سنتز، مشخصه یابی و بررسی اثرات بیولوژیک چارچوب های آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین با استفاده از مدلهای درون تنی و برون تنی

سرطان رشد بی­رویه سلول­ها در بدن است و به عنوان یکی از عوامل اصلی مرگ و میر در سطح جهان به شمار می­رود. چندین عامل شیمی­ درمانی سیتوتوکسیک از جمله متوترکسات، 5-فلوراوراسیل، سیس­پلاتین، تاموکسیفن، دوکسوروبیسین و غیره­ وجود­ دارد­ که برای درمان سرطان استفاده می­شود. تا حدی به دلیل کاستی‌های این درمان‌ها، سرطان همچنان یک بیماری بزرگ برای بشریت باقی مانده است. این کاستی­ها شامل ویژگی هدف­گیری پایین (دارو­­رسانی غیرهدفمند)­، عوارض جانبی شدید (به دلیل دوزهای بالا) و فارماکوکینتیک ضعیف است. برای جلوگیری از این اشکالات، اخیراً سیستم‌های تحویل داروی ضد سرطان با استفاده از نانوحامل‌ها از جمله لیپوزوم‌ها، میسل‌ها، کپسول‌های پلی الکترولیت و غیره توسعه یافته‌اند(1). یکی از کلاس‌های اخیر نانوذراتی که برای استفاده در شیمی‌درمانی مورد بررسی قرار گرفته است، چارچوب‌های آلی-فلزی یا­MOFها­[1] هستند که پلیمرهای ترکیبی هستند که از یون‌ها یا خوشه‌های فلزی و لیگاندهای آلی تشکیل شده‌اند.

مطالعات مختلف، سیستم­های متفاوتی نظیر لیپوزوم­ها، میسل­ها و یا ذرات جامد کوچک از جمله MOFها را مورد ارزیابی و بررسی قرار داده­اند. ­MOFها اخیراً در کاربردهای زیست‌پزشکی مانند ذخیره‌سازی دارو و تحویل دارو به دلیل سطح وسیع، حجم منافذ بالا و ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی قابل تنظیم استفاده شده‌اند(2, 3). MOFها دسته­ای از پلیمرهای متخلخل کئوردینانسیونی (PCPs)[2] می­باشند که در سال­های اخیر به شدت مورد توجه قرار گرفته­اند­(4). انواع مختلفی از MOFها براساس ایجاد ارتباط بین یون­ها و یا اجزای غیرآلی و مواد آلی نظیر فنول­ها، کربوکسیلات­ها و فسفات­ها شکل گرفته­اند­(5). کاربرد MOFها در انتقال دارو[3] مدتی است توجهات را به خود جلب کرده است. کاهش ابعاد و اندازه MOFها به حد نانو سبب ایجاد نانوپارتیکل­هایی شده است که به منظور انتقال مواد در شیمی­درمانی و یا تصویربرداری­ها(6) مورد استفاده قرار می­گیرد­(1, 7, 8).

داربست­های آلی فلزی (MOFs)دسته ای از مواد کریستالی متخلخل می­باشند که از دو جز اصلی شامل یک یون فلزی و یک لیگاند آلی اتصال­دهنده تشکیل شده­اند. ویژگی بارز این ترکیبات داشتن چگالی کم، سطح ویژه بسیار بالا و حفرات منظم در ابعاد مزو و میکرو می­باشد­. همچنین وجود گروه­های عاملی و کئوردینه شدن آن­ها با فلز منجر به انعطاف­پذیری و دینامیک بودن ساختار همراه با قابلیت تنظیم منافذ و تخلخل نسبت به سایر مواد متخلخل نظیر کربن فعال، زیولیت­ها و سیلیکات­ها می­شود. از آنجایی­که MOFs در حالت خالص به عنوان جاذب به تنهایی صرفه اقتصادی ندارند از طرفی در حالت پودر مقاومت مکانیکی کمتری داشته و نسبت به رطوبت حساسند. تلاش­هایی برای ترکیب آن­ها با سایر مواد متخلخل و تشکیل کامپوزیت­های مختلف صورت گرفته است. همینطور، MOF ها دارای ساختار انعطاف ­پذیر و مساحت سطح بالای آن­ها نسبت به سایر مواد متخلخل مانند زیولیت­ها، سیلیکا و کربن فعال، علاقه­ی بسیاری از محققان را به خود معطوف کرده ­اند به طوری که این مواد تحت عنوان موادی برای قرن 21 معرفی شده­اند. در حقیقت می­توان این مواد را پلی بین شیمی آلی و شیمی معدنی دانست که انعطاف ­پذیری خود را مدیون لیگاند آلی و ساختار منظم و کریستالی آن­ها ناشی از حضور یون­های فلزی می­باشد.

