بررسی اثر ضد مالاریایی نانوذرات آهن با استفاده از روش سنتز سبز عصاره برگ گیاه ازگیل ژاپنی (Eriobotrya japonica) ، در ترکیب با نیکوتین آمید (Vitamin B3) بر سویه 3D7 پلاسمودیوم فالسیپاروم در مقایسه با داروی کلروکین در شرایط In-vitro یا برون تنی

مقدمه و بیان مسئله:

مالاریا یک بیماری عفونی تهدید کننده زندگی انسان و یکی ازعوامل اصلی مرگ و میر در کشورهای گرمسیری و نیمه­ گرمسیری­ست. بر طبق آخرین گزارش سازمان WHO در سال 2020 حدود 241 میلیون مورد جدید مالاریا و 627 هزار مرگ بر اثر این بیماری ثبت شده است.⁽¹⁾ عامل این بیماری یک تک­یاخته بیماریزا از خانواده پلاسمودیوم­ می­باشد که توسط پشه­ آلوده آنوفل منتقل می­شود. چرخه زندگی انگل­های پلاسمودیوم شامل انتقال فرم اسپوروزوئیت انگل به بدن با گزش پشه آلوده ، ورود انگل به جریان خون و مهاجرت آن به هپاتوسیت و تثبیت در کبد است. پس از چند هفته نهفتگی انگل­های فعال وارد اریتروسیت­های داخل خون شده و درآن تکثیر پیدا کرده و فرم شیزونت تشکیل می­شود که باعث آسیب به RBC می­شود. در انتها به فرم گامتوسیت درآمده و با گزش مجدد پشه ، این فرم وارد بدن پشه می­شود.⁽²⁾⁽³⁾  از جمله علائم بیماری مالاریا در انسان، تب ، ضعف ، حالت تهوع و سردرد است و همچنین در موارد حاد بیماری باعث یرقان ، صرع ، کما و مرگ می­شود.⁽⁴⁾  Plasmodium falciparum شایع­ترین و کشنده­ترین تک­یاخته عامل بیماری مالاریا در انسان است.⁽⁵⁾  بنابراین ، کنترل و حذف این گونه از پلاسمودیوم الزامی­ست. از آن­جا که درسال­های اخیر به صورت گسترده ، مقاومت انگل نسبت به داروهای شیمیایی از جمله کلروکین ، آمودیاکین ، سولفادوکسین ، کینین ، مفلوکین و آرتمیسنین گزارش شده است^{(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)} و همچنین عوارض جانبی متعدد این داروها^{(15)(16)(17)(18)(19)(20)} ، ضرورت پژوهش ماده­ای جدید بر پایه عصاره­های گیاهی برای مقابله با پلاسمودیوم فالسیپاروم مشهود است.

از قدیم الایام  از عصاره گیاهان مفیدی چون شیرین بیان (Glycyrrhiza glabra) ، درمنه (Artemisia) ، زرشک (Berberis)  برای درمان مالاریا استفاده می­شده و در سال­های اخیر  اثر ضد پلاسمودیومی آن­ها مورد بررسی قرار گرفته است.. ^(21)(22)(23)

گیاه ازگیل ژاپنی (Eriobotrya japonica) یک درخت همیشه سبز مناطق نیمه گرمسیری­ست که بیش از 2000 سال پیش ، کشت آن درجهان گسترش یافت. برگ و میوه این گیاه شامل مواد موثره فراوان است و به شکل سنتی برای خواص درمانی متعدد همچون دیابت ، دفع سنگ کلیه و مشکلات کبدی مورد استفاده قرار می­گرفته است. ⁽²⁴⁾

برگ این گیاه شامل آنتی­اکسیدان­های فراوان ، مواد ضد التهابی ، اسیدهای چرب ، فنولیک­ها و ترپنوئیدها می­باشد که فعالیت ضد انگلی بسیاری از آن­ها اثبات شده است.  ⁽²⁵⁾

از ترپنوئید­های موجود در برگ گیاه می­توان به چند مورد اشاره کرد ، Ursolic acid با اثر بر آنزیم (PfHGXPT) همانندسازی پلاسمودیوم فالسیپاروم را مختل می­کند ⁽²⁶⁾  ، Maslinic acid در مرحله شیزونت انگل اثر مهاری دارد ⁽²⁷⁾ ، Corosolic acid نیز با IC50=100µg/ml پلاسمودیوم فالسیپاروم را مهار می­کند. ⁽²⁸⁾

پلی­فنول­های برگ گیاه شامل کافئیک اسید ( موجود در گیاه درمنه و بورکیا ) ، گالیک اسید (موجود در گاروم­زنگیان) و کاتچین است که اثر مهاری همه آن­ها بر پلاسمودیوم فالسیپاروم اثبات شده است. ^{(29)(30)(31)(32)(33)(34)(35)}

همچنین در برگ گیاه اسیدهای چرب لینولئیک اسید ، لینولنیک اسید ، اولئیک اسید و گالیک اسید وجود دارد که هرکدام اثرات مهاری مناسبی بر رشد پلاسمودیوم فالسیپاروم نشان داده­اند. ^(36)(37)

از طرفی در سالیان اخیر استفاده از نانوذرات آهن (IONPs) به دلیل ویژگی های خاص فیزیوشیمیایی، الکترومغناطیسی و پارامغناطیسی قابل کنترل، سمیت کم، پایداری شیمیایی، مسیرهای سنتز متعدد و خواص بیولوژیکی آن به طور گسترده در آزمایش­های بالینی برای افزایش کنتراست تصویربرداری، رزونانس مغناطیسی، ایمنی سنجی (Immunoassays)، ردیابی سلولی، ترمیم بافت و دارورسانی در شرایط In-vivo مورد استفاده واقع شده است. ⁽³⁸⁾

نانوذرات آهن (IONPs) خود نیز دارای فعالیت ضد پلاسمودیومی هستند و در ترکیب با دیگر داروها برای کنترل مقاومت دارویی مورد استفاده قرار گرفته­اند. ^(39)(40)

روش های فیزیکی و شیمیایی برای تولید نانو ذرات بسیار هزینه بر، ضد محیط زیست و نیازمند امکانات خاص و دما، فشار و انرژی بالا می باشند؛ همچنین به دلیل استفاده از مواد کاهش دهنده سمی و غیرقابل تجزیه و در برخی موارد سرطان زا، از این روش ها در موارد زیستی نمی توان استفاده کرد.در چندسال گذشته سنتز نانو ذره به روش سبز به عنوان یک روش موثر، سازگار با محیط زیست، غیرسمی و مقرون به صرفه مورد تایید قرار گرفته است. ⁽⁴¹⁾

برای سنتز سبز (Green synthesis) می توان از عصاره های گیاهی و میکروارگانیسم ها استفاده کرد. تحقیقات انجام شده حاکی از آن است که سرعت کاهش یون های فلزی و پایداری آن توسط عصاره های گیاهی بسیار سریع تر و بیشتر از میکروارگانیسم ها می باشد. ⁽⁴²⁾

در سنتز سبز عصاره گیاهی اکسید آهن (Fe₂O₃) را به عنصر فلزی ( پایه ) به عنوان نانوذرات غیر سمی تبدیل می­کند. توسط این فعالیت بیولوژیکی نانوذرات آهن در مراحل بعدی مطالعات می­تواند نقش حامل دارو را برای کاهش مقاومت دارویی و افزایش غلظت موضعی را ایفا کرده و به عنوان عوامل هدف­گیری سلولی-بافتی به منظور بهبود گزینش پذیری عمل کنند. ⁽³⁸⁾

همچنین نیکوتین­آمید (Vitamin B3) یک مشتق آمید محلول در آب است که در پژوهش­های متععد ثابت شده که به عنوان تقویت کننده و مکمل اثر داروهای ضد پلاسمودیوم فالسیپاروم فعالیت می­کند. ⁽⁴³⁾ همچنین این ویتامین می­تواند فعالیت هیستون دِاستیلاز فاکتور رونویسی سیرتوئین (Sir2) را متوقف کرده و رشد فالسیپاروم را مهار کند. ⁽⁴⁴⁾

Combination therapy به دلیل به تاخیر انداختن ظهور مقاومت در انگل همواره مد نظر WHO بوده است و می تواند منجر به کسب نتایج ارزشمندی شود.

