترول در 10 میلی­لیتر اتانول مطلق است. فرآیند تبخیر و تشکیل فیلم نازک در انتهای بالن ته­گرد با استفاده از اواپراتور چرخان با دور rpm 60 در دمای С˚60 انجام خواهد گرفت. بالن مدور برای اطمینان از حذف کامل حلال، به­مدت 12 تا 18 ساعت در دسیکاتور و در دمای محیط نگهداری می­شود. سپس فیلم لیپیدی خشک شده با استفاده از بافرفسفات نمکی (PBS; pH 7.4) حاوی mg/ml 10 پروتئین هیدرولیزشده، به­مدت min1 با استفاده از ورتکس مجددا هیدراته می­گردد. محلول حاصل با استفاده از روتاری در دمای С˚60 به­مدت min2 هم­زده و به­مدت min 2 در دمای محیط هم­زده و خنک می­شود. این فرآیند هم­زدن در 3 مرتبه تکرار می­گردد. نهایتا محلول حاصل برای 10 مرحله و در هر مرحله به­مدت min 1 به­صورت متناوب تحت پروب فراصوت (توان 70% و سیکل 5/0) قرار می­گیرد. برای جلوگیری از افزایش دما، فرآیند فراصوت در شرایط نگهداری نانولیپوزوم در آب سرد انجام خواهد گرفت. درنهایت نانولیپوزوم تولید شده با غلظت لیپید (لیستین و کلسترول) mg/ml 10 تا زمان انجام آزمون­ها در یخچال نگهداری می­شود.

پوشش­دهی نانولیپوزوم­ها با کیتوزان

برای پوشش­دهی نانولیپوزوم­ها، اثر غلظت­های مختلفی از کیتوزان (1/0، 2/0، 4/0، 6/0 و 8/0 درصد وزنی-حجمی) بررسی خواهد شد. برای این آزمون، کیتوزان در محلول اسیداستیک 1% گلایسال به­مدت 24 ساعت حل و همزده خواهد شد. سپس حجم یکسانی از محلول­های کیتوزان به آرامی و به­صورت قطره قطره به محلول نانولیپوزوم در حین هم­زدن افزوده می­شود. نمونه­ها پس از پوشش­دهی به یخچال منتقل می­شوند (لی و همکاران، 2015).

تعیین اندازه ذرات، شاخص­بس­پاشیدگی و پتانسیل زتا

برای این منظور، هریک از نمونه­ها (نانولیپوزوم­های فاقد پوشش و پوشش­دهی شده) نخست با استفاده از بافر فسفات نمکی (PBS) به نسبت 1:100 رقیق می­شوند. اندازه ذرات (به­صورت Z- میانگین[13]) و شاخص بس­پاشیدگی آن­ها با طیف­سنجی همبستگی فوتونی به­وسیله دستگاه زتا سایزر (نانوسایزر 3000، شرکت مالورن، انگلستان)[14] در زاویه ˚90 و دمای С˚ 25 در داخل سل مخصوص دستگاه با عرض 01/0 متر اندازه­گیری می­شود. همچنین بار الکتریکی نانولیپوزوم­ها (به­صورت پتانسیل زتا)، هدایت الکتریکی ویژه و جنبش الکتروفورزی با استفاده از همین دستگاه اندازه­گیری خواهد شد.

بازده ریزپوشانی

بازده ریزپوشانی پپتیدها و فراکسیون­های پپتیدی حاصل از هیدرولیز آنزیمی پروتئین بزرک با استفاده از روش لی و همکاران (2015) با مقداری اصلاحات انجام خواهد گرفت. بدین شکل که برای تعیین مقدار پپتیدهای ریزپوشانی نشده در ساختار لیپوزوم (پروتئین­های آزاد)، مقدار 2 میلی­لیتر از نانولیپوزوم تهیه شده با روش سانتریفوژ با استفاده از فیلتر آمیکون (با وزن مولکولی عبوری 10 کیلودالتون) منتقل و به مدت 10 دقیقه در دور rpm 3000 سانتریفوژ می­شود. محلول عبور کرده از فیلتر برای تعیین میزان پروتئین­های بارگیری نشده یا آزاد به روش بردفورد (1976) مورد استفاده قرار خواهد گرفت.

