بررسی توزیع حرارتی و بهره درمانی نانوذرات مغناطیسی اکسید گرافن در میدان مغناطیسی متناوب حاصل از امواج فرکانس رادیویی 56/13 مگاهرتز در موش- صحرایی دارای مدل توموری گلیومای C6

خلاصه اهمیت بحث، ضرورت طرح و روش اجرا 

گلیوما، شایع ترین نوع تومور مغزی در بزرگسالان است که منشاء آن سلول های گلیال می باشد. تومور مغزی گلیوما در حدود 78% از تومورهای سرطانی مغز را تشکیل می دهد. به دلیل موقعیت آناتومیکی تومور و وجود سد خونی مغز درمان های متداول تاثیر چندانی ندارند. از جمله درمان های جدید کاربرد توام هایپرترمیا و شیمی درمانی است. سلول‌های سرطانی به افزایش حرارت حساس هستند، با افزایش درجه حرارت بافت میتوان باعث القا و افزایش مرگ سلولی گردید. از رایج ترین حساس‌کننده های گرمایی تحت میدان مغناطیسی متناوب نانوذرات آهن می باشند. هایپرترمیا با استفاده از میدان مغناطیسی قدرت نفوذ بالایی دارد و می‌تواند برای تومورهای عمقی به کار رود. نانو اکسید گرافن به دلیل ساختار شبیه کندوی عسل، می توان انواع نانوذرات را به راحتی بر روی آن بارگذاری کرد. از ویژگی‌های این ساختار آن است که می‌تواند در حضور امواج رادیویی باعث افزایش حرارت گردد. لذا دراین تحقیق ابتدا با استفاده از سلول‌های گلیومای C6 در ناحیه مغز رت مدل توموری ایجاد می‌گردد، سپس از نانوذرات مغناطیسی اکسید گرافن جهت عبور از سد خونی مغز استفاده می‌شود. در چنین شرایطی از هایپرترمیای مغناطیسی جهت افزایش صدمات به سلول های توموری ناحیه مغز استفاده می‌گردد.    

-بیان مسئله  (Problem Statement)

بر اساس گزارش انجمن سرطان آمریکا، میزان شیوع سرطان ایالت متحده در سال 2019 در حدود 23820 مورد جدید تومورهای سیستم اعصاب مرکزی (CNS)، (۳/۱ درصد از کل سرطان ها) بوده و 17760 مرگ ناشی از تومورهای سیستم عصبی مرکزی مشاهده شده است [1]. تومورهای دستگاه عصبی بر اساس ماهیت سلولی که تومور از آن نشات گرفته به دو دسته تقسیم می شوند. تومورهای اولیه و ثانویه، تومورهای اولیه که از سیستم عصبی مرکزی ناشی می شوند و تومورهای ثانویه که ناشی از متاستاز تومور  به سایر قسمت های بدن هستند [3-2]. گلیوما، نئوپلاسم بافت پشتیبان در دستگاه عصبی مرکزی می باشد. بیش از نیمی از تمام تومورهای سیستم عصبی را گلیوما تشکیل می دهد. شیوع گلیوما بیشتر در سنین ۴۵ تا ۶۵ سالگی بوده و میزان ابتلای مردان به زنان یک و نیم به یک می باشد [5]. وخیم ترین نوع گلیوما، گلیوبلاستومای مولتی فرم (GBM) با درجه بدخیمی ۴ می باشد [6]. برای شناسایی گلیوما معمولاً از تصویربرداریCT، MRI و PET استفاده می شود و تشخیص نهایی با بیوپسی از بافت صورت می گیرد [7].

۱- جراحی متداول ترین روش درمانی برای این تومور به حساب می آید اما به دلیل موقعیت آناتومیکی تومور، سرطان به بعضی قسمت‌های بافت مغزی به گونه‌ای دست‌اندازی می‌کند که برداشتن آن نواحی باید همراه با برداشتن بخشی از بافت نرمال باشد لذا برداشتن کل تومور ممکن نیست و در حین جراحی قسمت هایی از بافت سالم نیز برداشته می شود [8].

۲- از پرتو درمانی برای کشتن سلول‌های سرطانی پس از جراحی و یا کوچک کردن تومور قبل از جراحی استفاده می‌شود. با وجود اینکه پرتو درمانی روشی پذیرفته شده برای کنترل سرطان مغز است ولی بافت های نرمال که در بر گیرنده تومور هستند دوز زیادی دریافت می کنند لذا این روش نیز دارای عوارضی برای بیمار می باشد و به سلول های سالم آسیب می رساند [9].

۳- در شیمی درمانی نیز مشکل عمده انتخاب نوع دارو بر حسب حساسیت تومورها به دارویی خاص و انتقال دز کافی از سد خونی مغز به درون تومور  می باشد. محدودیت های عمده شیمی درمانی شامل: توزیع سیستماتیک دارو در کل بدن، نرسیدن دارو به طور اختصاصی به تومور، کمبود غلظت دارو به طور موضعی در تومور، کنترل نداشتن بر روی رهایش دارو در موضع تومور می باشد. در نتیجه توزیع سیستماتیک دارو در کل بدن، عوارض جانبی شدیدی مشاهده می شود که این امر به دلیل حمله داروی شیمی درمانی به بافت های سالم بدن علاوه بر بافت های سرطانی می باشد. لذا ضرورت رساندن دارو به صورت هدفمند به بافت های  سرطانی احساس می شود [10].

۴- به دلیل وجود سد خونی مغز و همچنین غشای سلول سرطانی، فرآیند عبور دارو به داخل سلول بسیار زمان بر می باشد. به همین دلیل باید، دز بالایی از دارو تزریق گردد که در این صورت وارد مایع خارج سلولی می شود. دوز بالای دارو امکان رسیدن دارو به بافت های سالم را افزایش می دهد و سبب آسیب آنها می گردد [11].