 در این طرح ما قصد داریم با استفاده از ذرات نیترات آهن به وسیله عصاره آبی برگ گیاه ازگیل ژاپنی (Eriobotrya japonica) ، نانو ذره آهن به روش سنتز سبز تولید کنیم و فعالیت ضد پلاسمودیوم فالسیپاروم آن را در محیط In-vitro ( RPMI-1640) در ترکیب با نیکوتین­آمید بررسی و اثر آن را با داروی کلروکین مقایسه کنیم.

بررسی متون:

در طی سال­های مطالعه بر روی داروی مالاریا ، ایجاد مقاومت به داروهای شیمیایی به اثبات رسیده است. همچنین عوارض جانبی این داروها ، تحقیقات و پژوهش را  به داروهای گیاهی و بی ضرر سوق داده است.

در ادامه به چند مقاله در رابطه با مقاومت داروهای شیمیایی مختلف در برابر پلاسمودیوم فالسیپاروم اشاره می­شود.

در سال 1999 ،  Price و همکاران نشان دادند که آرتمیسینین و مشتقات آن باعث بی اشتهایی ، حالت تهوع و سرگیجه در بیماران تحت درمان مالاریا می­شود ، اما آرتسونیت که مشتق آرتمیسینین است این عوارض را با شدت کمتری ایجاد می­کند. ⁽⁴⁵⁾

Sidhu و همکاران در سال 2002 نیز جهش در ژن pfcrt را با مقاومت پلاسمودیوم فالسیپاروم به کلروکین مرتبط دانسته بودند. ⁽⁴⁶⁾

در سال 2008 گاتون و همکاران در مطالعه­ای نشان دادند که جهش در ژن دی­هیدروفولات ردوکتاز و دی­هیدروپتروات سنتتاز از عوامل مقاومت به سولفادوکسین-پیریتامین است. ⁽⁴⁷⁾

همچنین Sidhu و همکاران در سال 2005 مقاومت دارویی پلاسمودیوم فالسیپاروم به کینین را به جهش در ژن pfmdr1 نسبت دادند. (48) در همین زمینه ، Achan و همکاران در سال 2011 نشان دادند که همچنان استفاده از کینین در سه ماهه اول بارداری نقش مهمی در مدیریت بیماری مالاریا دارد. ⁽⁴⁹⁾

در سال 2006 اورسینگ و همکاران گزارش کردند که مقاومت به کلروکین در سال 1980 در ایران تایید گشته و نشان دادند که پلی مورفیسم در ژن­های pfcrt ، pfmdr1 و pfmrp با ایجاد مقاومت به کینولین ارتباط مستقیم دارد. ⁽⁷⁾

در سال 2009 ، Juliana Martha Sa و همکاران گزارش کردند که مقاومت پلاسمودیوم فالسیپاروم به آمودیاکین نیز با پلی­مورفیسم در ژن­های  pfcrt و pfmdr1 ارتباط مستقیم دارد.⁽⁹⁾  خالد بشیر و همکاران نیز در سال 2020 کدون 72 تا 76 pfcrt هاپلوتایپ SVMNT را عامل مقاومت به آمودیاکین اعلام کردند. ⁽⁵⁰⁾

در سال 2009 پیانچ و همکاران نشان دادند که افزایش تعداد کپی ژن pfmdr1 با مقاومت به داروی مفلوکین ارتباط مستقیم دارد. ⁽⁵¹⁾

براگا و همکاران در سال 2015 در مطالعه­ای دریافتند که استفاده از کلروکین و پریماکین برای درمان مالاریا باعث عوارض جانبی متعددی از جمله التهاب دستگاه گوارشی ، التهاب پوست و بی­خوابی می­شود. ⁽⁵²⁾

Fairhurst و همکاران در مطالعه­ای در سال 2016 نشان دادند که پلی­مورفیسم تک نوکلئوتیدی در ژن K13 موجب مقاومت پلاسمودیوم فالسیپاروم به آرتمیسینین می­باشد و حاصل فعالیت این ژن باعث شکسته شدن آرتمیسینین می­شود. ⁽⁵³⁾

با توجه به مطالعات اشاره شده ، استفاده از داروهای با عوارض جانبی کمتر یا بدون عوارض از طرف پژوهشگران همیشه پیشنهاد می­شود.

معمولا استفاده از داروهای گیاهی میتواند میزان عوارض را به حداقل رسانده که به مطالعات مختلف در جهان و ایران و مطالعات مرتبط با مواد موئره گیاه ازگیل ژاپنی میتوان اشاره کرد.

Prusty و همکاران در سال 2008 به کمک PCR و آنتی­بادی­های پلی­کلونال نشان دادند که نیکوتین­آمید می­تواند فعالیت هیستون دِاستیلاز فاکتور رونویسی سیرتوئین (Sir2)   را متوقف کرده و رشد پلاسمودیوم فالسیپاروم را مهار کند. ⁽⁴⁴⁾

در سال 2012 ، Paula melariri و همکاران نشان دادند که اثر لینولنیک اسید بر دو سویه D10 و Dd2 پلاسمودیوم فالسیپاروم به ترتیب باعث ایجاد IC50=4.12±0.25µg/ml و

IC50=5.04 ±1.24µg/ml می­شود. همچنین گزارش شد که اثر لینولئیک اسید بر این دو سویه ، به ترتیب ایجاد IC50=7.80±0.67µg/ml و IC50=7.56 ±0.92µg/ml می­کند. ⁽³⁶⁾

Khasanah و همکاران در سال 2017 در پژوهشی دریافتند که در شرایط In-vitro ، گالیک اسید فعالیت ضد پلاسمودیومی دارد و IC50=0.0722mM را ثبت کرده­اند.⁽⁵⁴⁾ در همین زمینه ، Horgen و همکاران نیز در سال 1997 فعالیت ضد پلاسمودیومی گالیک اسید را گزارش کرده بودند. ⁽⁵⁵⁾

Rizky Abdullah و همکاران در سال 2017 گزارش کردند که کاتچین در شرایط In-vitro ، IC50=198µm را در 24 ساعت آزمایش را ایجاد کرد. همچنین گزارش شد که کاتچین از طریق القای استرس اکسیداتیو در پلاسمویوم فالسیپاروم در مرحله شیزونت و ترفوزوئیت باعث مهار آن می­شود. ⁽⁵⁶⁾

در سال 2017 ، Sergey O Tcherniuk و همکاران دریافتند که نیکوتین­آمید در مقابل سویه­های CS2 و 3G8 به ترتیب IC50=6.9mm و IC50=2.2mm را از خود نشان داده. همچنین در این پژوهش گزارش شد که نیکوتین­آمید در ترکیب با آرتمیسینین و کلروکین پیریمتامین باعث افزایش 10-90% غلظت مهاری رشد این داروها می­شود. ⁽⁴³⁾

Alson و همکاران در سال 2018 نشان دادند که کافئیک اسید در شرایط In-vitro می­تواند IC50=9~30µg/ml را بر پلاسمودیوم فالسیپاروم باعث شود و در محیط In-vivo   نیز باعث مهار 55% در غلظت 100mg/kg را نیز از خود نشان دهد. ⁽²⁹⁾

Kannan و همکاران در سال 2019 طی پژوهشی دریافتند که داروی آرتسونیت غنی شده با نانوذرات اکسید آهن در مقابله با پلاسمودیوم فالسیپاروم باعث آزادسازی Fe²⁺ وابسته به PH پایدار را در واکوئل غذایی تک­یاخته و در نتیجه افزایش فراوان بیان ROS و آسیب به آن می­شود. ⁽⁴⁰⁾

در سال 2015 ، Chandel و همکاران دریافتند که عصاره آبی ریشه زرشک گونه aristata بر پلاسمودیوم برگئی در شرایط In-vitro باعث ایجاد IC50=40µg/ml شد. ⁽²³⁾

اشنایدر و همکاران در سال 2021 طی مطالعه­ای گزارش کردند که اثر عصاره گیاه آرتمیسیا گونه annua بر گامتوسیت­های پلاسمودیوم فالسیپاروم در محیط In-vitro ، باعث کاهش بیان ژن­های PfGEXP5 و Pfs25 شدند. ⁽²²⁾

در این زمینه چند مطالعه در ایران صورت گرفته که به ترتیب زیر هستند:

