بررسی و مقایسه فراوانی پلی مورفیسم های ژن HOTAIR ( rs4759314 , rs920778 , rs12826786 ، rs1899663 و rs3816153)در افراد مبتلا به بیماری مزمن کلیوی و مقایسه آن ها با افراد سالم

بیماری مزمن کلیه (Chronic Kidney Disease) یا CKD به شرایط بالینی گفته می شود که کارکرد موثر کلیه مختل شود به شرطی که ایجاد و پیشرفت بیماری، سیری تدریجی و کند (طی ماه­ها یا سال­ها) داشته باشد. کلیه‌ها وظیفه­ی خارج کردن تمام محصولات زاید و آب اضافی را دارند و به عنوان نوعی سد تصفیه­کننده برای بدن عمل می‌کنند(1). هر گونه بیماری که کلیه‌ها را تحت تأثیر قرار دهد، به تدریج توانایی تصفیه‌ی آن‌ها را کاهش می‌دهد و به این ترتیب محصولات زاید در خون انباشته می‌شوند.­ از آنجایی که کلیه‌ها بسیار سازگار هستند و قادرند عملکرد عقب‌افتاده را جبران کنند، علائم و نشانه‌ها بروز نمی‌کنند مگر آنکه آسیب غیر قابل‌برگشتی رخ داده باشد. شاخصGFR  در واقع مقداری از خون است که کلیه می‌تواند در واحد زمان تصفیه کندکه این شاخص برای تعیین وضعیت سلامتی کلیه به کار می‌رود و به وسیله‌ی آن می‌توان CKD و مراحل آن را در فرد بررسی کرد(2). در یک فرد طبیعی در حالت عادی، GFR برابر و یا بیشتر از 90 میلی لیتر در دقیقه است. دیابت نوع ۱ یا نوع ۲، فشار خون بالا، گلومرولونفریت (Glomerulonephritis) ، التهاب واحدهای پالایشگر کلیه یا گلومرول (Glomerulus) نفریت بینابینی، التهاب لوله‌های کلیه و سازه‌های اطراف، بیماری کلیه پلی‌کیستیک، انسداد دراز‌مدت دستگاه ادراری به خاطر بزرگ‌شدگی پروستات، سنگ کلیه و برخی از سرطان‌ها، ریفلاکس مثانه به حالب (بیماری که باعث برگشت ادرار به کلیه‌ها می‌شود) عفونت کلیه عودکننده یا پیلونفریت (Pyelonephritis)  از عوامل بروز CKD است اما دیابت و فشارخون بالا(3) شایع‌ترین علل هستند. علل متنوع دیگر نیز سبب CKD می‌شوند که از زمینه­ی ژنتیکی می­توان به عنوان یکی از عوامل مهم در اتیولوژی این بیماری مزمن نام برد(4). درجه بندی (Staging) بیماری CKD به صورت زیر است:

در مرحله‌ی نخست، GFR برابر یا بیشتر از 90 میلی لیتر در دقیقه است، که با میزان آن در کلیه‌ی سالم برابر است. تقریباً هیچ علامتی وجود ندارد و بنا بر این تشخیص این مشکل دشوار است. اما به طور کلی، به بیمارانی که به مشکلات کلیوی مبتلا هستند توصیه می‌شود آزمایش‌های مربوط به تعیین مقدار کراتینین یا اوره در خون، را انجام دهند. مقدار بالای کراتینین در خون یا پروتئین‌ها در ادرار شاخص خوبی است که نشان می‌دهد فرد مبتلا به بیماری مزمن کلیوی است. روش‌های دیگری برای پی بردن به وضعیت کلیه‌ی فرد وجود دارند که شامل MRI، امواج فرا صوت (سونو گرافی)، اشعه‌ی X و CT اسکن، است. اگر بتوان مشکل را در این مرحله تشخیص داد، در نتیجه درمان نیز ساده‌تر خواهد بود و از داروها می‌توان برای توقف، به تعویق انداختن یا تغییر علایم و بهبود CKD استفاده کرد. در مرحله‌‌ی دوم، علائم در این مرحله به آسانی مرحله‌ی اول قابل شناسایی نیستند و عمدتاْ شاخص GFR بین 60 و 89 میلی لیتر در دقیقه است (5). در این مرحله نیز تشخیص با اشعه‌ی  X، MRI، فرا صوت (سونو گرافی) و CT اسکن امکان پذیر است. به طور کلی برای فردی که در مرحله‌ی دوم این بیماری کلیوی شناسایی شده است، دیالیز کلیوی لازم نیست. طی مرحله‌ی سوم علائم ظاهر می‌شوند و میزان GFR به 30 تا 59 میلی لیتر در دقیقه کاهش می‌یابد. مایعات در قسمت‌های مختلف بدن انباشته می‌شوند و علامت آن تورم در دست‌ها و پاها است. رنگ ادرار فرد نیز تغییرات قابل توجهی می‌کند. رنگ ادرار به نارنجی، قرمز یا قهوه‌ای تیره تغییر می‌کند(6). در مرحله‌ی چهارم CKD با کاهش بیشتر  GFR، علائم بیشتری در بیمار ظاهر می‌شود. در نتیجه‌ی افزایش سطح محتویات ادرار در خون، بیمار با مشکل تنفسی رو به رو می‌شود و میزان فیلتراسیون گلومرولی بین 15 تا 29 میلی لیتر در دقیقه است. طی مرحله پنجم در مبتلایان به CKD، نارسایی کامل کلیه  مشاهده می­شود که در این مرحله GFR کمتر از 15 میلی لیتر در دقیقه است و در برخی موارد ممکن است به صفر برسد.