با توجه به مشکلات فوق برای کاهش عوارض جانبی درمان و افزایش بهره وری درمان می توان از روش هایی مثل: کاربرد حساس کننده های پرتویی، گرمایی یا نوری برای افزایش اثر پرتو بر بافت های سرطانی، کاربرد نانو ذرات برای شکستن سد خونی مغز و انتقال هدفمند دارو و استفاده از هایپرترمیا برای القای مرگ آپوپتوزی و نکروزی سلول های  سرطانی و ترکیب روش های فوق با  پرتودرمانی و شیمی درمانی استفاده کرد.

۱- هایپرترمیا

هایپرترمیا جزو روش های درمانی است که معمولاً به عنوان یک روش مکمل به همراه سایر روش ها مثل پرتو درمانی یا شیمی درمانی به کار می رود. سلول ها (به ویژه سلولهای هایپوکسیک و سلول های در pH پایین) به افزایش حرارت حساس می باشند[12]. لذا بر اساس میزان گرمادهی و افزایش درجه حرارت بافت می توان باعث القا و افزایش مرگ سلولی (در دمای ۴۱ تا ۴۳ درجه به صورت آپوپتوز و در درجه حرارت بالاتر از ۶۰ به صورت نکروز) گردید. در حال حاضر مشکل اصلی هایپرترمیا رسیدن به یک توزیع دقیق و یکنواخت گرما در حجم های معینی از تومور می باشد و در واقع این درمان مداخله ای گر چه باعث آسیب های سلولی جبران ناپذیری به سلول های سرطانی می شود اما باعث ایجاد بعضی آسیب ها به سلول های سالم هم می شود از جمله روش های ایجاد هایپرترمیا استفاده از لیزر، اولتراسوند، اعمال امواج رادیویی برای تولید میدان مغناطیسی یا الکتریکی متناوب می باشد [13].

۲- نانو اکسید آهن

از نانو اکسید آهن به عنوان ماده کنتراست زا در تکنیک تصویر برداری تشدید مغناطیسی برای ارزیابی میزان جذب دارو در تومور استفاده می شود. با استفاده از این نانو ذرات برای بارگذاری دارو می توان با اعمال میدان مغناطیسی دارو را به صورت هدفمند به مکان مورد نظر انتقال داد. علاوه براین از نانو ذرات اکسید آهن در هایپرترمیای مغناطیسی برای افزایش مقدار حرارت تولیدی در بافت تومورال استفاده می شود. از این ویژگی نانو ذرات اکسید آهن به صورت کلینیکی در هایپرترمیا استفاده می شود [14].

۳- نانو اکسید گرافن (NGO)

نانو اکسید گرافن غیر سمی بوده و به دلیل ساختار شبیه کندوی عسل آن، می توان دارو را به راحتی بر روی آن بارگذاری کرد. پروسه رهایش دارو از گرافن با پوشش پلیمری که اکثرا از پلیمرهای زیست تخریب پذیر ساخته می شوند و داخل آن ها یک داروی ضد سرطان بارگذاری شده است،متاثر از فعالیت های آنزیمی،تغییرات شرایط فیزیولوژیک نظیر pH، اسمولاریته و یا دما می باشد [15]. برای داشتن اکسید گرافن چند کاره می توان آن را با پلیمرهای خاصی پوشش داد و از آن ها برای رسیدن به اهداف از پیش تعیین شده ای در تشخیص و درمان سرطان بهره برد. از طرفی این صفحات در میدان امواج رادیویی (RF) می توانند تولید گرما کنند. بنابراین با تاباندن این پرتو به صفحات گرافن می توان به طور موضعی باعث تجمع حرارت شد برای افزایش مقدار حرارت تولیدی می توان درون نانو اکسید گرافن نانو ذراتی مثل آهن بارگذاری کرد، که روشی کاملاً غیر تهاجمی می باشد [16-17]. در این تحقیق سعی می شود تا با استفاده از موارد فوق به صورت ترکیبی اثرات درمانی بر بافت های سرطانی را با استفاده از:

کاربرد نانو اکسید گرافن برای بارگذاری بیشتر نانوذرات آهن در عبور از سد خونی مغز و تولید حرارت در اثر تابش امواج  رادیویی

کاربرد نانو ذرات اکسید آهن برای انتقال هدفمند تحت میدان مغناطیسی، تولید حرارت و  ردیابی نانوحامل تصویر برداری MRI

کاربرد هایپرترمیا برای افزایش آسیب های سلولی بافت سرطانی و القای مرگ آپوپتوزی بتوان بهره درمانی را افزایش داد.

بازنگری متون علم

۱-  در سال 2021، Afzalipour و همکارانش نشان دادند که وقتی داروی TMZ در نانوذرات تری بلاک کانژوگه شده با اسید فولیک بارگذاری می شود، می تواند نقش موثری در انتقال دارو از سد خونی مغزی داشته باشد. علاوه بر آن آنها نشان دادند که این نانوذرات تحت تاثیر افزایش دما میزان رهایش بیشتری دارند[18].

۲- در سال 2020، Mahdavi و همکاران با درمان بیماران دارای گلیوما با هایپرترمیای میدان الکتریکی متناوب به همراه رادیوتراپی نشان دادند این نوع هایپرترمیا در ترکیب با رادیوتراپی  نتایج قابل توجهی بر میزان مقای بیماران ندارد. آنها از 3-6 جلسه هایپرترمیا مابین جلسات پرتودرمانی استفاده کردند [19].

