طراحی، ویژگی ها، پایداری و فرمولاسیون نانولیپوزوم و نانوکیتوزوم بارگیری شده با فراکسیون های پپتیدی حاصل از هیدرولیز آنزیمی پروتئین گرده گل زنبور عسل

اکسیداسیون یک واکنش طبیعی است که در اندام های زنده موجودات رخ می­دهد و یکی از اثرات جانبی آن تولید رادیکال­های آزاد می­باشد. این رادیکال­های آزاد به طور طبیعی درطی واکنش­های داخلی و همچنین در جریان واکنش تنفس در اندام­های هوازی و نیز در شروع فرآیندهای طبیعی دیگری همچون تولید انرژی به وجود می­آیند که اغلب شامل رادیکال­های آنیونی سوپر اکسیداز (O^-₂) و رادیکال­های هیدروکسیل (OH) می­باشند. واکنش­های زنجیره­ای اکسیداسیونی که در اثر حمله این رادیکال­های آزاد به مولکول­های حاوی الکترون به وجود می­آیند، دلیل بسیاری از بیماری­هایی همچون بیماری­های قلبی، تصلب شرائین، دیابت و سرطان می­باشند (شهیدی و ژانگ، 2015).

در صنایع مختلف، برای پیشگیری از اکسایش لیپیدها در محصولات غذایی و امولسیون­ها از آنتی­اکسیدان­های سنتزی (BHA، BHT و پروپیل گالات­ها) استفاده می­شود. اما به علت خطرات بالقوه، استفاده از این آنتی­اکسیدان­ها در برخی محصولات غذایی و برخی کشورها محدود یا ممنوع شده است. از این رو میل به استفاده از آنتی­اکسیدان­های طبیعی افزایش یافته است (پیلانهو و همکاران، 2006). یکی از این منابع تولید آنتی­اکسیدان­های طبیعی با ساختار پروتئین میباشد. در گذشته، پروتئین‌ها، تنها به‌عنوان منبع تأمین انرژی و آمینو‌اسیدهای ضروری مورد نیاز برای رشد و تنظیم عملکرد فیزیولوژیکی بدن در نظر گرفته می‌شدند. افزایش آگاهی مصرف کنندگان در ارتباط بین سلامت و رژیم غذایی منجر به افزایش تقاضا برای غذاهای فراسودمند شده است. بنابراین در سال‌های اخیر مطالعات پژوهشگران در جهت شناسایی پپتیدهای زیست فعال حاصل از منابع گیاهی و حیوانی سوق پیدا کرده است. این پپتید‌ها، بخش‌های پروتئینی خاصی هستند که به سه روش سنتز شیمیایی، تخمیر میکروبی و هیدرولیز آنزیمی تولید می‌شوند دارای 20-2 آمینو‌اسید و جرم مولکولی آنها کمتر از 6000 دالتون می‌باشد، بر حسب نوع و توالی آمینو‌اسیدی خود، تأثیر مثبتی بر عملکرد و شرایط بدن و در نتیجه سلامت فرد دارند، از جمله این تأثیرات می‌توان به اثرات ایمنی بخشی، آرام بخشی، ضد میکروبی، آنتی اکسیدانی، ضد فشار خون و ضد سرطان اشاره نمود (هارتمن و میسل، 2007).

پپتیدهای آنتی ­اکسیدان ترکیباتی سلامتی بخش، ایمن، با وزن مولکولی کم، هزینه اندک، زیست فعالی بالا و جذب آسان هستند. همچنین از دیگر مزایای این ترکیبات نسبت به آنتی ­اکسیدان­های سنتزی می­توان به پایداری بالاتر در شرایط مختلف، بی خطر بودن، ارزش تغذیه­ ای و عملکردی آن­ها اشاره کرد. فعالیت آنتی­ اکسیدانی پپتیدهای زیست فعال را می­توان به قابلیت مهاررادیکال­های آزاد، ممانعت از پراکسیداسیون لیپیدها و شلاته ­کنندگی یون­های فلزی نسبت داد. همچنین، مقدار فعالیت آنتی­ اکسیدانی این پپتیدها تحت تاثیر ساختار و توالی آمینواسیدی آن­ها قرار می­گیرد (سرمدی و اسماعیل، 2010).

مطالعات مختلف نشان داده است که پروتئین­های هیدرولیز شده توسط آنزیم، اثرات بیولوژیکی قوی­تری از خود نشان می­دهند (مینروینی و همکاران، 2003). پپتیدهای تولیدی توسط هیدرولیز آنزیمی می­توانند ویژگی­هایی مانند بهبود وضعیت سیستم ایمنی، فعالیت آنتی اکسیدانی، کاهش دهندگی کلسترول و تشدید جذب مواد معدنی را دارا باشند (جامدار و همکاران، 2010). در حال حاضر هیدرولیز آنزیمی رایج ترین روش برای اصلاح ویژگی­های پروتئین­های گیاهی و حیوانی به شمار می­رود. این روش برای تولید پپتید به منظور غنی­سازی نوشیدنی­ها و مواد غذایی، تغذیه بیماران، تولید ترکیبات زیست فعال (بازدارنده­ های آنزیم افزایش دهنده فشارخون، آنتی­ اکسیدان­های طبیعی و ...) در مواد غذایی و دارویی مورد استفاده قرار گرفته است. گزارش شده است که پپتیدهای بدست آمده از هیدرولیز پروتئین­های غذایی توسط پپسین، تریپسین و آلکالاز دارای ویژگی­های آنتی اکسیدانی می­باشند (ویریافان و همکاران، 2012). این نوع از هیدرولیز فرایندی پیچیده بوده و مطالعات اولیه فراوان برای انجام یک فرایند موفق ضروری است (زیوانویچ و همکاران، 2011).

یکی از منابع گیاهی مهم و با ارزش پروتئین­های گیاهی، گرده­های گل هستند. گرده گل­ها حاوی پروتئین، لیپید، کربوهیدرات، ویتامین­ها و مواد معدنی هستند و با دارا بودن ترکیبات مهم و فعال زیستی مختلف دارای خواص عملکردی و درمانی فراوانی بوده و در صنایع داروسازی و آرایشی و اخیرا در صنعت غذا  بطور قابل توجهی مورد استفاده قرار گرفته است ( فاترکوا و همکاران، 2013). گرده گل حاوی 10 تا 40 درصد پروتئین، 1 تا 13 درصد لیپید، 13 تا 55 درصد کربوهیدرات و 2 تا 6 درصد خاکستر می­باشد. ترکیبات مهم و فعال زیستی گرده گل عبارتند از: اسید آمینه­های مختلف اصلی (به ویژه اسیدهای آمینه آزاد پرولین و لیزین) و کلاژن (مورایز و همکاران، 2011)، اسیدهای آلی آزاد با ساختار غیر معمول و کم­یاب در طبیعت مانند مونو و هیدروکسی اسیدها و دی­هیدروکسی­کربوکسیلیک­اسیدها با 8 و 10 اتم کربن، ویتامین­ها و مواد معدنی و ترکیبات فرعی دیگر مانند پلی­فنل­ها (آلمراز و همکاران، 2004)، نوکلئوتیدها، استیل کولین و ترکیبات هورمونی (رامادان و القمدی، 2014)، گلیکوپروتئین­ها و پپتیدهای مختلف (میاموتو و همکاران، 2004).

با توجه به ویژگی­های ذکر شده در مورد گرده زنبور عسل و با در نظر گرفتن اینکه در کشور ما ایران، علیرغم اینکه کیفیت محصولات جانبی زنبور عسل نسبت به سایر کشورهای تولید کننده بسیار بالاتر است، توجه اندکی به آنها می­شود و این محصولات با ارزش جایگاه خود در صنایع غذایی و دارویی بطور کامل بدست نیاورده­اند. بنابراین لازم است با بررسی ویژگی­های کاربردی آنها و قابلیت کاربردشان در مواد غذایی به عنوان یک افزودنی طبیعی و سلامتی بخش و جلوگیری کننده از بسیاری از بیماری­ها، توجه بسیاری از متخصصان در صنعت غذا، زنبورداری و داروسازی به این محصولات معطوف گردد. همانطور که در بالا ذکر شد، یکی از ویژگی­های عملکردی و سلامتی بخش گرده گل، ویژگی آنتی­اکسیدانی آناست. مشخص شده است که ویژگی آنتی­اکسیدانی گرده گل­ها مربوط به پروتئین­های اصلی و ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی آنها بوده (ناگای و اینو، 2004) و دی و تری پپتیدهای حاصل از هیدرولیز پروتئینی فعالیت آنتی­اکسیدانی قوی­تری از خود نشان می­دهند (گیو و همکاران، 2009). دلایل مربوط به عملکردآنتی­اکسیدانی این پپتیدها  شامل موارد زیر می­باشد: قابلیت احیاء وفعالیت پاک­کنندگی رادیکال­های آزاد، خاصیت خنثی­کنندگی برخی از  ترکیبات سمی همانند رادیکال­های هیدروکسیل و خاصیت شلاته کنندگی کاتیون­های فلزی پراکسیدان (کیشیمورا و بنجاکول، 2010).

اما پپتیدهای آنتی­ اکسیدان نیز همانند سایر ترکیبات زیست فعال نظیر پلی­فنل­ها و کارتنوئیدها دارای معایبی می­باشند. ازجمله این معایب میتوان به ناپایداری شیمیایی (تحت تاثیر دما، نور، اکسیژن)، طعم تلخ و جاذب­الرطوبگی[1] بالای این ترکیبات اشاره کرد (موهان و همکاران، 2015). بنابراین انکپسولاسیون پپتیدهای زیست فعال روشی موثر برای بهبود پایداری و کاهش معایب فوق است. روشهای متعددی برای افزایش حفاظت، پایداری، بهبود زیست دسترسی و همچنین غنی­سازی فرمولاسیون­های غذایی با این ترکیبات بررسی شده­اند.