رهایش ترکیبات ریزپوشانی­شده در شرایط مختلف نگهداری

اثر شرایط مختلف نگهداری بر رهایش پپتیدهای بارگیری شده در فرمول­های نانولیپوزوم به شرح زیر مورد بررسی قرار خواهد گرفت:

اثر نگهداری در دمای محیط و یخچال

برای تعیین اثر نگهداری در دمای یخچال (С˚ 4) و دمای محیط، از هر نمونه مقدار 2 میلی­لیتر به میکروتیوب منتقل؛ سپس به مدت 4 هفته در شرایط فوق نگهداری خواهد شد. سپس مقدار تغییر در اندازه ذرات و بازده ریزپوشانی مورد ارزیابی قرار خواهد گرفت (لی و همکاران، 2015).

غنی سازی و فرمولاسیون پاستیل

در این مطالعه، غنی­سازی پاستیل با نسبت­های مختلفی از پودر عصاره ریزپوشانی شده (2-5/0 % وزنی-وزنی) بعنوان منبع غنی از ترکیبات آنتی­اکسیدان و رنگ طبیعی انجام شد. در نهایت نتایج ارزیابی حسی با نمونه کنترل و پاستیل­های غنی شده با 2% عصاره آزاد مقایسه گردید. برای تولید پاستیل،  نخست فرآیند حرارت­دهی مخلوط سیروپ گلوکز (32%)، ساکارز (34%) و آب تا انحلال کامل آن­ها انجام شد. سپس ژلاتین (9%) در آب جوش به­مدت 10 دقیقه حل و به مخلوط سیروپ گلوکز و ساکارز افزوده شد. سپس سیتریک اسید (5/1%) در مقداری آب حل و به مخلوط اضافه شد (سرابندی و همکاران، 2019). پس از رسیدن دمای مخلوط به حدود С˚ 40، پودرهای حاوی عصاره و عصاره آزاد افزوده شد. فرآیند تولید نمونه کنترل بدون استفاده از عصاره آزاد و عصاره­های ریزپوشانی­شده انجام گرفت.

ارزیابی حسی

در این تحقیق، باتوجه به این­که هدف ارزیابی اثر فرآیند در این آزمون، ویژگی­ طعمی، رنگ، سفتی، چسبندگی، قابلیت جویدن، و پذیرش کلی نمونه­های تولید شده توسط 18 ارزیاب نیمه آموزش دیده از دانشجویان تحصیلات تکمیلی با استفاده از ارزیابی هدونیک 7 نقطه­ای و بر اساس امتیاز دهی از 1 (عدم مقبولیت) تا 7 (نمونه بسیار خوب) مورد بررسی قرار گرفتند.

در پژوهش حاضر، اثر آنزیم­های مختلف بر هیدرولیز پروتئین (نسبت آنزیم به سوبسترای 2 درصد) و وزن­های مولکولی پپتیدها و همچنین تاثیر نوع و ترکیبب حامل، نوع فرمول لیپوزوم بر ویژگی­های عملکردی و فعالیت آنتی­اکسیدانی و شلاته­کنندگی پروتئین هیدرولیز شده با کاربرد آنالیز واریانس و استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 19 مورد ارزیابی قرار خواهند گرفت تا فاکتور‌های مؤثر از لحاظ آماری شناسایی شوند و مقایسه میانگین­ها با استفاده از آزمون چند دامنه­ای دانکن جهت بررسی معنی­دار بودن اثر متغیرها در (P< 0.05) انجام خواهد گردید.

بر اساس  دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهشهای علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی  در جمهوری اسلامی ایران

و بندهای 1-  9- 10- 11 – 30 –و 31

1- هدف اصلی هر پژوهش‌باید ارتقای سلامت انسان‌ها توأم با رعایت کرامت و حقوق ایشان باشد.

9-در پژوهش‌های پزشکی که ممکن است به محیط زیست آسیب برسانند، باید احتیاط‌های لازم در جهت حفظ و نگهداری و عدم آسیب رسانی به محیط ریست انجام گیرد.

10- هر پژوهشی باید بر اساس و منطبق بر یک طرح‌نامه (پروپوزال) به انجام برسد. طرح‌نامه و دستورالعمل باید شامل تمامی اجزای ضروری باشد. از جمله بخش ملاحظات اخلاقی، اطلاعات مربوط به بودجه، حمایت کننده‌ها، وابستگی‌های سازمانی، موارد تعارض منافع بالقوه‌ی دیگرپیش از تصویب یا تأیید طرح‌نامه از سوی کمیته‌ی مستقل اخلاق در پژوهش، نباید اجرای پژوهش شروع شود.

11- کمیته‌ی اخلاق در پژوهش علاوه بر بررسی و تصویب طرح‌نامه و دستورالعمل، این حق را دارد که طرح‌‌ها را در حین و بعد از اجرا را از نظر رعایت ملاحظات اخلاقی مورد پایش قرار دهد. اطلاعات و مدارکی که برای پایش از سوی کمیته‌ی اخلاق درخواست می‌شود، باید از سوی پژوهشگران در اختیار این کمیته گذاشته شود.    

