بررسی بیان بیومارکر اینتگرین بتا 1 (ITGBL1) در سطح mRNA در سرم افراد مبتلا به سرطان کبد ناشی از هپاتیت B و مقایسه آن با گروه های هپاتیت B، سرطان کبد و افراد سالم

بررسی بیان بیومارکر اینتگرین بتا 1 (ITGBL1) در سطح mRNA در سرم افراد مبتلا به سرطان کبد ناشی از هپاتیت B و مقایسه آن با گروه های هپاتیت B، سرطان کبد و افراد سالم

Evaluation of liver serum mRNA expression level of Integrin beta‐like 1 )ITGBL1( in patients with hepatitis B-induced hepatocellular carcinoma in comparison with hepatitis B, hepatocellular carcinoma patients and healthy groups

بیماری‌های غیرواگیر (NCDs) Noncommunicable diseaseدر حال حاضر مسئول اکثر مرگ‌ و میرهای جهان هستند و به نظر می رسد سرطان به‌عنوان عامل اصلی مرگ و میر و به تنهایی مهم‌ترین مانع برای افزایش امید به زندگی در هر کشوری از جهان باشد. بر اساس برآوردهای سازمان جهانی بهداشت (WHO) در سال 2015، در 91 کشور سرطان رتبه اول و دوم از علل مرگ و میر قبل از 70 سالگی و در 22 کشور رتبه سوم و چهارم را دارد سرطان کبد ششمین سرطان شایع و چهارمین علت مرگ ناشی از سرطان در سراسر جهان با حدود 841000 مورد جدید و 782000 مرگ در سال می باشد. (1)

تخمین زده می شود که تا سال 2025، سالانه بیش از 1 میلیون نفر به سرطان کبد مبتلا می شوند. نتایج مطالعات اپیدمیولوژی(HCC) Hepatocellular carcinoma  را به عنوان سریع ترین علت افزایش دهنده مرگ و میر ناشی از سرطان در ایالات متحده از اوایل دهه 2000 گزارش کرد و پیش بینی می شود که HCC  در صورت ادامه این روندها تا سال 2030 به سومین علت مرگ ناشی از سرطان تبدیل شود. (2)

اگرچه بروز سرطان کبد در ایران در مقایسه با سایر کشورها کمتر است (3) اما نشان داده شده است میزان بروز HCC از سال 2000 تا 2016 در زیرگروه‌هایی مانند مردان، افراد بالای 50 سال و مناطق مرکزی، جنوبی و جنوب غربی کشور 21 درصد افزایش - با 1.28 درصد افزایش سالانه در هر دو جنس- داشته است. بنابراین توصیه شده است که راهبردهای پیشگیرانه و غربالگری بیشتری برای جمعیت ها و استان های پرخطر در ایران اتخاذ شود. (4)

سرطان اولیه کبد شامل کارسینوم کبدی (HCC) (شامل 75 تا 85 درصد موارد) و کلانژیوکارسینوم داخل کبدی (شامل 10 تا 15 درصد موارد) و سایر انواع نادر است. (1-4)

پیش آگهی بیماران HCC معمولا ضعیف است، نرخ بقای 5 ساله بعد از عمل برای بیماران مبتلا به HCC در مراحل اولیه 25٪ -50٪ است. میزان بقای 5 ساله بیماران HCC با متاستازهای دور به زیر 5 درصد کاهش داشته است. پس از جراحی، حدود 70 درصد از بیماران در عرض 2 سال عود می‌کنند یا متاستاز دوردست پیدا می‌کنند. (5)

عوامل خطر اصلی برای HCC عبارتند از عفونت مزمن با ویروس هپاتیت  B B  Hepatitis (HBV)  یا ویروس هپاتیت C (HCV)، HepatitisC مواد غذایی آلوده به آفلاتوکسین، مصرف زیاد الکل، چاقی، سیگار کشیدن و دیابت نوع 2. این عوامل، اهداف کارآمدی را برای پیشگیری، تشخیص و درمان زود هنگام HCC فراهم کرده اند. (1-6)

شکل ۱. مکانیسم بیماریزایی HCC بسته به علت زمینه ای متفاوت است، اما در تمام اتیولوژی ها توالی معمول آسیب کبدی، التهاب مزمن، فیبروز، سیروز مشترک است. (6)