نسبت به سایر مواد متخلخل، MOF­ها مزیت­های منحصر بفردی دارند از قبیل: سطح زیاد که برای انتقال میزان بیشتری از مواد مناسب­تر هستند و همچنین ایجاد تغییرات دلخواه در ویژگی­های فیزیکی و شیمیایی اجزای MOFها نظیر قابلیت تولید فلوروسنت و قابلیت اضافه کردن لیگاند به MOFها از مزیت کاربرد آن­ها  محسوب می­شود(9). پلیمرهای کوئوردیناسیونی متخلخل یا­MOF ها در محدوده اندازه حفره مزومتخلخل و میکرومتخلخل قرار می­گیرند (ترکیبات مزومتخلخل دارای قطری بین 2 تا 50 نانومتر و ترکیبات میکرومتخلخل قطری کمتر از 2 نانومتر دارند). ساختار و خواص­­MOF ها وابسته به دو فاکتور مواد اولیه و فرایند سنتز می­باشند. در مورد مواد اولیه دو عامل یون فلزی و یا کلاسترهای فلزی از یک طرف و اتصال دهنده­های آلی از طرف دیگر، که واحدهای سازندة ثانویه نامیده می شوند (SBU) مورد توجه می­باشند.

Erucar و همکاران در سال 2017 با مطالعه بر MOF-74 نشان دادند که این ترکیب می­تواند حامل موثرتری برای انتقال 2 داروی ضد سرطان متوترکسات[4] یا MTX و 5-فلورواوراسیل[5] یا  5-FUباشد(2).

Lei و همکاران در سال 2018 با مطالعه بر روی MOF-M (M­ =­ Fe, Al or Zr) در بهبود اثرگزاری داروهای ضد سرطانی نشان دادند که با ترکیب کورکومین (CCM) در MOF-Zr (DTBA)، نانوذرات CCM@MOF-Zr (DTBA)  به دست می­آید که رفتار آزادسازی سریع‌تری را در شرایط آزمایشگاهی نشان می­دهد و مرگ سلولی را در مقایسه با CCM آزاد افزایش می­دهد(3).

Gong و همکاران در سال 2020 نشان دادند سیستم دارورسانی تحریک‌شده با گلوتاتیون (DDS) مبتنی بر چارچوب‌های فلزی-آلی نانومقیاس[6] ­(NMOFs)، برای یک داروی ضد­ سرطان دارای یک آزادسازی درون­سلولی واکنش‌دهنده به اکسیداسیون-احیا است. بدین ترتیب در مقایسه با سلول‌های طبیعی، DDS­ مبتنی بر NMOFدارای سمیت سلولی 3 برابر بالاتری برای سلول‌های سرطانی است که پتانسیل بزرگ آن را برای درمان انتخابی سرطان نشان می‌دهد(10).

mTOR و مسیرهای سیگنالینگ:

مسیر سیگنالینگ mTOR[7] با ترکیب سیگنال­های داخل و خارج سلول بعنوان یک تنظیم­کننده مهم در فرآیندهایی نظیر متابولیسم، رشد و تکثیر نقش ایفا می­کند(11). ­مطالعات مختلف نشان می­دهد مسیر سیگنالینگ mTOR در فرآیندهای سلولی مختلف نظیر تشکیل تومور، آنژیوژنز و یا مقاومت به انسولین فعال می­شود­(12). از طرف دیگر تحقیقات از کاهش شدید فعالیت اجزای این مسیر در سرطان­ها و بیماری­های مختلف نظیر دیابت نوع­2 حکایت می­کند­(13). این مشاهدات توجه مجامع علمی به مسیر سیگنالینگ mTOR را سبب شده است. mTOR یک پروتئین سرین- ترئونین کیناز محافظت شده با وزن مولکولی 289­kD، یکی از اعضای خانواده کینازهای مرتبط به PI3K[8] می­باشد که رشد، تکثیر و متابولیسم سلول را تنظیم می­نماید. همانطور که در شکل1 نشان داده شده است، mTOR از دو کمپلکس پروتئینی mTORC1[9] و mTORC2[10] تشکیل شده است و دارای دمین­های عملکردی مشخص به نام 12 تکرار HEAT­[11] ­در پایانه آمینی، دمین­­FAT­[12]­، FRB[13]، دمین سرین ترئونین پروتئین کینازی و دمین­FATC­[14] می­باشد(14, 15). کمپلکس­mTORC1 از پنج جزء تشکیل شده است شامل: mTOR که جزء کاتالیتیک این کمپلکس می باشد، Raptor[15]، MLST8[16]، PRAS40­[17] و Deptor[18]. هنوز نقش دقیق پروتئین­های این کمپلکس به خوبی مشخص نشده است ولی احتمال می­رود  Raptor با تنظیم فرآیندهای مربوطه نقش مهمی در فعالیت این کمپلکس ایفا کند­(16, 17). کمپلکس mTORC2 از شش جزء تشکیل شده است سه تای آن­ها یعنی mTOR، MLST8 و Deptor با کملکس قبلی مشابه می­باشند و سه عضو دیگر یعنی Rictor[19]، mSIN1­[20] و Protor-1­[21] مختص این کمپلکس هستند­(18). mTORC1 سبب تنظیم رشد سلولی و متابولیسم می­شود، در حالیکه mTORC2 بطور کلی تکثیر و زنده­مانی سلول را کنترل می­نماید. mTOR در مسیرهای سیگنالینگ متعددی از جمله PI3K/AKT، TSC1[22]/TSC2/Rheb، LKBL/AMPK[23]، VAM6/Rag GTPases و تعدادی مسیر دیگر دارای نقش می­باشد­(20). mTOR در این مسیرها با درگیر کردن مسیرهای سیگنالینگ مختلف بر نسخه­برداری از DNA و سنتز پروتئین اثر می­گذارد و در نهایت بر فرآیندهایی نظیر مرگ سلولی[24]، رشد و اتوفاژی سلول­ها اثر می­گذارد­ (21, 22). این مسیر با تغییرات محیط سلول مانند سطح انرژی، فاکتورهای رشد و شرایط استرس­زا، همچنین افزایش سطح سایتوکاین­هایی که باعث پیشرفت سرطان می­شوند در محیط سلول، تعدیل می­شود. افزایش فعالیت این پروتئین­کیناز در انواع سرطان­های انسانی، به ویژه در سلول­های سرطانی شبه­بنیادی مشاهده شده است(23).­ علاوه بر آن ارتباط این مسیر با سرطان­های بدخیم سیستم عصبی مرکزی یا  CNSشامل گلیوبلاستوما، مدولابلاستوما و توبروز اسکلروزیس نیز مورد بررسی قرار گرفته است(24-26).­ مطالعات اخیر ارتباط میان جهش­های ژنی و مسیرهای سلولی مختلف در سرطان­های CNS را با مسیر mTOR مورد توجه قرار داده­اند(27).  مطالعات مختلف نقش mTOR را در تومورزایی و تکامل آن اثبات کرده­اند که فرضیه فعال­سازی مسیر سیگنالینگ mTOR/AKT در تومورها را تقویت می­نماید. از این­رو مهارکننده­های mTOR به­ طور وسیع در درمان تومورها، پیوند اعضا، آرتریت روماتوئید و سایر بیماری­ها مورد تحقیق و بررسی قرار گرفته اند­(28, 29). در حالت کلی mTOR رشد و تکثیر سلولی را تنظیم می­کند. در حالی­که در سلول­های توموری mTOR فعال شده و سیگنال­های مرتبط با رشد و متاستاز را صادر می­نماید­(30). جهش­های ژنتیکی در برخی از ژن­های مرتبط با mTOR نظیر PTEN، MMP-9 و PI3K سبب فعال­شدن مسیرهایی نظیر PI3K/Akt/mTOR و یا PTEN/Akt/mTOR و فعال­شدن تومورها می­گردد­(31). نقش محرک­های مسیر mTOR در سلول­های نرمال عصبی در جدول شماره 1­آورده شده است.

