بررسی نقش ورزش و سولفات منیزیم بر ناباورری ناشی از مصرف لیتیوم در مدل‌حیوانی موش‌ صحرایی نر

ناباروری: درقرن بیست و یکم آلودگی محیط زیست، تشعشعات رادیواکتیو، تغذیه نامناسب، آلودگی صوتی، اعتیاد به تنباکو، الکل، قهوه، داروها و مواد مخدر از عوامل اصلی اختلال پیشرونده در فرآیندهای تولید مثل و ناباروری هستند (1). ناباروری تقریباً 15 درصد از جمعیت جهان را تحت تأثیر قرار داده است و به عنوان یک مسئله جدی بهداشت عمومی جهانی توسط (WHO) [1] به رسمیت شناخته شده است (2).             از جمله عوامل ناباروری در مردان می‌تواند عوامل اولیه مانند اختلال در انتقال اسپرم از بیضه به لوله و عوامل ثانویه مانند عوارض داروها، هورمون‌ها و متابولیت‌های آن‌ها، سموم، عفونت‌های دستگاه ادراری و بیماری‌هایی مانند دیابت، التهاب و برخی اعمال جراحی باشد (1).

لیتیوم : در قرن نوزدهم برای اولین‌بار مصرف لیتیوم به عنوان یک روش درمانی برای افراد دارای اختلالات روانی مورد استفاده قرار گرفت(3). کلمه 'لیتیوم' برای اکثر مردم، تصاویری از ناآرامی‌های روانی، عدم‌تعادل یا بیماری‌های روانی آشکار را نشان می‌دهد. مصرف این دارو در دوزهای بالا (150-360 میلی لیتر عنصر لیتیوم) به عنوان یک روش درمانی برای اختلالات دوقطبی و اشکال مختلف بیماری‌های روانی مورد استفاده قرار می‌گیرد (4). استفاده‌ی طولانی‌مدت با دوزهای درمانی می‌تواند باعث ایجاد اختلالات متعدد در اندام‌های مختلف از جمله سیستم تولید مثل شود. در این خصوص پژوهش‌های به دست آمده حاکی از آن است که مصرف لیتیوم کلرید به میزان 2.5 میلی مولار، در طی درمان شیدایی حاد در انسان، فعالیت هیدروکسی اتروئید دهیدروژناز بیضه، استروئیدزایی بیضه و اسپرم زایی در موش‌های صحرایی را مهار می‌کند. همچنین ممکن است از طریق مهار فعالیت گلیکوژن سنتتاز کیناز،^[2] (GSK)-3 ، مسیر انتقال سیگنال در مغز را مهار کند. و منجر به کاهش سطح هورمون لوتئینیزه کننده ^[3] (LH) در خون و رفتار تولیدمثلی تعدیل شده در موش‌های صحرایی ماده شود و ااثرات نامطلوبی بر محور هیپوتالامو-هیپوفیزیال-گناد نیز داشته باشد (5). 

در همین خصوص شیما طغیانی و همکاران (2012) به یررسی اثر لیتیوم بر غلظت و تحرک اسپرم پرداختند،  در این مطالعه 48 موش ویستار تحت تیمار 48 روزه با کربنات لیتیوم در دوزهای 10، 20 و 30 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن در روز در شرایط استاندارد نگهداری شدند در پایان این دوره، سلول های اسپرم جدا شده از دم اپیدیدیم شمارش شد و میزان تحرک تخمین زده شد، نتایج به‌دست آمده در این پژوهش منجر به کاهش میزان اسپرم‌زایی و کیفیت اسپرم در گروه‌های تحت درمان با لیتیوم، در دوزهای مختلف شده بود (1).