پاتوفیزیولوژی CKD ­شامل 2سری مکانیسم وسیع است: (5) مکانیسم­های آغازگر مانند کمپلکس­های ایمنی در انواع خاصی از گلومرولونفریت یا مواجهه با سموم در انواع خاصی از بیماری­های لوله­ای بینابینی کلیه. (5) گروهی از مکانیسم­های پیشرونده شامل هیپر­فیلتراسیون و هیپرتروفی نفرون­های زنده باقی­مانده که نتیجه کاهش طولانی مدت توده کلیوی صرف نظر از اتیولوژی زمینه­ای می­باشد. CKD یکی از مشکلات عمده بهداشت عمومی در سراسر جهان است(7-9). در ایالات متحده، بررسی‌های سازمان ملی سلامت و تغذیه­(NHANES)­نشان داد که شیوع بیماری مزمن کلیه از 10­درصد در سال‌های 1988-1994 به 13.1­درصد در سال‌های 1999-2004 افزایش داشت(10). بروز نارسایی مزمن کلیه در جهان 242 مورد در هر یک میلیون نفر است و هر سال 8٪ به این جمعیت اضافه می شود(11, 12). مطالعات متاآنالیز، شیوع CKD در سراسر جهان را 13.4٪ تخمین می­زند(13). همچنین مطالعاتی مشابه شیوع جهانی CKD بر اساس جنسیت را 10.4 درصد در مردان و 11.8 درصد در زنان برآورد می­کند(14). به طور کلی­CKD شیوع قابل توجه­­­ای (14.9%) را در بین افراد 20 سال به بالا در جمعیت شهری دارد(15). مطالعات نشان می­دهد که مرگ و میر ناشی از CKD در ایران از کمتر از 1 درصد در سال 1990 به بیش از 2 درصد در سال 2013 افزایش یافته است و نرخ فیلتراسیون گلومرولی پایین (GFR) یکی از عوامل خطر اصلی مرگ و میر و عوارض در ایران است(16-18).

کلاس بزرگ و جدیدی از RNAها، ­lncRNAs­ هستند , که رونویسی می شوند ولی ترجمه نمی شوند , معمولا بیش از 200 نوکلئوتید طول دارند و نقش مهمی در سرطان ها ایفا می کنند(19-21).  LncRNA ها می­توانند فعالیت رونویسی را مورد هدف قرار دهند و همچنین بیان و عملکرد پروتئین را تعدیل می نمایند(20). lncRNA­ها مولکول های کلیدی درگیر در پاتوفیزیولوژی آسیب کلیوی شناسایی شده اند.مطالعه­ای در سال 2019 منتشر شد که نشان داد ­lncRNA­ها ازجمله­NOP14-AS1­و HCP5­نشانگرهای زیستی برای تشخیص زودهنگام و پیش آگهی بالقوه در CKD هستند(22, 23).ژن HOTAIR (HOX antisense intergenic RNA)حاوی 12649 باز است و مولکول RNA غیر­کدکننده(Long noncoding RNA) 2.2 کیلوبایتی را رمزگذاری می­کند که بیان ژن را کنترل می­کند(24).  HOTAIR­یک LncRNA انکوژنی است(25) که در ناحیه HOXC روی بازوی بلند کروموزوم12 (12q13.13) قرار دارد. ژن آن  دارای 7 اگزون می­باشد و جایگاه کروموزومی رونوشت HOTAIR بین HOXC11 و HOXC12 است که با متیلاسیون DNA و هیستون باعث خاموشی اپی ژنتیکی ژن های هدف از جمله HOXD و پیشرفت سیکل  سلولی و سرطان می­شود(26, 27). این lincRNA دارای کلاهک 7methylguanosineدر سر 5’و دم 3’ پلی آدنیله است(28). مطالعات انجام شده نشان می­دهد که بیان این ژن در اکثر سرطان ها از جمله سرطان کولون، پستان، معده، ریه و کلیه افزایش می­یابد(29). ژن HOTAIR با متیلاسیون نواحی CpG در پروموتر PTEN باعث مهار این ژن و در نهایت موجب افزایش فعالیت تیروزین کینازی و افزایش تومورزایی می­گردد(30).

التهاب یک پاسخ طبیعی و ضروری بدن به محرک های مختلف است و نقش اصلی را در پاسخ ایمنی دارد(31, 32). ­پاسخ التهابی معمولاً به انرژی بالاتری نیاز دارد و بنابراین با متابولیسم گلوکز در ارتباط است. ­ lncRNA HOTAIR­ نقشی کلیدی در فعال سازی­NF-kB، بیان سیتوکین و التهاب ایفا می­کند(33). نتایج مطالعات نشان می‌دهد که التهاب ناشی از LPS­باعث بیان ایزوفرم 1 ناقل گلوکز­(Glut1)­می‌شود که جذب گلوکز را در ماکروفاژها کنترل می‌کند­­(34, 35). بیان Glut1 ناشی از LPS از طریق فعال سازی NF-kB تنظیم می­شود. تحقیقات نشان داده است که شکست HOTAIR با واسطه siRNA، بیان Glut1 ناشی از LPS را سرکوب می­کند(36, 37). ­HOTAIR­ همچنین سایر تنظیم کننده­های بالادستی متابولیسم گلوکز مانند PTEN و HIF1α را تنظیم می­کند که نشان­دهنده عملکرد چندوجهی آن در متابولیسم گلوکز است(36, 38, 39).­ژن­HOTAIR­به صورت اختصاصی فعال­کننده مسیر سیگنالینگ فسفاتیدیل اینوزیتول 3 کیناز-پروتئین کیناز(PI3K-AKT)B­، می باشد که مسیر اصلی مرتبط با التهاب، سرطان، تنظیم متابولیسم گلوکز و افزایش تهاجم سلولی است(40, 41).

پروتئین­های پیش­التهابی در بیماران­CKD به طور قابل توجهی بالا است. داده­ها نشان می­دهد که مسیرهای رگزایی و التهاب در پلاسمای بیماران CKD فعال می شوند(42, 43). به طوری که یکی از مشخصه­های CKD که منجر به ایجاد، پیشرفت و عوارض آن می­شود، التهاب پایدار است(44, 45).

گروه هایی از نشانگرهای التهابی که در بیماری مزمن کلیه نقش دارند(46).