در بین انواع سیستمهای رسانش، نانولیپوزوم­ها به­علت استفاده از ترکیبات و اجزای خوراکی در فرمولاسیون تولید خود، قابلیت هدفمندسازی^[2] و حمل همزمان هر دو نوع ترکیبات زیست فعال هیدروفیل و لیپوفیل از اهمیت ویژه­ای برخوردارند (کاتوزیان، 2016). این ویژگی­ها موجب شده تا بارگیری انواع ترکیبات رنگی، طعمی، غذا-دارو^[3]، ویتامین­ها، اسیدهای چرب، فیتواسترول­ها، آنزیم­ها، پروبیوتیک­ها، پپتیدهای دارویی و هیدرولیزشده­ های پروتئینی، پلی ­فنل­ها و آنتوسیانین­ها در ساختار نانولیپوزوم­ها مطالعه شده است (اسدپور و جعفری، 2018). اما علیرغم مزایای ذکر شده، پایداری فیزیکی کم، حساسیت نسبتا زیاد به تنش­های دمایی و pH، و رهایش سریع ترکیبات بارگیری شده در شرایط نگهداری طولانی مدت، از مهمترین چالش­هایی هستند که استفاده از نانولیپوزوم­ها در ریزپوشانی ترکیبات زیست فعال و غنی­سازی فرمولاسیون­های مختلف غذایی را دشوار می­ سازند (مک کلمنت 2015). به ­این دلایل، تحقیقات مختلفی برای به حداقل رساندن این معایب انجام شده ­اند. یکی از راه حل­ های مورد استفاده برای افزایش پایداری نانولیپوزومها، بکارگیری ترکیبات پایدارکننده غشاء مانند کلسترول (مظفری، 2004) و پوشش­ دهی این ذرات با پلیمری با بار مخالف مانند کیتوزان است (زاوارز و همکاران، 2014). با این حال، وجود مکانیسم­های ناپایدارکننده مانند ادغام^[4]، توده­ ای شدن^[5] و رسیدگی استوالد^[6] (مک کلمنت، 2015)، و فرآیندهایی مانند اکسیداسیون و فعالیت میکروبی موجب کاهش قابلیت نگهداری نانوحامل­ها می­شوند. بعنوان یک راه حل دیگر میتوان به پایدارسازی این سیستم­ها از طریق جامدسازی و افزایش قابلیت نگهداری این ترکیبات در طول زمان و سپس بازسازی سیستم برای استفاده مجدد اشاره کرد. در بین روش­های مختلف ریزپوشانی، خشک­کردن پاششی فرآیندی رایج، اقتصادی و انعطاف­پذیر است که بوسیله آن میتوان انواع محصولات مایع را به پودرهایی با قابلیت نگهداری طولانی­مدت، پایداری فیزیکوشیمیایی و میکروبی بالا، و ویژگی­های عملکردی مناسب تبدیل کرد (جعفری و همکاران، 2007؛ سرابندی و همکاران، 2018). از تحقیقات انجام شده با این فرآیند میتوان به میکروانکپسولاسیون به روش خشک کردن پاششی روغن گردو (ژو و همکاران، 2017)، آنتوسیانین­های گلبرگ زعفران[7] (مهدوی خزائی و همکاران، 2014)، هیدرولیزشده کازئین (سرابندی و همکاران، 2018)، هیدرولیزشده پروتئین آب پنیر (یانگ و همکاران، 2012) اشاره کرد.

تاجائیکه میدانیم، تاکنون تحقیقی در خصوص استخراج پروتئین و تولید پپتیدهای زیست فعال از گرده گل­های استکانی (Campanula latifolia)، بهارنارنج (Citrus aurantium L.) و بیدمشک (Pussy willow) صورت نگرفته است. همچنین، ویژگی­های پروتئین و هیدرولیزشده حاصل از هر یک از این گرده­ها شامل ترکیب آمینواسیدی، ویژگی­های آنتی­اکسیدانی و سلامتی بخش بررسی و مقایسه نشده است. از سوی دیگر، با توجه به مزایای متعدد ذکر شده برای پپتیدهای زیست فعال و معایب و چالش­های آنها مانند ناپایداری، ضرورت پایدارسازی آنها حائز اهمیت است.

بنابراین، با توجه به مزایا و کاربردهای فرآیند ریزپوشانی ترکیبات زیست فعال با نانوحامل­های لیپیدی و مزایای آنها، مهمترین اهداف این مطالعه عبارتند از استخراج و تولید پپتیدهای زیست فعال از گرده ­های گل زنیور عسل،  مقایسه فعالیت آنتی­ اکسیدانی در شرایط مختلف، بارگیری در نانوحامل­های لیپیدی و پایدارسازی نانولیپوزوم­های بارگیری شده با روشهای اصلاح غشا، پوشش دهی لیپوزوم با کیتوزان و جامدسازی به روش خشک کردن پاششی و بررسی ویژگی­های فیزیکوشیمیایی و مورفولوژیکی نانوذرات حاصله می باشد

با درنظر گرفتن نیاز به تولید و استفاده از ترکیبات زیست فعال و غذا-دارو از منابع طبیعی برای افزایش سطح سلامت مصرف­کنندگان از طریق تولید محصولات غذایی فراسودمند و کاهش روند رو به رشد انواع بیماریهای قلبی عروقی و سرطان­های ناشی از تغذیه نامناسب در درجه نخست اهمیت و ضرورت میتوان به استفاده از منابع گیاهی طبیعی و مغذی برای استخراج پروتئین با کیفیت بالا؛ سپس اصلاح ساختار پروتئین و تولید پپتیدهای زیست فعال با هیدرولیز آنزیمی با انواع پروتئازهای مختلف (آلکالاز، پانکراتین، پپسین و تریپسین) با ویژگی­های متعدد سلامتی­بخش و آنتی­اکسیدان با قابلیت مهار انواع رادیکال­های آزاد و شلاته­کنندگی یون­های فلزی پرواکسیدان بعنوان جایگزین آنتی­اکسیدان­ها و شلاته­کننده­های سنتزی در محصولات غذایی مختلف؛ شناسایی و مقایسه کارایی فراکسیون­های پپتیدی و ریزپوشانی پپتیدهای اصلاح ساختاری شده با خشک کردن پاششی در حامل­های مختلف با هدف کاهش معایب و چالش­های این ترکیبات اشاره کرد.

مروری بر تحقیقات پیشین

تولید پپتیدهای زیست فعال و هیدرولیزشده­ های پروتئینی

ژای و همکاران (2019) ویژگیهای فیزیکوشیمیای و انتی اکسیدانی هیدرولیزشده­ های پروتئین ماش^[1] را بررسی کردند. در بین نمونه ­های مختلف، هیدرولیزشده­ های حاصل از آلکالاز بالاترین درجه هیدرولیز (24%) را نسبت به نوتراز^[2] (21%) و پاپائین^[3] (15%) داشتند. همچنین، بالاترین درصد پروتئین محلول در TCA، به ­ترتیب مربوط به هیدرولیزشده ­های با آلکالاز (38%)، نوتراز (33%) و پاپائین (26%) بود. همچنین، مهار رادیکال آزاد DPPH و ABTS پس از هیدرولیز آنزیمی پروتئین خام به­ طور قابل توجهی افزایش یافت.

اوانجلو و همکاران (2016) اثر هیدرولیز آنزیمی کنسانتره پروتئین لوبیای سیاه با استفاده از پسین و آلکالاز بر فعالیت آنتی ­اکسیدنی هیدرولیزشده ­ها مورد بررسی قرار دادند. وزن مولکولی هیدرولیزشده ­ها با الکتروفورز و فعالیت آنتی ­اکسیدانی آن­ ها با مهار رادیکال ­های DPPH و ABTS بررسی شد. نتایج الکتروفورز نشان حاکی از این بود که باند های مربوط به ترکیبات با وزن مولکولی بیش از 50 کیلودالتون پس از هیدرولیز آنزیمی با پپسین، ناپدید شدند. هر یک از آنزیم­های پپسین و آلکالاز، اثر متفاوتی بر تولید هیدرولیزشده­ های با وزن مولکولی و فعالیت آنتی­ اکسیدانی مختلف از خود نشان دادند. هیدرولیزشده­ های حاصل از آلکالاز، فعالیت مهار رادیکال آزاد ABTS بالاتری نسبت به نمونه ­های هیدرولیزشده با پپسین از خود نشان دادند. اما نمونه­های تولید شده با پپسین از فعالیت مهار رادیکال آزاد DPPH بالاتری برخوردار بودند.