جدول1 نقش محرک­های مسیر mTOR در سلول­های نرمال عصبی

در مسیر پیام­رسانی مولکولی mTOR به واسطه مهارکننده­های­mTORC1/2  مثل راپامایسین، رشد سلول­های سرطانی از طریق مسیر مذکور و به واسطه مداخله در چرخه سلولی، تکثیر، مهاجرت، رگ­زایی، پیشرفت سیکل سلولی و نهایتاً بقای سلول­ها کنترل می­شود(22, 36, 37).

سیلیمارین و اثرات ضد سرطانی آن :

سیلیمارین یک ترکیب فلاونوئیدی است که از گیاه خارمریم (Silybum marianum) استخراج می­شـود و ایـن گیاه، یکساله یا دوسـاله از خانواده کاسنی است که در اروپا و برخـی منـاطق آمریکا رشد می­کند(38). سیلیبینین بخـش عمـده سیلیمارین یعنـی حـدود 50% تا 70% آن را تشکیل می­دهد­(39). سیلیمارین به هورمون­هـای استروئیدی بسیار شبیه است و این هورمـون­هـا از طریق افزایش تولید پروتئین بر میزان بیـان ژن­هـا مؤثرنــد(38). سیلیمارین تام شامل ایزومرهای شیمیایی از دسته فلاونولیگنان­ها است که مهم­ترین آن­ها شامل هفت ترکیب سیلیبینین، ایزوسیلیبین، دهیدروسیلیبینین، سیلی­دیانین، سیلی­کریستین، تاکسوفولین و کوئرستین می­باشند. در میان این ایزومرها، سیلیبینین (یا سیلیبین) بیشترین، مهم­ترین و فعال­ترین جزء فراورده بوده که حدود 60 تا 70 درصد آن را تشکیل می­دهد که خود شامل دو فلاونولیگنان دیاسترئوایزومریک به نسبت 1:1 می­باشد : سیلیبینA (2R, 3R, 10R, 11R) و سیلیبینB (2R, 3R, 10S, 11S)

اثــر ضدســرطانی ســیلیمارین روی ســلول­هــای ســرطانی پوســت، کولون، تخمــدان و دستگاه عصبی مطالعه شده است­(40). سیلیمارین از لیپوپروکسیداســیون و آســیب غشــای ســلولی جلـوگیری مـی­کنـد­(41). سیلمارین ماده مؤثر گیاه خار مریم پلـی­فنـول­فلانولیگنـان است که در سال­های اخیر بـه دلیـل خاصـیت آنتی­اکسیدانی و ضدسرطانی بسـیار مـورد توجـه قرار گرفته اسـت­(40).