LncRNA HOTAIR میتواند باید اثر بر فرآیندهای التهابی در بیماری مزمن کلیوی یا CKD به صورت تعدیل­کننده اثر گذار باشد. فراوانی آللی جزئی (Minor Allele Frequency) یا MAF به فرکانس آلل پایین‌تر اشاره دارد (نسبت دومین آلل رایج از بین دو آلل در یک مکان ژنتیکی و در یک جمعیت) و می‌تواند بر اساس جمعیت متفاوت باشد. واریانت rs920778 اینترونی است و­MAF آن بر اساس پروژه 1000 ژنوم G=0.44 است. همچنین MAF واریانت اینترونی rs4759314 ­بر اساس پروژه 1000 ژنوم G=0.095 است.­MAF واریانت rs12826786 ­ بر اساس پروژه 1000 ژنوم T=0.357 است.  MAF واریانت اینترونی rs1899663 نیز بر اساس پروژه 1000 ژنوم A=0.253 است.­SNP­های انتخاب شده دارای MAF بالاتر از 0.05 (5%) بوده یعنی خاصیت پلی مورفیسم دارد و نیز دارای اهمیت بالینی می­باشند یعنی با ریسک خیلی از بیماری­ها در ارتباط بوده و نیز آنزیم­های برش دهنده آن­ها به لحاظ تجاری برای ما در دسترس بوده است.

با توجه به شیوع نسبتاً بالای بیماری CKD­، بر آن شدیم تا میزان شیوع پلی مورفیسم­های تک نوکلئوتیدی احتمالی در ژن HOTAIR را در جمعیتی از افراد سالم و بیماران بستری شده در بیمارستان­ علی بن ابیطالب­(ع)­یا مراجعه­کننده به کلینیک نفرولوژی بیمارستان بو­علی شهر زاهدان بررسی کنیم. بدیهی است شناخت جایگاه­های ژنی موثر در بروز این بیماری، کمک شایان توجهی به روند درمان و تشخیص به موقع این اختلال مزمن تهدید کننده­ی سلامت جامعه­ در آینده خواهد نمود.

مروری بر مطالعات گذشته

• Volkogon و همکاران در سال 2020  طی مطالعه­ای ارتباط احتمالی پلی مورفیسم rs1899663 ژن HOTAIR با بقای بیماران مبتلا به سرطان کلیه را بررسی کردند و نشان دادند rs1899663 ژن HOTAIR با اندازه تومور در بیماران مبتلا به سرطان کلیه ارتباطی ندارد(47).
• چهار پلی مورفیسم rs7958904، rs1899663، rs4759314، و rs920778 در ژن­HOTAIR   برای ارزیابی ارتباط با شیوع و پیش آگهی از سرطان کولورکتال در یک مطالعه مورد-شاهدی توسط Kim و همکاران در سال 2020 بر روی 850 نفر شامل 450 بیمار CRC و 400 فرد کنترل صورت گرفت. که نشان داده شد ­rs7958904  با شیوع سرطان کولورکتال مرتبط است(48).
• Taheri و همکاران در سال 2020 سه پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی­(SNPs)  (rs12826786، rs1899663­و­rs4759314) را در ژن HOTAIR روی 403 بیمار MS ایرانی و 420 فرد سالم بررسی کردند. در مجموع با ثبت نتایج معنادارHOTAIR  را به عنوان یک منبع خطر برای ام اس در جمعیت ایرانی در نظر گرفتند(49).
• Sayad و همکاران در سال 2020 ارتباط بین پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی rs1899663 در رونوشت lncRNA HOX (HOTAIR)­و خطر ابتلا به ADHD در جمعیت ایرانی را بررسی کردند و ارتباط معنادار آن را نشان دادند(50).
• Cho و همکاران در سال 2020 ارتباط بین پلی‌مورفیسم‌های rs4759314، rs920778، rs1899663 و rs7958904 رونوشت Hox RNA (HOTAIR) و نارسایی اولیه تخمدان (POI)­را در زنان کره‌ای با 134 فرد مبتلا و 383 فرد کنترل را  بررسی کردند. نتایج آنها نشان داد که پلی مورفیسم­های فوق در POI دخیل هستند(51).
• Majumder و همکاران در سال 2019 برای درک تنظیم و عملکرد lncRNA در بیماران با کلیه دیابتی (Diabetic kidney disease) یا DKD، اثرات lncRNA HOTAIR را بررسی کردند. برحسب این مطالعه بیان HOTAIR در انسان و موش­ با DKD افزایش می­یابد. آنها  نشان دادند که اختلال در تنظیم lncRNA می‌تواند در بیماری‌های مزمن پیچیده مانند DKD رخ دهد، بدون اینکه لزوماً در پاتوژنز بیماری نقش داشته باشد(52).
• اختلال عملکرد سلول­های اندوتلیال شبکیه (Retinal endothelial cell) یا REC ناشی از دیابت یک مرحله پاتولوژیک مهم رتینوپاتی­دیابتی (Diabetic retinopathy) یا DR است. Zhao و همکاران در سال 2020 نقش و مکانیسم lncRNA Hotair­را در تنظیم اختلال عملکرد REC ناشی از DMبررسی کردند و با توجه به داده­های مطالعه نشان دادند که­ Hotair یک هدف درمانی بالقوه برای DR است(53).
• Wang و همکاران در سال 2021  با ارزیابی سطح HOTAIR در سرم 96 بیمار دیابتی نوع­2 و 82 فرد کنترل نشان دادند که سطح سرمی HOTAIR در بیماران مبتلا به دیابت نوع2 به طور قابل توجهی بالاتر از افراد سالم بود لذا طبق این مطالعه بیان بالای سرمی HOTAIR یک نشانگر تشخیصی در بیماران مبتلا به دیابت نوع2 بود(54).
• Jung و همکاران در سال 2020 در یک مطالعه مروری بر محور اینکه lncRNA­ها نقش مهمی در پاتوژنز کلیه دارند، نقش موثر lncRNA­ها را در ایسکمی کلیوی، آسیب، التهاب، فیبروز، بیماری­های گلومرولی، پیوند کلیه و کارسینوم سلول کلیوی را بیان کردند و نقش بالقوه این مولکول­های تنظیم­کننده ­از جمله­ H19 و HOTAIR را به عنوان اهداف درمانی برای درمان بالینی التهاب و فیبروز کلیه روشن کردند(55).
• مطالعات Cheng و همکاران در سال 2021 مکانیسم زمینه‌ای LncRNA HOTAIR در فعال‌سازی میکروگلیال ناشی از آسیب تروماتیک مغزی (TBI)  و آزادسازی فاکتور التهابی و معناداری آن را روشن کرد(56).
• Rakhshan و همکاران در سال 2020 سه SNP (rs12826786، rs1899663­و­rs4759314) از HOTAIR­را در 286 بیمار مبتلا به پسوریازیس و 300 فرد کنترل بررسی کردند و معنادار بودن rs12826786­را ­با خطر پسوریازیس نشان دادند(57).