۳- در سال 2020 Piehler و همکارانش با ساخت نانوذرات مغناطیسی اکسید آهن (MF66) و بارگذاری داروی دوکسوروبیسین DOX) ( به بررسی صدمات سلولی القاشده بر روی سلولهای سرطان پستان و مدل توموری زنوگرافت موشی در حضور هایپرترمیای مغناطیسی پرداختند. مطالعات آنها نشان دهنده اثر هم افزایی هایپرترمیای مغناطیسی و داروی DOX بود[14].

۴-  در سال 2017، Nehate و همکارانش استفاده از نانو ذرات اکسید آهن بارگذاری شده با دوکسوربیسین و هدفمند شده با اسید فولیک را در مطالعه in vitro بررسی کردند. نتایج آنها نشان داد در سلول های سرطانی HeLa and MDA-MB-231 اثر هم افزایی فولات و هایپرترمیا مشاهده شد در حالی که در سلول های نرمال  (L929) این اثر قابل اغماض بود[20].

۵- در سال 2017، Ohtake و همکارانش اثرات درمانی هایپرترمیای میدان مغناطیسی متناوب را با حضور نانوذرات سوپر پارامغناطیسی و بدون نانوذرات را بر روی موش‌های دارای تومور بررسی کردند. برای این کار سلول‌های U251 به صورت زیر جلدی در ران پای موش‌ها تزریق شد. 7 روز بعد از تزریق سلول، نانوذرات حاویmM 50 آهن در ناحیه تومور تزریق شدند. برای هایپرترمیا موش‌ها داخل سیم پیچ مسی با قطر داخلی 4 سانتی‌متر قرار گرفتند. برای کنترل حرارت تولیدی نیز از اپلیکاتور فیبر نوری استفاده شد. هایپرترمیا 2 بار در هفته انجام شد و هر بار موش‌ها یک ساعت در دمای 43 درجه قرار گرفتند. نتایج درمانی حاکی از کاهش حجم تومور در گروه درمانی هایپرترمیا با نانوذرات سوپرپارامغناطیس و افزایش بقای موش‌ها بود[21].

۶- در سال۲۰۱۴، Yi و همکارانش اثرات غلظت های مختلف (۲، ۵ و ۱۰ میلی گرم) نانو ذرات اکسید آهن را در درمان موش های صحرایی دارای تومور گلیوبلاستومای C6 با کاشت درون جمجمه ای بررسی کردند. تحقیقات آنها نشان داد که تزریق نانو ذرات اکسید آهن در هایپرترمیا اثر قابل توجهی داشته و می تواند دما را تا ۴۵ درجه افزایش دهد. غلظت های مختلف نانو ذرات اکسید آهن  ۲، ۵ و ۱۰ میلی گرم باعث بقای ۱۸، ۲۰ و ۲۱ روز موش ها شده که نشان می دهد تفاوت چندانی در اثرات درمانی غلظت های مختلف نانو ذرات وجود ندارد ولی نکته مهم عدم سمیت نانو ذرات اکسید آهن برای بافت های  سالم و کاربرد آنها در ارزیابی تومور در تصویر MRI ، T2WI می باشد[22].

۷-  در سال۲۰۱۳، Takagi و همکارانش با بررسی اثر هایپرترمیا در دماهای بالا بر روی موش های صحرایی دارای گلیوبلاستومای C6 نشان دادند که در دما های ۴۵-۵۰ درجه سانتیگراد رشد تومور در موش های تحت درمان هایپرترمیا در قیاس با گروه کنترل کاهش مطلوبی را نشان می دهد. در دماهای ۶۰-۷۰ درجه سانتیگراد، کاهش رشد تومور چشمگیرتر بوده و تقریباً رشد تومور متوقف می شود. آنها دلیل این مساله را القای آپوپتوز در دماهای پایین و نکروز در دماهای بالا دانستند. در دماهای بالا ساختار پروتیین تخریب شده و DNA آسیب می بیند[23].

۸- در سال۲۰۱۳، Jaworski و همکارانش بر روی اثر سمیت زایی صفحات کوچک گرافن با غلظت های ۵، ۱۰، ۲۰، ۵۰و ۱۰۰میکرو گرم بر میلی لیتر به مدت ۲۴ ساعت بر روی سلول های گلیوما U87 تحقیق کردند. آنها به این نتیجه رسیدند که گرافن از طریق چسبندگی با غشا سلول می تواند باعث اختلال در رسیدن مواد مغذی به سلول شود و از این طریق باعث فعال سازی آپوپتوز در سلول های سرطانی می شود. با افزایش غلظت صفحات گرافن مرگ سلولی هم افزایش یافت به صورتی که در غلظت ۱۰۰ میکرو گرم بر میلی لیتر درصد مرگ سلولی ۴۲ بود. در این مطالعه اندازه صفحات بین ۴۵۰ نانومتر تا  ۱.۵ میکرومتر بود. این اندازه ی صفحات، حرکت آن ها در بافت و همچنین میزان مصرف به وسیله سلول های فاگوسیتوز را محدود کرد. در نتیجه هیچ صفحه گرافنی داخل سلول مشاهده نشد[24].

۹- در سال ۲۰۰۷، Gannon و همکارانش برای اولین بار نشان دادند که کاربرد امواج میکرو فرکانس ۱۳.۵۶ مگاهرتز برای تحریک نانو تیوب  های کربن تزریق شده به خرگوش های دارای تومور هپاتیت VX2 برای تولید گرما باعث افزایش آسیب های نکروزی در هر دو بافت  سرطانی و  سالم در محل سوزن الکترود شده و دورتر از سوزن اثر مضری روی بافت  سالم ندارد. در واقع سلول های  سرطانی نسیت به سلول های  سالم به گرما حساس تر هستند. آنها همچنین نشان دادند که کاربرد نانو تیوب  های کربن برای تحریک با RF هیچ نوع سمیتی برای بافت سالم ندارد[16].