در تحقیقی، یو و همکاران (2009) اثر آنزیم­های پاپائین و پرتامکس را بر ویژگی­ های آنتی­اکسیدانی پروتئین­ های هیدرولیز شده ماهی تیان[4] بررسی کردند. هیدرولیز طولانی­ مدت با پاپائین موجب قهوه ­ای شدن هیدرولیزشده ­ها گردید. به طورکلی، بیشترین فعالیت آنتی­ اکسیدانی پروتئین ­های هیدرولیز شده پروتامکس در درجه هیدرولیز 23% بدست آمد. حداکثر مقدار فعالیت مهار رادیکال­های آزاد هیدروکسیل، DPPH و ABTS، همچنین قدرت احیاءکنندگی به ­ترتیب در حدود 1/56%، 5/95%، 8/2 میلی­مولار و 46/1 به­ دست آمد. هیدرولیزهای تهیه شده با پروتامکس[5] در درجه هیدرولیز 28%، بالاترین فعالیت مهار رادیکال هیدروکسیل (55%) را دارا بودند؛ بیشترین مهار رادیکال DPPH (2/92%) و ABTS (81/2 میلی­مولار) در درجه هیدرولیز 23%؛ اما قدرت احیاءکنندگی (17/1) در درجه هیدرولیز 33% به­ دست آمدند. در این نتایج، وجود اسیدآمینه­ های آنتی­ اکسیدان مانند تریپتوفان و هیستیدین، نقش قابل توجهی از خود نشان دادند. همچنین، افزایش پپتیدهای با وزن مولکولی کم­تر از 500 دالتون با افزایش درجه هیدرولیز نمونه­ ها مشاهده شد. همچنین نتایح حاکی از اثر قابل توجه درجه هیدرولیز، وزن مولکولی و ترکیب اسیدآمینه ­ای بر ویژگی­ های آنتی ­اکسیدانی پروتئین ­های هیدرولیز شده بود.

جامدار و همکاران (2010)، ویژگی­های عملکردی، فعالیت آنتی­ اکسیدانی و کاهندگی فشار خون را در ایزوله و پروتئین­های هیدرولیزشده بادام زمینی با آنزیم آلکالاز، بررسی کردند. در آن تحقیق، اثرات درجات مختلف هیدرولیز (10، 20، 30 و 40%) بر شاخص­ های فوق ارزیابی شد. 10% هیدرولیز موجب بهبود قابل توجهی در حلالیت (بیش از 80%)، ویژگی­ های امولسیفیه­ کنندگی و کف ­کنندگی ایزوله پروتئین بادام زمینی به ­ویژه در pHهای بین 6-4 گردید. با افزایش درجه هیدرولیز، فعالیت شلاته ­کنندگی یون آهن، مهار رادیکال آزاد DPPH و آنزیم مبدل آنژیوتنسین افزایش یافت؛ درحالی­ که، قدرت احیاءکنندگی کاهش یافت (p< 0.05). ایزوله پروتئین بادام زمینی و پروتئین هیدرولیز شده در درجه هیدرولیز 10%، اثری بهتری در فعالیت آنتی ­اکسیدانی با ارزیابی رنگ­بری بتاکاروتن نسبت به نمونه ­های با درجات بالاتر هیدرولیز دارا بودند.

نانوریزپوشانی پپتیدهای زیست فعال در ساختار نانوحامل­ ها

موهان و همکاران (2017) بارگیری پپتیدهای آنیونی و کاتیونی آب پنیر در ساختار نانولیپوزوم­ها را انجام و اثر بار پپتید بر بازده ریزپوشانی ترکیبات را بررسی کردند. نتایج نشان دادند که بازده ریزپوشانی پپتیدهای آنیونی کم­تر از نوع کاتیونی بود. بار پپتیدها تاثیری بر پتانسیل زتای نانولیپووزم­ها نداشت. اگرچه بازده ریزپوشانی مقداری تحت تاثیر بار خالص پپتید قرار گرفت.

رمضان­زاده و همکاران (2017) اثر ریزپوشانی پپتیدهای زیست فعال حاصل از هیدرولیز آنزیمی پوست ماهی قزل­آلای رنگین کمان^[1] را در ساختار لیپوزوم پوشش ­دهی شده با پلیمرهای زیستی بررسی کردند. آن­ها پپتیدهای آنتی ­اکسیدان با وزن مولکولی کم­تر از 30 کیلودالتون حاصل از هیدرولیز ژلاتین پوست ماهی را در نانولیپوزوم­های پوشش­ دهی شده با کیتوزان^[1]، ریزپوشانی کردند. در آن تحقیق، میانگین اندازه ذرات نانووزیکول ­های لیپوزومی بارگیری شده با پپتیدهای آنتی ­اکسیدان بین 234- 163 نانومتر متغیر بودند. همچنین، شاخص بس­پاشیدگی (PDI) نانوحامل­های کم­تر از 5/0 بود. علاوه­ بر این، پتانسیل زتا از mV 9/3+ در لیپوزوم­های پوشش­دهی نشده به mV 5/45+ در نمونه ­های پوشش­دهی شده تغییر کرد. آن­ها همچنین گزارش کردند که نانولیپوزوم­های پوشش­دهی شده با کیتوزان با حفظ فعالیت آنتی اکسیدانی، از قابلیت بالایی برای غنی ­سازی و استفاده در تولید انواع محصولات غذایی و دارویی برخوردارند.

جنبه جدید بودن و نوآوری در تحقیق:

تاکنون  تحقیقی در خصوص استخراج، تیمار اولیه و هیدرولیز آنزیمی پروتئین­های موجود در گرده گل­های استکانی، بهارنارنج و بیدمشک منتشر نشده است. همچنین اثرات هیدرولیز آنزیمی با آنزیمهای مختلف بر تولید پپتیدهای زیست فعال، فراکسیون­های حاصل با وزن­های مولکولی مختلف و ویژگی­های عملکردی، آنتی­ اکسیدانی و شلاته­ کنندگی این ترکیبات بررسی نشده است. از سوی دیگر، بارگیری این پپتیدها درون نانولیپوزوم­ها، تولید کیتوزوم و پرولیپوزوم­ها و در نهایت ارزیابی ویژگی­های حامل­ها منتشر نشده است.  

1.نوع نانولیپوزوم و نانوکیتوزوم پپتیدهای گرده گل بر ویژگی­های عملکردی پپتیدها( حلالیت،امولسیفیه کنندگی،کف کنندگی، نوع پپتید جزء شده) موثر است

2. نوع نانولیپوزوم و نانوکیتوزوم پپتیدهای گرده گل بر ویژگی­های فعالیت آنتی­اکسیدانی( درصد مهار رادیکال آزاد، رادیکال ABTS ، فعالیت احیا کنندگی، فعالیت مهار رادیکال هیدروکسیل، فعالیت شلاته کنندگییون آهن و مس،فعالیت آنتی اکسیدانی کل،مهار رادیکال نیتریک اکسید)  پپتیدها موثر است

3.  نوع نانولیپوزوم و نانوکیتوزوم پپتیدهای گرده گل بر ویژگی­های فیزیکوشیمیایی پپتیدها ( اندازه ذرات، شاخص بس پاشیدگی،پتانسیل زتا، بازده ریز پوشانیرهایش ترکیبات ریز پوشانی شده ) موثر است

4. نوع نانولیپوزوم و نانوکیتوزوم  پپتیدهای گرده گل بر مورفولوژی پپتیدها موثر است

 5. دمای نگهداری نانو لیپوزوم و نانو کیتوزوم پپتیدهای گرده گل بر ویژگی­های فیزیکوشیمیایی پپتیدها ( اندازه ذرات، شاخص بس پاشیدگی،پتانسیل زتا، بازده ریز پوشانیرهایش ترکیبات ریز پوشانی شده ) موثر است

طراحی، ویژگی­ها، پایداری و فرمولاسیون نانولیپوزوم و نانوکیتوزوم بارگیری شده با فراکسیون ­های  پپتیدی  حاصل از هیدرولیز آنزیمی پروتئین گرده گل زنبور عسل

.مقایسه نوع نانولیپوزوم و نانوکیتوزوم پپتیدهای گرده گل بر ویژگی­های عملکردی پپتیدها( حلالیت،امولسیفیه کنندگی،کف کنندگی، نوع پپتید جزء شده)

2. مقایسه نوع نانولیپوزوم و نانوکیتوزوم پپتیدهای گرده گل بر ویژگی­های فعالیت آنتی­اکسیدانی( درصد مهار رادیکال آزاد، رادیکال ABTS ، فعالیت احیا کنندگی، فعالیت مهار رادیکال هیدروکسیل، فعالیت شلاته کنندگییون آهن و مس،فعالیت آنتی اکسیدانی کل،مهار رادیکال نیتریک اکسید)  پپتیدها

3. مقایسه نوع نانولیپوزوم و نانوکیتوزوم پپتیدهای گرده گل بر ویژگی­های فیزیکوشیمیایی پپتیدها ( اندازه ذرات، شاخص بس پاشیدگی،پتانسیل زتا، بازده ریز پوشانیرهایش ترکیبات ریز پوشانی شده )

4. مقایسه نوع نانولیپوزوم و نانوکیتوزوم  پپتیدهای گرده گل بر مورفولوژی پپتیدها

5. مقایسه دمای نگهداری نانو لیپوزوم و نانو کیتوزوم پپتیدهای گرده گل بر ویژگی­های فیزیکوشیمیایی پپتیدها ( اندازه ذرات، شاخص بس پاشیدگی،پتانسیل زتا، بازده ریز پوشانیرهایش ترکیبات ریز پوشانی شده )

وزارت بهداشت درمان و آموزش پزشکی، کارخانجات صنایع غذایی و دارویی

تعریف علمی :

لیپوزوم، یک وزیکول کروی شکل است که از یک یا چند لایه فسفولیپید تشکیل شده است. ساختار لیپوزوم شباهت زیادی نیز به ساختار غشای سلول دارد. این ساختارها، اولین بار در اواسط دهه ۱۹۶۰ کشف و معرفی شدند. توانایی لیپوزوم‌ها در کپسوله سازی داروهای هیدروفیل یا لیپوفیل باعث شده است که این وزیکول ها به سیستم های دارویی مفید و بسیار موثری در امر دارورسانی تبدیل شوند

تعریف عملی:

در این تحقیق نانو لیپوزوم ها با استفاده ازفرآیند تولید لیپوزوم شامل انحلال به ترتیب، 09/0 و 01/0 گرم لیستین سویا و کلسترول در 10 میلی­لیتر اتانول و فرآیند تبخیر و تشکیل فیلم نازک در انتهای بالن ته­گرد با استفاده از اواپراتور چرخان با دور rpm 60 در دمای С˚60    تولید خواهند شد