 سازمان بهداشت جهانی تخمین می زند که 257 میلیون نفر یا 3.3 درصد از جمعیت جهان با عفونت مزمن HBV زندگی می کنند (6) و بیش از 780000 نفر هر ساله به دلیل عوارض هپاتیت B از جمله فیبروز مرتبط با HBV، سیروز و کارسینوم سلولی کبدی جان خود را از دست می دهند. مرگ و میر ناشی از HBV به ویژه در آسیا به دلیل شیوع بالاتر هپاتیت B یک مشکل جدی است. (7) سیروز در 1.3-2.4٪ از بیماران آلوده به HBV ایجاد می شود و 3.9٪ از بیماران مزمن HBV به HCC مبتلا می شوند. در سال 2018، 54.5 درصد از موارد جدید HCC  جهانی به عفونت های HBV  نسبت داده شدندHBV(6).  می تواند در غیاب سیروز باعث HCC شود، اگرچه اکثر موارد HCC مرتبط با (70-90 %) HBV در بیماران مبتلا به سیروز رخ می دهد. (8)

درمان HBV به دلیل تداوم واسطه تکثیر ویروسی بسیار پایدار، covalently closed circular DNA (cccDNA)، به عنوان یک اپیزوم غیر یکپارچه در هسته بیماران آلوده دشوار است. (6)  داروهای اولیه در درمان ضد ویروسی عفونت HBV آنالوگ های نوکلئوزیدی (NAs) nucleos(t)ide analogs  هستند. شواهد فزاینده نشان می دهد که درمان NA می تواند خطر کوتاه مدت و میان مدت HCC را کاهش دهد، اما از بین نمی برد. (9) بنابراین تشخیص HCC ناشی از HBV  در مراحل اولیه برای کاهش مرگ و میر ناشی از بیماری در جمعیت های در معرض خطرحیاتی است، زیرا بیماران با برداشتن زودهنگام تومور، پیوند کبد،  یا ریشه کنی تومور، نرخ بقای بالاتری خواهند داشت. (10)

برخی از استراتژی‌های نظارتی مانند سونوگرافی (US) ultrasonography و آزمایش‌های آلفا فتوپروتئین سرم (AFP) Alpha-fetoprotein در فواصل 6 ماهه توسط دستورالعمل‌ها برای افراد در معرض خطر - یعنی افرادی که آنتی ژن سطحی ویروس هپاتیت B (HBsAg) مثبت و/ یا سیروز داشته باشند- توصیه شده است (11)، با این حال، این غربالگری های معمول اغلب حساسیت کمی برای تشخیص HCC در مراحل اولیه دارند. اثربخشی سونوگرافی به اندازه تومور یا در بیماران مبتلا به چاقی محدود می‌شود (12, 13) و AFP، رایج‌ترین نشانگر تومور مورد استفاده، در برخی شرایط پاتولوژیک خاص مانند بیماری‌های مزمن کبد، تومورهای سلول زایا و سرطان معده عملکردی کمتر از حد مطلوب دارد. (14, 15) بنابراین، نیاز فوری به بیومارکرهای سرمی جدید برای بهبود اثربخشی تشخیص زودهنگام در بیماران مبتلا به hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma  (HBV-HCC)  وجود دارد.  (10)

 ادغام HBV در ژنوم میزبان تصادفی است و زمانی که مکان‌های ادغام نزدیک به ژن‌های دخیل در چرخه سلولی، تکثیر و متابولیسم مانند ترانس کریپتاز معکوس تلومراز انسانی  Telomerase reverse transcriptase(hTERT) هستند می‌تواند باعث انکوژن ‌شود. مقایسه نمونه‌های غیر توموری و تومور کبد ، وجود الگوهای متفاوت افزایش ادغام HBV  در تومورها را در مقایسه با غیر تومورهای همسان نشان داده است. پروتئین تنظیم کننده ویروسی علاوه بر نقشی که در تکثیر ویروسی دارد، احتمالا در انکوژنز نیز نقش دارد. این پروتئین تنظیم کننده در تعدیل مسیرهای انکوژنیک، بی ثباتی کروموزومی، استرس اکسیداتیو، متیلاسیون  DNA، رگزایی و مهاجرت نقش دارد. (6)

هر دو پاسخ ایمنی ذاتی و تطبیقی در پاسخ به عفونت HBV نقش دارند. HBV برای چند هفته پس از عفونت خاموش می ماند و باعث فقدان سیستم ایمنی ذاتی اولیه قوی می شود. پاسخ ایمنی تطبیقی شامل آنتی‌ژن‌های اختصاصی HBV و سلول‌های T نقش اصلی را در پاکسازی عفونت HBV بازی می کنند. بلوغ نامناسب سلول T خاطره باعث کمبود سلول های T اختصاصی علیه آنتی ژن HBV و عدم ایجاد پاسخ ایمنی می شود که این می تواند باعث عفونت مزمن، التهاب مکرر کبد، فیبروز، سیروز و HCC شود. (6)