30 -گزارش‌ها و مقالات حاصل از پژوهش‌هایی که مفاد این راهنما را نقض کرده‌اند، نباید برای انتشار پذیرفته شوند.

31-روش پژوهش نباید با ارزش های اجتماعی، فرهنگی و دینی  جامعه در تناقض باشد.

تهیه برخی مواد تخصصی و کمبود یا عدم دسترسی به برخی تجهیزات تخصصی و امکانات آزمایشگاهی و نیاز به هماهنگی با سایر مراکز تحقیقاتی 

گرده گل؛ شقایق وحشی؛ پپتیدهای زیست فعال؛ نانولیپوزوم ها؛ پایدارسازی؛ پاستیل فراسودمند

Abeyrathne ED, Lee HY, Jo C, Suh JW, Ahn DU. Enzymatic hydrolysis of ovomucin and the functional and structural characteristics of peptides in the hydrolysates. Food chemistry. 2016 Feb 1;192:107-13.

Ahmadi F, Kadivar M, Shahedi M. Antioxidant activity of Kelussia odoratissima Mozaff. in model and food systems. Food chemistry. 2007 Jan 1;105(1):57-64.

Akbarbaglu Z, Jafari SM, Sarabandi K, Mohammadi M, Heshmati MK, Pezeshki A. Influence of spray drying encapsulation on the retention of antioxidant properties and microstructure of flaxseed protein hydrolysates. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2019 Jun 1;178:421-9.

Alashi AM, Blanchard CL, Mailer RJ, Agboola SO, Mawson AJ, He R, Girgih A, Aluko RE. Antioxidant properties of Australian canola meal protein hydrolysates. Food Chemistry. 2014 Mar 1;146:500-6.

Almaraz-Abarca, N., Campos, M.G., Avila-Reyes, J.A., Naranjo-Jimenez, N., HerreraCorral, J., Gonzalez-Valdez, L.S., 2004. Variability of antioxidant activity among honeybee-collected pollen of different botanical origin. Interciencia 29, 574-578.

Ambigaipalan P, Al-Khalifa AS, Shahidi F. Antioxidant and angiotensin I converting enzyme (ACE) inhibitory activities of date seed protein hydrolysates prepared using Alcalase, Flavourzyme and Thermolysin. Journal of Functional Foods. 2015 Oct 1;18:1125-37.

Balasundram N, Sundram K, Samman S. Phenolic compounds in plants and agri-industrial by-products: Antioxidant activity, occurrence, and potential uses. Food chemistry. 2006 Jan 1;99(1):191-203.

Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 1976 May 7;72(1-2):248-54.

Chen L, Chen J, Ren J, Zhao M. Modifications of soy protein isolates using combined extrusion pre-treatment and controlled enzymatic hydrolysis for improved emulsifying properties. Food Hydrocolloids. 2011 Jul 1;25(5):887-97.

Collins AR. Antioxidant intervention as a route to cancer prevention. European Journal of Cancer. 2005 Sep 1;41(13):1923-30.

Cumby N, Zhong Y, Naczk M, Shahidi F. Antioxidant activity and water-holding capacity of canola protein hydrolysates. Food chemistry. 2008 Jul 1;109(1):144-8.

da Rosa Zavareze, E., Telles, A. C., El Halal, S. L. M., da Rocha, M., Colussi, R., de Assis, L. M., ... & Prentice-Hernández, C. (2014). Production and characterization of encapsulated antioxidative protein hydrolysates from Whitemouth croaker (Micropogonias furnieri) muscle and byproduct. LWT-Food Science and Technology, 59(2), 841-848.

Decker EA, Welch B. Role of ferritin as a lipid oxidation catalyst in muscle food. Journal of Agricultural and food Chemistry. 1990 Mar;38(3):674-7.

Decker EA. Strategies for manipulating the prooxidative/antioxidative balance of foods to maximize oxidative stability. Trends in Food Science & Technology. 1998 Jun 1;9(6):241-8.

EVANGELHO JA, Berrios JD, Pinto VZ, Antunes MD, Vanier NL, Zavareze ED. Antioxidant activity of black bean (Phaseolus vulgaris L.) protein hydrolysates. Food Science and Technology. 2016 Jul;36:23-7.

F. Gibbs, Selim Kermasha, Inteaz Alli, Catherine N. Mulligan B. Encapsulation in the food industry: a review. International journal of food sciences and nutrition. 1999 Jan 1;50(3):213-24.