اسماعیلی و همکاران در سال 2009 ، تعداد 32 گیاه سنتی برای درمان مالاریا را جمع آوری کرده و عصاره متانولی آن­ها را بر محیط کشت پلاسمودیوم فالسیپاروم آزمایش کردند. در این پژوهش 4 گیاه Buxaceae ، Geraniaceae ، Fabaceae و Apiaceae ایجاد IC50=4.7~26.6µg/ml کردند. ⁽⁵⁷⁾

در سال 2013 ، نقیبی و همکاران در پژوهشی ، عصاره گیاه myrtle را بر سویه 3D7 اثر داده و IC50=87µg/ml را در محیط کشت مشاهده کردند.  ⁽⁵⁸⁾

سنگیان و همکاران در سال 2013 ، اثر عصاره متانولی 10 گیاه را بر محیط کشت پلاسمودیوم فالسیپاروم بررسی کردند. در این میان 4 گیاه Malvaceae ، Myrtaceae ، Plantaginaceae و Papilionaceae به ترتیب غلظت مهارکنندگی نیمی حداکثر 62.77 ، 42.18 ، 40.00 و 13.56 میکروگرم در میلی­لیتر را از خود نشان دادند. ⁽⁵⁹⁾

در سال 2015 ، نقیبی و همکاران در مطالعه ای ، عصاره ریشه گیاه Dorema hyrcanum Koso-Pol را بر محیط کشت پلاسمودیوم فالسیپاروم آزمایش کرده و به IC50=26.64µg/ml رسیدند. ⁽⁶⁰⁾

فیض حداد و همکاران در سال 2017 نشان دادند که اثر عصاره متانولی سه گیاه Citrullus colocynthis، Physalis alkekengi  و Solanum nigrum بر محیط کشت پلاسمودیوم فالسیپاروم سویه 3D7 ، ایجاد IC50=2.01~18.67µg/ml میکند. ⁽⁶¹⁾

رمضانی و همکاران در سال 2018 نشان دادند که فرکشن­های آبی متانول و اتیل استات ریشه شیرین بیان که به روش پرکولاسیون در محیط کشت RPMI-1640 بر پلاسمودیوم فالسیپاروم آزمایش شد ، به ترتیب IC50=9.95µg/ml و IC50=13µg/ml را ایجاد کردند. ⁽²¹⁾

علمی و همکاران در سال 2021 گزارش کردند که اثر عصاره Allium paradoxum در غلظت 80µg/ml باعث مهار 60.43 درصدی مهار رشد پلاسمودیوم فالسیپاروم سویه 3D7 در محیط کشت می­شود. ⁽⁶²⁾

همچنین مطالعاتی که در سیستان و بلوچستان درباره داروهای پلاسمودیوم فالسیپاروم صورت گرفته شامل موارد زیر است:

حیدری و همکاران در سال 2007 به بررسی ارتباط جهش ژن­های (DHFR) و (DHPS) پلاسمودیوم فالسیپاروم با شکست درمانی آنتی­ فولات مانند سولفادوکسین-پیری­متامین (SP) به روش PCR-ELISA روی 53 ایزوله در شرایط In-vivo پرداختند. مشاهده شد که در 11.3% موارد پلی مورفسیم شدید ژن­های مورد  نظر رخ داده و در 96% موارد حداقل دو جهش اتفاق افتاده که شیوع بالای این جهش میتواند به کاهش اثربخشی دارو در آینده منجر شود. ⁽⁶³⁾

حیدری و همکاران در سال 2012 به منظور تعیین حساسیت پلاسمودیوم ویواکس در جنوب شرق ایران به کلروکین ، 270 بیمار مبتلا به مالاریا علامتدار یا شدید را تحت درمان با کلروکین قرار داده و با روش­های میکروسکوپی و Nested-PCR به ارزیابی خون این بیماران پرداختند. طبق نتایج گزارش شد که در سال 2012 هنوز پلاسمودیوم ویواکس به کلروکین در این مناطق حساس بوده است. ⁽⁶⁴⁾

در سال 2013 مهدی­پور و همکاران با بررسی اثر بخشی 8 هفته­ای پریماکین در پیشگیری از عود در 163 بیمار مبتلا به پلاسمودیوم ویواکس با استفاده از روش SSCP-PCR و تعیین توالی تنوع ژن  PvMSP-1 در جنوب شرق ایران ، گزارش کردند که استفاده پریماکین 0.75ml/kg برای پیشگیری موثر بوده و گزینه مناسبی می­باشد. ⁽⁶⁵⁾

آذریان مقدم و همکاران در سال 2018 در پایش پاسخ پلاسمودیوم ویواکس به کلروکین و آرتسونیت-فنسیدار بر روی 208  بیمار مبتلا به مالاریا در جنوب شرق ایران و مناطق همسایه ،  بر اساس ارزیابی MPCT دریافتند که در انگل در این مناطق به کلروکین حساس­تر شده است. ⁽⁶⁶⁾

در مطالعات ذکر شده نواقصی نظیر استفاده از داروهای شیمیایی دارای عوارض جانبی ، عدم استفاده از نانوذرات به منظور ماندگاری و تاثیر بهتر و بیشتر مواد موثره و عدم استفاده از داروهای ترکیبی وجود دارد.

با توجه به مطالعات و موارد ذکر شده و سوق پژوهش­ها در این زمینه به سمت داروهای بی­خطر به نظر می­رسد استفاده از داروهای گیاهی با روش سنتز سبز می­تواند مفید باشد.

همچنین استفاده همزمان از عصاره بر گیاه ازگیل ژاپنی همراه با نیکوتین آمید میزان اثربخشی را افزایش می­دهد و میتواند برای دست­یابی به یک ترکیب دارویی موثر کمک کند.

از آنجایی که که استان سیستان و بلوچستان به عنوان یک کانون اندمیک بیماری مالاریا در ایران به شمار می­رود و گونه پلاسمودیوم فالسیپاروم عامل مالاریای بدخیم می­باشد ، و تا کنون مطالعه ای بر روی اثر ضد مالاریایی نانوذرات آهن حاوی عصاره برگ گیاه ازگیل ژاپنی در ترکیب با نیکوتین آمید صورت نگرفته، لذا ضرورت این پژوهش جهت مطالعات کاربردی کاملا مشهود است

6-فرضیات و سوالات تحقیق:

1. IC50 عصاره آبی برگ گیاه ازگیل ژاپنی به صورت مستقل بر محیط کشت پلاسمودیوم فالسیپاروم سویه 3D7 در مقایسه با کلروکین چقدر است ؟
2. IC50 نانوذرات آهن حاوی عصاره آبی برگ گیاه ازگیل ژاپنی بر محیط کشت پلاسمودیوم فالسیپاروم سویه 3D7 در مقابسه با کلروکین چقدر است ؟
3.  IC50 نانوذرات آهن حاوی عصاره آبی برگ گیاه ازگیل ژاپنی در ترکیب با نیکوتین آمید بر محیط کشت پلاسمودیوم فالسیپاروم سویه 3D7 در مقایسه با کلروکین چقدر است ؟
4. آیا بین IC50 های بدست آمده از عصاره آبی برگ گیاه ازگیل ژاپنی در ترکیب با نیکوتین آمید با IC50 های بدست آمده از مواد مورد استفاده بصورت مستقل تفاوت معنی داری وجود دارد ؟
5. آیا IC50 نانوذرات آهن حاوی عصاره آبی برگ ازگیل ژاپنی در ترکیب با نیکوتین­آمید تحت تاثیر تغییر بار سطحی ، اندازه و مورفولوژی نانوذرات آهن قرار می­گیرد ؟

5- هدف کلی:

تعیین اثر ضد مالاریایی نانوذرات آهن با استفاده از روش سنتز سبز عصاره برگ گیاه ازگیل ژاپنی (Eriobotrya japonica) ، در ترکیب با نیکوتین­آمید (Vitamin B3) بر سویه 3D7 پلاسمودیوم فالسیپاروم در مقایسه با داروی کلروکین در شرایط In-vitro  یا برون­تنی

7- اهداف اختصاصی:

1. تعیین اثر ضد مالاریایی غلظت­های مختلف عصاره آبی برگ گیاه ازگیل ژاپنی به صورت مستقل بر محیط کشت پلاسمودیوم فالسیپاروم سویه 3D7 در مقایسه با کلروکین برای بدست آوردن IC50
2. تعیین اثر ضد مالاریایی غلظت­های مختلف نیکوتین­آمید به صورت مستقل بر محیط کشت پلاسمودیوم فالسیپاروم سویه 3D7 در مقایسه با کلروکین برای بدست آوردن IC50
3. تعیین اثر ضد مالاریایی غلظت­های مختلف نانوذره آهن حاوی عصاره آبی برگ گیاه ازگیل ژاپنی بر محیط کشت پلاسمودیوم فالسیپاروم سویه 3D7 در مقابسه با کلروکین برای بدست آوردن IC50
4. تعیین اثر ضد مالاریایی نسبت­های مختلف نانوذره آهن حاوی عصاره آبی برگ گیاه ازگیل ژاپنی در ترکیب با نیکوتین آمید بر محیط کشت پلاسمودیوم فالسیپاروم سویه 3D7 در مقایسه با کلروکین برای بدست آوردن IC50
5. مقایسه IC50 نانوذره حاوی عصاره آبی برگ گیاه ازگیل ژاپنی در ترکیب با نیکوتین آمید با IC50 های بدست آمده از مواد مورد استفاده بصورت مستقل
6. تعیین خصوصیات فیزیکی و شیمیایی ( بار سطحی ، انداره و مورفولوژی ) نانوذرات آهن حاوی عصاره آبی گیاه ازگیل ژاپنی در ترکیب با نیکوتین­آمید

    8- اهداف کاربردی:

1. بدست آوردن بهترین غلظت مهارکنندگی نانوذره آهن حاوی عصاره آبی برگ گیاه ازگیل ژاپنی در ترکیب با نیکوتین آمید به عنوان یک ترکیب پیشنهادی برای درمان مالاریای فالسیپاروم
2. ایجاد زمینه مطالعات و تحقیقات در مورد اثرات ضد مالاریایی نانوذرات آهن حاوی عصاره برگ گیاه ازگیل ژاپنی در ترکیب با نیکوتین آمید علیه پلاسمودیوم برگئی

دانشگاه­های علوم پزشکی

مراکز تحقیقاتی

مراکز بهداشتی و بیمارستان­ها

11- تعریف واژه های تخصصی:

IC50: غلظتی از ماده موثره یا داروکه موجب مهار رشد نیمی از ارگانیسم مورد نظر در شرایط آزمایشگاهی شود.

اکسید آهن: یک ترکیب معدنی با فرمول شیمیایی Fe3O4   است که در مطالعات آزمایشگاهی و روش سنتز سبز به منظور ایجاد نانوذرات و ترکیب با دیگر مواد برای افزایش پایداری و اثربخشی استفاده می­شود.

نانوذره حاوی عصاره آبی گیاه: عصاره آبی حاصل از برگ گیاه ازگیل ژاپنی را با روش سنتز سبز به نانوذرات آهن می­افزاییم که تشکیل نانولوله­های کربنه حاوی عصاره برگ گیاه ازگیل ژاپنی داده و باعث افزایش پایداری محصول می­گردد.

سویه 3D7 پلاسمودیوم فالسیپاروم: یک سوش استاندارد از پارازیت ایجاد کننده مالاریا که به داروی کلروکین حساس بوده و برای بررسی اثربخشی داروهای مختلف در شرایط In-vitro در مطالعات مختلف استفاده می­شود.

کلروکین: داروییست که برای پیشگیری و درمان مالاریا در مناطقی که ثابت شده مالاریا نسبت به اثرات آن حساس است به کار می‌رود. سوش 3D7 به آن حساس بوده و فرمول شیمیایی آن C₁₈H₂₆ClN₃ است.

تجربی – آزمایشگاهی

سویه 3D7 پلاسمودیوم فالسیپاروم در محیط کشت

با توجه به اینکه مطالعه آزمایشگاهی بوده و سویه 3D7 پلاسمودیوم فالسیپاروم در محیط کشت مورد مطالعه قرار می­گیرد ، نیاز به تعیین حجم نمونه نیست.

با توجه به نوع مطالعه امکان محاسبه حجم نمونه وجود ندارد. جهت حصول اطمینان از مراحل کار آزمایش سه بارتکرارخواهد شدونتایج به صورت میانگین آن‌ها ارایه می‌گردد.

جمع آوری و نتایج حاصل از شمارش انگل در محیط کشت.

استفاده از نرم افزار های الکترونیکی برای بررسی.

6- روش اجرای طرح(با جزئیات بطور کامل شرح داده شود)

1-6  کشت پلاسمودیوم فالسیپاروم

کشت انگل پلاسمودیوم فالسیپاروم مطابق روش Tranger & Jensen و Volkman ^(67)(68) با انجام یکسری تغییرات در آن برروی سوش 3D7 در ازمایشگاه ملی مالاریا، دانشکده بهداشت دانشگاه علوم پزشکی تهران انجام می­گیرد.

هدف استفاده از این سویه در مطالعه حاضر، به دلیل حساسیت آن نسبت به داروی کلروکین است.

محیط کشت ناکامل (PCM) شامل محیط 1640 RPMI (500mL) ، هایپوگزانتین (0.0278gr) و جنتامیسین (0.025gr)  ،  NaOH 5  مولار (300µL) و آب مقطر دیونیزه تهیه خواهد شد.

محیط کشت کامل (CCM) شامل PCM ، سرم AB+ دکمپلمانه شده (15-10%) و آلبومکس است.

به منظور تنظیم PH محیط کشت و جلوگیری از نوسان آن ، باید NaOH به آن افزود.

به علت حساسیت بسیار بالای انگل مالاریا بهتر است که از محیط کشت آماده RPMI 1640 از شرکت Gibco استفاده شود که خود  حاوی Hepes و گلوکز است.

پس از تهیه محیط کامل برای غنی سازی و رشد مطلوب انگل به پلیت­ها و فلاسک­های محتوی انگل ، محیط CCM و آلبومکس اضافه می­گردد . آلبومکس یک لیپوپروتئین گاوی است که به میزان 50µL به پلیت­های کوچک حاوی انگل و به میزان 100µL به فلاسک در پایان تعویض محیط کشت انگل اضافه خواهد گردید.

برای کشت انگل مالاریا، پس از دفریز کردن سوش 3D7 از پلیت­های کوچک 35˟10 میلیمتری که ظرفیت آن معادلmL 3-4 محیط کشت است و یا از فلاسک های کوچک T25 یا cm2 ، 25 یا 50 میلیلیتری که ظرفیت آنها معادل  mL8-7 است استفاده می­شود. عمل افزودن خون  (جهت حفظ هماتوکریت 10% محیط کشت برای رشد و تکثیر انگل) و تهیه لام ، هر دو روز یک بار و عمل سانتریفیوژ کردن محیط کشت انگل، هر دو هفته یک بار انجام می­شود.

به منظور تأمین اتمسفر لازم برای انگل ها روزانه با گاز مخلوط شامل (3%) O₂ ، (4%) CO₂ ، (93%) N₂ گازدهی می­شود.

زمانیکه پارازیتمی به بیش از 10 % رسید، انگل به فلاسک cm²25 که ظرفیت آن mL50 محیط کشت است، یا دو پلیت کوچک 10˟35 میلی متری منتقل می­گردد. تعویض محیط کشت و تهیه لام، هر روز باید انجام گردد و هماتوکریت به میزان 10%  نگه داشته شود ، زیرا حجم بالای هماتوکریت خود میتواند موجب اسیدی شدن محیط و از بین رفتن انگل­ها شود. وقتی که پارازیتمی بیشتر از 20 % شد، به فلاسک 500 میلی لیتری که ظرفیت آن معادل mL130-140 محیط کشت است و یا 2 فلاسک 150 میلی لیتری انتقال داده می­شوند. در صورت افزایش پارازیتمی بیش از این مقدار، شرایط مانند قبل ادامه داده میشود و به جای انتقال به فلاسک های بزرگتر، به دو فلاسک تقسیم شده و کار به همان صورت ادامه می­یابد تا پارازیتمی به 10 % برسد. 

برای تعیین میزان پارازیتمی، تعداد انگلها در مقابل 10000 گلبول قرمز شمارش و به درصد تبدیل می­شوند. برای شمارش انگلها، تمامی انگلهای خارج و داخل گلبول قرمز (اگر گلبول قرمز الوده به چندین انگل باشد ) هر کدام به عنوان یک انگل در شمارش محسوب می­شوند و شیزونت­ها به عنوان یک انگل شمارش می­شوند.