فیبروز کبدی با تداوم پاسخ طبیعی بهبود زخم مشخص می شود، بنابراین منجر به افزایش سنتز و رسوب ماتریکس خارج سلولی (ECM) extracellular matrix  در بافت آسیب دیده می شود. فیبروژنز فرآیند پیچیده ای است که شامل تعدادی سلول مختلف از جمله سلول های کبدی، سلول های ستاره ای کبدی Hepatic stellate cells  (HSCs) و ایمونوسیت ها می شود. فعال‌سازی HSC و تمایز به سلول‌های شبه میوفیبروبلاست از مراحل کلیدی در فیبروز کبدی در نظر گرفته می‌شود. فعال‌سازی HSC  اساساً توسط سیتوکین‌های فیبروژنیک و فاکتورهای رشد آزاد شده توسط سلول‌های التهابی فعال و سلول‌های اپیتلیوم (شامل سلول‌های کبدی و کلانژیوسیت) انجام می‌شود که در میان آنها Transforming growth factor β -  (TGFβ1) برجسته‌ترین تنظیم‌کننده است. (16)

بسیاری از ژن ها از طریق برهمکنش با مسیر سیگنالینگ TGFβ در فیبروژنز شرکت می کنند که در میان آنها اینتگرین ها بسیار مهم هستند. اینتگرین‌ها گیرنده‌های سلولی هستند که از یک زیرواحد α و β تشکیل شده‌اند و حداقل 24 دیمر مختلف را تشکیل می‌دهند که واسطه برهمکنش‌های سلول-سلول و سلول- ECM هستند. مطالعات نشان داده اند که اینتگرین ها نقش مهمی در فیبروژنز دارند. برای مثال در طول پیشرفت فیبروز صفراوی، اینتگرین α vβ6 به شدت در کلانژیوسیت ها تنظیم می شود و فیبروژنز را از طریق فعال سازی TGFβ1 هدایت می کند. (16)

اینتگرین بتا 1، Integrin beta‐like 1  (ITGBL1) همچنین به عنوان Oligomycin sensitivity- conferring protein  ( (OSCP یا TGF-beta inhibitory element (TIED) نامیده می شود، یک گلیکوپروتئین ترشحی حاوی ده دامنه تکراری فاکتور رشد اپیدرمی (EGF) است و ساختار آن شبیه به اینتگرین β است که برای اولین بار در سال 1998 از کلون‌های(cDNA) Complementary DNA   ریه جنین، سلول‌های اندوتلیال ورید ناف انسان  Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)  و cDNA استئوبلاست شبیه‌سازی و مشخص شد. (17) این ژن از طریق فعال کردن مسیر سیگنال‌دهی TGF-β به تومورزایی در بسیاری از سرطان ها مانند سرطان تخمدان، سرطان سینه، و سرطان های دستگاه گوارش از جمله روده و سرطان معده کمک می کند. (18) همچنین تومورهای اولیه می‌توانند وزیکول‌های خارج سلولی غنی از ITGBL1 را آزاد کنند تا فعال شدن فیبروبلاست‌های ساکن در اندام‌های دور را تحریک کنند، که باعث رشد سرطان متاستاتیک می‌شود. (19)

شکل ۲.: ITGBL1 انتقال اپیتلیال - مزانشیمی را از طریق مسیر سیگنالینگ TGF-β/Smads در سلول های HCC ترویج می کند. (18)

مشخص شده است که ITGBL1 به طور قابل‌توجهی در بافت‌های فیبروز یا سیروز کبدی مرتبط با عفونت HBV بیان می‌شود. همچنین در مطالعات اخیرنشان داده شده است که ITGBL1 نقش مهمی در پیشرفت بیماری سرطان کبد، از جمله ترویج تکثیر سلولی، متاستاز و تهاجم به سلول‌های سرطانی کبد ایفا می‌کند. (10, 16, 18)

 بنابراین، ما فرض کردیم که ITGBL1 بافت ممکن است یک بیومارکر جدید و امیدوارکننده برای تشخیص زودهنگام و پیشرفت HCC  مرتبط با HBV ا (HBV-HCC) در افراد در معرض خطر -بیماران مبتلا به عفونت مزمن HBV ا (CHB) باشد. در این مطالعه  بیان  ژن ITGBL1  در بافت افراد مبتلا به HCC  ناشی از  HBV  و مقایسه آن با افراد سالم ، افراد مبتلا به  HCCو افراد مبتلا به  HBV  مورد بررسی قرار خواهد گرفت.