توصیفی تحلیلی (تجربی )

گرده های گل جمع آوری شده حاصل از فعالیت زنیورهای عسل در طی جمع آوری شهد گل ها از مزارع و باغات  گل­های استکانی، بهارنارنج و بیدمشک آذربایجان غربی

با احتساب میزان پروتئین مورد نیاز برای سه تکرار برای هریک از آزمون های مورد نیاز 3 کیلوگرم گرده گل از هر نوع گرده براورد می شود

از نمونه های در دسترس از کندوهایی که در مزارع و باغات مذکور قرار دارند انجام خواهد شد

نتایج آزمایشگاهی

مواد اولیه

گرده گل­های زنبور عسل آویشن، سیب و بزرک از مزارع و باغات کشت و پرورش این گیاهان (مراکز تهیه عسل موجود در این مراکز) واقع در استان آذربایجان غربی تهیه خواهند شد، آنزیم­های آلکالاز و پانکراتین، پپسین و تریپسین، تری­کلرواستیک اسید (TCA)، کوماسی بلو (G250)، DPPH، ABTS، پتاسیم پرسولفات، ترولوکس، پتاسیم فری­سیانید، فریک کلراید، آلفا-داکسی ریبوز، سولفات آهن، EDTA، پراکسید هیدروژن، دی­کلرید آهن، فروزین، سولفات مس، پیریدین، پیروکاتکول ویولت، تویین 20، اسکوربیک اسید، تیوباربیتوریک اسید (TBA)، سدیم دودسیل سولفات (SDS) از سیگما، اتانول، سود، اسیدکلریدریک، پتاسیم کلراید، پتاسیم دی هیدروژن فسفات، اسید فسفریک (مرک، آلمان).

استخراج پروتئین گرده ­های گل

به منظور چربی زدایی گرده­ های گل، هر یک از پس از آسیاب کردن و تولید پودر  به نسبت 1:4 (وزنی/ حجمی) با هگزان مخلوط می‌شود و به مدت 3 ساعت در دمای اتاق همزده می‌شود. سپس با استفاده از قیف بوخنر هگزان جدا شده و آرد حاصل در دمای اتاق خشک می­گردد و از الک با مش 40 عبور داده می‌شود. عملیات استخراج پروتئین از پودر چربی زدایی شده به اینصورت خواهد بود که پودر چربی گیری شده به نسبت 1:10 با محلول  NaCl33/0مولار، 25/9pH= مخلوط شده و به مدت 2 ساعت همزده می‌شود، سپس محلول حاصل در ×g4500 به مدت 30 دقیقه سانتریفوژ خواهد شد. در مرحله بعد pH سوپرناتانت در 5/4pH = (pH ایزوالکتریک پروتئین) تنظیم خواهد شد. سپس در جهت رسوب پروتئین‌ها، محلول حاصل درg×4500 به مدت 20 دقیقه سانتریفوژ می‌شود. در ادامه رسوب پروتئین با آب مقطر دو بار شسته شده و درg ×4500، به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ می‌شود و با تنظیم2/7pH = با افزودن NaOH 1 مولار، دوباره به حالت محلول تبدیل خواهد شد. سپس کنسانتره پروتئین حاصل با فریز درایر خشک شده و در دمایC°4 نگهداری می‌شود. تمامی فرآیندها در دمای اتاق انجام می‌شود (فیضی و همکاران، 2015).

تهیه پروتئین هیدرولیز شده

برای فرآیند هیدرولیز آنزیمی، پروتئین­های استخراج شده از گرده گل­ها را در غلظت  (W/V)5% در بافر فسفات M2/0 مولار (4/7pH=) حل نموده و امکان هیدراته شدن کامل آن در حین هم­زدن مداوم به مدت min30 در دمای محیط محیاء خواهد شد. سپس محلول اولیه آنزیم پانکراتین و تریپسین در بافر فوق و در نسبت آنزیم به پروتئین سوبسترا  (W/W) 2% به محلول حاوی پروتئین افزوده می­شود. دمای واکنش Cº 40 و زمان واکنش در شرایط هم­زدن مداوم با دور rpm 200 ، 150 دقیقه در نظر گرفته خواهد شد. پس از اتمام فرآیند هیدرولیز، برای غیرفعال کردن واکنش و فعالیت آنزیم، محیط واکنش در حمام آب Cº 90 به مدت  min15 قرار داده می­شود. پس از آن، محلول تا دمای محیط خنک می­شود. محلول در دور rpm 5000 به مدت  min10 سانتریفیوژ خواهد شد. سوپرناتانت جدا، لیوفیلیزه و تا زمان استفاده در دمای Cº 20- نگهداری می­شود. تمام مراحل فوق برای هدرولیز آنزیمی با آلکالاز در بافر با 8pH= و دمایCº 50  و برای پپسین در2 pH= در دمای Cº  37 انجام خواهد شد (چن و همکاران، 2011).

حلالیت

برای تعیین حلالیت پروتئین‌های هیدرولیز شده از روش جامدار و همکاران (2010) با مقداری اصلاحات استفاده خواهد شد. بدین ترتیب که، 200 میلی‌گرم پروتئین هیدرولیز شده در 20 میلی‌لیتر آب مقطر پراکنده و pH مخلوط با استفاده از سود یا اسیدکلریدریک 1 نرمال روی 1 تا 12 تنظیم می­شود. محلول در g 10000 برای 10 دقیقه سانتریفوژ می­شود. سپس مقدار پروتئین موجود در محلول رویی با استفاده از روش بردفورد (1976) تعیین و درصد حلالیت بر اساس مقدار پروتئین محلول بر پروتئین کل نمونه تعیین خواهد شد.

ویژگی‌های امولسیفیه‌کنندگی

ویژگی‌های امولسیفیه کنندگی پروتئین‌های هیدرولیز شده بر‌طبق روش کلامپانگ و همکاران (2007) با اندکی اصلاحات تعیین خواهد گردید. ابتدا 5 میلی‌لیتر روغن هسته انگور و 15 میلی‌لیتر محلول 1% پروتئین با هم مخلوط و  pHبا استفاده از سود یا اسید کلریدریک 1 نرمال به 3، 5، 6، 7 و 9 تنظیم می­شود. مخلوط با استفاده از هموژنایزر در سرعت rpm20000 به‌مدت 1 دقیقه هموژن می­شود. سپس، 50 میکرولیتر نمونه امولسیون در زمان 0 و 10 دقیقه پس از هموژنیزاسیون از انتهای ظرف برداشته و با 5 میلی‌لیتر محلول 1/0 درصد سدیم دودسیل سولفات (SDS) مخلوط می­شود. جذب محلول رقیق شده در 500 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر خوانده می­شود. مقدار جذب در زمان اولیه (A₀) و 10 دقیقه پس از تشکیل امولسیون (A₁₀) برای محاسبه فعالیت امولسیون کنندگی (EAI) و شاخص پایداری امولسیون (ESI) با استفاده از معادلات زیر محاسبه می‌شوند:

EAI (m²/g) = (2 × 2.303 × A₀)/ 0.25 × protein weight (g)                            (معادله 1)

ESI (%) = (A₀ - A₁₀/A₀) × 100                                                                          (معادله 2)

ویژگی‌های کف‌کنندگی

ظرفیت و پایداری کف‌کنندگی پروتئین هیدرولیز شده بر‌طبق روش کلامپانگ و همکاران (2007) با اندکی اصلاحات تعیین می­شود. حجم 15 میلی‌لیتر محلول 5/0 درصد نمونه با استفاده از سود یا اسیدکلریدریک 1 نرمال،  pHآن به 3، 5، 6، 7 و 9 تنظیم و هموژنیزاسیون در سرعت rpm16000 به‌مدت 2 دقیقه با هدف ورود هوا به درون محلول در دمای محیط انجام می­شود. نمونه زده شده به سرعت به استوانه مدرج 25 میلی‌لیتر منتقل و حجم کل پس از 1 دقیقه خوانده می­شود. ظرفیت کف کنندگی (FC) بر طبق معادله زیر محاسبه خواهد شد:

FC (%) = (A /B) × 100                                                                                       (معادله 3)

در اینجا، A حجم کف پس از زدن (میلی‌لیتر) و B حجم اولیه قبل از زدن (میلی‌لیتر) می‌باشد.

نمونه‌های زده شده در دمای Cº 25 برای 10 دقیقه نگهداری، سپس حجم کف خوانده می­شود. پایداری کف (FS) با معادله زیر محاسبه می­شود:

FS (%) = (A /B) × 100                                                                                       (معادله 4)

در اینجا، A حجم کف پس از نگهداری (میلی‌لیتر) و B حجم اولیه قبل از زدن (میلی‌لیتر) می‌باشد.

تعیین درجه هیدرولیز

سوسپانسیون پروتئین هیدرولیز شده و تری کلرواستیک اسید (M 44/0) در نسبت حجمی 1:1 مخلوط و به مدت 15 دقیقه در دمای Cº 4 انکوبه می­شود. سپس، مخلوط در rpm 10000 و به مدت  min10 سانتریفوژ می­شود. مقدار پروتئین موجود در سوپرناتانت حاوی تری کلرواستیک اسید M 22/0 با روش بردفورد (بردفورد، 1976) تعیین می­گردد.