۱۰- در سال۱۹۹۳، Paulus  و همکارانش با تزریق 10⁵-10⁶ سلول گلیوبلاستومای C6 به صورت درون جمجمه ای در موش های صحرایی به این نتیجه رسیدند که سلول های سرطانی خاصیت تهاجمی بالا داشته و می توانند به صورت منفرد به درون بافت اطراف مغز نفوذ کرده و به فیبرهای عصبی و رگ های خونی آسیب برسانند. در ایجاد این آسیب ها برهمکنش های سلول- سلول و سلول- ماتریس و چسبندگی مولکول هایی مثل پروتئاز و سیتوکین نقش مهمی دارد[25].

۱- توزیع حرارتی نانوذرات مغناطیسی اکسید گرافن در میدان مغناطیسی متناوب داخل بدن رت دارای تومور گلیوما به چه صورت است؟

۲- آیا نانوذرات مغناطیسی اکسید گرافن بر سلول های گلیومای C6 تولید سمیت می کنند؟

۳- آیا نانوذرات مغناطیسی اکسید گرافن در حضور میدان مغناطیسی متناوب در سلول های گلیومای C6 تولید گونه های اکسیژن فعال می کنند؟

۴- آیا کاربرد نانو ذرات مغناطیسی اکسید گرافن بر میزان بیان ژنهای bax و bcl2 در رده سلولی گلیوبلاستوما C6 در شرایط in vitro و in vivo  موثر است؟

۵- آیا کاربرد نانو ذرات مغناطیسی اکسید گرافن در حضور میدان مغناطیسی متناوب بر میزان بیان ژنهای bax و bcl2 در رده سلولی گلیوبلاستوما C6 در شرایط in vitro و in vivo  موثر است؟

بررسی توزیع حرارتی و بهره درمانی نانوذرات مغناطیسی اکسید گرافن در میدان مغناطیسی متناوب حاصل از امواج فرکانس رادیویی 56/13 مگاهرتز در موش- صحرایی دارای مدل توموری گلیومای C6

۱- تعیین توزیع حرارتی نانوذرات مغناطیسی اکسید گرافن در میدان مغناطیسی متناوب داخل بدن رت دارای تومور گلیوما

۲- تعیین میزان سمیت نانوذرات نانوذرات مغناطیسی اکسید گرافن بر سلول های گلیومای C6

۳- تعیین میزان تولید گونه های اکسیژن فعال توسط نانوذرات مغناطیسی اکسید گرافن در حضور میدان مغناطیسی متناوب

۴- تعیین اثر میدان مغناطیسی متناوب بر میزان بیان ژنهای bax و bcl2 در رده سلولی گلیوبلاستوما C6 در شرایط in vitro و in vivo 

۵- تعیین اثر نانوذرات مغناطیسی اکسید گرافن در حضور میدان مغناطیسی متناوب بر میزان بیان ژنهای bax و bcl2 در رده سلولی گلیوبلاستوما C6 در شرایط in vitro و in vivo 

دانشگاهها

مراکز تحقیقاتی

شرکتهای دانش بنیان

شرکتهای داروسازی

مراکز درمانی

۱- هایپرترمیا

هایپرترمیا جزو روش های درمانی است که معمولاً به عنوان یک روش مکمل به همراه سایر روش ها مثل پرتو درمانی یا شیمی درمانی به کار می رود. سلول ها (به ویژه سلولهای هایپوکسیک و سلول های در pH پایین) به افزایش حرارت حساس می باشند[12]. لذا بر اساس میزان گرمادهی و افزایش درجه حرارت بافت می توان باعث القا و افزایش مرگ سلولی (در دمای ۴۱ تا ۴۳ درجه به صورت آپوپتوز و در درجه حرارت بالاتر از ۶۰ به صورت نکروز) گردید. در حال حاضر مشکل اصلی هایپرترمیا رسیدن به یک توزیع دقیق و یکنواخت گرما در حجم های معینی از تومور می باشد و در واقع این درمان مداخله ای گر چه باعث آسیب های سلولی جبران ناپذیری به سلول های سرطانی می شود اما باعث ایجاد بعضی آسیب ها به سلول های سالم هم می شود از جمله روش های ایجاد هایپرترمیا استفاده از لیزر، اولتراسوند، اعمال امواج رادیویی برای تولید میدان مغناطیسی یا الکتریکی متناوب می باشد [13].

۲- نانو اکسید آهن

از نانو اکسید آهن به عنوان ماده کنتراست زا در تکنیک تصویر برداری تشدید مغناطیسی برای ارزیابی میزان جذب دارو در تومور استفاده می شود. با استفاده از این نانو ذرات برای بارگذاری دارو می توان با اعمال میدان مغناطیسی دارو را به صورت هدفمند به مکان مورد نظر انتقال داد. علاوه براین از نانو ذرات اکسید آهن در هایپرترمیای مغناطیسی برای افزایش مقدار حرارت تولیدی در بافت تومورال استفاده می شود. از این ویژگی نانو ذرات اکسید آهن به صورت کلینیکی در هایپرترمیا استفاده می شود [14].