توزیع فراوانی پلی مورفیسم  rs1899663ژن  HOTAIR­در افراد مبتلا به بیماری مزمن کلیوی در مقایسه با افراد سالم متفاوت است.

توزیع فراوانی پلی مورفیسم rs12826786 ژن  HOTAIR­در افراد مبتلا به بیماری مزمن کلیوی در مقایسه با افراد سالم متفاوت است.

توزیع فراوانی پلی مورفیسم rs920778 ژن  HOTAIR­در افراد مبتلا به بیماری مزمن کلیوی در مقایسه با افراد سالم متفاوت است.

توزیع فراوانی پلی مورفیسم rs4759314 ژن  HOTAIR­در افراد مبتلا به بیماری مزمن کلیوی در مقایسه با افراد سالم متفاوت است.

توزیع فراوانی پلی مورفیسم rs3816153 ژن  HOTAIR­در افراد مبتلا به بیماری مزمن کلیوی در مقایسه با افراد سالم متفاوت است.

تعیین و مقایسه فراوانی پلی مورفیسم­های ژن­HOTAIR  ( rs4759314 , rs920778 , rs12826786 ،­rs1899663 و  rs3816153)در افراد مبتلا به بیماری مزمن کلیوی با افراد سالم

مقایسه فراوانی پلی مورفیسم  rs1899663ژن  HOTAIR­در افراد مبتلا به بیماری مزمن کلیوی در مقایسه با افراد سالم.

مقایسه فراوانی پلی مورفیسم rs12826786 ژن  HOTAIR­در افراد مبتلا به بیماری مزمن کلیوی در مقایسه با افراد سالم.

مقایسه فراوانی پلی مورفیسم rs920778 ژن  HOTAIR­در افراد مبتلا به بیماری مزمن کلیوی در مقایسه با افراد سالم.

مقایسه فراوانی پلی مورفیسم rs4759314 ژن  HOTAIR­در افراد مبتلا به بیماری مزمن کلیوی در مقایسه با افراد سالم.

مقایسه فراوانی پلی مورفیسم rs3816153 ژن  HOTAIR­در افراد مبتلا به بیماری مزمن کلیوی در مقایسه با افراد سالم.

دانشگاه علوم پزشکی زاهدان

بیماری مزمن کلیوی (CKD): به شرایط بالینی گفته می شود که کارکرد موثر کلیه مختل شود به شرطی که ایجاد و پیشرفت بیماری، سیری تدریجی و کند (طی ماه­ها یا سال­ها) داشته باشد.

پلی‌مورفیسم: اختلاف توالی بازهای DNA در افراد یا گروه­های مختلف.

پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی (single nucleotide polymorphism: SNP): به صورت یک جایگاه ژنومی تعریف می شود که در آن یک یا چند باز جایگزین با فراوانی محسوس ( بیشتر از 1% ) ظاهر می شود.

 موردی – شاهدی

گروه مورد: افراد دارای بیماری مزمن کلیوی (CKD) که به تشخیص پزشک متخصص بر پایه معیار های تشخیص انجمن نفرولوژی آمریکا(58) به این بیماری مبتلا و در بخش کلیه بیمارستان علی ابن ابیطالب (ع) بستری یا به کلنیک نفرولوژی بیمارستان بوعلی شهر زاهدان مراجعه کرده­اند.

گروه شاهد: افراد فاقد سابقه بیماری کلیوی که برای انجام آزمایشات روتین به بیمارستان­های علی ابن ابیطالب (ع) و بوعلی شهر زاهدان مراجعه می کنند و میزان فیلتراسیون گلومرولی (GFR) آنها بیشتر از 90 میلی لیتر بر دقیقه به ازای هر 1.73 متر مربع از سطح بدن (محاسبه شده بر اساس معادله ارائه شده توسط Florkowski, C.M. and Chew-Harris) می باشد(59).

معیار­های ورود به مطالعه : تأیید تشخیص بیماری مزمن کلیوی در افراد با سابقه­ی بستری شدن یا مراجعه اولیه در صورتی­که بیشتر از سه ماه از تشخیص اولیه­ی اختلال در کارکرد کلیه­ها گذشته باشد (با میزان ­GFR­ کمتر از 90 میلی لیتر بر دقیقه طی دو بار آزمایش در فاصله ی سه ماهه) با شواهد آلبومینوری یا بدون آن.

معیار­های خروج از مطالعه : زنان باردار و افراد مبتلا به اختلالات کلیوی گذرا (Transient Renal Dysfunction) و همینطور افرادی که مورد پیوند کلیه قرار گرفته­اند از مطالعه خارج می­­شوند. همچنین افرادی که مبتلا به آرتریت رومانوئید، لوپوس و بیماری­های اتو ایمیون و انواع عفونت­های حاد یا مزمن و سابقه­­ی هر نوع بیماری خود­ایمنی یا بدخیمی در مراحل­ انتهایی­ هستند وارد مطالعه نمی­­شوند. ضمناً تمامی معیار­های ورود به مطالعه برای گروه کنترل مطابق با معیارهای پرسشنامه ضممیه شده رعایت خواهد شد و افراد سالم تنها در صورتی که بیماری­های زمینه­ای نداشته باشند وارد مطالعه می­شوند.