منیزیم: منیزیم به عنوان یک ماده معدنی و چهارمین یون فراوان در بدن با عملکردهای حیاتی می‌باشد که برای فعالیت بسیاری از آنزیم‌ها از جمله آنزیم‌های درگیر در متابولیسم گلوکز مانند هگزوکیناز، فسفوفروکتوکیناز، آلدولاز، فسفوگلیسیرات کیناز و پیروات کیناز، سنتز و شکست اسیدهای چرب و متابولیسم پروتئین و DNA ضروری می‌باشد (6). منیزیم یک ماده معدنی ضروری بوده و یک کوفاکتور برای بیش از 325 واکنش آنزیمی درگیر در تولید و ذخیره انرژی سلولی است (7) و از طریق نقش آن با آنزیم های دخیل در آزادسازی انرژی (ATP) و گلیکولیز بی هوازی برای تحرک اسپرم ضروری است. غلظت بهینه منیزیم نیز برای بقای اسپرم ضروری می‌باشد (8) و می‌تواند به عنوان یک روش درمانی برای بهبود تولید مثل مورد استفاده قرار گیرد.

ورزش: تمرینات ورزشی منظم منجر به بهبود عملکرد سیستم قلبی عروقی، استقامت و پایداری ماهیچه‌ها، کاهش چربی بدن و تغییر در میزان تستوسترون توتال و گلوبولین متصل شونده به هورمون جنسی مردان می‌شود. پژوهش های به دست آمده حاکی از آن است که مقادیر هورمون‌های موثر در فرایند تولید مثل به جنس، سن و فعالیت بدنی افراد وابسته است، این عوامل نقش مهمی بر هورمون‌های جنسی مردان، از جمله تولید و تحریک اسپرم‌سازی دارند.  دراین رابطه نتایج ضد و نقیضی وجود دارد از جمله در   مطالعه ای گزارش شده است  که فعالیت‌های ورزشی بلند مدت در مقادیر برخی هورمون‌های جنسی تغییری ایجاد نمی‌کند، اما برخی دیگر نشان داده اند انجام فعالیت های ورزشی منجر به افزایش هورمون‌های جنسی می‌شود(9).

در همین خصوص مشخص شده است  افرادی که با مقادیر اندک تستوسسترون و تولید کمتر اسپرم از حالت طبیعی مواجه هستند با انجام فعالیت ورزشی میزان ترشح هورمون تستسترون افزایش یافته است (9).  

از این‌رو تمرینات ورزشی می‌تواند در تنظیم سطوح هورمو‌‌ن های جنسی اثرگذار باشند. هدف از پژوهش پیش‌رو تاثیر تمرین اینتروال کم شدت و مصرف منیزیم  بر کاهش باروری ناشی از مصرف لیتیوم  و سطح هورمو‌ن‌های جنسی در موش‌های صحرایی نر می‌باشد.

1- میزان سطح سرمی LH در گروه‌های مورد و شاهد متفاوت است.

2- میزان سطح سرمی FSH در گروه‌های مورد و شاهد متفاوت است.

3- میزان سطح سرمی تستوسترون در گروه‌های مورد و شاهد متفاوت است.

4-   میزان تغییرات بافتی بیضه در گروه‌های مورد و شاهد متفاوت است.

5-  میزان غلظت اسپرم در گروه‌های مورد و شاهد متفاوت است.

6-   میزان حرکت اسپرم در گروه‌های مورد و شاهد متفاوت است.

7-    تعداد اسپرم در  گروه‌های مورد و شاهد متفاوت است.

تعیین تاثیر تمرین اینتروال کم شدت و مصرف منیزیم بر ناباروری ناشی از مصرف لیتیوم در موش‌های صحرایی نر

1. تعیین میزان سطح سرمی LH در پایان مطالعه در  گروه‌های مورد و شاهد

2-     تعیین میزان سطح سرمی FSH در پایان مطالعه در  گروه‌های مورد و شاهد

3-  تعیین میزان سطح سرمی تستوسترون در پایان مطالعه در  گروه‌های مورد و شاهد

4-   تعیین میزان تغییرات بافتی بیضه در پایان مطالعه در  گروه‌های مورد و شاهد

5-  تعیین میزان غلظت اسپرم در پایان مطالعه در  گروه‌های مورد و شاهد

6-   تعیین میزان حرکت اسپرم در پایان مطالعه در  گروه‌های مورد و شاهد

7-   تعیین  تعداد اسپرم در پایان مطالعه در  گروه‌های مورد و شاهد

-

دانشگاه ها و مراکز تحقیقاتی

لیتیوم: لیتیوم کاتیون تک ظرفیتی از گروه یک جدول تناوبی عناصر می‌باشد که ارتباط نزدیکی با سدیم و پتاسیم دارد و می‌تواند در بسیاری ازکانال های سدیمی، جایگزین سدیم شود و به عنوان یک روش درمانی موثر برای اختلالات عاطفی دو قطبی استفاده شده است. استفاده‌ی طولانی‌مدت با دوزهای درمانی می‌تواند باعث ایجاد اختلالات متعدد در اندام‌های مختلف از جمله سیستم تولید مثل شود (5).