۳- نانو اکسید گرافن (NGO)

نانو اکسید گرافن غیر سمی بوده و به دلیل ساختار شبیه کندوی عسل آن، می توان دارو را به راحتی بر روی آن بارگذاری کرد. پروسه رهایش دارو از گرافن با پوشش پلیمری که اکثرا از پلیمرهای زیست تخریب پذیر ساخته می شوند و داخل آن ها یک داروی ضد سرطان بارگذاری شده است،متاثر از فعالیت های آنزیمی،تغییرات شرایط فیزیولوژیک نظیر pH، اسمولاریته و یا دما می باشد [15]. برای داشتن اکسید گرافن چند کاره می توان آن را با پلیمرهای خاصی پوشش داد و از آن ها برای رسیدن به اهداف از پیش تعیین شده ای در تشخیص و درمان سرطان بهره برد. از طرفی این صفحات در میدان امواج رادیویی (RF) می توانند تولید گرما کنند. بنابراین با تاباندن این پرتو به صفحات گرافن می توان به طور موضعی باعث تجمع حرارت شد برای افزایش مقدار حرارت تولیدی می توان درون نانو اکسید گرافن نانو ذراتی مثل آهن بارگذاری کرد، که روشی کاملاً غیر تهاجمی می باشد [16-17].

تحربی 

بنیادی-کاربردی

رت های ویستار نر (-180-220 گرم) دارای تومور گلیوما

10 عدد رت در هر گروه درمانی در مجموع 40 عدد رت دارای تومور گلیوما که وجود تومور با تصویربرداری MRI تایید شده باشد.

10 عدد رت در هر گروه درمانی در مجموع 40 عدد رت دارای تومور گلیوما که وجود تومور با تصویربرداری MRI تایید شده باشد.

روش های مانند ترمومتری که توسط دور بین IR انجام می شود قبل از شروع ازمایش دستگاه با دماسنج جیوه ای کالیبره می شود.

دستگاه RF قبل از استفاده توسط اسیلوسکوپ جریان خروجی سنجش می گردد.

وجود تومور در رت ها قبل از ورود به آزمایش توسط تصویربرداری MRI تایید می گردد.

تمامی آزمایش های In vitro به صورت 3 بار تکرار هستند. و ازمایش های In vivo با وجود 10 رت در هر گروه درمان انجام می شوند.

۱- سلول های سرطان گلیوبلاستوما C6 از گونه سلول های هستند که به کف ظرف می چسبند. شرایط کشت این سلول: دمای ۳۷ درجه سلسیوس و اتمسفر ۹۵ درصد هوا و ۵ درصد دی اکسید کربن می باشد. بعد از این که سلول ها کف ظرف را پر کردند، فلاسک از انکوباتور خارج و محیط رویی دور ریخته می شوند. فلاسک به مدت ۳ تا ۴ دقیقه در انکوباتور ۳۷ درجه سلسیوس قرار داده می شود تا سلول ها از کف ظرف کنده شوند. بعد از اینکه سلول ها کشت داده می شوند آن ها را همگن کرده ، به نسبت نه به یک با رنگ متیل گرین مخلوط می شوند و سلول ها توسط میکروسکوپ نوری شمارش می شوند. برای اندازه گیری نسبت سلول های زنده از خاصیت نفوذ رنگ تریپان بلو در سلول های مرده استفاده می شود، برای این کار رنگ تریپان بلو به نسبت ۱ به ۹ به سلول اضافه می شود و بعد از چند دقیقه درصد سلول های آبی رنگ که نشان دهنده درصد سلول های مرده است، تعیین می گردد. با رسم منحنی رشد زمان دو برابر شدن سلول ها تعیین می گردد. برای تزریق در نمونه حیوانی نیاز به 106 سلول برای هر موش داریم.

۲- بعد از آن خصوصیات  نانوصفحات ساخته شده نظیر سایز و بار سطحی تعیین می شود. برای تعیین مشخصات نانو صفحات اکسید گرافن از روش های تهیه تصویر با دستگاه TEM و SEM از نانو صفحات و اندازه گیری توزیع سایز نانو صفحات با دستگاه DLS استفاده می شود.

۳- تعیین سمیت نانوذرات بر کشت سلولی C6 و خون رت

برای بررسی سمیت نانوذرات در ابتدا سلول ها برای 24 ساعت در پلیت 96 کشت داده شده و غلظت های مختلفی از نانوذرات به چاهک ها اضافه می شود. بعد از 24 ساعت محیط چاهک ها اوت شده، چاهک ها با PBS شسته شده و به هر کدام 200 میکرولیتر رنگ MTT اضافه می شود. بعد از 4 ساعت رنگ ها اوت شده و به چاهک ها 200 میکرولیتر محلول DMSO اضافه شده و بعد از 20 دقیقه با الایزا ریدر خوانش می گردند.

برای تست همولیز نیز بعد از سانتریفیوژ کردن خون و اوت کردن محلول رویی، گلبول های قرمز باقیمانده با PBS رقیق شده و درون میکروتیوپ ها ریخته می شوند به هر میکروتیوپ غلظت های مختلفی از نانوذرات اضافه شده و میکروتیوپ ها به مدت 2 ساعت درون انکوباتور قرار می گیرند. بعد از 2 ساعت میکروتیوپ ها خارج و به پلیت 96 برای خوانش توسط الایزا ریدر منتقل می گردند از آب به عنوان کنترل منفی و از PBS به عنوان کنترل مثبت استفاده می گردد.

۴-  تزریق استریوتاکتیک درون جمجمه ای 106 سلول کشت داده شده گلیوبلاستوما موشی C6 (در 10 موش صحرایی) برای ایجاد تومور در موش صحرایی

۵- از آنجا که نانوساختار از طریق ورید دمی تزریق می شود، هدفمند کردن آن باید از طریق میدان مغناطیسی ( 18/0 تسلا) انجام شود بنابراین پس از ایجاد مدل توموری و قبل از انجام تیمارها ورود نانوساختار بدرون مغز  با روشی مثل MRI یا TEM تایید می شود.

۶- موش های صحرایی لازم جهت کار in vivo تهیه شده و گروه بندی می گردد، در هر گروه 10 موش قرار می گیرد.