بررسی متون:

1.         در مطالعه ای که Wei Huang و همکاران در سال 2019 انجام دادند نشان داده شد که بیان ITGBL1 در بافت HCC در مقایسه با بافت طبیعی مجاور به طور قابل توجهی بیشتر بود می باشد. بیان ITGBL1  بالاتر با کاهش بقای کلی همراه بود و بیان بیش از حد ITGBL1 مهاجرت و تهاجم به سلول های SMMC-7721 و HepG2 را در شرایط in vitro و in vivo را شدت بخشید، در حالی که ناک داون یا ناک اوت ITGBL1 در سلول های CSQT-2  به طور قابل توجهی مهاجرت سلولی و توانایی های تهاجم را کاهش داد. در سلول‌های SMMC-7721، بیان بیش از حد ITGBL1  مسیر سیگنال‌دهی TGF-β/Smads را همراه با KRT17 و ژن‌های دخیل در انتقال اپیتلیال- مزانشیمی (EMT) تحریک می کند در مقابل، ناک اوت ITGBL1 مسیر سیگنالینگ TGF-β/Smads را در سلول های CSQT-2 مهار می کند. (18)

2.         در مطالعه ای که Fei Ye و همکاران در سال 2021 انجام دادند نشان داده شد  که سطح سرمی ITGBL1  در بیماران HBV-HCC  به طور معنی داری کمتر از بیماران(CHB) Chronic  (HBV-LC)hepatitisB  hepatitis B virus-related liver cirrhosis  است. همچنین این نتیجه در بیماران پیگیری که از HBV-LC به HCC پیشرفت کرده بودند تأیید شد . ITGBL1   سرم دارای دقت تشخیصی بالاتری نسبت به AFP20 در افتراق HBV-HCC در مراحل اولیه از بیماران در معرض خطر است و ترکیب ITGBL1 با AFP20 به طور قابل توجهی دقت تشخیصی را در افتراق HBV-HCC از بیماران در معرض خطر افزایش داد. (10)

3.       در مطالعه ای که Mingjie Wang و همکاران در سال 2016 انجام دادند نشان داده شد که ITGBL1 به عنوان موثرترین ژن مربوط به مرحله فیبروز می باشد و تعامل آن با TGFβ1 به عنوان یک تنظیم کننده کلیدی فیبروژنز در سلول های کبدی نشان داده شد. بنابراین، بیان بالا ITGBL1 نشان می‌دهد که سلول‌های کبدی ممکن است مسیر سیگنالینگ TGFβ را با تنظیم مثبت و متعاقب آن ترویج فعال‌سازی HSC در بیماران فیبروز کبدی مرتبط با HBV فعال کنند. (16)

1. میزان بیان بیومارکر ITGBL1 در سطح mRNA در سرم افراد مبتلا به HCC با سایر گروه های مطالعه متفاوت است. 

2. میزان بیان بیومارکر ITGBL1 در سطح mRNA در سرم افراد مبتلا به HBV  مزمن با سایر گروه های مطالعه متفاوت است. 

3. میزان بیان بیومارکر ITGBL1 در سطح mRNA در سرم افراد مبتلا به HCC ناشی از HBV  مزمن با سایر گروه های مطالعه متفاوت است. 

4. میزان بیان بیومارکر ITGBL1 در سطح mRNA در سرم  افراد سالم با سایر گروه های مطالعه متفاوت است. 

5. میزان بیان بیومارکر ITGBL1 در سطح mRNA در سرم افراد مبتلا به HCC ناشی از HBV و در مقایسه با افراد مبتلا به HBV، افراد مبتلا به HCC و افراد سالم متفاوت است.