جزء به جزء کردن پپتیدها

هر یک از سوپرناتانت­های حاوی هیدرولیزشده­ ها با آنزیم­های مختلف بصورت مجزا در چند مرحله از سیستم غشایی اولترافیلتراسیون با قابلیت­های جداسازی متفاوت (molecular weight cutoff = 100, 30, 10 kDa, Millipore, UK) بر حسب وزن مولکولی بمدت 20 دقیقه و در g  × 2500 عبور داده خواهند شد. بدین شکل که ابتدا سوپرناتانت از فیلتر 100 عبور سپس بخش عبور کرده از فیلتر از فیلتر30 و 10 عبور داده می­شوند و در هر مرحله پپتیدها و هیدرولیزشده ­های مانده در فیلترها جداسازی و به روش انجمادی خشک خواهند شد. سپس برای انجام دیگر آزمون­ها در فریزر نگهداری خواهند شد (لیناریس و همکاران، 2015).

آنالیز اسید آمینه کل و آزاد

ترکیب آمینواسیدی هیدرولیزشده ­ها با استفاده از روش آلاشی و همکاران (2019) و با دستگاه HPLC مجهز به ستون با فاز معکوس (Novapack C18, 4μm, Waters, Milford, MA) تعیین می گردد. در ابتدا هر یک از هیدرولیزشده ­ها بمدت 24 ساعت در اسید کلریدریک 6 نرمال در دمای С˚ 110 هضم می­شوند. تعیین اسیدهای آمینه آزاد نیز پس از انحلال هر یک از هیدرولیزشده ­ها در آب دوبار تقطیر انجام می­شود.

فعالیت مهار رادیکال DPPH

درصد مهار رادیکال آزاد DPPH با استفاده از روش وو و همکاران (2003) با کمی اصلاحات تعیین می­شود. ابتدا پودرهای پروتئین هیدرولیز شده در آب مقطر (mg/ml40) حل می­شوند. سپس، ml 5/1 از هر نمونه با ml 5/1 از محلول اتانولی DPPH (mM 15/0) مخلوط و بمدت 20 ثانیه ورتکس می­شود. سپس، مخلوط حاصل در rpm 2500 به مدت  min10 سانتریفوژ و بمدت  min20 در تاریکی نگهداری می­شود. جذب محلول سوپرناتانت در طول موج nm 517 خوانده می­شود.

فعالیت مهار رادیکال ABTS

فعالیت مهار رادیکال ABTS پودرهای پروتئین هیدرولیز شده با استفاده از روش تشریح شده توسط یو و همکاران (2010) با کمی اصلاحات تعیین می­شود. محلول رادیکال ⁺ABTS با ترکیب نسبت حجمی یکسانی از ABTS در غلظت mM 7 و mM 45/2 پتاسیم پرسولفات تهیه می­گردد. مخلوط در تاریکی و در دمای محیط به مدت h 16-12 قبل از مصرف قرار داده می­شود. در این مدت، اکسیداسیون و تولید رادیکال ⁺ABTS به وسیله پتاسیم پرسولفات انجام می­گیرد. قبل از آزمون، محلول ⁺ABTS با استفاده از (M, pH 7.4 2/0) [1]PBS تا جذب 02/0 ± 7/0 در nm 734 رقیق می­شود. سپس µl 40 از هر نمونه (حاوی  mg protein/mL4) به ml 4 محلول رقیق شده ⁺ABTS افزوده شد. مخلوط برای 30 ثانیه به شدت ورتکس و به مدت  min6 در تاریکی قرار داده می­شود. جذب محلول نهایی در nm 734 اندازه­گیری می­شود. منحنی استاندارد با واکنش µl 40 ترولوکس[2] (μM 1000، 750، 500، 250، 100، 50) با ml 4 محلول رقیق شده ⁺ABTS تهیه می­شود. درصد مهار رادیکال ⁺ABTS نمونه­ها بر اساس معادله زیر محاسبه خواهد شد. همچنین، فعالیت مهار رادیکال ⁺ABTS بر اساس منحنی استاندارد ترولوکس به شکل ظرفیت آنتی­اکسیدانی معادل ترولوکس[3] (TEAC, mM) بیان می­شود.

فعالیت قدرت احیاءکنندگی

برای تعیین قدرت احیاءکنندگی نمونه­ های هیدرولیز شده، ml 5/0 نمونه حل شده در آب مقطر (در غلظت mg/ml40) با ml 5/0 بافرفسفات M2/0 (pH 6.6) و ml 5/0پتاسیم فری­سیانید (W/V) 1% مخلوط می­شود. مخلوط در دمای Cº 50 برای min 20 دقیقه انکوبه می­شود. سپس، ml 5/0 محلول تری­کلرو استیک اسید 10% به مخلوط اضافه و به­مدت min 10 در rpm 2500 سانتریفوژ می­شود. در نهایت، ml 1 سوپرناتانت با ml 1 آب مقطر و ml 2/0 فریک کلراید  (W/V)1/0% مخلوط می­شود. جذب نمونه در nm 700 پس از min 10 نگهداری مخلوط در دمای محیط، خوانده می­شود. حجم یکسانی آب مقطر به جای نمونه برای تهیه نمونه کنترل استفاده می­شود. افزایش جذب مخلوط واکنش نشان دهنده افزایش قدرت احیاءکنندگی است (احمدی و همکاران، 2007).

فعالیت مهار رادیکال هیدروکسیل

فعالیت مهار رادیکال هیدروکسیل با استفاده از اکسیداسیون 2-داکسی ریبوز[4] بر طبق روش کیم و مینامیکاوا (1997) و با اندکی اصلاحات تعیین می­شود. برای این آزمون، ml 2/0 از مخلوط mM 10 (FeSO₄-EDTA)، ml 5/0 (mM 10) آلفاداکسی ریبوز، ml 2/0 نمونه هیدرولیز شده، ml 9/0 سدیم فسفات بافرM 2/0 (pH 7.4) و ml 2/0 پراکسید هیدروژن (mM 10) با هم مخلوط می­شوند. مخلوط در Cº 37 برای h 1 انکوبه می­شود. سپس، ml 1 تری کلرواستیک اسید (TCA) 8/2% برای توقف واکنش به مخلوط افزوده می­شود. مخلوط برای min 15 در حمام آب جوش قرار، در یخ سرد شده، سپس جذب آن در nm 532 با اسپکتروفتومتر اندازه­گیری می­شود. حجم یکسانی آب مقطر به جای نمونه برای تهیه شاهد استفاده می­گردد. فعالیت مهارکنندگی رادیکال هیدروکسیل به شکل سرعت مهار اکسیداسیون آلفاداکسی ریبوز به­وسیله رادیکال­های هیدروکسیل ارزیابی می­شود.

فعالیت شلاته ­کنندگی یون آهن

فعالیت شلاته کنندگی یون آهن بر طبق روش دکر و ولچ (1990) اندازه­گیری می­شود. ابتدا، ml 1 نمونه حل شده در آب مقطر (در غلظت mg/ml40) با ml 05/0 محلول دی کلرید آهن (mM 2) و ml 85/1 آب دوبار تقطیر مخلوط می­شود. سپس، ml 1/0 محلول فروزین[5] (mM 5) افزوده و مخلوط به شدت هم­زده می­شود. جذب پس از min 10 نگهداری مخلوط در دمای محیط در nm 562 خوانده می­شود. آب دوبار تقطیر به عنوان نمونه شاهد مورد استفاده قرار می­گیرد.

فعالیت شلاته کنندگی یون مس

فعالیت شلاته­ کنندگی یون مس پروتئین­های هیدرولیز شده با استفاده از روش کانگ و ژیانگ (2006) اندازه­گیری می­شود. در ابتدا، ml 1 محلول mM 2/0 سولفات مس[6] با ml 1 هیدرولیز شده در فالکون ml 15 مخلوط و برای min 5 در دمای اتاق انکوبه می­شود. سپس، ml 1 محلول تری کلرواستیک اسید 3/11% افزوده و نمونه­ها در rpm 2500 برای min 10 سانتریفوژ می­شوند. پس از آن، ml 2 از سوپرناتانت به ml 1 محلول 10% پیریدین[7] و µl 20 پیروکاتکول ویولت[8] افزوده و مخلوط ورتکس و برای min 5 در دمای اتاق انکوبه می­شود. جذب نمونه­ها در nm 632 خوانده و فعالیت شلاته ­کنندگی یون مس تعیین می­گردد.

فعالیت آنتی ­اکسیدانی در امولسیون

امولسیون روغن در آب با هموژن کردن g 1 روغن هسته انگور و µl 100 تویین 20 با ml 100 آب مقطر با استفاده از هموژنایزر با سرعت rpm 22000 برای min 2 در حمام یخ تهیه می­شود. نمونه­ ها برای ارزیابی اکسیداسیون لیپیدی با مخلوط نمودن ml 8 امولسیون روغن، ml 5/0 محلول 2/0% اسکوربیک اسید، ml 5/0 محلول ppm 200 سولفات آهن (FeSO₄) و ml 1 محلول پروتئین هیدرولیز شده (در غلظت mg/ml40) تهیه می­شوند. سپس، نمونه­ ها در Cº 37 برای h 16 انکوبه می­شوند. پس از انکوباسیون، ml 1 از هر نمونه به ml 2 محلول تیوباربیتوریک اسید[9]/ تری کلرواستیک اسید (mM TBA 20/TCA  15%) و µl 50 محلول BHA 10% در اتانول 90% افزوده و سپس ورتکس می­شود. مخلوط حاصل برای توسعه رنگ در حمام آب Cº 90 برای min 15 انکوبه می­شود. نمونه­ها در حمام آب یخ برای min 10 خنک و در rpm 3000 برای min 15 و در دمای Cº 5 سانتریفوژ می­شوند. جذب محلول در طول موج nm 532 اندازه­گیری می­شود. برای تهیه نمونه شاهد از مخلوط ml 1 آب مقطر با ml 2  محلول TBA/TCA استفاده می­شود. مقدار TBARS (ترکیبات حاصل از واکنش تیوباربیتوریک اسید) به شکل mg مالون آلدهید (MDA) بر لیتر امولسیون بیان می­شود (آبیران و همکاران، 2016).