۷- برای سنجش گونه های فعال اکسیژن، سلول ها در پلیت 24 کشت داده شده و بعد از 24 ساعت نانوذرات به سلول ها افزوده شده و تحت میدان قرار می گیرند. بعد از اعمال میدان مغناطیسی متناوب توسط کیت میزان تولید گونه های فعال اکسیژن سنجش می گردد.

۸- در گروه های شامل نانو دارو قبل از شروع درمان دارو از طریق دم موش تزریق می گردد با اعمال میدان مغناطیسی (1800 گوس و 2 ساعت) به صورت هدفمند انتقال می یابد و تایید ورود نانو دارو به مغز توسط تصاویر MRI با وزن T2 صورت می گیرد.

۹- گروه های شامل موج رادیویی تحت تابش امواج با فرکانس ۱۳.۵۶ مگاهرتز به مدت ۱۰ دقیقه قرار می گیرند.

۱۰- گروه میدان مغناطیسی:  شدت مگنت و زمان تابش به تومور: توسط تصویر MRI میزان عبور نانوحامل حاوی دارو از سد خونی مغز، سایز تومور و نقشه توزیع حرارتی بافت به دست می آید.

(دما متغیر مستقل است چون تا رسیدت به دمای 43 درجه، درمان انجام میشود. ولی چون حضور نانوذرات باعث میشود که دما در زمان کمتری به 43 درجه برشد، زمان وایسته به شرایط و کلربرد نانوذرات و حتی غاظت نانوذرات است.)

۱۱- از روی نمونه تومور به دست آمده به کمک کیت استخراج RNA بر اساس پروتکل شرکت تولید کننده، RNA استخراج شده و پرایمرها جهت سنتز cDNA و انجام تکنیک PCR نسبت بیان دو ژن bcl2 و bax سنجیده می شود. ژن bcl2 مهار کننده آپوپتوز و ژن bax القا کننده آپوپتوز می باشد. چنانچه در پروتکل درمانی نسبت ژن bax به bcl2 افزایش یابد، آن پروتکل برای القای آپوپتوز و در نتیجه درمان سرطان مفید خواهد بود.

پس از انجام آزمون های لازم و محاسبه میانگین و انحراف معیار داده های به دست آمده برای هر رت در گروه های درمانی تحت آزمون ANOVA و با استفاده از نرم افزار SPSS بررسی خواهد شد. (P<0.05 معنی دار خواهد بود).

۱- تهیه حیوانات و نگهداری از آنها در حیوانخانه دانشگاه  می باشد. رتها به آب و غذای کافی دسترسی داشته و در ۱۲ ساعت روشنایی و ۱۲ ساعت تاریکی خواهند بود. شرایط تهویه مناسب برقرار نیباشد..  

۲- کلیه آزمایشات بر روی موشهای صحرایی و خرگوش هاو معدوم کردن آنها مطابق با پروتکل ارائه شده از طرف دانشگاه علوم پزشکی زاهدان  مطابق با مفاد پروتکل الحاقی کار با حیوانات (هلسینکی) صورت خواهد گرفت

بندهای 1تا6دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی ایران رعایت می‌شود.

1- پژوهشگر باید به این امر مهم توجه داشته باشد که بافت‌ها و اعضای مورد استفاده، دارای منشأ انسانی‌اند و کرامت انسانی اقتضا می‌کند که جمع‌آوری، نگه‌داری، استفاده و نابودسازی آن‌ها توأم با رعایت ملاحظات و شؤون مرتبط باشد.

2- از اجزای بدنی دارای منشأ انسانی باید تنها در پژوهش‌هایی استفاده شود که اهداف ارزشمندی را در راستای مبارزه با بیماری‌ها و ارتقای سلامت انسان‌ها دنبال می‌کنند.

3- تمامی پژوهش‌ها بر روی عضو و بافت انسانی، پیش از اجرا، باید مورد تأیید کمیته‌ی اخلاق در پژوهش مرتبط قرار گیرد. کمیته‌ی اخلاق در پژوهش حق دارد که در تمامی مراحل پژوهش بر آن نظارت داشته باشد. پژوهشگران باید در این زمینه با کمیته‌ی اخلاق در پژوهش همکاری کنند.

4- رضایت آگاهانه‌ی فرد دهنده‌ی عضو یا بافت، یا جانشین قانونی او، شرط اساسی در تأیید اخلاقی هر پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی است. رضایت‌نامه باید با رعایت تمامی اصول مرتبط تهیه و هنگام ارسال طرح‌نامه برای تصویب، به آن پیوست شده باشد.

5- در مواردی که اخذ رضایت آگاهانه از دهنده‌ی نمونه‌ی ذخیره‌شده یا جانشین قانونی او امکان‌پذیر نباشد، به‌شرط وجود رضایت کلی اولیه بر استفاده‌ی پژوهشی، در صورت تأیید کمیته‌ی اخلاق در پژوهش می‌توان از آن نمونه برای پژوهش استفاده کرد. در چنین مواردی باید از نمونه‌هایی استفاده شود که به ‌نحو برگشت‌ناپذیر بی‌نام ‌شده باشد. ‌

6- پژوهشگر باید از اعضاء و بافت‌هایی که به منظور پژوهش در اختیار او قرار می‌گیرد استفاده‌ی بهینه کرده، از هدر رفتن آن‌ها جلوگیری کند.

راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی ایران (کدهای 1 و 2و 3و 8)

1- پژوهشگر باید به این امر مهم توجه داشته باشد که بافت‌ها و اعضای مورد استفاده، دارای منشأ انسانی‌اند و کرامت انسانی اقتضا می‌کند که جمع‌آوری، نگه‌داری، استفاده و نابودسازی آن‌ها توأم با رعایت ملاحظات و شؤون مرتبط باشد.