سولفات منیزیم: منیزیم چهارمین کاتیون فراوان در بدن است.یکی از کاتیون های عمده داخل سلولی است ودر حفظ تعادل یونی و عملکردهای آنزیمی نقش دارد و به عنوان یک ماده معدنی با عملکردهای حیاتی می‌باشد که برای فعالیت بسیاری از آنزیم ها از جمله آنزیم‌های درگیر در متابولیسم گلوکز نقش دارد.

ورزش: تمرینات ورزشی منظم منجر به بهبود عملکرد سیستم قلبی عروقی، استقامت و پایداری ماهیچه‌ها، کاهش چربی بدن و تغییر در میزان تستوسترون توتال و گلوبولین متصل شونده به هورمون جنسی مردان می‌شود (9).

ناباروری: ناباروری بیماری است که پس از 12 ماه رابطه جنسی منظم و محافظت نشده، یا به دلیل اختلال در توانایی فرد در تولیدمثل، حاملگی ایجاد نمی کند (10). بین 12 تا 15 درصد زوج ها از بین  همه زوج های فعال جنسی نابارور هستند، 50 درصد را می توان از مولفه مرد در حال حاضر تعیین کرد (11).

تجربی

موش صحرایی نر نژاد ویستار،

 سن 9-7 هفته،

 در محدوده وزنی 200-160 گرم

براساس مطالعات قبلی انجام شده موش‌ها به صورت تصادفی به  12  گروه 6 تایی تقسیم شدند (12).

انتخاب72 سر موش صحرایی با توجه به ملاک های مورد مطالعه و قرار گرفتن حیوانات در 12 گروه به صورت تصادفی می باشد.

پس از تصویب طرح، تعداد  72 رت نر از نژاد ویستار (در محدوده وزنی 200-160 گرم) در12 گروه به طور تصادفی قرار می گیرند. حیوانات یک هفته قبل از شروع آزمایش ،در اتاق حیوانات با دمای 2± 22 درجه سانتی گراد با تهویه مناسب و رطوبت 15-10%  وسیکل نوری 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی با دسترسی آزاد به آب و غذا در قفس های فایبر گلاس نگه داری خواهند شد (13). بعد از یک هفته سازگاری رت با محیط آزمایشگاه، برای آشنایی و سازگاری با تردمیل رت ها به مدت پنج روز با سرعت 10 متر در دقیقه و به مدت 5 دقیقه بر روی تردمیل خواهند دوید. بعد از آن برای تعیین حداکثر سرعت دویدن، در هر شش ثانیه به سرعت دویدن رت ها یک متر در دقیقه اضافه شد. شدت دویدن تا 10 متر در دقیقه ادامه یافت و بعد از آن هر دو دقیقه یکبار سه متر در دقیقه به سرعت دویدن اضافه خواهد شد و تا مرز خستگی موش ها ادامه  خواهد یافت (14).  بعد از انجام تست حداکثر سرعت دویدن رت ها تمرینات ورزشی به روش تمرینی تناوبی متوسط اعمال خواهدگردید.

تمرین تناوبی متوسط (MIT): تمرینات ورزشی در هفته اول با شدت 55% حداکثر اکسیژن مصرفی به مدت 37 دقیقه، اعمال می گردد و تا پایان هفته ششم شدت تمرینات ورزشی تا 70 % حداکثر اکسیژن مصرفی و مدت 46 دقیقه افزایش یمی یابد (51).