سیلیبینین و مشتقات فلاونوئید آن در چندین مدل آزمایشگاهی اثر مهاری قابل توجهی در انواع مختلف تومورها از جمله پوست، پستان، ریه، روده بزرگ، مثانه، پروستات، کلیه و کبد نشان داده­اند. پتانسیل­های شیمی­درمانی این فلاونوئید با القای آپوپتوز، افزایش مهارکننده­های تومور و چرخه سلولی، مهار فاکتورهای رشد، تضعیف واسطه ­های تکثیر و داشتن خواص ضد­رگ­زایی افزایش می­یابد(42). علیرغم خواص آنتی ­اکسیدانی و ضدسرطانی سیلیمارین، دارای انحلال­پذیری پایینی در آب می­باشد و همین اثر، زیست در دسترسی آن را کاهش می­دهد. محققان برای افزایش اثر پذیری ترکیبات دارای انحلال پذیری پایین، از نانوحامل­ها استفاده می­کنند.­ امروزه پیشرفت­های قابل توجهی در زمینه درمان انواع بیماری­ها با بهره­گیری از تکنیک­های نوین در انتقال دارو صورت گرفته است. توجه به سامانه ­های داروسانی جدیدی که در درمان هدفمند و تخصصی بیماری­ها کارایی لازم را داشته باشد فزونی یافته و زمینه­ی بهره­گیری از حامل­های نوین از جمله جاذبه­های سطحی متخلخل را در تحویل هدفمند داروها فراهم کرده است. این حامل­ها در بهبود فراهمی زیستی، محلولیت، آزادسازی کنترل شده، آهسته و سریع داروها امروزه مورد توجه فراوانی واقع شده­اند. تعدادی از حامل­های نانو متخلخل رایج در داروسازی همانند MOFs و پلیمرهای کئوردینه شونده، کارایی بالایی در بارگیری و بهبود رهش دارو از خود نشان داده­اند. این ترکیبات به دلیل خواص منحصربه فرد خود از جمله تخلخل زیاد و منظم و حضور گروه­های آلی قابل تغییر در چهارچوب که تنظیم اندازه حفره­ها را ممکن می­سازند، افق امید بخشی در دارورسانی نشان دادند. با کنترل عوامل اثرگذار در میزان بارگیری ایده­آل دارو توسط جاذب متخلخل و انتخاب نوع جاذب، می­توان سامانه دارورسانی هدفمندی را به کار گرفت­(43).

اثرات بیولوژیکی مختلف فلاونوئیدهای سیلیمارین و مکانیسم­های مولکولی آن­ها

همانطور که در شکل3 نشان داده شده است افزایش یا کاهش فعالیت، بیان و تولید ماکرومولکول های مختلف از جمله : فاکتور نکروز تومور آلفا-1[25] یا TNF-α، اینترلوکین 1 و 6[26] یا IL 1/6، فاکتور تحریک کننده کلنی ماکروفاژ-گرانولوسیت[27] یا GM-CSF، اینترفرون گاما[28] یا IFN-γ، پروتئین کیناز فعال کننده میتوژن[29] یا MAPK، پروتئین های مشابه­bcl-2 [30] یا Bax، لنفوم سلولی نوع­B[31] یا Bcl-2، فاکتور رشد شبه انسولین[32] یا IGF، اکتین ماهیچه صاف نوع آلفا[33] یا α-SMA، فاکتور رشد تبدیل[34] یا TGF-β، پروتئین شوک حرارتی[35] یا HSP، گیرنده گاما فعال شده با تکثیر پراکسی زوم[36] یا PPAR-γ، فسفاتیدیل اینوزیتول 4 و 5-دی فسفات 3-کیناز[37] یا PI3K، پروتئین­کیناز­B[38] یا ­AKT، 3-هیدروکسی-3-متیل­گلوتاریل کوآنزیم­A[39] یا HMG-­CoA، ترانسپورتر گلوکز نوع4­[40] یا  GLUT4­در مجاورت سیلیمارین در معرض تغییر هستند(42).