برای بررسی پلی­مورفیسم تک نوکلئوتیدی افراد مبتلا به بیماری مزمن کلیوی در زاهدان به تعداد 300  نفر با توجه به هزینه طرح خون گرفته می­شود. نمونه گروه شاهد این پژوهش شامل افراد سالم به تعداد 150 نفر و همچنین نمونه گروه بیمار مبتلا به CKD به تعداد 150 نفر می باشد. مطالعه Aghdaie و همکاران در سال 2011 تعداد بیماران پیوند کلیوی را در جمعیت ایرانی 144 نفر و تعداد افراد سالم را 100 نفر در نظر گرفته است(60). همچنین بر اساس مطالعه متا آنالیز Lin و همکاران در سال 2014 که افراد مبتلا به CKD را در جمعیت های آسیایی بررسی کرده است(61)، مشاهده می شود جمعیت مورد مطالعه در برخی موارد از جمعیت مد نظر ما بیشتر نبوده است. طبق این توضیحات، بدیهی است تعداد 300 نفر کیس و کنترل برای انجام این پژوهش کافی به نظر می رسد و نتایج قابل انتشار خواهند بود.

به صورت سر شماری و آسان در دسترس

مشاهده و بررسی های آزمایشگاهی

بعد از کسب رضایت از بیماران و گروه کنترل از کلیه افرادی که در مطالعه وارد شده­اند 5 میلی لیتر خون در لوله­های حاوی EDTA جمع­آوری می­گردد. نمونه­های خون ­در 20- درجه سانتیگراد نگهداری می­شود، DNA با استفاده از روش salting out استخراج می‌شود. سپس با استفاده از پرایمرهای اختصاصی قطعات واجد ناحیه پلی مورفیک با روش  PCR  تکثیر گردیده و سپس توسط آنزیم­های AluI برای­rs4759314  و MspI برای rs920778 و با استفاده از تکنیک­هایPCR-RFLP  بر روی ژل اگارز 2 تعیین ژنوتیپ می­­گردد. همچنین پرایمرهای اختصاصی جهت تعیین پلی مورفیسم ژنی به روش -PCRARMS برای تعیین ژنوتایپ  3 جایگاه rs12826786 و rs1899663 و rs3816153 طراحی می شود و ژنوتایپ تعیین می­گردد.

پس از گردآوری اطلاعات لازم، یافته ھا در نرم افزار آماری SPSS16 وارد شده و آنالیز می شود. تعادل Hardy Weinberg در گروه کنترل برای ھر سه  پلی مورفیسم توسط آزمون chi square بررسی می شود. سپس داده ھا با استفاده از آزمون آماری independent sample T test ، Chi square در صورت نیاز مورد تجزیه  و تحلیل قرار خواھند گرفت. ریسک ابتلا به بیماری مزمن کلیوی ضمن محاسبه Odds Ratio و فاصله اطمینان 95 % تخمین زده می شود. همچنین همبستگی بین پارامترھای دموگرافیک بیماران و ژنوتایپ ھای پلی مورفیسم ھای مورد مطالعه توسط آزمون unconditional logistic regression بررسی خواھد شد. در تمامی آزمونها ، P<0.05 معنی دار در نظر گرفته می شود.

در این مطالعه کدهای 1,2,3,8,10, 11,12,13,14,15,17,19,22,25,28و31 از راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش‌های علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی در جمهوری اسلامی ایران به شرح زیر استفاده می شود.

هدف پژوهش ارتقاء سلامت انسان خواهد بود 2- سلامت و ایمنی فرد آزمودنی اولویت دارد 3- منافع پژوهش برای فرد آزمودنی بیشتر از خطرهای آن است 8- روش انجام پژوهش منطبق بر اصول علمی است 10- پژوهش به صورت پروپوزال ارائه می شود 11- کمیته اخلاق طرح حاضر را مورد پایش قرار می دهد 12- انتخاب آزمودنی ها از بین بیماران منصفانه خواهد بود  13- رضایت آگاهانه از افراد مورد پژوهش اخذ می شود 14- تغییر احتمالی در نحوه انجام پژوهش به اطلاع کمیته اخلاق دانشگاه خواهد رسید 15- پژوهشگر از آگاهانه بودن رضایت اخذ شده اطمینان حاصل می کند 17 پژوهشگر اطلاعات کافی را در مورد مطالعه در اختیار آزمودنی قرار خواهد داد 19- عدم شرکت در پژوهش هیچ تآثیری در میزان خدمات درمانی دریافتی توسط آزمودنی نخواهد داشت 22- از گروههای آسیب پذیر نمونه گیری انجام نمی شود 25- پژوهشگر اصول راز داری را رعایت خواهد کرد 28- نتایج پژوهش به طور صادقانه منتشر خواهد شد

همچنین کد های از  1,2,3,4,6,8,12از راهنمای ‌عمومی اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی به همراه کد­های 1 و 2 از فصل چهارم (زیست بانکها) این راهنما در پژوهش فعلی رعایت می گردد.

پژوهشگر توجه دارد که نمونه خون فرد مورد استفاده، دارای منشأ انسانی‌اند و کرامت انسانی اقتضا می‌کند که جمع‌آوری، نگه‌داری، استفاده و نابودسازی آن‌ها توأم با رعایت ملاحظات و شؤون مرتبط باشد.

از نمونه خون فرد دارای منشأ انسانی باید تنها در پژوهشی استفاده می شود که اهداف ارزشمندی را در راستای مبارزه با بیماری‌ها و ارتقای سلامت انسان‌ها دنبال کند.

پژوهش فعلی انجام شده بر روی نمونه خون افراد پیش از اجرا مورد تأیید کمیته‌ی اخلاق در پژوهش مرتبط قرار می گیرد.

رضایت آگاهانه‌ی فرد دهنده‌ی نمونه خون، یا جانشین قانونی او، شرط اساسی در تأیید اخلاقی هر پژوهش بر روی نمونه انسانی می باشد.

- پژوهشگر باید از اعضاء و بافت‌هایی که به منظور پژوهش در اختیار او قرار می‌گیرد استفاده‌ی بهینه خواهد کرد.