تعیین میزان  بیان بیومارکر ITGBL1 در سطح mRNA در سرم  افراد مبتلا به سرطان کبد ناشی از هپاتیت B و مقایسه آن با گروه های هپاتیت B، سرطان کبد و افراد سالم

1. تعیین میزان بیان بیومارکر ITGBL1 در سطح mRNA در سرم  افراد مبتلا به HCC

2. تعیین میزان بیان بیومارکر ITGBL1 در سطح mRNA در سرم  افراد مبتلا به HBV  مزمن  

3. تعیین میزان بیان بیومارکر ITGBL1 در سطح mRNA در سرم  افراد مبتلا به HCC ناشی از HBV  مزمن 

4. تعیین میزان بیان بیومارکر ITGBL1 در سطح mRNA در سرم  افراد سالم

5.مقایسه میزان بیان بیومارکر ITGBL1 در سطح mRNA در سرم  افراد مبتلا به HCC ناشی از HBV با گروه افراد مبتلا به HBVو افراد مبتلا به HCC و افراد سالم

تشخیص  زودهنگام HCC

موسسات آموزشی، پژوهشی و درمانی- دانشگاه علوم پزشکی زاهدان

HCC: Hepatocellular carcinoma

HBV: Hepatitis B virus

HBV-HCC: hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma

ECM: extracellular matrix

TGFβ1: Transforming growth factor-β

ITGBL1: Integrin beta‐like 1

موردی-شاهدی (Case- Control)

نمونه ها از پایان نامه دوره دکترا خانم دکتر بیتا مودی با کد 7262 استخراج خواهد شد. در پایان نامه ایشان بیماران مبتلا به هپاتیت B، هپاتوسل کارسینوم، HBV + HCC  مراجعه کننده به بیمارستان شهید لبافی نژاد تهران،  بیمارستان سوم شعبان تهران و مرکز تحقیقات گوارش و کبد دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله الاعظم (عج) و بیمارستان های دانشگاه علوم پزشکی شیراز (گروه مورد )  که از سال 1394 تا 1400 مراجعه کرده اند انتخاب خواهند شد. نمونه ها از آرشیو بخش بافت شناسی و مربوط به طرح 7262 استخراج خواهد شد.

معیارهای ورود و معیارهای خروج:

با رعایت معیار های ورود شامل ابتلا به هپاتیت B، ابتلا به هپاتوسل کارسینوم، ابتلا به HBV + HCC  و معیارهای خروج شامل افراد سیگاری، زنان باردار، بیماران دیابت نوع یک و دو، بیماران قلبی عروقی و کلیوی، HIV ، HCV ، افراد واجد ضایعات سرطانی خوش خیم و یا بدخیم در سایر ارگان ها

با توجه به شیوع متوسط هپاتوسلولار کارسینوما در ایران و با استفاده از فرمول تعیین حجم نمونه برای داده های زوجی اسمی و همچنین با توجه به حجم نمونه سایر مقالات ، طی رایزنی هایی که با افراد متخصص امر انجام شده است حداقل حجم نمونه در هر کدام از گروه های مطالعه شامل افراد مبتلا به HBV ،HCCو HBVهمراه با HCC و گروه کنترل  40 در نظر گرفته شده است.

در عمل به جای   از برآورد آن یعنی P استفاده می شود که از مطالعات مشابه بدست می آید.

نمونه ها از آرشیو بخش بافت شناسی دانشگاه علوم پزشکی زاهدان استخراج خواهد شد. نمونه های مستخرج از این مطالعه ها، در گروهHCC ،  برای افراد مبتلا به HBV ، HBVهمراه با HCC و گروه کنترل هر کدام برابر 40  می باشد. همچنین نمونه گیری از بیماران واجد شرایط که شاخص های ورود به مطالعه را داشته باشند ادامه خواهد یافت.

نمونه های مورد نظر  از بین افراد مبتلا به HBV و HCC انتخاب می شوند. تشخیص HBV و/یا HCC در همه افراد بر اساس معیارهای سازمان بهداشت جهانی انجام شده است.  بیماران مبتلا به عفونت هپاتیت HBsAg + B و HBV-DNA + بودند. با توجه به راهنمای عملی 2018 توسط انجمن آمریکایی برای مطالعه بیماری‌های کبد، اکثر بیماران HBV-HCC با بررسی هیستوپاتولوژیک زمانی که نمونه‌های بیوپسی و جراحی کبد در دسترس است، تشخیص داده می شوند. تشخیص بقیه بیماران HBV-HCC از تصویربرداری و معاینات سرولوژیکی از جمله سونوگرافی، اسکن توموگرافی کامپیوتری، آنژیوگرافی کبدی و سطوح سرمی AFP در بیماران مبتلا به عفونت HBV، در غیاب هر گونه بیماری کبدی الکلی یا سایر عفونت‌های ویروسی ثابت خواهد شد. گروه داوطلبان سالم شامل افراد همسان ساز از نظر سن و جنس با توجه به شرایط ورود و عدم داشتن شرایط خروج با بیوشیمی طبیعی کبد، بدون هپاتیت ویروسی، و بدون سابقه بیماری کبد یا سایر بیماری های بدخیم خواهد بود که توسط معاینه فیزیکی تایید می شوند.