• Wuttke و همکارانش در سال­2015  نشان دادند که سیستم MOF@lipid می‌تواند به طور موثر مولکول‌های رنگ را در داخل داربست متخلخل MOF ذخیره کند و لایه دوگانه لیپیدی از انتشار زودرس آن­ها جلوگیری می‌کرد. جذب موثر نانوذرات با سیستم MOF@lipid توسط سلول‌های سرطانی، این نانوحامل‌ها را برای تحویل دارو و اهداف تشخیصی برای درمان بیماری­ها امیدوارکننده نشان می­داد(44).
• Chen و همکاران در سال 2019 طی مطالعه­­ای نانوذرات چارچوب فلزی-آلی UiO-68 (NMOFs) را با داروی دوکسوروبیسین (آنالوگ­های رنگ فلورسنت) بارگیری ­کردند. نتایج­ آن­ها نشان می­داد که NMOF­های مربوطه توسط miRNA-21 یا miRNA-221 باز می شوند و منجر به سمیت سلولی انتخابی نسبت به سلول های سرطان سینه MCF-7 یا سلول های سرطان تخمدان OVCAR-3 می شود(45).
•  Chenو همکاران در سال 2017 طی مطالعه­ای از چارچوب‌های آلی-فلزی MIL-101(Fe) اصلاح‌شده با نانوذرات سلنیوم/روتنیم را برای ارائه RNAهای مداخله‌گر کوچک (siRNA) برای افزایش اثربخشی درمان با خاموش کردن ژن‌های مقاومت چند دارویی[1] (MDR) و تداخل با دینامیک میکروتوبول (MT) در رده سلولی MCF-7/T (Taxol-resistance) اصلاح کردند. نتایج­ مطالعات­شان نشان می­داد ­Se@MIL-101 و­ Ru@MIL-101 بارگذاری شده با siRNA­های خاموش­کننده ژن MDR از طریق هماهنگی سطحی می­توانند به طور قابل توجهی محافظت از siRNA­ها را در برابر تخریب نوکلئازها افزایش دهند، جذب سلولی siRNA و فرار siRNA را از آندوزوم­ها/ لیزوزوم برای خاموش کردن ژن­های MDR در MCF-7/T تقویت کنند(46).
• Gohulkumar و همکاران در سال 2014 طی مطالعات خود اثر ضد سرطانی سیلیبینین را در سلول های سرطان دهان[2] مورد بررسی قرار دادند و نشان دادند نانوذرات بارگذاری شده با سیلیبینین را می­توان به عنوان یک سیستم دارورسانی موثر برای ایجاد یک پاسخ شیمیایی پیشگیرانه بهتر برای درمان این سرطان استفاده کرد(47).
• Snima و همکاران در سال 2014 طی مطالعه­ای پلی نانوذرات سیلیمارین[3] را به منظور بهبود اثربخشی درمانی سیلیمارین در برابر سرطان پروستات[4] یا PC با تکنیک تبخیر حلال امولسیونی منفرد توسعه دادند. نانوذرات تهیه شده دارای راندمان کپسولاسیون 60­ درصد و بازده بارگذاری 13­درصد بودند.­ روش آپوپتوز مبتنی بر فلوسایتومتری القای مرگ ناشی از آپوپتوز در سلول‌های PC-3 توسط نانوذرات سیلیمارینPLGA­-­[5] را پیشنهاد کرد. به طور کلی، نانوذرات سیلیمارینPLGA- آماده شده به عنوان یک کاندید امیدوارکننده برای درمان سرطان پروستات ثابت شدند(48).

لازم به ذکر است مطالعه مشابهی بر روی بررسی اثرات بیولوژیک سیلیمارین محصور شده درون چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن انجام نشده است.

1. بارگیری سیلیمارین درون چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن باعث افزایش اثرپذیری دارو خواهد شد
2. سیلمارین به صورت کنترل شده و آهسته از چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن آزاد می شود
3. سیلیمارین محصور شده درون چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن سمیت سلولی بیشتری نسبت به فرم آزاد این دارو در سلول­های سرطانی در مقایسه با سلولهای نرمال ایجاد می­کند
4. نانوذره سنتز شده حاوی سیلیمارین باعث تغییر بیان نسبی mTOR و TP53 در سلولهای سرطانی می­شود
5. مورفولوژی سلولهای سرطانی و نرمال در اثر تیمار با چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین در مقایسه با سلولهای تیمار نشده تغییر خواهد کرد.
6. میزان نیتروژن اوره خون رت ها پس از تیمار با چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین در مقایسه با گروه کنترل تغییر خواهد کرد.
7. میزان کراتینین خون رت ها پس از تیمار با چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین در مقایسه با گروه کنترل تغییر خواهد کرد.
8. سطح سرمی مالون دی آلدئید در رت های تیمار با چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین در مقایسه با گروه کنترل تغییر خواهد کرد.
9. فعالیت آنزیم کبدی ALT در خون رت ها پس از تیمار با چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین در مقایسه با گروه کنترل تغییر خواهد کرد.
10. فعالیت آنزیم کبدی AST در خون رت ها پس از تیمار با چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین در مقایسه با گروه کنترل تغییر خواهد کرد.
11. فعالیت آنزیم کاتالاز در خون رت ها پس از تیمار با چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین در مقایسه با گروه کنترل تغییر خواهد کرد.
12. فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز در خون رت ها پس از تیمار با چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین در مقایسه با گروه کنترل تغییر خواهد کرد.
13. تیمار با چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین منجر به تغییرات هیستوپاتولوژیک در بافت کلیه رت در مقایسه با رتهای تیمار نشده میشود.
14. تیمار رت ها با چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین منجر به تغییرات هیستوپاتولوژیک در بافت قلب رت در مقایسه با رتهای تیمار نشده میشود.
15. تیمار رت ها با چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین منجر به تغییرات هیستوپاتولوژیک در بافت کبد رت در مقایسه با رتهای تیمار نشده میشود.
16. تیمار رت ها با چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین منجر به تغییرات هیستوپاتولوژیک در بافت پانکراس در مقایسه با رتهای تیمار نشده میشود.
17. تیمار رت ها با چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین منجر به تغییرات هیستوپاتولوژیک در بافت مغز رت در مقایسه با رتهای تیمار نشده میشود.
18. ترکیب چارچوب های آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین، در محدوده غلظتی 100-.39 میکروگرم بر میلی لیتر بر مهار رشد باکتری استاندارد اشریشیاکلی موثر است.
19. ترکیب چارچوب های آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین، در محدوده غلظتی 100-.39 میکروگرم بر میلی لیتر بر مهار رشد باکتری استاندارد استافیلوکوکوس اورئوس موثر است.
20. ترکیب چارچوب های آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین، در محدوده غلظتی 100-.39 میکروگرم بر میلی لیتر اثر کشندگی بر رشد باکتری استاندارد اشریشیاکلی دارد.
21. ترکیب چارچوب های آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین، در محدوده غلظتی 100-.39 میکروگرم بر میلی لیتر اثر کشندگی بر رشد باکتری استاندارد استافیلوکوکوس اورئوس دارد.