تمرینات ورزشی به مدت شش هفته انجام می‌شود و لیتیوم به میزان 30,10 mg/kg و سولفات منیزیوم به میزان 80mg/kg  به صورت روزانه و داخل صفاقی و تا پایان پروتکل تمرین ورزشی (پایان هفته هشتم) تجویز خواهند شد. 48 ساعت پس از آخرین جلسه تمرینی حیوانات با کتامین (mg/kg  75) و زایلازین 10 mg/kg  بیهوش  و در شرایط استریل با ایجاد شکافی در ناحیه ی اسکروتوم بیضه های راست و چپ خارج و با استفاده از سرنگ 10 ، از قسمت دم اپی دیدیم نمونه استخراج و به درون یک سی سی محلول نرمال سالین 40 درجه انتقال یخواهد. صد مایکرو لیتر از نمونه ی رقیق شده بر روی لام قرار داده به  طوری که لایه ای نازک زیر لامل پخش شود. با استفاده از میکروسکپ نوری متصل به نرم افزار( نرم افزار اسپرم) ، برای تعیین غلظت و درصد حرکت اسپرم ها حداقل در پنج میدان میکروسکپی متفاوت مشاهده و بررسی خواهند شد.(بزرگنمایی 40). لازم به یادآوری است در این پژوهش نیازی به داروی پیش بیهوشی نمی باشد.

سپس نمونه خونی از قلب  جهت اندازه گیری های پارامتر های مورد نظر ( طیح سرمی تستوسترون، LH . FSH )انجام خواهد شد. (16). در پایان بیضه ها خارج و وزن  و جهت برش بافتی در فرمالین  10 درصد فیکس خواهند شد.

در پایان جهت کشتن حیوانات از دوز بالای بیهوشی ( کتامین 100mg/kg  و زایلازین 20mg/kg ) استفاده خواهد شد . اجساد حیوانات حهت سوزاندن در کوره تحویل مرکز حیوانات آزمایشگاهی داده خواهد شد.

گروه بندی حیوانات:  موش ها به صورت تصادفی به 12 گروه 6 تایی تقسیم خواهند شد. 

گروه 1: گروه کنترل لتیوم صفر  mg/kg+ بدون تمرین

گروه 2: موش های دریافت کننده: لتیوم صفر  mg/kg+ تمرین تناوبی متوسط MIT

گروه 3: موش های دریافت کننده: لتیوم صفر  mg/kg+ سولفات منیزیم

گروه 4: موش های دریافت کننده: لتیوم صفر  mg/kg+ سولفات منیزیم + تمرین تناوبی متوسط MIT  

گروه 5: موش های دریافت کننده: لتیوم 10 mg/kg+ بدون تمرین

گروه 6: موش های دریافت کننده: لتیوم 10 mg/kg + تمرین تناوبی متوسط MIT

گروه 7: موش های دریافت کننده: لتیوم 10 mg/kg + سولفات منیزیم + بدون تمرین

گروه 8: موش های دریافت کننده: لتیوم 10 mg/kg + سولفات منیزیم + تمرین تناوبی متوسط MIT

گروه 9: موش های دریافت کننده: لتیوم 30 mg/kg + بدون تمرین

گروه 10: موش های دریافت کننده: لتیوم 30 mg/kg + تمرین تناوبی متوسط MIT

گروه 11: موش های دریافت کننده: لتیوم 30 mg/kg + سولفات منیزیم + بدون تمرین

گروه 12: موش های دریافت کننده: لتیوم 30 mg/kg + سولفات منیزیم + تمرین تناوبی متوسط MIT

سطح سرمی  FSH  ،  LHو سطح سرمی تستسترون  با استفاده از کیت الیزا (شرکت Promega آمریکا) اندازه‌گیری خواهد شد. برای ارزیابی پاتولوژی بافت بیضه رنگ آمیزی اختصاصی  انجام خواهد گرفت و برای بررسی تغییرات هیستوپاتولوژیک شامل بررسی لوله های اسپرم ساز ( وضعیت لوله های اسپرم ساز ، تعداد اسپرماتوسیت ها، اسپرماتووآ، اسپرماتید)و بافت همنبد بینابینی ( از نظر ظاهری ، پراکندگی، ادم، از هم پاشیدگی و حالات غیر نرمال) به شرح زیر  نمره دهی می شود که بصورت دو سو کور توسط پاتولوژیست انجام می گردد.