 پس از تایید پارازیتمی 10 % تکثیر محیط کشت انجام شده و در صورتی که حداقل 10 % از پارازیتمی بیان شده در مرحلة حلقه قرار گرفت، عمل فریز کردن انجام می­گردد.

برای انجام تست حساسیت دارویی از پلیت­های 96 حفره ای استفاده خواهد شد،  به این صورت که ردیف اول خالی

گذاشته شده و ردیف دوم به کنترل منفی و ردیف سوم  به کنترل مثبت اختصاص داده خواهد  شد. در چاهک دوم و سوم محیط کشت کامل (CCM) اضافه می­گردد.

 از ردیف چهارم تا ردیف هشتم به رقت های مختلف عصاره اختصاص داده خواهد شد.

پس از افزودن رقت­ها ، به تمامی چاهک­های ردیف دوم تا ردیف هشتم µL10 از خون شسته شده O⁺  اضافه می­گردد. در اخر به همه­ی چاهک­ها از ردیف سوم به عنوان کنترل مثبت تا ردیف هشتم µL10 از خون حاوی انگل کشت داده شده (شستشو داده شده با PBS) اضافه خواهد شد.

پلیت­ها در جار بی­هوازی و پس از آن درون انکوباتور قرار می­گیرد. سپس جار و پلیت­ها از انکوباتور خارج شده و از رسوب­ها گسترش نازک تهیه میگردد. پس از فیکس کردن گسترش­ها با متانول و رنگ­امیزی به روش گیمسا، با شمارش تعداد گلبول­های قرمز الوده به انگل در مقابل گلبول­های قرمز سالم، میانگین با توجه به نتیجه شمارش حفره­ها، محاسبه می­شود. و به عنوان IC50 بیان می­شود.

IC50 یعنی غلظتی از ماده موثره یا داروکه موجب مهار رشد نیمی از ارگانیسم مورد نظر در شرایط آزمایشگاهی شود.

کشت پلاسمودیوم فالسیپاروم و بررسی IC50 مواد در مرکز ملی مالاریای ایران در دانشکده پزشکی دانشگاه تهران انجام می­شود.

2-6 شیوه عصاره­گیری برگ گیاه

ابتدا برگ گیاه ازگیل ژاپنی از درخت­های آن چیده خواهد شد و سپس آسیاب شده و به پودر تبدیل می‌شود. سپس پودرها به آب مقطر در حال جوش به مدت 30 دقیقه اضافه می‌گردد. محلول تهیه شده و بوسیله کاغذ واتمن نمره 4 صاف و  به کمک دستگاه فریزدرایر لیوفیلیزه می‌گردد و مورد استفاده قرار می‌گیرد.

3-6 تولید نانوذره حاوی عصاره برگ گیاه

سنتز نانو ذرات آهن از روش رسوب گذاری با احیای یون های آهن توسط عصاره گیاهی ازگیل ژاپنی انجام میگیرد.  برگهای گیاه ازگیل ژاپنی جمع آوری و از برگهای خشک شده این گیاه دارویی، عصاره تهیه میشود و برای تولید نانوذرات، عصاره در معرض یونهای فلزی اکسید آهن آهن قرار می دهیم. برای این منظور ۱۵گرم از برگ گیاه در ۱۰۰میلی لیتر آب دیونیزه ریخته، سپس به مدت ۵دقیقه جوشانده و عصاره حاصل از آن پس از سرد شدن با کاغذ صافی و فیلترهای ۰.۴۵میکرومتری فیلتر میشود. اکسید آهن با غلظتهای مختلف ۱۰ ،۱۵ و ۲۰میلی مولار به عصاره اضافه، و زمانهای انجام واکنش در دمای اتاق اندازه گیری میشود. پس از اینکه فرآیند سنتز نانوذرات آهن تکمیل شد، برای تغلیظ  نانوذرات تشکیل شده، رسوب حاصل با سرعت ۱۲۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۲۰دقیقه سانتریفیوژ و سپس محلول رویی دور ریخته میشود. به منظور شستن و پراکنده شدن نانوذرات ته نشین شده با اضافه کردن آب دویونیزه، عمل سانتریفیوژ ۳بار تکرار میگردد. در انتهای کار روی محصول بدست آمده تست های ماهیت شناسی AFM, TEM, XRD  انجام میگیرد.

در کشور مؤسسات و مراکز محدودی دارای میکروسکوپ­های الکترونی مورد نظر هستند. مانند مؤسسه هوا و فضا که زیر نظر دانشگاه خواجه نصیر تهران فعالیت می­کند. همچنین دانشگاه کاشان و دانشگاه علوم پزشکی مشهد در همین زمینه مشغول فعالیت هستند. در استان نیز دانشگاه سیستان در این زمینه فعال است.

پس از تهیه محصول مورد نظر برای انجام هر تست میکروسکوپ الکترونی ، 2ml را جدا کرده و داخل میکروتیوپ قرار داده و به موسسه ارسال می­شود.

برای جداسازی نمونه ، 50-100µl را روی قالب مخصوص قرار داده و با تیغه الماس آن را برش می­دهند تا سطح مقطع آن افزایش و حجم مورد نیاز برای مشاهده زیر میکروسکوپ کاهش یابد.

سطح نمونه را با لایه بسیاز نازک فلز رسانا مانند کروم ، طلا یا پلاتین پوشش می­دهند.

پراش الکترونی حاصل از برخورد پرتوهای الکترونی با نمونه مورد نظر توسط دتکتور میکروسکوپ دریافت و تحلیل می­شود و مورفولوژی و توپوگرافی نانوذره مشخص می­گردد.

در میکروسکوپ الکترونی TEM ، پرتوهای الکترونی از داخل نمونه عبور کرده و موفولوژی و ماهیت نانوذره را نشان می­دهد.

در میکروسکوپ الکترونی SEM ، پرتوها به سطح نمونه برخورد کرده و به دتکتور می­رسد و مورفولوژی و اندازه توسط میکروسکوپ اسکن می­شود.

تعیین بار نانوپارتیکل به کمک دستگاه DLS ( زتا سایزر ) انجام می­شود.

آزمایش XRD  برای تایید  مورفولوژی ، اندازه و بار سطحی نانوذره کاربرد دارد و میانگین کلی این پارامترها را به صورت گراف بیان می­کند.

با توجه به نیاز طرح برای استفاده از میکروسکوپ الکترونی ( TEM و SEM ) و آزمایش XRD و عدم  وجود آن در دانشگاه علوم پزشکی زاهدان ، لزوم به همکاری با سایر موسسات و دانشگاه­هاست. به علت هزینه نگهداری و وسایل مصرفی، هر بار انجام این آزمایشات تخصصی نیازمند صرف هزینه می­باشد.

نتایج حاصل از تاثیر رقتهای مختلف دارویی برای تعیین IC50 دارو بر روی انگل پلاسمودیوم فالسیپاروم گونه 3D7 در جدول گزارش می­شود.

گروه 1 ( کنترل منفی ) : RBC شسته شده O⁺  به میزان 10μL بعلاوه 90μL از CCM.

گروه 2 (کنترل مثبت ) : انگل کشت داده شده به میزان 10μL بعلاوه 90μL از CCM و RBC شسته شده O⁺  به میزان 10μL.

گروه 3 تا گروه 7 ( گروه­های تست pi) : انگل کشت داده شده به میزان 10μL بعلاوه RBC شسته شده O⁺  به میزان 10μL بعلاوه رقت دارویی از 10^-6 mol/Lit تا 10^-10 mol/Lit به میزان 90μL.

نتایج حاصل از اثر نانوذرات ، عصاره گیاهی ، نیکوتین آمید و کلروکین به صورت مستقل و در ترکیب با یکدیگر در جدول­های جداگانه گزارش می­شود.

داده ها بعد از جمع آوری وارد نرم افزار SPSS(22) خواهد شد و برای بررسی ارتباط بین متغیرها از ضریب همبستگی استفاده می­شود.

برای بررسی اثر متغیرهای مستقل بر وابسته از آزمون آماری رگرسیون استفاده می­شود و در سطح‌معناداری 0.05 تجزیه و تحلیل خواهد شد.

نمودار سطح سه­بعدی و نمودار دو بعدی اثرات متقابل متغیرهای مستقل با پاسخ­های مربوط به آن­ها با استفاده از نرم­افزار Design Expert نسخه آزمایشی (0/5/0/13) برای مشاهده تعامل بین متغیرهای  طراحی می­شود.

             دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش های دارای آزمودنی انسانی

-٢٨ پژوهشگران موظفند که نتایج پژوهش­های خود را صادقانه ، دقیق، و کامل منتشر کنند. نتایج، اعم

از منفی یا مثبت، و نیز منابع تأمین بودجه، وابستگی سازمانی، و تعارض منافع – در صورت وجود – باید

کاملاً آشکارسازی شوند. پژوهشگران نباید در هنگام عقد قرارداد انجام پژوهش، هیچ گونه شرطی را مبنی

بر حذف یا عدم انتشار یافته­هایی که از نظر حمایت کنندهی پژوهش مطلوب نیست، بپذیرند.

-٢٩ نحوه­ی گزارش نتایج پژوهش باید ضامن حقوق مادی و معنوی تمامی اشخاص مرتبط با پژوهش،

از جمله خود پژوهشگر یا پژوهشگران، آزمودنی­ها و مؤسسه­ ی حمایت کننده­ی پژوهش باشد.

-3٠ گزارشها و مقالات حاصل از پژوهش­هایی که مفاد این راهنما را نقض کرده­ اند، نباید برای انتشار

پذیرفته شوند.

-٣١ روش پژوهش نباید با ارزش­های احتماعی، فرهنگی و دینی جامعه در تناقض باشد

با توجه به پیشینه دانشکده در زمینه کارهای تحقیقاتی به نظر می رسد موردی وجود نداشته باشد. محدودیت ها قبلا با کوشش اساتید دست اندرکار در پژوهش مرتفع گردیده است.

پلاسمودیوم فالسیپاروم ، سنتز سبز ، نانوذرات آهن ، نیکوتین­آمید ، ازگیل ژاپنی ، برون-تنی

1.        WHO. WHO World Malaria Report 2020. Malar Rep [Internet]. 2020 [cited 2022 Feb 20];299. Available from: https://www.wipo.int/amc/en/

2.        Greenwood BM, Fidock DA, Kyle DE, Kappe SHI, Alonso PL, Collins FH, et al. Malaria: progress, perils, and prospects for eradication. J Clin Invest [Internet]. 2008 Apr 1 [cited 2022 Feb 20];118(4):1266. Available from: /pmc/articles/PMC2276780/

3.        Miller LH, Ackerman HC, Su XZ, Wellems TE. Malaria biology and disease pathogenesis: insights for new treatments. Nat Med [Internet]. 2013 Feb [cited 2022 Feb 20];19(2):156–67. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23389616/

4.        Bartoloni A, Zammarchi L. Clinical aspects of uncomplicated and severe malaria. Mediterr J Hematol Infect Dis [Internet]. 2012 [cited 2022 Feb 20];4(1). Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22708041/

5.        Rich SM, Leendertz FH, Xu G, LeBreton M, Djoko CF, Aminake MN, et al. The origin of malignant malaria. Proc Natl Acad Sci U S A [Internet]. 2009 Sep 1 [cited 2022 Feb 20];106(35):14902–7. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19666593/

6.        Payne D. Spread of chloroquine resistance in Plasmodium falciparum. Parasitol Today [Internet]. 1987 [cited 2022 Feb 20];3(8):241–6. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15462966/

7.        Ursing J, Zakeri S, Gil JP, Björkman A. Quinoline resistance associated polymorphisms in the pfcrt, pfmdr1 and pfmrp genes of Plasmodium falciparum in Iran. Acta Trop [Internet]. 2006 Mar [cited 2022 Feb 20];97(3):352–6. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16490179/

8.        Hasugian AR, Purba HLE, Kenangalem E, Wuwung RM, Ebsworth EP, Maristela R, et al. Dihydroartemisinin-Piperaquine versus Artesunate-Amodiaquine: Superior Efficacy and Posttreatment Prophylaxis against Multidrug-Resistant Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax Malaria. Clin Infect Dis [Internet]. 2007 Apr 15 [cited 2022 Feb 20];44(8):1067. Available from: /pmc/articles/PMC2532501/

9.        Sá JM, Twu O, Hayton K, Reyes S, Fay MP, Ringwald P, et al. Geographic patterns of Plasmodium falciparum drug resistance distinguished by differential responses to amodiaquine and chloroquine. Proc Natl Acad Sci U S A [Internet]. 2009 Nov 10 [cited 2022 Feb 20];106(45):18883–9. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19884511/

10.      Edrissian GH, Afshar A, Sayedzadeh A, Mohsseni G, Satvat MT. Assessment of the response in vivo and in vitro of Plasmodium falciparum to  sulphadoxine-pyrimethamine in the malarious areas of Iran. J Trop Med Hyg. 1993 Aug;96(4):237–40.

11.      Edrissian GH, Shahabi S. Preliminary study of the response of Plasmodium falciparum to chloroquine in Sistan and Baluchestan province of Iran. Trans R Soc Trop Med Hyg [Internet]. 1985 [cited 2022 Feb 21];79(4):563–4. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/3909559/

12.      Rieckmann KH, Trenholme GM, Williams RL, Carson PE, Frischer H, Desjardins RE. Prophylactic activity of mefloquine hydrochloride (WR 142 490) in drug-resistant malaria. Bull World Health Organ [Internet]. 1974 [cited 2022 Feb 21];51(4):375. Available from: /pmc/articles/PMC2366307/?report=abstract

13.      Hyde JE. Drug-resistant malaria. Trends Parasitol [Internet]. 2005 Nov [cited 2022 Feb 21];21(11):494–8. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16140578/

14.      Wongsrichanalai C, Pickard AL, Wernsdorfer WH, Meshnick SR. Epidemiology of drug-resistant malaria. Lancet Infect Dis [Internet]. 2002 [cited 2022 Feb 21];2(4):209–18. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11937421/

15.      Braga CBE, Martins AC, Cayotopa ADE, Klein WW, Schlosser AR, Da Silva AF, et al. Side effects of chloroquine and primaquine and symptom reduction in malaria endemic area (Mâncio lima, Acre, Brazil). Interdiscip Perspect Infect Dis. 2015;2015.

16.      Adjei GO, Goka BQ, Rodrigues OP, Hoegberg LCG, Alifrangis M, Kurtzhals JAL. Amodiaquine-associated adverse effects after inadvertent overdose and after a standard therapeutic dose. Ghana Med J [Internet]. 2010 Jun 8 [cited 2022 Feb 21];43(3). Available from: https://www.ajol.info/index.php/gmj/article/view/55340

17.      Peters PJ, Thigpen MC, Parise ME, Newman RD. Safety and toxicity of sulfadoxine/pyrimethamine: implications for malaria prevention in pregnancy using intermittent preventive treatment. Drug Saf [Internet]. 2007 [cited 2022 Feb 21];30(6):481–501. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17536875/

18.      Hálfdanarson TR, Sigfússon A, Haraldsdóttir V, Thornorsteinsson SB, Pálsson R. [Severe adverse effects of quinine: Report of seven cases.]. Laeknabladid. 2002 Oct;88(10):717–22.

19.      Lee SJ, Ter Kuile FO, Price RN, Luxemburger C, Nosten F. Adverse effects of mefloquine for the treatment of uncomplicated malaria in Thailand: A pooled analysis of 19, 850 individual patients. PLoS One [Internet]. 2017 Feb 1 [cited 2022 Feb 21];12(2):e0168780. Available from: https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0168780

20.      Artemisinin. In Bethesda (MD); 2012.

21.      Ramazani A, Tavakolizadeh M, Ramazani S, Kheiri-Manjili H, Eskandari M. Antiplasmodial Property of Glycyrrhiza glabra Traditionally Used for Malaria in Iran: Promising Activity with High Selectivity Index for Malaria. J Arthropod Borne Dis [Internet]. 2018 [cited 2022 Feb 23];12(2):135. Available from: /pmc/articles/PMC6091801/

22.      Snider D, Weathers PJ. In vitro reduction of Plasmodium falciparum gametocytes: Artemisia spp. tea infusions vs. artemisinin. J Ethnopharmacol. 2021 Mar 25;268:113638.