سنتز، مشخصه یابی و تعیین اثرات بیولوژیک چارچوب های آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین با استفاده از مدلهای درون تنی و برون تنی

1. سنتز و تعیین سایز چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن و بارگیری آن با سیلیمارین

2. تعیین میزان بارگیری سیلیمارین درون چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن

3. تعیین میزان رهایش سیلمارین به صورت کنترل شده و آهسته از چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن

4. تعیین میزان سمیت سیلیمارین محصور شده درون چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن در مقایسه با فرم آزاد این دارو در سلول­های سلولهای سرطانی و نرمال

5. بررسی بیان ژن mTOR و TP53 در اثر تیمار  سلولهای سرطانی با نانوذره سنتز شده حاوی سیلیمارین در مقایسه با سلولهای تیمار نشده.

6. بررسی تغییرات مورفولوژیک سلول­های سرطانی و نرمال در اثر تیمار با چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین در مقایسه با سلولهای تیمار نشده.

7. بررسی و تعیین میزان نیتروژن اوره خون رت ها پس از تیمار با چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین در مقایسه با گروه کنترل

8. بررسی و تعیین میزان کراتینین خون رت ها پس از تیمار با چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین در مقایسه با گروه کنترل.

9. بررسی و تعیین میزان سطح سرمی مالون دی آلدئید در رت های تیمار با چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین در مقایسه با گروه کنترل .

10. بررسی و تعیین میزان فعالیت آنزیم کبدی ALT در خون رت ها پس از تیمار با چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین در مقایسه با گروه کنترل.

11. بررسی و تعیین میزان فعالیت آنزیم کبدی AST در خون رت ها پس از تیمار با چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین در مقایسه با گروه کنترل.

12. بررسی و تعیین میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در خون رت ها پس از تیمار با چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین در مقایسه با گروه کنترل .

13. بررسی و تعیین میزان فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز در خون رت ها پس از تیمار با چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین در مقایسه با گروه کنترل .

14. بررسی تغییرات هیستوپاتولوژیک چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین در بافت کلیه رت در مقایسه با رتهای تیمار نشده.

15. بررسی تغییرات هیستوپاتولوژیک چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین در بافت قلب رت در مقایسه با رتهای تیمار نشده.

16. بررسی تغییرات هیستوپاتولوژیک چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین در بافت پانکراس رت در مقایسه با رتهای تیمار نشده.

17. بررسی تغییرات هیستوپاتولوژیک چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین در بافت کبد رت در مقایسه با رتهای تیمار نشده.

18. بررسی تغییرات هیستوپاتولوژیک چارچوب آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین در بافت مغز رت در مقایسه با رتهای تیمار نشده.

19. بررسی میزان حساسیت ضدمیکروبی به روش میکروبراث دیلوشن و تعیین مقدار MIC ترکیب چارچوب های آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین بر روی سویه استاندارد اشریشیاکلی

20. بررسی میزان حساسیت ضدمیکروبی به روش میکروبراث دیلوشن و تعیین مقدار MIC ترکیب چارچوب های آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین بر روی سویه استاندارد استافیلوکوکوس اورئوس

21. بررسی میزان حساسیت ضدمیکروبی به روش میکروبراث دیلوشن و تعیین مقدار MBC ترکیب چارچوب های آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین بر روی سویه استاندارد اشریشیاکلی

22. بررسی میزان حساسیت ضدمیکروبی به روش میکروبراث دیلوشن و تعیین مقدار MBC ترکیب چارچوب های آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین بر روی سویه استاندارد استافیلوکوکوس اورئوس

دانشگاه ها و مراکز تحقیقاتی

کمک به تشخیص و درمان سرطان به عنوان جایگزینی برای داروهای شیمی درمانی کلاسیک

سرطان: تکثیر بیش از حد و غیر طبیعی سلول ها

نانوحامل: شامل نانوحامل های دارویی کلوئیدی، چارچوب های آلی فلزی  (MOF)، لیپوزوم ، نیوزوم  میکروامولسیون، نقاط کوانتومی و فیتوزوم و...) و نانوذرات معناطیسی که به عنوان یکی از سیستم های تحویل دارو در سال های اخیر به شکل وسیعی مورد توجه محققان در حوزه های پزشکی و داروسازی قرار گرفته اند.