برای بررسی میزان بیان ژن بیومارکر ITGBL1 در سرم از تکنیک qRT-PCR استفاده خواهد شد .

استخراج RNA در مرکز تحقیقات بیماری های عفونی و گرمسیری دانشگاه علوم پزشکی زاهدان انجام شده است. در این پایان نامه تعیین و مقایسه میزان بیان کمی ITGBL1 در گروه ها با استفاده از RNA استخراج شده که در دمای 80 – درجه سانتیگراد و در مرکز تحقیقات بیماری های عفونی و گرمسیری نگهداری می شود انجام خواهد شد.

در این طرح 5 میلی لیتر نمونه خون از هر فرد گرفته شد. نمونه خون محیطی در لوله حاوی EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid ) به عنوان ماده ضد انعقاد از افراد تهیه و در مرکز تحقیقات بیماری های عفونی و در دمای 80 – درجه سانتیگراد تا زمانیکه استخراج  RNA بر روی نمونه های خون انجام شود فریز گردید. استخراج RNA تام  ژنومی با استفاده از کیت استخراج RNA  انجام شد. با استفاده ازدستگاه اسپکتروفوتومتر نسبت جذب نوری در طول موج260 نانومتر (طول موجی که DNA و یا RNA حداکثر جذب را دارد) به 280 نانومتر (طول موجی که در آن پروتئین حداکثر جذب را دارد) اندازه گرفته و نمونه هایی که بهترین خلوص را داشتند(2>280/260 OD >1.8 )در 80- درجه سانتیگراد جهت استفاده در فرایند  qRT-PCR فریز شد . پرایمرهای اختصاصی برای بررسی بیان ژنی به روش  qRT-PCR  طراحی خواهند شد. برای تعیین میزان بیان  RNA بیومارکر  از روش QRT-PCR (Quantification Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) یا واکنش زنجیره ای پلیمراز ترانس کریپتاز معکوس کمی استفاده خواهد شد. در این روش پس از طراحی و تهیه  پرایمرها و پروب های مناسب جهت تکثیر RNA و تولید CDNA مناسب و تکثیر آن برای بیومارکر، واکنش پلیمریزاسیون با استفاده از مواد اولیه خریداری شده از شرکت های معتبر و با استفاده از دستگاه Real Time انجام خواهد شد.

برای تعیین وجود یا عدم وجود تفاوت معنی دار در میانگین دو گروه مستقل از آزمون t مستقل استفاده خواهیم کرد(Independent student t test) . برای اثبات تبعیت داده ها از توزیع نرمال ابتدا آزمون کولموگروف- اسمیرونوف (one sample Kolmogorov–Smirnov test) انجام خواهد پذیرفت. برای مقایسه داده های آماری از آزمون های ناپارامتریک من ویتنی، کروسکال والیس، آنالیز واریانس یک طرفه، کای اسکوئر و آزمون دقیق فیشر استفاده شد.

در نهایت نتایج به صورت Mean ± SD گزارش می شود. برای آنالیز تمام داده ها و انجام تست های آماری از نرم افزار SPSS ویرایش 20 بهره خواهیم برد. هنگامیکه 05/0P-value <   شود تفاوت ها معنی دار فرض خواهند شد.

کدهای 1،2،3،4،5،10،13،18،28،30 مصوب کمیته کشوری اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی که در دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش‌های دارای آزمودنی انسانی در جمهوری اسلامی ایران، دربردارنده‌ی اصول و مقررات اخلاقی‎ مطرح  و در سال 1392 در 31 بند تصویب شده است در این طرح رعایت می شود. تمامی بیماران تحت مطالعه آگاهانه و برای مقاصد علمی  اقدام به دادن نمونه خواهند کرد. شرکت در این طرح هیچ گونه هزینه ای برای بیماران ندارد و نام و مشخصات بیماران گزارش نخواهد شد.

همچنین کدهای 1و2و3و4و5و6و7و8و9 مصوب کمیته کشوری اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی که در دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی مربوط به بخش عمومی تصویب شده است در این طرح رعایت می گردد.

همچنین کدهای 1و5و6و13 مصوب کمیته کشوری اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی که در دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش‌های ژنتیک پزشکی تصویب شده است در این طرح رعایت می گردد.