23.      Chandel S, Bagai U, Badoni R, Deepak S&, Semwal K, Semwal RB, et al. Antiplasmodial activity of aqueous extract of Berberis aristata roots against Plasmodium berghei-infected BALB/c mice. http://dx.doi.org/103109/1388020920151005750 [Internet]. 2015 Oct 13 [cited 2022 Feb 23];53(12):1735–40. Available from: https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.3109/13880209.2015.1005750

24.      Tian S, Qin G, Li B. Loquat (Eriobotrya japonica L.). Postharvest Biol Technol Trop Subtrop Fruits Cocona to Mango. 2011 Jan 1;424-444e.

25.      Liu Y, Zhang W, Xu C, Li X. Biological Activities of Extracts from Loquat (Eriobotrya japonica Lindl.): A Review. Int J Mol Sci 2016, Vol 17, Page 1983 [Internet]. 2016 Dec 6 [cited 2022 Feb 23];17(12):1983. Available from: https://www.mdpi.com/1422-0067/17/12/1983/htm

26.      Opoku F, Govender PP, Pooe OJ, Simelane MBC. Evaluating Iso-Mukaadial Acetate and Ursolic Acid Acetate as Plasmodium falciparum Hypoxanthine-Guanine-Xanthine Phosphoribosyltransferase Inhibitors. Biomol 2019, Vol 9, Page 861 [Internet]. 2019 Dec 11 [cited 2022 Feb 23];9(12):861. Available from: https://www.mdpi.com/2218-273X/9/12/861/htm

27.      Moneriz C, Marín-García P, García-Granados A, Bautista JM, Diez A, Puyet A. Parasitostatic effect of maslinic acid. I. Growth arrest of Plasmodium falciparum intraerythrocytic stages. Malar J [Internet]. 2011 Apr 10 [cited 2022 Feb 23];10(1):1–10. Available from: https://malariajournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/1475-2875-10-82

28.      APPLICATION OF FERRIPROTOPORPHYRIN BIOCRYSTALLIZATION INHIBITION TEST TO FIND ANTIPLASMODIAL COMPOUNDS IN THE FLORA OF THE “ZONGO VALLEY” - BOLIVIA [Internet]. [cited 2022 Feb 23]. Available from: http://www.scielo.org.bo/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0250-54602012000100007

29.      Alson SG, Jansen O, Cieckiewicz E, Rakotoarimanana H, Rafatro H, Degotte G, et al. In-vitro and in-vivo antimalarial activity of caffeic acid and some of its derivatives. J Pharm Pharmacol [Internet]. 2018 Sep 6 [cited 2022 Feb 23];70(10):1349–56. Available from: https://academic.oup.com/jpp/article/70/10/1349/6121770

30.      Ezenyi IC, Okpoko CK, Ufondu CA, Okhale SE, Adzu B. Antiplasmodial, antinociceptive and antipyretic potential of the stem bark extract of Burkea africana and identification of its antiplasmodial-active fraction. J Tradit Complement Med. 2021 Jul 1;11(4):311–7.

31.      Liu NQ, Cao M, Frédérich M, Choi YH, Verpoorte R, van der Kooy F. Metabolomic investigation of the ethnopharmacological use of Artemisia afra with NMR spectroscopy and multivariate data analysis. J Ethnopharmacol. 2010 Mar 2;128(1):230–5.

32.      Khasanah U, Waruyanti AW, Hafd AF, Tanjung M. Antiplasmodial Activity of Isolated Polyphenols from Alectryon serratus Leaves Against 3D7 Plasmodium falciparum. Pharmacognosy Res [Internet]. 2017 Dec 1 [cited 2022 Feb 23];9(Suppl 1):S57. Available from: /pmc/articles/PMC5757328/

33.      Ndjonka D, Bergmann B, Agyare C, Zimbres FM, Lüersen K, Hensel A, et al. In vitro activity of extracts and isolated polyphenols from West African medicinal plants against Plasmodium falciparum. Parasitol Res 2012 1112 [Internet]. 2012 Apr 5 [cited 2022 Feb 23];111(2):827–34. Available from: https://link.springer.com/article/10.1007/s00436-012-2905-y

34.      Jansen O, Tchinda AT, Loua J, Esters V, Cieckiewicz E, Ledoux A, et al. Antiplasmodial activity of Mezoneuron benthamianum leaves and identification of its active constituents. J Ethnopharmacol. 2017 May 5;203:20–6.

35.      Abdulah R, Suradji EW, Subarnas A, Supratman U, Sugijanto M, Diantini A, et al. Catechin isolated from Garcinia celebica leaves inhibit Plasmodium falciparum growth through the induction of oxidative stress. Pharmacogn Mag [Internet]. 2017 Apr 1 [cited 2022 Feb 27];13(50):301. Available from: http://www.phcog.com/article.asp?issn=0973-1296;year=2017;volume=13;issue=50;spage=301;epage=305;aulast=Abdulah

36.      Melariri P, Campbell W, Etusim P, Smith P. In Vitro and in Vivo Antimalarial Activity of Linolenic and Linoleic Acids and their Methyl Esters. Adv Stud Biol. 2012;4.

37.      Khasanah U, Waruyanti AW, Hafd AF, Tanjung M. Antiplasmodial Activity of Isolated Polyphenols from Alectryon serratus Leaves Against 3D7 Plasmodium falciparum. Pharmacognosy Res [Internet]. 2017 Dec 1 [cited 2022 Feb 27];9(Suppl 1):S57. Available from: /pmc/articles/PMC5757328/

38.      Cortajarena AL, Ortega D, Ocampo SM, Gonzalez-García A, Couleaud P, Miranda R, et al. Engineering Iron Oxide Nanoparticles for Clinical Settings. Nanobiomedicine [Internet]. 2014 Jan 1 [cited 2022 Mar 2];1:2. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30023013

39.      Quadros HC, Silva MCB, Moreira DRM. The Role of the Iron Protoporphyrins Heme and Hematin in the Antimalarial Activity of Endoperoxide Drugs. Pharm 2022, Vol 15, Page 60 [Internet]. 2022 Jan 4 [cited 2022 Mar 2];15(1):60. Available from: https://www.mdpi.com/1424-8247/15/1/60/htm

40.      Kannan D, Yadav N, Ahmad S, Namdev P, Bhattacharjee S, Lochab B, et al. Pre-clinical study of iron oxide nanoparticles fortified artesunate for efficient targeting of malarial parasite. EBioMedicine [Internet]. 2019 Jul 1 [cited 2022 Mar 2];45:261. Available from: /pmc/articles/PMC6642363/

41.      Parveen K, Banse V, Ledwani L. Green synthesis of nanoparticles: Their advantages and disadvantages. AIP Conf Proc [Internet]. 2016 Apr 13 [cited 2022 Mar 5];1724(1):020048. Available from: https://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.4945168

42.      Mustapha T, Misni N, Ithnin NR, Daskum AM, Unyah NZ. A Review on Plants and Microorganisms Mediated Synthesis of Silver Nanoparticles, Role of Plants Metabolites and Applications. Int J Environ Res Public Heal 2022, Vol 19, Page 674 [Internet]. 2022 Jan 7 [cited 2022 Mar 5];19(2):674. Available from: https://www.mdpi.com/1660-4601/19/2/674/htm

43.      Tcherniuk SO, Chesnokova O, Oleinikov I V., Oleinikov A V. Nicotinamide inhibits the growth of P. falciparum and enhances the antimalarial effect of artemisinin, chloroquine and pyrimethamine. Mol Biochem Parasitol. 2017 Sep 1;216:14–20.