سیتوتوکسیسیتی: اثر سمیت سلولی

 تجربی- مداخله ای

لاین های سلولی سرطانی (Hela ، MCF-7، SH-SY5Y) و غیر سرطانی (HUVEC و فیبروبلاست پوستی انسان HDF)، 32 سر رت نر بالغ (خون و 5 نوع بافت حیوانی)، 2 سویه استاندارد باکتریایی.

برای آنالیز های برون تنی (in vitro) با توجه به اینکه بر روی سل لاین سرطانی انجام میشود، محاسبه حجم نمونه ضرورتی ندارد.
برای آنالیز های درون تنی (in vivo) تعداد 32 سر رت نر بالغ مورد نیاز است که تعداد کل رت و تعداد رت در هر گروه بر اساس متودولوژی مطالعات مشابه ذیل انتخاب شده است.

Mohammadyari A, Razavipour ST, Mohammadbeigi M, Negahdary M, Ajdary M. Explore in-vivo toxicity assessment of copper oxide nanoparticle in Wistar rats. J Biol Today's world. 2014;3:124-28.

Thakur M, Gupta H, Singh D, Mohanty IR, Maheswari U, Vanage G, Joshi DS. Histopathological and ultra structural effects of nanoparticles on rat testis following 90 days (Chronic study) of repeated oral administration. Journal of nanobiotechnology. 2014 Oct;12(1):1-3.
 

ندارد

مشاهده آزمایشگاهی

الف: سنتز چارچوب آلی فلزی نیکل، بارگیری سیلیمارین و تعیین سایز:

MOFهای دو فلزی Ni/Fe به شرح زیر تهیه شدند:

 به طور کلی، 0.9 میلی مول FeCl3·6H2O، 0.45 میلی مول Ni(NO3)2·6H2O، 1.35 میلی مول 2-آمینوترفتالیک اسید (NH2-BDC) و 0.9 گرم پلی وینیل پیرولیدون (PVP، K-30) در 30 میلی لیتر DMF حل شدند. پس از هم زدن کامل، محلول شفاف نهایی به اتوکلاو تفلونی منتقل شد و به مدت 12 ساعت در دمای 120 درجه سانتیگراد نگهداری شد.

رسوب به دست آمده شستشو و سانتریفیوژ شد و در دمای 60 درجه سانتیگراد یک شب تحت خلاء خشک شد (59). جهت بارگیری سیلیمارین، مقدار 200 میکروگرم بر میلی لیتر از سیلیمارین با 500 میکروگرم بر میلی لیتر از نانوذره در دمای 50 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت همزده شد و سپس 24 ساعت دیگر در شیکر انکوباتور با دور 200 دور بر دقیقه و 37 درجه سانتی گراد نگهداری شد. جهت بررسی میزان به دام اندازی درون نانوذرات از دستگاه اسپکتروفتومتر استفاده شد. اندازه MOF های حاوی سیلیمارین با دستگاه پراکندگی نور پویا (Dynamic light scattering) اندازه گیری میشود.

ب : بررسی آزادسازی سیلیمارین از نانوذره

برای مطالعه رفتار آزادسازی سیلیمارین، نانوذره (5 میلی‌گرم) در یک محلول بافر (1 میلی‌لیتر) با pH کنترل‌شده حل شد، که سپس به یک کیسه (MWCO) 12000 Daمنتقل شد که در محلول بافر مربوطه (100 میلی لیتر) با هم زدن مغناطیسی در دمای 37 درجه سانتیگراد غوطه ور شد. غلظت سیلیمارین در محیط رهاسازی توسط طیف سنج UV-vis در فواصل زمانی مشخص بررسی شد و در هر نقطه زمانی، محیط تازه اضافه شد (60).

 ج: کشت سلول

5 رده سلولی مورد مطالعه پس از کشت داده شدن در 4 گروه به صورت زیر تعریف می کنیم :

1. گروه کنترل که شامل سلولهای سرطانی یا نرمال  بوده و تحت تیمار با هیچ دارویی قرار نمی گیرد.
2. سلولهای سرطانی یا نرمال تیمار شونده با سیلیمارین آزاد  
3. سلولهای سرطانی یا نرمال تیمار شونده با MOF آهن-نیکل بارگیری نشده با سیلیمارین
4. سلولهای سرطانی یا نرمال تیمار شونده با MOF آهن-نیکل بارگیری شده با سیلیمارین

• بررسی سمیت سلولی:

سمیت سلولی نانوذره متخلخل به فرم آزاد، سیلیمارین آزاد و نانوفرموله بر روی رده­های سلولی مختلفسرطانی یا نرمال به روش MTT به شرح زیر مورد بررسی قرار خواهد گرفت:

- ابتدا 100 میکرولیتر از محلول حاوی سلول‌های مورد نظر با دانسیته مناسب به هر چاهک میکروپلیت 96 چاهکی می افزاییم.

- مقدار 100 میکرولیتر از محلول X2 نمونه مورد آزمایش به چاهک واکنش ارزیابی افزوده خواهد شد. ارزیابی در غلظت­های مختلف برای هر ترکیب بر اساس مطالعات مشابه (به تعداد حداقل 5 غلظت) انجام خواهد گرفت. چند دقیقه قبل از تیمار سلول‌ها، سوسپانسیون نانوذرات یا داروی سیلیمارین یا نانو دارو در محیط کشت، بواسطه‌ی هم زدن با سونیکاتور[5] به مدت ۵ دقیقه و با غلظت‌های مختلف تهیه می‌شود.