مشکلات مربوط به تهیه مواد اولیه و تجهیزات آزمایشگاهی مورد نیاز و بودجه مورد نیاز طرح عمده ترین محدودیت های اجرای طرح به نظر می رسد زیرا بسیاری از مواد مورد نیاز باید از منابع خارج از کشور تهیه شوند و در این ارتباط بحث تحریم های اقتصادی خودنمایی می کند. برای مدیریت این محدودیت و همچنین منابع مالی، بسیاری از محلول ها بصورت دستی تهیه خواهد شد.

Hepatocellular carcinoma(HCC), Hepatitis B virus (HBV), Integrin beta‐like 1(ITGBL1)

هپاتوسلولار کارسینوما-هپاتیت بی-اینتگرین بتا1

1.         Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2018;68(6):394-424.

2.         Llovet JM, Kelley RK, Villanueva A, Singal AG, Pikarsky E, Roayaie S, et al. Hepatocellular carcinoma. Nat Rev Dis Primers. 2021;7(1):6.

3.         Pourhoseingholi MA, Fazeli Z, Zali MR, Alavian SM. Burden of hepatocellular carcinoma in Iran; Bayesian projection and trend analysis. Asian Pac J Cancer Prev. 2010;11(4):859-62.

4.         Fattahi N, Rezaei N, Asadi-Lari M, Yousefi M, Madadi Z, Gohari K, et al. Hepatocellular carcinoma incidence at national and provincial levels in Iran from 2000 to 2016: A meta-regression analysis. PLoS One. 2021;16(1):e0245468.

5.         Villanueva A, Hoshida Y, Battiston C, Tovar V, Sia D, Alsinet C, et al. Combining clinical, pathology, and gene expression data to predict recurrence of hepatocellular carcinoma. Gastroenterology. 2011;140(5):1501-12.e2.

6.         Chidambaranathan-Reghupaty S, Fisher PB, Sarkar D. Hepatocellular carcinoma (HCC): Epidemiology, etiology and molecular classification. Adv Cancer Res. 2021;149:1-61.

7.         Schuppan D, Afdhal NH. Liver cirrhosis. Lancet. 2008;371(9615):838-51.

8.         Kulik L, El-Serag HB. Epidemiology and Management of Hepatocellular Carcinoma. Gastroenterology. 2019;156(2):477-91.e1.

9.         McGlynn KA, Petrick JL, El-Serag HB. Epidemiology of Hepatocellular Carcinoma. Hepatology. 2021;73 Suppl 1(Suppl 1):4-13.

10.       Ye F, Huang W, Xue Y, Tang E, Wang M, Shi F, et al. Serum Levels of ITGBL1 as an Early Diagnostic Biomarker for Hepatocellular Carcinoma with Hepatitis B Virus Infection. J Hepatocell Carcinoma. 2021;8:285-300.

11.       Heimbach JK, Kulik LM, Finn RS, Sirlin CB, Abecassis MM, Roberts LR, et al. AASLD guidelines for the treatment of hepatocellular carcinoma. Hepatology. 2018;67(1):358-80.

12.       Simmons O, Fetzer DT, Yokoo T, Marrero JA, Yopp A, Kono Y, et al. Predictors of adequate ultrasound quality for hepatocellular carcinoma surveillance in patients with cirrhosis. Aliment Pharmacol Ther. 2017;45(1):169-77.

13.       Singal AG, Conjeevaram HS, Volk ML, Fu S, Fontana RJ, Askari F, et al. Effectiveness of hepatocellular carcinoma surveillance in patients with cirrhosis. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2012;21(5):793-9.

14.       Kim MN, Kim BK, Kim SU, Park JY, Ahn SH, Han KH, et al. Longitudinal assessment of alpha-fetoprotein for early detection of hepatocellular carcinoma in patients with cirrhosis. Scand J Gastroenterol. 2019;54(10):1283-90.

15.       Quaglia A. Hepatocellular carcinoma: a review of diagnostic challenges for the pathologist. J Hepatocell Carcinoma. 2018;5:99-108.

16.       Wang M, Gong Q, Zhang J, Chen L, Zhang Z, Lu L, et al. Characterization of gene expression profiles in HBV-related liver fibrosis patients and identification of ITGBL1 as a key regulator of fibrogenesis. Scientific Reports. 2017;7(1):43446.

17.       Berg RW, Leung E, Gough S, Morris C, Yao WP, Wang SX, et al. Cloning and characterization of a novel beta integrin-related cDNA coding for the protein TIED ('ten beta integrin EGF-like repeat domains') that maps to chromosome band 13q33: A divergent stand-alone integrin stalk structure. Genomics. 1999;56(2):169-78.