فعالیت آنتی ­اکسیدانی کل (TAA)

این روش بر مبنای احیاء (VI) Mo به مولیبدن (V) Mo می­باشد که با تشکیل کمپلکس سبز رنگ فسفومولیبدن[10] در محیط اسیدی همراه است. در این روش ml 1/0 از نمونه حل شده در آب مقطر (2.5-20 mg/mL) به ml1 از معرف[11] (اسیدسولفوریک 6/0 مولار، فسفات سدیم[12] 28 میلی مولار و آمونیوم مولیبدات 4 میلی مولار) افزوده شده و به­مدت 90 دقیقه در حمام آب 90 درجه سانتی گراد انکوبه می­شود. پس از سرد شدن، جذب نمونه­­ها در 695 نانومتر خوانده می­شود. از آب مقطر دوبار تقطیر به عنوان نمونه شاهد استفاده خواهد شد. جذب بیشتر نشان دهنده ­ی ظرفیت آنتی اکسیدانی کل بیشتر است (اومایاپراواتیا و همکاران، 2014).

مهار رادیکال نیتریک اکسید (NO)

مهار رادیکال نیتریک اکسید بر اساس روش تشریح شده توسط تسایی و همکاران (2007) تعیین خواهد شد. برای این فرآیند در ابتدا 200 میکرولیتر نمونه در غلظت­های مختلف با 200 میکرولیتر سدیم نیتروپروساید 10 میلی مولار تهیه شده در بافر فسفات نمکی مخلوط شده و بمدت 150 دقیقه در زیر نور و در دمای محیط نگهداری خواهند شد. سپس حجم یکسانی از معرف گریس (ترکیب 1% سولفانیل آمید و 0.1 نفتیل اتیلن دی کلرید دی­آمین حل شده در محلول 2.5 درصد اسید فسفریک) به مخلوط اضافه خواهد شد. سپس جذب در طول موج 546 نانومتر خوانده و مشابه فرمول 1، درصد مهار رادیکال نیتریک اکسید محاسبه خواهد شد.

نانولیپوزوم و ارزیابی ویژگی­ها

بارگیری پپتیدها و فراکسیون­های پپتیدی در نانولیپوزوم­ها

نانولیپوزوم با استفاده از روش هیدراسیون لایه نازک و بر اساس روش تشریح شده توسط سرابندی و همکاران (2019) تولید می گردند. فرآیند تولید لیپوزوم شامل انحلال به ترتیب، 09/0 و 01/0 گرم لیستین سویا و کلسترول در 10 میلی­لیتر اتانول مطلق است. فرآیند تبخیر و تشکیل فیلم نازک در انتهای بالن ته ­گرد با استفاده از اواپراتور چرخان با دور rpm 60 در دمای С˚60 انجام خواهد گرفت. بالن مدور برای اطمینان از حذف کامل حلال، به­مدت 12 تا 18 ساعت در دسیکاتور و در دمای محیط نگهداری می­شود. سپس فیلم لیپیدی خشک شده با استفاده از بافرفسفات نمکی (PBS; pH 7.4) حاوی mg/ml 10 پروتئین هیدرولیزشده، به­ مدت min1 با استفاده از ورتکس مجددا هیدراته می­گردد. محلول حاصل با استفاده از روتاری در دمای С˚60 به­مدت min2 هم­زده و به­مدت min 2 در دمای محیط هم­زده و خنک می­شود. این فرآیند هم­زدن در 3 مرتبه تکرار می­گردد. نهایتا محلول حاصل برای 10 مرحله و در هر مرحله به­مدت min 1 به­صورت متناوب تحت پروب فراصوت (توان 70% و سیکل 5/0) قرار می­گیرد. برای جلوگیری از افزایش دما، فرآیند فراصوت در شرایط نگهداری نانولیپوزوم در آب سرد انجام خواهد گرفت. درنهایت نانولیپوزوم تولید شده با غلظت لیپید (لیستین و کلسترول) mg/ml 10 تا زمان انجام آزمون­ها در یخچال نگهداری می­شود.

پوشش­دهی نانولیپوزوم­ها با کیتوزان

برای پوشش­دهی نانولیپوزوم­ها، اثر غلظت­های مختلفی از کیتوزان (1/0، 2/0، 4/0، 6/0 و 8/0 درصد وزنی-حجمی) بررسی خواهد شد. برای این آزمون، کیتوزان در محلول اسیداستیک 1% گلایسال به­ مدت 24 ساعت حل و همزده خواهد شد. سپس حجم یکسانی از محلول­های کیتوزان به آرامی و به­صورت قطره قطره به محلول نانولیپوزوم در حین هم­زدن افزوده می­شود. نمونه­ ها پس از پوشش­دهی به یخچال منتقل می­شوند (لی و همکاران، 2015).

تعیین اندازه ذرات، شاخص­بس­پاشیدگی و پتانسیل زتا

برای این منظور، هریک از نمونه ­ها (نانولیپوزوم­های فاقد پوشش و پوشش­ دهی شده) نخست با استفاده از بافر فسفات نمکی (PBS) به نسبت 1:100 رقیق می­شوند. اندازه ذرات (به­صورت Z- میانگین[13]) و شاخص بس­پاشیدگی آن­ها با طیف ­سنجی همبستگی فوتونی به­وسیله دستگاه زتا سایزر (نانوسایزر 3000، شرکت مالورن، انگلستان)[14] در زاویه ˚90 و دمای С˚ 25 در داخل سل مخصوص دستگاه با عرض 01/0 متر اندازه­ گیری می­شود. همچنین بار الکتریکی نانولیپوزوم­ها (به­ صورت پتانسیل زتا)، هدایت الکتریکی ویژه و جنبش الکتروفورزی با استفاده از همین دستگاه اندازه­ گیری خواهد شد.

بازده ریزپوشانی

بازده ریزپوشانی پپتیدها و فراکسیون­های پپتیدی حاصل از هیدرولیز آنزیمی پروتئین بزرک با استفاده از روش لی و همکاران (2015) با مقداری اصلاحات انجام خواهد گرفت. بدین شکل که برای تعیین مقدار پپتیدهای ریزپوشانی نشده در ساختار لیپوزوم (پروتئین­های آزاد)، مقدار 2 میلی­لیتر از نانولیپوزوم تهیه شده با روش سانتریفوژ با استفاده از فیلتر آمیکون (با وزن مولکولی عبوری 10 کیلودالتون) منتقل و به مدت 10 دقیقه در دور rpm 3000 سانتریفوژ می­شود. محلول عبور کرده از فیلتر برای تعیین میزان پروتئین­های بارگیری نشده یا آزاد به روش بردفورد (1976) مورد استفاده قرار خواهد گرفت.

رهایش ترکیبات ریزپوشانی­ شده در شرایط مختلف نگهداری

اثر شرایط مختلف نگهداری بر رهایش پپتیدهای بارگیری شده در فرمول­های نانولیپوزوم به شرح زیر مورد بررسی قرار خواهد گرفت:

اثر نگهداری در دمای محیط و یخچال

برای تعیین اثر نگهداری در دمای یخچال (С˚ 4) و دمای محیط، از هر نمونه مقدار 2 میلی­ لیتر به میکروتیوب منتقل؛ سپس به مدت 4 هفته در شرایط فوق نگهداری خواهد شد. سپس مقدار تغییر در اندازه ذرات و بازده ریزپوشانی مورد ارزیابی قرار خواهد گرفت (لی و همکاران، 2015).

اثر انجماد و رفع انجماد بر پایداری و رهایش نانولیپوزوم­ها

برای تعیین اثر انجماد و رفع انجماد بر پایداری فیزیکی (اندازه ذرات) و رهایش ترکیبات بارگیری شده بر طبق روش لی و همکاران (2015) با اندکی تغییرات، از هر نمونه مقدار 2 میلی­لیتر به میکروتیوب منتقل؛ سپس نمونه ­ها به فریزر (С˚ 18-) منتقل و به­ مدت 2 هفته بدون استفاده از محافظ انجمادی نگهداری می­شوند. پس از آن فرآیند رفع انجماد در دمای محیط انجام و نمونه ­ها ورتکس می­شوند. مقدار پپتیدهای رهایش یافته مشابه روش اندازه­ گیری بازده ریزپوشانی و با استفاده از روش بردفورد محاسبه می­شود. همچنین، اندازه ذرات و پایداری فیزیکی نانوحامل­ ها با استفاده از دستگاه زتاسایزر (روش فرآیند در قبل تشریح شده است) انجام خواهد گرفت.