Fatrcová-Šramková, K., Nôžková, J., Kačániová, M., Máriássyová, M., Rovná, K., Stričík, M. 2013. Antioxidant and antimicrobial properties of monofloral bee pollen. Journal of Environmental Science and Health. 48: 133-138.

Fitzgerald C, Gallagher E, Doran L, Auty M, Prieto J, Hayes M. Increasing the health benefits of bread: Assessment of the physical and sensory qualities of bread formulated using a renin inhibitory Palmaria palmata protein hydrolysate. LWT-Food Science and Technology. 2014 May 1;56(2):398-405.

Hartmann R, Meisel H. Food-derived peptides with biological activity: from research to food applications. Current opinion in biotechnology. 2007 Apr 1;18(2):163-9.

Jafari SM, Assadpoor E, He Y, Bhandari B. Encapsulation efficiency of food flavours and oils during spray drying. Drying technology. 2008 Jul 1;26(7):816-35.

Jamdar SN, Rajalakshmi V, Pednekar MD, Juan F, Yardi V, Sharma A. Influence of degree of hydrolysis on functional properties, antioxidant activity and ACE inhibitory activity of peanut protein hydrolysate. Food chemistry. 2010 Jul 1;121(1):178-84.

Khazaei KM, Jafari SM, Ghorbani M, Kakhki AH. Application of maltodextrin and gum Arabic in microencapsulation of saffron petal's anthocyanins and evaluating their storage stability and color. Carbohydrate polymers. 2014 May 25;105:57-62.

Kim JW, Minamikawa T. Hydroxyl radical-scavenging effects of spices and scavengers from brown mustard (Brassica nigra). Bioscience, biotechnology, and biochemistry. 1997 Jan 23;61(1):118-23.

Klompong V, Benjakul S, Kantachote D, Shahidi F. Antioxidative activity and functional properties of protein hydrolysate of yellow stripe trevally (Selaroides leptolepis) as influenced by the degree of hydrolysis and enzyme type. Food chemistry. 2007 Jan 1;102(4):1317-27.

Kong B, Xiong YL. Antioxidant activity of zein hydrolysates in a liposome system and the possible mode of action. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2006 Aug 9;54(16):6059-68.

Lee SK, Han JH, Decker EA. Antioxidant activity of phosvitin in phosphatidylcholine liposomes and meat model systems. Journal of food science. 2002 Jan;67(1):37-41.

LI W, BOWERS JA, CRAIG JA, PERNG SK. Sodium tripolyphosphate stability and effect in ground turkey meat. Journal of Food Science. 1993 May;58(3):501-4.

Mahdavi SA, Jafari SM, Assadpoor E, Dehnad D. Microencapsulation optimization of natural anthocyanins with maltodextrin, gum Arabic and gelatin. International journal of biological macromolecules. 2016 Apr 1;85:379-85.

Mancuso JR, McClements DJ, Decker EA. The effects of surfactant type, pH, and chelators on the oxidation of salmon oil-in-water emulsions. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1999 Oct 18;47(10):4112-6.

McClements DJ, Decker EA. Lipid oxidation in oil‐in‐water emulsions: Impact of molecular environment on chemical reactions in heterogeneous food systems. Journal of food science. 2000 Nov;65(8):1270-82.

Miyamoto, M., Tsumura, K., Kimura, M., Okihara, S., Sugimoto, H., Yamada, H. 2004. N-glycans bearing beta-1,3-galactosyl residue in royal jelly glycoproteins. Glycobiology. 14 (11): 241.

Mohan A, McClements DJ, Udenigwe CC. Encapsulation of bioactive whey peptides in soy lecithin-derived nanoliposomes: Influence of peptide molecular weight. Food chemistry. 2016 Dec 15;213:143-8.

Mohan A, Rajendran SR, He QS, Bazinet L, Udenigwe CC. Encapsulation of food protein hydrolysates and peptides: a review. RSC advances. 2015;5(97):79270-8.

Morais, M., Moreira, L., Feás, X., Estevinho, L.M. 2011. Honeybee-collected pollen from five portuguese natural parks: Palynological origin phenolic content antioxidant properties and antimicrobial activity. Food and Chemical Toxicology 49, 1096-1101.

Mosquera, M., Giménez, B., da Silva, I. M., Boelter, J. F., Montero, P., Gómez-Guillén, M. C., & Brandelli, A. (2014). Nanoencapsulation of an active peptidic fraction from sea bream scales collagen. Food chemistry, 156, 144-150.