جدول امتیازدهی جانسون برای ارزیابی اسپرماتوژنز امتیاز معیارهای بافت شناسی

 10 ،اسپرماتوژنز و تشکیل کامل لوله ها

 9 ،روند اسپرماتوژنز نامنظم، اسپرماتوژنز بهطور جزئی آسیبدیده

 8 ،تعداد کمی اسپرماتوزوا وجود دارد

 7 ،عدم وجود اسپرماتوزا و وجود تعداد زیادی اسپرماتید

 6 ،عدم وجود اسپرماتوزا و وجود تعداد کمی اسپرماتید

 5 ،عدم اسپرماتوزا و اسپرماتید و وجود تعداد زیادی اسپرماتوسیت

 4 ،وجود تعداد کمی اسپرماتوسیت

 3 ،عدم اسپرماتوسیتها و فقط وجود اسپرماتوگونی

 2 ،عدم سلولهای زایا و فقط وجود سلولهای سرتولی

 1 ،عدم سلولهای زایا و سلولهای سرتولی

در پژوهش پیش رو آزمایش با سه عامل mg/kg) 0،10،30،)، سولفات منیزیم mg/kg)  0،80) و یک روش تمرینی (MIT) در 12 گروه، در هر گروه 6 رت به طور تصادفی تقسیم شدند.    

 داده ها توسط نرم افزار SPSS نسخه 17 مورد بررسی قرار خواهد گرفت. برای آنالیز داده ها از آزمون آنالیز واریانس یک طرفه  (one-way ANOVA) و سپس  برای مقایسه میانگین ها از تست توکی استفاده خواهد شد.P –value  کمتر از( P<0.05)  به عنوان اختلاف آماری معنی دار در نظر گرفته خواهد شد.

میانگین حداقل مربعات گروه ها (پس از تصحیح برای مقایسه های چندگانه  براساس آزمون توکی) با هم مقایسه خواهند شد.

در طول مطالعه بر اساس پروتکل کار با حیوانات آزمایشگاهی رفتار شده وانجام کار به تایید کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی زاهدان خواهد رسید،وهمچنین چک لیست کار با حیوانات آزمایشگاهی مورد تایید وزارت متبوعه تکمیل وپیوست می شود.

محدودیت زمانی- با توجه به شرایط تحریم ایجاد مشکل در تهیه کیت یا مواد خارجی احتمالی مورد نیاز

لیتیوم، منیزیم سولفات ، تمرین تناوبی متوسط، تستسترون، LH ، FSH حرکت اسپرم، ناباروری

Lithium, Magnesium sulfate, infertility, Moderate intensity training،testosterone، FSH، LH

1- Toghyani S, Dashti GR, Roudbari NH, Rouzbehani S, Monajemi R. Lithium carbonate inducing disorders in three parameters of rat sperm. Adv Biomed Res. 2013 Jul 30;2:55. doi: 10.4103/2277-9175.115793. PMID: 24223370; PMCID: PMC3814897.

2- Salas-Huetos A, Rosique-Esteban N, Becerra-Tomás N, Vizmanos B, Bulló M, Salas-Salvadó J. The Effect of Nutrients and Dietary Supplements on Sperm Quality Parameters: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Clinical Trials. Adv Nutr. 2018 Nov 1;9(6):833-848. doi: 10.1093/advances/nmy057. PMID: 30462179; PMCID: PMC6247182.

3- Lee J-H, Kim S-W, Kim J-H, Kim H-J, Um J, Jung D-W, et al. Lithium Chloride Protects against Sepsis-Induced Skeletal Muscle Atrophy and Cancer Cachexia. Cells. 2021;10(5):1017.

4- Marshall TM. Lithium as a nutrient. Journal of American Physicians and Surgeons. 2015;20(4):104-9.

5- Thakur SC, Thakur SS, Chaube SK, Singh SP. Subchronic supplementation of lithium carbonate induces reproductive system toxicity in male rat. Reprod Toxicol. 2003 Nov-Dec;17(6):683-90. doi: 10.1016/s0890-6238(03)00107-2. PMID: 14613820.