12- در صورت کمبود نمونه خون، باید استفاده‌های درمانی بر استفاده‌های پژوهشی اولویت داده می شود.

فصل 4 از راهنمای ‌عمومی اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی - زیست‌بانک‌ها:

ذخیره‌سازی نمونه خون با منشأ انسانی با اخذ رضایت آگاهانه صورت میگیرد. در رضایت‌نامه باید نحوه و مدت نگه‌داری و استفاده‌های احتمالی آتی آورده می شود.

فرد آزمودنی حق دارد هر وقت که بخواهد درخواست کند که نمونه‌هایش از زیست‌بانک خارج شوند.

به علاوه، کد های ذیل از دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش­های ژنتیک پزشکی در جمهوری اسلامی ایران در پژوهش فعلی رعایت می شوند

پژوهش‌ فعلی بر روی آزمودنی انسانی با هدف بررسی یا تشخیص استعداد ابتلا به بیماری‌ انجام خواهد شد (کد 1-2-)

پژوهش حاضر در بر دارنده اهداف به‌نژادی (کد 2-1)، شبیه سازی (2-2-)، تبعیض (2-3-) و نقض کرامت انسانی یا حقوق و آزادی‌های بنیادین انسان (2-4) نخواهد بود. در این پژوهش رضایت آگاهانه از آزمودنی کسب خواهد شد (کد 5) و در مواردی که داده‌های ژنتیک انسانی یا نمونه‌های بیولوژیک با هدف پژوهشی جمع‌آوری شده باشند، آزمودنی این اختیار را دارد که رضایت اولیه‌ی خود را لغو کند (کد 6) و در صورت نیاز مشاوره‌ی‌ ژنتیکی مناسب برای آزمودنی  فراهم می شود (کد 7) و همچنین نتایج پژوهش به صورت محرمانه با اطلاع آزمودنی خواهد رسید (کد 8) و فرد آزمودنی از دسترسی به داده‌های ژنتیکی خودش منع نخواهد شد ( کد 10). همچنین داده‌های ژنتیک و نمونه‌های بیولوژیک جمع‌آوری شده، برای هدف دیگری که با مفاد رضایت کسب شده مغایرت دارد به‌کار گرفته نخواهد شد (کد 11) و نتایج آن در اختیار جامعه قرار می گیرد (کد 13).

- عدم همکاری بیمار

- مشکل تهیه مواد و امکان طولانی شدن زمان دریافت آنها

اختلال مزمن کلیوی، HOTAIR  ، پلی مورفیسم ژنی

chronic kidney disease, HOTAIR­ ­, Gene polymorphism

1.        Smith HW. The kidney: structure and function in health and disease: Oxford University Press; 1951.

2.        Ma Y-C, Zuo L, Chen J-H, Luo Q, Yu X-Q, Li Y, et al. Modified glomerular filtration rate estimating equation for Chinese patients with chronic kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology. 2006;17(10):2937-44.

3.        Parikh NI, Hwang S-J, Larson MG, Meigs JB, Levy D, Fox CS. Cardiovascular disease risk factors in chronic kidney disease: overall burden and rates of treatment and control. Archives of internal medicine. 2006;166(17):1884-91.

4.        Vivante A, Hildebrandt F. Exploring the genetic basis of early-onset chronic kidney disease. Nature Reviews Nephrology. 2016;12(3):133-46.

5.        Liu H JX, Zhang MW, Pan YF, Yu YX, Zhang SC, Ma XY, Li QL, Chen K. Association of CASP9, CASP10 gene polymorphisms and tea drinking with colorectal cancer risk in the Han Chinese population. Journal of Zhejiang University SCIENCE B. 2013 Jan 1;14(1):47-57. Association of CASP9, CASP10 gene polymorphisms and tea drinking with colorectal cancer risk in the Han Chinese population. 2013.

6.        Kirsztajn GM, Suassuna JH, Bastos MG. Dividing stage 3 of chronic kidney disease (CKD): 3A and 3B. Kidney international. 2009;76(4):462-3.

7.        Johnson CA, Levey AS, Coresh J, Levin A, Eknoyan JGL. Clinical practice guidelines for chronic kidney disease in adults: Part 1. Definition, disease stages, evaluation, treatment, and risk factors. American family physician. 2004;70(5):869-76.

8.        Vafaei AA, Nobahar M. The care preferences of patients under hemodialysis. Journal of Renal Injury Prevention. 2017;6(3):210-5.

9.        Tamadon MR, Zahmatkesh M. World kidney day 2015. J Parathyr Dis. 2015;3(2):34-6.

10.      Coresh M. J, Selvin E, Stevens LA, Manzi J, Kusek JW, Eggers P et al. Prevalence of chronic kidney disease in the United States JAMA. 2007;298:2038-47.

11.      Xue JL, Ma JZ, Louis TA, Collins AJ. Forecast of the number of patients with end-stage renal disease in the United States to the year 2010. Journal of the American Society of Nephrology. 2001;12(12):2753-8.

12.      Snyder JJ, Foley RN, Collins AJ. Prevalence of CKD in the United States: a sensitivity analysis using the National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES) 1999-2004. American Journal of Kidney Diseases. 2009;53(2):218-28.

13.      Hill NR, Fatoba ST, Oke JL, Hirst JA, O’Callaghan CA, Lasserson DS, et al. Global prevalence of chronic kidney disease–a systematic review and meta-analysis. PloS one. 2016;11(7):e0158765.

14.      Mills KT, Xu Y, Zhang W, Bundy JD, Chen C-S, Kelly TN, et al. A systematic analysis of worldwide population-based data on the global burden of chronic kidney disease in 2010. Kidney international. 2015;88(5):950-7.

15.      Hosseinpanah F, Kasraei F, Nassiri AA, Azizi F. High prevalence of chronic kidney disease in Iran: a large population-based study. BMC public Health. 2009;9(1):1-8.

16.      Vos T, Barber RM, Bell B, Bertozzi-Villa A, Biryukov S, Bolliger I, et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 301 acute and chronic diseases and injuries in 188 countries, 1990–2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. The lancet. 2015;386(9995):743-800.