44.      Prusty D, Mehra P, Srivastava S, Shivange A V., Gupta A, Roy N, et al. Nicotinamide inhibits Plasmodium falciparum Sir2 activity in vitro and parasite growth. FEMS Microbiol Lett [Internet]. 2008 May 1 [cited 2022 Feb 27];282(2):266–72. Available from: https://academic.oup.com/femsle/article/282/2/266/456446

45.      Price R, Van Vugt M, Phaipun L, Luxemburger C, Simpson J, McGready R, et al. Adverse effects in patients with acute falciparum malaria treated with artemisinin derivatives. Am J Trop Med Hyg [Internet]. 1999 Apr 1 [cited 2022 Feb 27];60(4):547–55. Available from: https://www.ajtmh.org/view/journals/tpmd/60/4/article-p547.xml

46.      Singh Sidhu AB, Verdier-Pinard D, Fidock DA. Chloroquine resistance in Plasmodium falciparum malaria parasites conferred by pfcrt mutations. Science (80- ) [Internet]. 2002 Oct 4 [cited 2022 Feb 27];298(5591):210–3. Available from: https://www.science.org/doi/abs/10.1126/science.1074045

47.      Gatton ML, Martin LB, Cheng Q. Evolution of resistance to sulfadoxine-pyrimethamine in Plasmodium falciparum. Antimicrob Agents Chemother [Internet]. 2004 Jun [cited 2022 Feb 27];48(6):2116–23. Available from: https://journals.asm.org/doi/abs/10.1128/AAC.48.6.2116-2123.2004

48.      Sidhu ABS, Valderramos SG, Fidock DA. pfmdr1 mutations contribute to quinine resistance and enhance mefloquine and artemisinin sensitivity in Plasmodium falciparum. Mol Microbiol [Internet]. 2005 Aug 1 [cited 2022 Feb 27];57(4):913–26. Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/j.1365-2958.2005.04729.x

49.      Achan J, Talisuna AO, Erhart A, Yeka A, Tibenderana JK, Baliraine FN, et al. Quinine, an old anti-malarial drug in a modern world: Role in the treatment of malaria. Malar J [Internet]. 2011 May 24 [cited 2022 Feb 27];10(1):1–12. Available from: https://malariajournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/1475-2875-10-144

50.      Beshir K, Sutherland CJ, Merinopoulos I, Durrani N, Leslie T, Rowland M, et al. Amodiaquine resistance in Plasmodium falciparum malaria in Afghanistan is associated with the pfcrt SVMNT allele at codons 72 to 76. Antimicrob Agents Chemother [Internet]. 2010 Sep [cited 2022 Feb 27];54(9):3714–6. Available from: https://journals.asm.org/doi/abs/10.1128/AAC.00358-10

51.      Preechapornkul P, Imwong M, Chotivanich K, Pongtavornpinyo W, Dondorp AM, Day NPJ, et al. Plasmodium falciparum pfmdrl amplification, mefloquine resistance, and parasite fitness. Antimicrob Agents Chemother [Internet]. 2009 Apr [cited 2022 Mar 6];53(4):1509–15. Available from: https://journals.asm.org/doi/abs/10.1128/AAC.00241-08

52.      Braga CBE, Martins AC, Cayotopa ADE, Klein WW, Schlosser AR, Da Silva AF, et al. Side Effects of Chloroquine and Primaquine and Symptom Reduction in Malaria Endemic Area (Mâncio Lima, Acre, Brazil). Interdiscip Perspect Infect Dis [Internet]. 2015 [cited 2022 Mar 5];2015. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26357512/

53.      Fairhurst RM, Dondorp AM. Artemisinin-Resistant Plasmodium falciparum Malaria. Microbiol Spectr [Internet]. 2016 May 6 [cited 2022 Feb 27];4(3). Available from: https://journals.asm.org/doi/abs/10.1128/microbiolspec.EI10-0013-2016

54.      Khasanah U, Waruyanti AW, Hafd AF, Tanjung M. Antiplasmodial Activity of Isolated Polyphenols from Alectryon serratus Leaves Against 3D7 Plasmodium falciparum. Pharmacognosy Res [Internet]. 2017 Dec 1 [cited 2022 Feb 27];9(Suppl 1):S57–60. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29333044/

55.      Horgen FD, Madulid DA, Angerhofer CK, Pezzuto JM, Soejarto DD, Farnsworth NR. Isolation of gallic acid esters as antiplasmodial constituents of Swintonia foxworthyi (Anacardiaceae). Phytomedicine. 1997 Dec 1;4(4):353–6.

56.      Abdulah R, Suradji EW, Subarnas A, Supratman U, Sugijanto M, Diantini A, et al. Catechin isolated from Garcinia celebica leaves inhibit Plasmodium falciparum growth through the induction of oxidative stress. Pharmacogn Mag [Internet]. 2017 Apr 1 [cited 2022 Feb 23];13(50):301. Available from: http://www.phcog.com/article.asp?issn=0973-1296;year=2017;volume=13;issue=50;spage=301;epage=305;aulast=Abdulah

57.      Esmaeili S, Naghibi F, Mosaddegh M, Sahranavard S, Ghafari S, Abdullah NR. Screening of antiplasmodial properties among some traditionally used Iranian plants. J Ethnopharmacol [Internet]. 2009 Jan 30 [cited 2022 Mar 5];121(3):400–4. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19059470/

58.      Naghibi F, Esmaeili S, Abdullah NR, Nateghpour M, Taghvai M, Kamkar S, et al. In vitro and in vivo antimalarial evaluations of myrtle extract, a plant traditionally used for treatment of parasitic disorders. Biomed Res Int. 2013;2013.

59.      Sangian H, Faramarzi H, Yazdinezhad A, Mousavi SJ, Zamani Z, Noubarani M, et al. Antiplasmodial activity of ethanolic extracts of some selected medicinal plants from the northwest of Iran. Parasitol Res [Internet]. 2013 Nov 7 [cited 2022 Feb 27];112(11):3697–701. Available from: https://link.springer.com/article/10.1007/s00436-013-3555-4

60.      Naghibi F, Ghafari S, Esmaeili S, Jenett-Siems K. Naghibione; A Novel Sesquiterpenoid with Antiplasmodial Effect from Dorema hyrcanum  Koso-Pol. Root, a Plant Used in Traditional Medicine. Iran J Pharm Res  IJPR. 2015;14(3):961–8.

61.      Feiz Haddad MH, Mahbodfar H, Zamani Z, Ramazani A. Antimalarial evaluation of selected medicinal plant extracts used in Iranian traditional medicine. Iran J Basic Med Sci [Internet]. 2017 Apr 1 [cited 2022 Feb 27];20(4):415–22. Available from: https://ijbms.mums.ac.ir/article_8583.html

62.      Elmi T, Hajialiani F, Asadi MR, Sadeghi S, Namazi MJ, Tabatabaie F, et al. Antimalarial effects of the hydroalcoholic extract of Allium paradoxum in vitro and in vivo. J Parasit Dis 2021 454 [Internet]. 2021 May 12 [cited 2022 Feb 27];45(4):1055–64. Available from: https://link.springer.com/article/10.1007/s12639-021-01359-0

63.      Heidari A, Dittrich S, Jelinek T, Kheirandish A, Banihashemi K, Keshavarz H. Genotypes and in vivo resistance of Plasmodium falciparum isolates in an endemic region of Iran. Parasitol Res [Internet]. 2007 Feb 26 [cited 2022 Feb 28];100(3):589–92. Available from: https://link.springer.com/article/10.1007/s00436-006-0291-z

64.      Heidari A, Keshavarz H, Shojaee S, Raeisi A, Dittrich S. In vivo Susceptibility of Plasmodium vivax to Chloroquine in Southeastern Iran. Iran J Parasitol [Internet]. 2012 Jan 1 [cited 2022 Feb 28];7(2):8–14. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmid/23109940/?tool=EBI

65.      Miahipour A, Keshavarz H, Heidari A, Raeisi A, Rezaeian M, Rezaei S. Assessment of the efficacy of 8 weeks of primaquine for the prevention of relapse in vivax malaria patients using SSCP-PCR and sequencing in south and south-east Iran, 2008–2011. Trans R Soc Trop Med Hyg [Internet]. 2013 Jul 1 [cited 2022 Feb 28];107(7):420–6. Available from: https://academic.oup.com/trstmh/article/107/7/420/1932309

66.      Azarian Moghadam H, Nateghpour M, Raeisi A, Motevalli Haghi A, Edrissian G, Farivar L. Monitoring the Response of Plasmodium vivax to Chloroquine and Uncomplicated P. falciparum to Artesunate-fansidar Antimalarials in Southeastern Iran. Iran J Parasitol [Internet]. 2018 Jan 1 [cited 2022 Feb 28];13(1):31. Available from: /pmc/articles/PMC6019585/

67.      Trager W, Jensen JB. Human malaria parasites in continuous culture. Science [Internet]. 1976 [cited 2022 Feb 28];193(4254):673–5. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/781840/

68.      Mukherjee A, Bopp S, Magistrado P, Wong W, Daniels R, Demas A, et al. Artemisinin resistance without pfkelch13 mutations in Plasmodium falciparum isolates from Cambodia. Malar J [Internet]. 2017 May 12 [cited 2022 Feb 28];16(1):1–12. Available from: https://malariajournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12936-017-1845-5