18.       Huang W, Yu D, Wang M, Han Y, Lin J, Wei D, et al. ITGBL1 promotes cell migration and invasion through stimulating the TGF-β signalling pathway in hepatocellular carcinoma. Cell Prolif. 2020;53(7):e12836.

19.       Ji Q, Zhou L, Sui H, Yang L, Wu X, Song Q, et al. Primary tumors release ITGBL1-rich extracellular vesicles to promote distal metastatic tumor growth through fibroblast-niche formation. Nat Commun. 2020;11(1):1211.

ضمیمه1

فرم اطلاعاتی طرح پژوهشی

بررسی بیان بیومارکر اینتگرین بتا 1 (ITGBL1) در سطح mRNA در سرم افراد مبتلا به سرطان کبد ناشی از هپاتیت B و مقایسه آن با گروه های هپاتیت B، سرطان کبد و افراد سالم

اطلاعات زمینه ای:

نام ونام خانوادگی: 

گروه شاهد                     شماره .......                         گروه مورد              شماره ..........

سن(سال)  :            

جنس:       مرد                   زن

علائم بالینی بیمار:

Immunology test:

HBs Antigene (quality)                     Negative                positive        

HBV DNA                                       Negative                positive              

HBs Antibody(mIU/ml)………………………………….

Anti HCV                                         Negative                positive       

Anti HDV                                         Negative                positive                      

HIV                                                  Negative                positive                       

AST

ALT

ضمیمه2

ویژگی های بالینی جمعیت مورد مطالعه

میزان بیان بیومارکر  ITGBL1 به روش QRT-PCR

بررسی بیان بیومارکر اینتگرین بتا 1 (ITGBL1) در سطح mRNA در بافت کبد افراد مبتلا به سرطان کبد ناشی از هپاتیت B و مقایسه آن با گروه های هپاتیت B، سرطان کبد و افراد سالم:

در این مطالعه  بیان  ژن ITGBL1  در بافت افراد مبتلا به HCC  ناشی از  HBV  و مقایسه آن با افراد سالم ، افراد مبتلا به  HCCو افراد مبتلا به  HBV  مورد بررسی قرار خواهد گرفت.

ندارد.

ITGBL1 بافت ممکن است یک بیومارکر جدید و امیدوارکننده برای تشخیص زودهنگام و پیشرفت HCC  مرتبط با HBV ا (HBV-HCC) در افراد در معرض خطر -بیماران مبتلا به عفونت مزمن HBV ا (CHB) باشد.

ندارد. با توجه به اینکه نمونه های مورد استفاده در این طرح از آرشیو بخش بافت شناسی دانشگاه علوم پزشکی زاهدان مربوط به طرح کد 7262 (دارای کد اخلاق) استخراج خواهد شد عوارض جانبی بیماران را تهدید نخواهد کرد.

ندارد.

هزینه‌های وسایل و مواد (QuantiFast SYBR® Green RT-PCR Kit/ سنتز پرایمر) /هزینه های متفرقه (هزینه تایپ و تکثیر طرح  و گزارش نهائی)به عهده مجری و دانشجو می باشد.

ندارد.

 اطلاعات شخصی آزمودنی‌های طرح محرمانه ‌بوده و انتشار نتایج به‌صورت آماری و به‌نحوی که اطلاعات فردی فاش نشود خواهد بود.

 جهت ارتباط با پژوهشگر: زهرا صائبی نسب : 09031318840

شروع و تداوم شرکت آزمودنی در پژوهش  آزادانه می باشد. از همین رو، هیچ‌‌یک از اعضای تیم پژوهش  آزمودنی‌ها را برای ادامه‌ی مشارکت در مطالعه مورد اجبار، تطمیع، اغوا، تهدید و/ یا تحت محذوریت قرار نخواهند داد. مشارکت افراد در طرح داوطلبانه بوده و آزمودنی‌ها در هر مرحله از کارآزمایی این حق را دارند که از مطالعه خارج شوند بدون این‌که لازم باشد جریمه یا خسارتی را پرداخت کنند یا درمان معمول ایشان تحت تأثیر قرار گیرد. این موضوع در فرایند اخذ رضایت آگاهانه به فرد آزموده اطلاع داده شده است.

رضایت آگاهانه و کتبی از هر بیمار (به صورت آگاهانه و بدون اجبار رضایت در شرکت در مطالعه دارم.) برای استفاده از نمونه های بافت آزمایش خون و سوابق بالینی آنها اخذ شده است.