17.      Abubakar I, Tillmann T, Banerjee A. Global, regional, and national age-sex specific all-cause and cause-specific mortality for 240 causes of death, 1990-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet. 2015;385(9963):117-71.

18.      Collaborators GRF. Global, regional, and national comparative risk assessment of 79 behavioural, environmental and occupational, and metabolic risks or clusters of risks in 188 countries, 1990–2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet. 2015;386(10010):2287-323.

19.      Yoon J-H, Abdelmohsen K, Kim J, Yang X, Martindale JL, Tominaga-Yamanaka K, et al. Scaffold function of long non-coding RNA HOTAIR in protein ubiquitination. Nature communications. 2013;4(1):1-14.

20.      Wang KC, Chang HY. Molecular mechanisms of long noncoding RNAs. Molecular cell. 2011;43(6):904-14.

21.      Hashemi M, Moazeni-Roodi A, Sarabandi S, Karami S, Ghavami S. Association between genetic polymorphisms of long noncoding RNA H19 and cancer risk: a meta-analysis. Journal of genetics. 2019;98(3):1-11.

22.      Li N, Cui Y, Yin M, Liu F. Screening potential prognostic biomarkers of long non-coding RNAs for predicting the risk of chronic kidney disease. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 2019;52.

23.      Moreno JA, Hamza E, Guerrero-Hue M, Rayego-Mateos S, García-Caballero C, Vallejo-Mudarra M, et al. Non-Coding RNAs in Kidney Diseases: The Long and Short of Them. International Journal of Molecular Sciences. 2021;22(11):6077.

24.      Elsayed ET, Salem PE, Darwish AM, Fayed HM. Plasma long non-coding RNA HOTAIR as a potential biomarker for gastric cancer. The International journal of biological markers. 2018;33(4):528-33.

25.      Tang Q, Hann SS. HOTAIR: an oncogenic long non-coding RNA in human cancer. Cellular Physiology and Biochemistry. 2018;47(3):893-913.

26.      Xie X, Tang B, Xiao Y-F, Xie R, Li B-S, Dong H, et al. Long non-coding RNAs in colorectal cancer. Oncotarget. 2016;7(5):5226.

27.      Okugawa Y, Grady WM, Goel A. Epigenetic alterations in colorectal cancer: emerging biomarkers. Gastroenterology. 2015;149(5):1204-25. e12.

28.      Rinn JL, Kertesz M, Wang JK, Squazzo SL, Xu X, Brugmann SA, et al. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs. cell. 2007;129(7):1311-23.

29.      Hajjari M, Salavaty A. HOTAIR: an oncogenic long non-coding RNA in different cancers. Cancer biology & medicine. 2015;12(1):1.

30.      Li D, Feng J, Wu T, Wang Y, Sun Y, Ren J, et al. Long intergenic noncoding RNA HOTAIR is overexpressed and regulates PTEN methylation in laryngeal squamous cell carcinoma. The American journal of pathology. 2013;182(1):64-70.

31.      Chen L, Deng H, Cui H, Fang J, Zuo Z, Deng J, et al. Inflammatory responses and inflammation-associated diseases in organs. Oncotarget. 2018;9(6):7204.

32.      Takeuchi O, Akira S. Pattern recognition receptors and inflammation. Cell. 2010;140(6):805-20.

33.      Obaid M, Udden SN, Deb P, Shihabeddin N, Zaki MH, Mandal SS. LncRNA HOTAIR regulates lipopolysaccharide-induced cytokine expression and inflammatory response in macrophages. Scientific reports. 2018;8(1):1-18.

34.      Freemerman AJ, Johnson AR, Sacks GN, Milner JJ, Kirk EL, Troester MA, et al. Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. Journal of Biological Chemistry. 2014;289(11):7884-96.

35.      Ieronymaki E, Theodorakis EM, Lyroni K, Vergadi E, Lagoudaki E, Al-Qahtani A, et al. Insulin resistance in macrophages alters their metabolism and promotes an M2-like phenotype. The Journal of Immunology. 2019;202(6):1786-97.

36.      Obaid M, Udden SN, Alluri P, Mandal SS. LncRNA HOTAIR regulates glucose transporter Glut1 expression and glucose uptake in macrophages during inflammation. Scientific reports. 2021;11(1):1-19.

37.      Fukuzumi M, Shinomiya H, Shimizu Y, Ohishi K, Utsumi S. Endotoxin-induced enhancement of glucose influx into murine peritoneal macrophages via GLUT1. Infection and immunity. 1996;64(1):108-12.

38.      Li A, Qiu M, Zhou H, Wang T, Guo W. PTEN, insulin resistance and cancer. Current pharmaceutical design. 2017;23(25):3667-76.

39.      Yu F, Chen B, Dong P, Zheng J. HOTAIR epigenetically modulates PTEN expression via MicroRNA-29b: a novel mechanism in regulation of liver fibrosis. Molecular Therapy. 2017;25(1):205-17.

40.      Tian F-J, He X-Y, Wang J, Li X, Ma X-L, Wu F, et al. Elevated tristetraprolin impairs trophoblast invasion in women with recurrent miscarriage by destabilization of HOTAIR. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 2018;12:600-9.

41.      Qi K, Zhong J. LncRNA HOTAIR improves diabetic cardiomyopathy by increasing viability of cardiomyocytes through activation of the PI3K/Akt pathway. Experimental and therapeutic medicine. 2018;16(6):4817-23.

42.      Jalal D, Sanford B, Renner B, Ten Eyck P, Laskowski J, Cooper J, et al. Detection of pro angiogenic and inflammatory biomarkers in patients with CKD. Scientific reports. 2021;11(1):1-16.

43.      Germolec DR, Shipkowski KA, Frawley RP, Evans E. Markers of inflammation. Immunotoxicity Testing. 2018:57-79.

44.      Mihai S, Codrici E, Popescu ID, Enciu A-M, Albulescu L, Necula LG, et al. Inflammation-related mechanisms in chronic kidney disease prediction, progression, and outcome. Journal of Immunology Research. 2018;2018.