ریزپوشانی به روش خشک کردن پاششی

نانولیپوزوم­های تولید شده به نسبت حجمی 1 به 1 در محلول مالتودکسترین (10 درصد وزنی حجمی) مخلوط و برای خشک کردن از یک خشک ‌کن پاششی در مقیاس آزمایشگاهی استفاده می­شود. محفظه خشک ‌کن به صورت استوانه‌ای با قسمت تحتانی مخروطی شکل با قطر قسمت استوانه‌ای 28 سانتی­متر و ارتفاع کل محفظه 80 سانتی­متر است. دستگاه مجهز به یک پمپ تغذیه حجمی پریستالتیک با دبی تغذیه متغیر با فشار 1 بار برای ارسال خوراک به نازل است. فرآیند پاشش توسط اتمایزر فشاری با قطر  cm2 و قابلیت عمل توسط کمپرسور هوا انجام می­شود. متغیرهای فرآیند بر طبق روش تشریح شده توسط اکبربگلو و همکاران (2019) تنظیم خواهند شد. بدین شکل که، از هوای ورودی با دمای (C˚130) و بصورت هم جهت با خوراک‎های از قبل تهیه شده برای خشک کردن استفاده می­شود. برای همه تیمارها، دبی خوراک ورودی 3 میلی­لیتر در دقیقه و دمای هوای خروجی در فرآیند C˚ 75 ثابت نگه­داشته می­شوند. پودرهای جمع شده در محفظه شیش ه­ای تا رسیدن به دمای ثابت و ممانعت از تغییرات رطوبت در دسیکاتور نگهداری می­شوند. سپس محصولات ریزپوشانی شده در شیشه‌های تیره و دور از نور تا زمان انجام آزمایشات نگهداری خواهند گردید.

ویژگی­های فیزیکوشیمیایی پودرهای خشک شده به روش پاششی

بازده تولید با محاسبه نسبت جرمی پودر تولید شده به ماده جامد کل در خوراک تعیین می­شوند. سایر ویژگی­های فیزیکی پودرها مانند مقدار رطوبت، فعالیت آبی، دانسیته توده، زاویه ریپوز، حلالیت و جاذب­الرطوبه ­بودن با استفاده از روشهای تشریح شده توسط سرابندی و همکاران (2018) محاسبه می­شوند.

حفظ فعالیت آنتی ­اکسیدانی

درصد حفظ فعالیت آنتی­اکسیدانی (AA) در هیدرولیزشده­های خشک شده به روش پاششی با تعیین فعالیت آنتی­ اکسیدانی هیدرولیزشده ­ها قبل و بعد از فرآیند ریزپوشانی محاسبه خواهند شد.

طیف سنجی فروسرخ (FTIR)

طیف سنجی فروسرخ در دستگاه FTIR مدل Shimadzu 8400، انجام خواهد گرفت. روش آماده ­سازی نمونه برای اندازه­ گیری طیف IR، به ­این صورت خواهد بود که در دستگاه FTIR، پپتیدهای خالص خشک شده به روش انجمادی و ذرات خشک شده به روش پاششی هر کدام جداگانه با نسبت 100:1 با برومید پتاسیم (KBr) مخلوط شده و از این مخلوط در طیف ­سنجی استفاده می­شوند (سرابندی و همکاران، 2018).

مورفولوژی ذرات

ساختار ذرات پودر با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی (مدل هیتاچی PS-230، ژاپن) مورد ارزیابی قرار خواهند گرفت. نمونه‌ها به طور مجزا با استفاده از نوار چسب‌های دوسویه بر صفحه‌های آلومینیومی قرار می­گیرند. سپس عمل روکش‌ دهی ذرات با استفاده از لایه نازکی از طلا انجام می­شود. در نهایت هر نمونه پوشش‌دهی شده به میکروسکوپ منتقل و مشاهده ساختار سطحی ذرات انجام می­شود.

[1] Sodium phosphate-buffered saline

[2] Trolox

[3] Trolox equivalent antioxidant capacity

[4] 2-deoxyribose

[5] Ferrozine

[6] CuSO₄

[7] Pyridine

[8] Pyrocatechol violet

[9] Thiobarbituric acid

[10] Phosphomolybden

[11] Reagent

[12] Sodium  phosphate

[13] Z-average

[14] Zetasizer (NanoSizer 3000, Malvern Instruments, Malvern, UK)

)

 از آمار توصیفی جهت توصیف داده ها شامل میانگین انحراف معیار تعداد و درصد و از آزمون آنالیز واریانس و یا تی تست مستقل جهت نقایسه میانگین ها استفاده خواهد شد در صورت برقرار نیودن شرایط آزمون های پارامتریک از معادل های ناپارامتریک آنها استفاده خواهد شد . از نرم افزار SPSS 19  برای تحلیل داده ها کمک گرفته خواهد شد

بر اساس  دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهشهای علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی  در جمهوری اسلامی ایران

و بندهای 1-  9- 10- 11-  28- 29 – 30 –و 31

1- هدف اصلی هر پژوهش‌باید ارتقای سلامت انسان‌ها توأم با رعایت کرامت و حقوق ایشان باشد.

9-در پژوهش‌های پزشکی که ممکن است به محیط زیست آسیب برسانند، باید احتیاط‌های لازم در جهت حفظ و نگهداری و عدم آسیب رسانی به محیط ریست انجام گیرد.

10- هر پژوهشی باید بر اساس و منطبق بر یک طرح‌نامه (پروپوزال) به انجام برسد. طرح‌نامه و دستورالعمل باید شامل تمامی اجزای ضروری باشد. از جمله بخش ملاحظات اخلاقی، اطلاعات مربوط به بودجه، حمایت کننده‌ها، وابستگی‌های سازمانی، موارد تعارض منافع بالقوه‌ی دیگرپیش از تصویب یا تأیید طرح‌نامه از سوی کمیته‌ی مستقل اخلاق در پژوهش، نباید اجرای پژوهش شروع شود.

11- کمیته‌ی اخلاق در پژوهش علاوه بر بررسی و تصویب طرح‌نامه و دستورالعمل، این حق را دارد که طرح‌‌ها را در حین و بعد از اجرا را از نظر رعایت ملاحظات اخلاقی مورد پایش قرار دهد. اطلاعات و مدارکی که برای پایش از سوی کمیته‌ی اخلاق درخواست می‌شود، باید از سوی پژوهشگران در اختیار این کمیته گذاشته شود.    

30 -گزارش‌ها و مقالات حاصل از پژوهش‌هایی که مفاد این راهنما را نقض کرده‌اند، نباید برای انتشار پذیرفته شوند.