2- از اجزای بدنی دارای منشأ انسانی باید تنها در پژوهش‌هایی استفاده شود که اهداف ارزشمندی را در راستای مبارزه با بیماری‌ها و ارتقای سلامت انسان‌ها دنبال می‌کنند.

3- تمامی پژوهش‌ها بر روی عضو و بافت انسانی، پیش از اجرا، باید مورد تأیید کمیته‌ی اخلاق در پژوهش مرتبط قرار گیرد. کمیته‌ی اخلاق در پژوهش حق دارد که در تمامی مراحل پژوهش بر آن نظارت داشته باشد. پژوهشگران باید در این زمینه با کمیته‌ی اخلاق در پژوهش همکاری کنند.

8- پژوهشگر باید از اعضاء و بافت‌هایی که به منظور پژوهش در اختیار او قرار می‌گیرد استفاده‌ی بهینه کرده، از هدر رفتن آن‌ها جلوگیری کند

راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش‌های علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی  در جمهوری اسلامی ایران (کدهای 1و 3و 4 و 5 و 9 و 11 و 28 و 29و 30 و 31)

1-هدف اصلی هر پژوهش‌باید ارتقای سلامت انسان‌ها توأم با رعایت کرامت و حقوق ایشان باشد.

3-پژوهش بر انسان فقط در صورتی توجیه‌پذیر است که منافع بالقوه‌ی آن برای هر فرد آزمودنی بیش‌تر از خطرهای  آن باشد. در پژوهش‌های دارای ماهیت غیر درمانی، سطح آسیبی که آزمودنی در معرض آن قرار می‌گیرد نباید بیش‌تر از آن‌چه باشد که مردم عادی در زندگی روزمره‌ی خود با آن مواجه می‌شوند. حصول اطمینان از این امر برعهده‌ی طراحان، مجریان و همکاران پژوهش و تمامی شوراهای بررسی یا پایش‌کننده‌ی پژوهش از جمله کمیته‌ی اخلاق در پژوهش‌ است.

4-مواردی از قبیل سرعت، سهولت کار، راحتی پژوهشگر، هزینه‌ی پایین‌تر و/ یا صرفاً عملی بودن آن به هیچ وجه نباید موجب قرار دادن آزمودنی در معرض خطر یا زیان افزوده یا تحمیل هر گونه محدودیت اختیار اضافی به وی شود.

5-قبل از آغاز هر پژوهش پزشکی ، باید اقدامات  اولیه جهت به حداقل رساندن زیان احتمالی وارده به آزمودنی‌ها و تامین سلامت آن‌ها انجام گیرد.

9-در پژوهش‌های پزشکی که ممکن است به محیط زیست آسیب برسانند، باید احتیاط‌های لازم در جهت حفظ و نگهداری و عدم آسیب رسانی به محیط ریست انجام گیرد.

11-کمیته‌ی اخلاق در پژوهش علاوه بر بررسی و تصویب طرح‌نامه و دستورالعمل، این حق را دارد که طرح‌‌ها را در حین و بعد از اجرا را از نظر رعایت ملاحظات اخلاقی مورد پایش قرار دهد. اطلاعات و مدارکی که برای پایش از سوی کمیته‌ی اخلاق درخواست می‌شود، باید از سوی پژوهشگران در اختیار این کمیته گذاشته شود.   

28- پژوهشگران موظفند که نتایج پژوهش‌های خود را صادقانه ، دقیق، و کامل منتشر کنند. نتایج، اعم از منفی یا مثبت، و نیز منابع تأمین بودجه، وابستگی  سازمانی، و تعارض منافع – در صورت وجود – باید کاملاً آشکارسازی شوند. پژوهشگران نباید در هنگام عقد قرارداد انجام پژوهش، هیچ  گونه شرطی را مبنی بر حذف یا عدم انتشار یافته‌هایی که از نظر حمایت کننده‌ی پژوهش  مطلوب نیست، بپذیرند.

29-نحوه‌ی گزارش نتایج پژوهش باید ضامن حقوق مادی و معنوی تمامی اشخاص مرتبط با پژوهش، از جمله خود پژوهشگر یا پژوهشگران، آزمودنی‌ها و مؤسسه‌ی حمایت کننده‌ی  پژوهش باشد.

30-گزارش‌ها و مقالات حاصل از پژوهش‌هایی که مفاد این راهنما را نقض کرده‌اند، نباید برای انتشار پذیرفته شوند.

31-روش پژوهش نباید با ارزش‌های احتماعی، فرهنگی و دینی  جامعه در تناقض باشد.

بر اساس گایدلاین اخلاقی تمام ملاحظات اخلاقی در نگهداری و کار با حیوانات آزمایشگاهی در تمام مراحل:

• نگهداری
• تیمار
• نمونه گیری رعایت میشود.

۱- هزینه بالای انجام طرح

۲- محدودیت در انجام هایپرترمیا در مراکز درمانی و تعداد جلسات لازم برای درمان

۳- به دلیل نیود تجهیزات لازم برای هایپرترمیا به صورت متمرکز نیاز به جابه جایی موش ها در هر جلسه درمانی بین مراکز مختلف وجود دارد.

۴- محدودیت در تجهیزات تزریق داخل جمجمه ای در نمونه های حیوان

توزیع حرارتی ، بهره درمانی ، نانوذرات مغناطیسی اکسید گرافن ، میدان مغناطیسی متناوب ،امواج فرکانس رادیویی ، مدل توموری گلیومای C6

1.         Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2019. CA: a cancer journal for clinicians. 2019;69(1):7-34.