45.      Hojs R, Ekart R, Bevc S, Hojs N. Markers of inflammation and oxidative stress in the development and progression of renal disease in diabetic patients. Nephron. 2016;133(3):159-62.

46.      Petreski T, Piko N, Ekart R, Hojs R, Bevc S. Review on Inflammation Markers in Chronic Kidney Disease. Biomedicines. 2021;9(2):182.

47.      Volkogon А, Harbuzova V, Ataman A, Harbuzova Y, Kolnoguz A. Analysis of association between long non-coding RNA HOTAIR gene rs1899663 polymorphism and disease-free survival in kidney cancer patients. Ukrainian Journal of Nephrology and Dialysis. 2020(2 (66)):17-23.

48.      Kim JO, Jun HH, Kim EJ, Lee JY, Park HS, Ryu CS, et al. Genetic variants of HOTAIR associated with colorectal cancer susceptibility and mortality. Frontiers in oncology. 2020;10:72.

49.      Taheri M, Noroozi R, Sadeghpour S, Omrani MD, Ghafouri-Fard S. The rs4759314 SNP within Hotair lncRNA is associated with risk of multiple sclerosis. Multiple sclerosis and related disorders. 2020;40:101986.

50.      Sayad A, Badrlou E, Ghafouri-Fard S, Taheri M. Association Analysis Between the rs1899663 Polymorphism of HOTAIR and Risk of Psychiatric Conditions in an Iranian Population. Journal of Molecular Neuroscience. 2020:1-6.

51.      Cho SH, Kim JH, Park HW, Park HS, An HJ, Kim YR, et al. Associations between HOTAIR polymorphisms rs4759314, rs920778, rs1899663, and rs7958904 and risk of primary ovarian insufficiency in Korean women. Maturitas. 2021;144:74-80.

52.      Majumder S, Hadden MJ, Thieme K, Batchu SN, Niveditha D, Chowdhury S, et al. Dysregulated expression but redundant function of the long non-coding RNA HOTAIR in diabetic kidney disease. Diabetologia. 2019;62(11):2129-42.

53.      Zhao D, Zhao Y, Wang J, Wu L, Liu Y, Zhao S, et al. Long noncoding RNA Hotair facilitates retinal endothelial cell dysfunction in diabetic retinopathy. Clinical Science. 2020;134(17):2419-34.

54.      Wang H, Xia Y, Zhang Y. Diagnostic significance of serum lncRNA HOTAIR and its predictive value for the development of chronic complications in patients with type 2 diabetes mellitus. Diabetology & Metabolic Syndrome. 2021;13(1):1-6.

55.      Jung HJ, Kim H-J, Park K-K. Potential roles of long noncoding RNAs as therapeutic targets in renal fibrosis. International journal of molecular sciences. 2020;21(8):2698.

56.      Cheng S, Zhang Y, Chen S, Zhou Y. LncRNA Hotair Participates in microglia activation and inflammatory factor release by regulating the ubiquitination of MYD88 in traumatic brain injury. Journal of Molecular Neuroscience. 2021;71(1):169-77.

57.      Rakhshan A, Zarrinpour N, Moradi A, Ahadi M, Omrani MD, Ghafouri‐Fard S, et al. A single nucleotide polymorphism within HOX Transcript Antisense RNA (HOTAIR) is associated with risk of psoriasis. International journal of immunogenetics. 2020;47(5):430-4.

58.      Berl T. American Society of Nephrology renal research report. Journal of the American Society of Nephrology. 2005.

59.      Florkowski CM, Chew-Harris JS. Methods of estimating GFR–different equations including CKD-EPI. The Clinical Biochemist Reviews. 2011;32(2):75.

60.      Aghdaie MH, Azarpira N, Kazemi K, Geramizadeh B, Darai M, Malekhoseini SA. Frequency of HLA-G exon 8 polymorphisms and kidney allograft outcome in Iranian population. Molecular biology reports. 2011;38(5):3593-7.

61.      Lin C, Yang H-Y, Wu C-C, Lee H-S, Lin Y-F, Lu K-C, et al. Angiotensin-converting enzyme insertion/deletion polymorphism contributes high risk for chronic kidney disease in Asian male with hypertension–a meta-regression analysis of 98 observational studies. PloS one. 2014;9(1):e87604.

فرم پرسشنامه طرح تحقیقاتی بر روی بیماران مزمن کلیوی (CKD)

نام و نام خانوادگی:

مدت زمان پیگیری:                          شماره تماس:                              گروه:  مورد □      شاهد □         شماره: …..

در این مطالعه ارتباط آماری بین واریانت های ژنی مختلف واقع شده در ژن رمز گذار یک RNA بلند غیر کد کننده به نام HOTAIR‌و ریسک ابتلا به بیماری مزمن کلیوی در جمعیتی از بیماران جنوب شرق ایران بررسی خواهد شد.

بعد از کسب رضایت از بیماران و گروه کنترل از کلیه افرادی که در مطالعه وارد شده ­اند 5 میلی لیتر خون در لوله های حاوی EDTA جمع­آوری می­ گردد.

شناسایی ژن های دخیل در پاتوژنز بیماریهای کلیوی.

ایجاد هماتوم جزیی در محل خونگیری که قابل جبران است.

برای جلوگیری از ایجاد هماتوم در محل خونگیری میبایستی خونگیری توسط فرد مجرب (پرسنل آزمایشگاه) انجام شود

تمامی هزینه ها توسط مجری از محل بودجه طرح تحقیقاتی پرداخت شده و بیمار هیچگونه هزینه ای پرداخت نخواهد کرد.

ندارد

اطلاعات بیماران به طور کاملاْ محرمانه حفظ خواهد شد.

مجری طرح دکتر رامین سراوانی

۰۹۱۵۵۴۳۲۶۰۹

بیمار یا فرد شاهد اجازه دارد از شرکت در مطالعه امتناع کند یا طی مطالعه بنا به صلاحدید خود از مطالعه خارج شود.

رضایت کتبی از بیمار قبل از خونگیری اخذ خواهد شد.