Pihlanto A. Antioxidative peptides derived from milk proteins. International dairy journal. 2006 Nov 1;16(11):1306-14.

Ramadan, M.F., Al-Ghamdi, A. 2012. Bioactive compounds and health-promoting properties of royal jelly: A review. Journal of  Functional Foods. 4:39–52.

Ramezanzade, L., Hosseini, S. F., & Nikkhah, M. (2017). Biopolymer-coated nanoliposomes as carriers of rainbow trout skin-derived antioxidant peptides. Food chemistry, 234, 220-229.

Rodsamran P, Sothornvit R. Physicochemical and functional properties of protein concentrate from by-product of coconut processing. Food chemistry. 2018 Feb 15;241:364-71.

Sarabandi K, Gharehbeglou P, Jafari SM. Spray-drying encapsulation of protein hydrolysates and bioactive peptides: Opportunities and challenges. Drying Technology. 2020 Apr 3;38(5-6):577-95.

Sarabandi K, Gharehbeglou P, Jafari SM. Spray-drying encapsulation of protein hydrolysates and bioactive peptides: Opportunities and challenges. Drying Technology. 2020 Apr 3;38(5-6):577-95.

Sarabandi K, Mahoonak AS, Hamishehkar H, Ghorbani M, Jafari SM. Protection of casein hydrolysates within nanoliposomes: Antioxidant and stability characterization. Journal of Food Engineering. 2019 Jun 1;251:19-28.

Sarabandi K, Mahoonak AS, Hamishekar H, Ghorbani M, Jafari SM. Microencapsulation of casein hydrolysates: Physicochemical, antioxidant and microstructure properties. Journal of Food Engineering. 2018 Nov 1;237:86-95.

Sarabandi K, Peighambardoust SH, Mahoonak AS, Samaei SP. Effect of carrier types and compositions on the production yield, microstructure and physical characteristics of spray dried sour cherry juice concentrate. Journal of Food Measurement and Characterization. 2017 Dec 1;11(4):1602-12.

Sarmadi BH, Ismail A. Antioxidative peptides from food proteins: a review. Peptides. 2010 Oct 1;31(10):1949-56.

Shahidi F, Rubin LJ, Diosady LL, Kassam N, Fong JL, Wood DF. Effect of sequestering agents on lipid oxidation in cooked meats. Food chemistry. 1986 Jan 1;21(2):145-52.

Sofos JN. Use of phosphates in low-sodium meat products. Food technology (USA). 1986.

Tong LM, Sasaki S, McClements DJ, Decker EA. Mechanisms of the antioxidant activity of a high molecular weight fraction of whey. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2000 May 15;48(5):1473-8.

Tsai PJ, Tsai TH, Yu CH, Ho SC. Comparison of NO-scavenging and NO-suppressing activities of different herbal teas with those of green tea. Food Chemistry. 2007 Jan 1;103(1):181-7.

Udenigwe CC, Lu YL, Han CH, Hou WC, Aluko RE. Flaxseed protein-derived peptide fractions: Antioxidant properties and inhibition of lipopolysaccharide-induced nitric oxide production in murine macrophages. Food Chemistry. 2009 Sep 1;116(1):277-84.

Umayaparvathi S, Meenakshi S, Vimalraj V, Arumugam M, Sivagami G, Balasubramanian T. Antioxidant activity and anticancer effect of bioactive peptide from enzymatic hydrolysate of oyster (Saccostrea cucullata). Biomedicine & Preventive Nutrition. 2014 Jul 1;4(3):343-53.

Wu HC, Chen HM, Shiau CY. Free amino acids and peptides as related to antioxidant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus). Food research international. 2003 Jan 1;36(9-10):949-57.

Xie J, Du M, Shen M, Wu T, Lin L. Physico-chemical properties, antioxidant activities and angiotensin-I converting enzyme inhibitory of protein hydrolysates from Mung bean (Vigna radiate). Food chemistry. 2019 Jan 1;270:243-50.

Yang S, Mao XY, Li FF, Zhang D, Leng XJ, Ren FZ, Teng GX. The improving effect of spray-drying encapsulation process on the bitter taste and stability of whey protein hydrolysate. European Food Research and Technology. 2012 Jul 1;235(1):91-7.

You L, Zhao M, Cui C, Zhao H, Yang B. Effect of degree of hydrolysis on the antioxidant activity of loach (Misgurnus anguillicaudatus) protein hydrolysates. Innovative food science & emerging technologies. 2009 Apr 1;10(2):235-40.

اطلاعات مربوط به ویژگیهای عملکردی پروتئین و پپتیدها درج خواهند شد