2.         Packer RJ, MacDonald T, Vezina G. Central nervous system tumors. Pediatric Clinics of North America. 2008;55(1):121-45.

3.         Groothuis DR, Vriesendorp FJ, Kupfer B, Warnke PC, Lapin GD, Kuruvilla A, et al. Quantitative measurements of capillary transport in human brain tumors by computed tomography. Annals of Neurology: Official Journal of the American Neurological Association and the Child Neurology Society. 1991;30(4):581-8.

4.         Kaye AH, Laws Jr ER. Brain Tumors E-Book: An Encyclopedic Approach: Elsevier Health Sciences; 2011.

5.         Shirvalilou S, Khoei S, Esfahani AJ, Kamali M, Shirvaliloo M, Sheervalilou R, et al. Magnetic Hyperthermia as an adjuvant cancer therapy in combination with radiotherapy versus radiotherapy alone for recurrent/progressive glioblastoma: a systematic review. Journal of Neuro-Oncology. 2021:1-10.

6.         Mahaley Jr M, Mettlin C, Natarajan N, Laws Jr E, Peace B. Analysis of patterns of care of brain tumor patients in the United States: a study of the Brain Tumor Section of the AANS and the CNS and the Commission on Cancer of the ACS. Clinical neurosurgery. 1990;36:347-52.

7.         Pardridge WM. CNS drug design based on principles of blood‐brain barrier transport. Journal of neurochemistry. 1998;70(5):1781-92.

8.         Hornback N. Historical aspects of hyperthermia in cancer therapy. Radiologic Clinics of North America. 1989;27(3):481-8.

9.         Mirzaghavami PS, Khoei S, Khoee S, Shirvalilou S, Mahdavi SR, Mahabadi VP. Radio-sensitivity enhancement in HT29 cells through magnetic hyperthermia in combination with targeted nano-carrier of 5-Flourouracil. Materials Science and Engineering: C. 2021;124:112043.

10.       Leong K, D'Amore P, Marletta M, Langer R. Bioerodible polyanhydrides as drug‐carrier matrices. II. Biocompatibility and chemical reactivity. Journal of biomedical materials research. 1986;20(1):51-64.

11.       Brightman MW. The anatomic basis of the blood-brain barrier.  Implications of the blood-brain barrier and its manipulation: Springer; 1989. p. 53-83.

12.       Khoei S, Azarian M, Khoee S. Effect of hyperthermia and triblock copolymeric nanoparticles as quercetin carrier on DU145 prostate cancer cells. Current Nanoscience. 2012;8(5):690-6.

13.       Horsman MR. Tissue physiology and the response to heat. International journal of hyperthermia. 2006;22(3):197-203.

14.       Piehler S, Dähring H, Grandke J, Göring J, Couleaud P, Aires A, et al. Iron Oxide nanoparticles as carriers for DOX and magnetic hyperthermia after intratumoral application into breast cancer in mice: Impact and future perspectives. Nanomaterials. 2020;10(6):1016.

15.       Bichel P, Overgaard J. Hyperthermic effect on exponential and plateau ascites tumor cells in vitro dependent on environmental pH. Radiation research. 1977;70(2):449-54.

16.       Gannon CJ, Cherukuri P, Yakobson BI, Cognet L, Kanzius JS, Kittrell C, et al. Carbon nanotube‐enhanced thermal destruction of cancer cells in a noninvasive radiofrequency field. Cancer: Interdisciplinary International Journal of the American Cancer Society. 2007;110(12):2654-65.

17.       Zhang L, Xia J, Zhao Q, Liu L, Zhang Z. Functional graphene oxide as a nanocarrier for controlled loading and targeted delivery of mixed anticancer drugs. small. 2010;6(4):537-44.

18.       Afzalipour R, Khoei S, Khoee S, Shirvalilou S, Raoufi NJ, Motevalian M, et al. Thermosensitive magnetic nanoparticles exposed to alternating magnetic field and heat-mediated chemotherapy for an effective dual therapy in rat glioma model. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 2021;31:102319.

19.       Mahdavi S, Khalafi L, Nikoofar A, Fadavi P, Arbabi Kalateh F, Aryafar T, et al. Thermal enhancement effect on chemo-radiation of glioblastoma multiform. International Journal of Radiation Research. 2020;18(2):255-62.

20.       Nehate C, Alex MA, Kumar A, Koul V. Combinatorial delivery of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (γFe2O3) and doxorubicin using folate conjugated redox sensitive multiblock polymeric nanocarriers for enhancing the chemotherapeutic efficacy in cancer cells. Materials Science and Engineering: C. 2017;75:1128-43.

21.       Ohtake M, Umemura M, Sato I, Akimoto T, Oda K, Nagasako A, et al. Hyperthermia and chemotherapy using Fe (Salen) nanoparticles might impact glioblastoma treatment. Scientific reports. 2017;7(1):1-12.

22.       Yi G-q, Gu B, Chen L-k. The safety and efficacy of magnetic nano-iron hyperthermia therapy on rat brain glioma. Tumor biology. 2014;35(3):2445-9.

23.       Takagi H, Azuma K, Tsuka T, Imagawa T, Osaki T, Okamoto Y. Antitumor effects of high‑temperature hyperthermia on a glioma rat model. Oncology letters. 2014;7(4):1007-10.

24.       Jaworski S, Sawosz E, Grodzik M, Winnicka A, Prasek M, Wierzbicki M, et al. In vitro evaluation of the effects of graphene platelets on glioblastoma multiforme cells. International journal of nanomedicine. 2013;8:413.

25.       Paulus W, Baur I, Schuppan D, Roggendorf W. Characterization of integrin receptors in normal and neoplastic human brain. The American journal of pathology. 1993;143(1):154.

نیاز ندارد