محدودیت قابل توجهی وجود ندارد 

نانو لیپوزوم ، نانو کیتوزوم، گرده گل

1. Abeyrathne ED, Lee HY, Jo C, Suh JW, Ahn DU. Enzymatic hydrolysis of ovomucin and the functional and structural characteristics of peptides in the hydrolysates. Food chemistry. 2016 Feb 1;192:107-13.
2. Ahmadi F, Kadivar M, Shahedi M. Antioxidant activity of Kelussia odoratissima Mozaff. in model and food systems. Food chemistry. 2007 Jan 1;105(1):57-64.
3. Akbarbaglu Z, Jafari SM, Sarabandi K, Mohammadi M, Heshmati MK, Pezeshki A. Influence of spray drying encapsulation on the retention of antioxidant properties and microstructure of flaxseed protein hydrolysates. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2019 Jun 1;178:421-9.
4. Alashi AM, Blanchard CL, Mailer RJ, Agboola SO, Mawson AJ, He R, Girgih A, Aluko RE. Antioxidant properties of Australian canola meal protein hydrolysates. Food Chemistry. 2014 Mar 1;146:500-6.
5. Almaraz-Abarca N, Campos MD, Ávila-Reyes JA, Naranjo-Jiménez N, Herrera-Corral J, González-Valdez LS. Variability of antioxidant activity among honeybee-collected pollen of different botanical origin. Interciencia. 2004 Oct;29(10):574-8.
6. Ambigaipalan P, Al-Khalifa AS, Shahidi F. Antioxidant and angiotensin I converting enzyme (ACE) inhibitory activities of date seed protein hydrolysates prepared using Alcalase, Flavourzyme and Thermolysin. Journal of Functional Foods. 2015 Oct 1;18:1125-37.
7. Balasundram N, Sundram K, Samman S. Phenolic compounds in plants and agri-industrial by-products: Antioxidant activity, occurrence, and potential uses. Food chemistry. 2006 Jan 1;99(1):191-203.
8. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 1976 May 7;72(1-2):248-54.
9. Chen L, Chen J, Ren J, Zhao M. Modifications of soy protein isolates using combined extrusion pre-treatment and controlled enzymatic hydrolysis for improved emulsifying properties. Food Hydrocolloids. 2011 Jul 1;25(5):887-97.
10. Collins AR. Antioxidant intervention as a route to cancer prevention. European Journal of Cancer. 2005 Sep 1;41(13):1923-30.
11. Cumby N, Zhong Y, Naczk M, Shahidi F. Antioxidant activity and water-holding capacity of canola protein hydrolysates. Food chemistry. 2008 Jul 1;109(1):144-8.
12. da Rosa Zavareze E, Telles AC, El Halal SL, da Rocha M, Colussi R, de Assis LM, de Castro LA, Dias AR, Prentice-Hernández C. Production and characterization of encapsulated antioxidative protein hydrolysates from Whitemouth croaker (Micropogonias furnieri) muscle and byproduct. LWT-Food Science and Technology. 2014 Dec 1;59(2):841-8.
13. Decker EA, Welch B. Role of ferritin as a lipid oxidation catalyst in muscle food. Journal of Agricultural and food Chemistry. 1990 Mar;38(3):674-7.
14. Decker EA. Strategies for manipulating the prooxidative/antioxidative balance of foods to maximize oxidative stability. Trends in Food Science & Technology. 1998 Jun 1;9(6):241-8.
15. EVANGELHO JA, Berrios JD, Pinto VZ, Antunes MD, Vanier NL, Zavareze ED. Antioxidant activity of black bean (Phaseolus vulgaris L.) protein hydrolysates. Food Science and Technology. 2016 Jul;36:23-7.
16. F. Gibbs, Selim Kermasha, Inteaz Alli, Catherine N. Mulligan B. Encapsulation in the food industry: a review. International journal of food sciences and nutrition. 1999 Jan 1;50(3):213-24.
17. Fatrcová-Šramková K, Nôžková J, Kačániová M, Máriássyová M, Rovná K, Stričík M. Antioxidant and antimicrobial properties of monofloral bee pollen. Journal of Environmental Science and Health, Part B. 2013 Jan 15;48(2):133-8.
18. Fitzgerald C, Gallagher E, Doran L, Auty M, Prieto J, Hayes M. Increasing the health benefits of bread: Assessment of the physical and sensory qualities of bread formulated using a renin inhibitory Palmaria palmata protein hydrolysate. LWT-Food Science and Technology. 2014 May 1;56(2):398-405.
19. Hartmann R, Meisel H. Food-derived peptides with biological activity: from research to food applications. Current opinion in biotechnology. 2007 Apr 1;18(2):163-9.
20. Jafari SM, Assadpoor E, He Y, Bhandari B. Encapsulation efficiency of food flavours and oils during spray drying. Drying technology. 2008 Jul 1;26(7):816-35.
21. Jamdar SN, Rajalakshmi V, Pednekar MD, Juan F, Yardi V, Sharma A. Influence of degree of hydrolysis on functional properties, antioxidant activity and ACE inhibitory activity of peanut protein hydrolysate. Food chemistry. 2010 Jul 1;121(1):178-84.
22. Katouzian I, Jafari SM. Nano-encapsulation as a promising approach for targeted delivery and controlled release of vitamins. Trends in Food Science & Technology. 2016 Jul 1;53:34-48.
23. Khazaei KM, Jafari SM, Ghorbani M, Kakhki AH. Application of maltodextrin and gum Arabic in microencapsulation of saffron petal's anthocyanins and evaluating their storage stability and color. Carbohydrate polymers. 2014 May 25;105:57-62.
24. Kim JW, Minamikawa T. Hydroxyl radical-scavenging effects of spices and scavengers from brown mustard (Brassica nigra). Bioscience, biotechnology, and biochemistry. 1997 Jan 23;61(1):118-23.
25. Klompong V, Benjakul S, Kantachote D, Shahidi F. Antioxidative activity and functional properties of protein hydrolysate of yellow stripe trevally (Selaroides leptolepis) as influenced by the degree of hydrolysis and enzyme type. Food chemistry. 2007 Jan 1;102(4):1317-27.
26. Kong B, Xiong YL. Antioxidant activity of zein hydrolysates in a liposome system and the possible mode of action. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2006 Aug 9;54(16):6059-68.
27. Lee SK, Han JH, Decker EA. Antioxidant activity of phosvitin in phosphatidylcholine liposomes and meat model systems. Journal of food science. 2002 Jan;67(1):37-41.
28. LI W, BOWERS JA, CRAIG JA, PERNG SK. Sodium tripolyphosphate stability and effect in ground turkey meat. Journal of Food Science. 1993 May;58(3):501-4.
29. Li X, Deng J, Shen S, Li T, Yuan M, Yang R, Ding C. Antioxidant activities and functional properties of enzymatic protein hydrolysates from defatted Camellia oleifera seed cake. Journal of food science and technology. 2015 Sep;52(9):5681-90.
30. Mahdavi SA, Jafari SM, Assadpoor E, Dehnad D. Microencapsulation optimization of natural anthocyanins with maltodextrin, gum Arabic and gelatin. International journal of biological macromolecules. 2016 Apr 1;85:379-85.
31. Mancuso JR, McClements DJ, Decker EA. The effects of surfactant type, pH, and chelators on the oxidation of salmon oil-in-water emulsions. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1999 Oct 18;47(10):4112-6.
32. McClements DJ, Decker EA. Lipid oxidation in oil‐in‐water emulsions: Impact of molecular environment on chemical reactions in heterogeneous food systems. Journal of food science. 2000 Nov;65(8):1270-82.
33. Miyamoto M, Tsumura K, Kimura M, Okihara S, Sugimoto H, Yamada H, Kimura Y. N-glycans bearing beta-1, 3-galactosyl residue in royal jelly glycoproteins. InGlycobiology 2004 Nov 1 (Vol. 14, No. 11, pp. 1122-1122). JOURNALS DEPT, 2001 EVANS RD, CARY, NC 27513 USA: OXFORD UNIV PRESS INC.
34. Mohan A, McClements DJ, Udenigwe CC. Encapsulation of bioactive whey peptides in soy lecithin-derived nanoliposomes: Influence of peptide molecular weight. Food chemistry. 2016 Dec 15;213:143-8.
35. Mohan, A., Rajendran, S. R., He, Q. S., Bazinet, L., & Udenigwe, C. C. (2015). Encapsulation of food protein hydrolysates and peptides: a review. RSC Advances, 5(97), 79270-79278.
36. Morais M, Moreira L, Feás X, Estevinho LM. Honeybee-collected pollen from five Portuguese Natural Parks: Palynological origin, phenolic content, antioxidant properties and antimicrobial activity. Food and Chemical Toxicology. 2011 May 1;49(5):1096-101.
37. Mosquera M, Giménez B, da Silva IM, Boelter JF, Montero P, Gómez-Guillén MC, Brandelli A. Nanoencapsulation of an active peptidic fraction from sea bream scales collagen. Food chemistry. 2014 Aug 1;156:144-50.

38. Mozafari MR. Micro and nano carrier technologies: high quality production within pharmaceutical standards. Cell Mol Biol Lett. 2004;9(Suppl 2):44-5.
39. Pihlanto A. Antioxidative peptides derived from milk proteins. International dairy journal. 2006 Nov 1;16(11):1306-14.
40. Ramadan MF, Al-Ghamdi A. Bioactive compounds and health-promoting properties of royal jelly: A review. Journal of functional foods. 2012 Jan 1;4(1):39-52.
41. Ramezanzade L, Hosseini SF, Nikkhah M. Biopolymer-coated nanoliposomes as carriers of rainbow trout skin-derived antioxidant peptides. Food chemistry. 2017 Nov 1;234:220-9.
42. Rodsamran P, Sothornvit R. Physicochemical and functional properties of protein concentrate from by-product of coconut processing. Food chemistry. 2018 Feb 15;241:364-71.
43. Sarabandi K, Gharehbeglou P, Jafari SM. Spray-drying encapsulation of protein hydrolysates and bioactive peptides: Opportunities and challenges. Drying Technology. 2020 Apr 3;38(5-6):577-95.
44. Sarabandi K, Peighambardoust SH, Mahoonak AS, Samaei SP. Effect of carrier types and compositions on the production yield, microstructure and physical characteristics of spray dried sour cherry juice concentrate. Journal of Food Measurement and Characterization. 2017 Dec 1;11(4):1602-12.
45. Sarabandi K, Mahoonak AS, Hamishehkar H, Ghorbani M, Jafari SM. Protection of casein hydrolysates within nanoliposomes: Antioxidant and stability characterization. Journal of food engineering. 2019 Jun 1;251:19-28.
46. Sarabandi K, Mahoonak AS, Hamishekar H, Ghorbani M, Jafari SM. Microencapsulation of casein hydrolysates: Physicochemical, antioxidant and microstructure properties. Journal of Food Engineering. 2018 Nov 1;237:86-95.
47. Sarmadi BH, Ismail A. Antioxidative peptides from food proteins: a review. Peptides. 2010 Oct 1;31(10):1949-56.
48. Shahidi F, Rubin LJ, Diosady LL, Kassam N, Fong JL, Wood DF. Effect of sequestering agents on lipid oxidation in cooked meats. Food chemistry. 1986 Jan 1;21(2):145-52.
49. Sofos JN. Use of phosphates in low-sodium meat products. Food technology (USA). 1986.
50. Tong LM, Sasaki S, McClements DJ, Decker EA. Mechanisms of the antioxidant activity of a high molecular weight fraction of whey. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2000 May 15;48(5):1473-8.
51. Tsai PJ, Tsai TH, Yu CH, Ho SC. Comparison of NO-scavenging and NO-suppressing activities of different herbal teas with those of green tea. Food Chemistry. 2007 Jan 1;103(1):181-7.
52. Udenigwe CC, Lu YL, Han CH, Hou WC, Aluko RE. Flaxseed protein-derived peptide fractions: Antioxidant properties and inhibition of lipopolysaccharide-induced nitric oxide production in murine macrophages. Food Chemistry. 2009 Sep 1;116(1):277-84.
53. Umayaparvathi S, Meenakshi S, Vimalraj V, Arumugam M, Sivagami G, Balasubramanian T. Antioxidant activity and anticancer effect of bioactive peptide from enzymatic hydrolysate of oyster (Saccostrea cucullata). Biomedicine & Preventive Nutrition. 2014 Jul 1;4(3):343-
54. Wu HC, Chen HM, Shiau CY. Free amino acids and peptides as related to antioxidant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus). Food research international. 2003 Jan 1;36(9-10):949-57.
55. Xie J, Du M, Shen M, Wu T, Lin L. Physico-chemical properties, antioxidant activities and angiotensin-I converting enzyme inhibitory of protein hydrolysates from Mung bean (Vigna radiate). Food chemistry. 2019 Jan 1;270:243-50.
56. Yang S, Mao XY, Li FF, Zhang D, Leng XJ, Ren FZ, Teng GX. The improving effect of spray-drying encapsulation process on the bitter taste and stability of whey protein hydrolysate. European Food Research and Technology. 2012 Jul 1;235(1):91-7.
57. You L, Zhao M, Cui C, Zhao H, Yang B. Effect of degree of hydrolysis on the antioxidant activity of loach (Misgurnus anguillicaudatus) protein hydrolysates. Innovative food science & emerging technologies. 2009 Apr 1;10(2):235-40.

فرم های اطلاعاتی بر اساس ازمایشات مربوطه انجام خواهد شد