6- Amaral LS, Silva FA, Correia VB, Andrade CE, Dutra BA, Oliveira MV, Magalhães AC, Volpini RA, Seguro AC, Coimbra TM, Soares TD. Beneficial effects of previous exercise training on renal changes in streptozotocin-induced diabetic female rats. Experimental biology and medicine. 2016 Feb;241(4):437-45.

7- Leite AB, Lima HN, de Oliveira Flores C, Oliveira CA, Cunha LE, Neves JL, Correia TM, de Melo FF, Oliveira MV, de Magalhães AC, de Jesus Soares T. High-intensity interval training is more effective than continuous training to reduce inflammation markers in female rats with cisplatin nephrotoxicity. Life Sciences. 2021 Feb 1;266:118880.

8- Hasan MF, Raddam QN. The relationship of zinc and magnesium in different male infertility cases. EurAsian Journal of BioSciences. 2020 Aug 1;14(2).

9- Samadian Z, Tofighi A, Razi M, Tolouei Azar J, Ghaderi Pakdel F. Moderate-intensity exercise training ameliorates the diabetes-suppressed spermatogenesis and improves sperm parameters: Insole and simultaneous with insulin. Andrologia. 2019 Dec;51(11):e13457. doi: 10.1111/and.13457. Epub 2019 Oct 23. PMID: 31642094.

10- Zegers-Hochschild F, Adamson GD, Dyer S, Racowsky C, de Mouzon J, Sokol R, Rienzi L, Sunde A, Schmidt L, Cooke ID, Simpson JL, van der Poel S. The International Glossary on Infertility and Fertility Care, 2017. Fertil Steril. 2017 Sep;108(3):393-406. doi: 10.1016/j.fertnstert.2017.06.005. Epub 2017 Jul 29. PMID: 28760517.

11- Machen, Graham Luke, and Jay I. Sandlow. 'Causes of male infertility.' Male Infertility. Springer, Cham, 2020. 3-14.

12- Estrela GR, Wasinski F, Batista RO, Hiyane MI, Felizardo RJ, Cunha F, de Almeida DC, Malheiros DM, Câmara NO, Barros CC, Bader M. Caloric restriction is more efficient than physical exercise to protect from cisplatin nephrotoxicity via PPAR-alpha activation. Frontiers in physiology. 2017 Mar 2;8:116

13- Hendriks JG, van Horn JR, van der Mei HC, Busscher HJ. Backgrounds of antibiotic-loaded bone cement and prosthesis-related infection. Biomaterials. 2004;25(3):545-56.

14-Amaral LS, Silva FA, Correia VB, Andrade CE, Dutra BA, Oliveira MV, Magalhães AC, Volpini RA, Seguro AC, Coimbra TM, Soares TD. Beneficial effects of previous exercise training on renal changes in streptozotocin-induced diabetic female rats. Experimental biology and medicine. 2016 Feb;241(4):437-45.

15- Leite AB, Lima HN, de Oliveira Flores C, Oliveira CA, Cunha LE, Neves JL, Correia TM, de Melo FF, Oliveira MV, de Magalhães AC, de Jesus Soares T. High-intensity interval training is more effective than continuous training to reduce inflammation markers in female rats with cisplatin nephrotoxicity. Life Sciences. 2021 Feb 1;266:118880.

16- Niazi AA, Gharaei FK, Saebinasab Z, Maleki M, Maghool F, Fereidooni F, Safari T. Eugenol administration improves liver damage induced by a fructose-rich diet. Advanced Biomedical Research. 2021;10.

17- شفیعی فاطمه,مرندی. تاثیر تمرینات هوازی و عصاره سیلیمارین بر نفروتوکسیسیتی کلیه در رات.شرکت دانش بنیان پژوهشگران فن آور برنا، دانشگاه مازندران، وزارت کشور آبان  1394 , دوره 1

18- Qian C, Yang Q, Guo L, Zhu H, You X, Liu H, Sun Y. Exercise reduces hyperlipidemia‑induced kidney damage in apolipoprotein E‑deficient mice. Experimental and Therapeutic Medicine. 2021 Feb 1;21(2):1-.

در قسمت فرم اطلاعاتی ضمیمه شده است.