- میکروپلیت به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه خواهد شد.

- پس از سانتریفیژ میکروپلیت با دور g350 به مدت 10 دقیقه، 200 میکرولیتر از محلول هر چاهک برداشته و 200 میکرولیتر از محلولMTT (mg/ml 0.5 ) به آن اضافه خواهد شد.

- میکروپلیت به مدت 3 ساعت در دمایC37 انکوبه می شود.

- در این مرحله  میکرولیتر 200  از محلول هر چاهک برداشته و به ازای آن میکرولیتر 200  از حلال DMSO به هر چاهک افزوده خواهد شد.

- میکروپلیت به مدت نیم ساعت با سرعت 130 دور در دقیقه هم زده خواهد شد.

- در نهایت جذب هر چاهک در طول موج 492 nm نسبت به فیلتر مرجع 630 nm ثبت می شود. مراحل فوق سه بار تکرار شده و نتیجه نهایی به صورت IC50 گزارش خواهد شد.

-سنجش بیان نسبی ژن mTOR و p53

Real Time PCR تکنیک جمع آوری داده­های واکنش PCR همزمان با انجام آن بوده و تکثیر و تشخیص را در یک مرحله انجام می­دهد. این امر به ­وسیله­ ی انواع متنوعی از واکنش­های شیمیایی مرتبط با تشعشع فلورسنس انجام می_­­گیرد که غلظت محصول PCR را به شدت نور فلورسنس تولیدی مرتبط می­نماید (61).

-استخراج :RNA

RNA سلولی با استفاده از متد Acid Guanidinum Thiocyanate Phenol در زمانهای 3 و 6 و 12 و 24 و 48 ساعت پس از تیمار استخراج میگردد. به این منظور ابتدا سلول‌ها را از ظرف کشت جدا کرده و پس از چند بار شستشو با بافر نمکی فسفات (PBS) و انجام سانتریفیوژ، به 2-1 میلیون سلول یک میلی لیتر از محلول RNX (سیناکلون) اضافه شده و پس از مخلوط نمودن، به مدت 5 دقیقه در دمای محیط انکوبه میشود. سپس µl 200 کلروفرم به آن اضافه نموده و پس از مخلوط نمودن، به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه قرار داده می شود. سپس سانتریفیوژ به مدت 15 دقیقه در 12000 دور و دمای 4 درجه انجام خواهد شد (54). پس از این مرحله، یک محلول سه فازی تشکیل میشود که مایع رویی حاوی RNA می‌باشد. فاز رویی را به یک میکروتیوب RNase free منتقل نموده و هم حجم آن ایزوپروپانول اضافه شده و به مدت یک ساعت در دمای 20- درجه قرار میدهیم. سپس به مدت 15 دقیقه در دمایی 4 درجه با دور 1200دور  سانتریفیوژ میکنیم و پس از خارج نمودن محلول رویی، به رسوبRNA  یک میلی لیتر اتانول 75% اضافه میکنیم و مجددا ًبه مدت 8 دقیقه در دمایی 4 درجه با دور 7500 سانتریفیوژ میکنیم. پس از خارج نمودن اتانول، اجازه می‌دهیم تا رسوب خشک شود (کامل خشک نشود). سپس نمونه‌ها را در آب تیمار شده با دی اتیل پیروکربنات 01/0% ( مهارکننده RNAse) به میزان µl 50 حل می‌نماییم.  RNA تام استخراج شده تا زمان استفاده در دمای 80- نگهداری خواهد شد.

-سنتز cDNA:

برای بررسی میزان بیان ژن نیاز به الگویی از جنس DNA است تا توسط آنزیم تک DNA پلیمراز[6] قابل تکثیر باشد. برای این کار باید RNA تام به عنوان الگویی برای ساخت رشته مکمل­اش یعنی cDNA مورد استفاده قرار گیرد تا این cDNA[7] در مطالعات تغییر بیان ژن استفاده شود. برای سنتز cDNA از روی RNA، از Oligo dT و یا Random hexamer به عنوان پرایمرهایی استفاده می­شود که به الگوی RNAای متصل شده و امکان رونویسی از RNA را توسط آنزیم رونویسی کننده معکوس[8] در حضور dNTP‌ ها فراهم می­کنند. نمونه ­های cDNA طبق پروتکل کمپانی سازنده آنزیم رونویسی کننده معکوس تهیه شده (پارس طوس، ایران) سنتز شده و برای آزمایشات بعدی در °C20- نگهداری خواهند شد.

- بررسی میزان mRNA:

جهت انجام واکنش Real-Time PCRاز دستگاه Applied Biosystem Real-Time PCR و از Master Mix شرکت Amplicon استفاده خواهد شد. در این واکنش دو میکروتیوپ برای هر نمونه انتخاب نموده و اجزای واکنش را با هم مخلوط میکنیم؛ با این تفاوت که در یک میکروتیوپ پرایمرهای مربوط به ژن مورد مطالعه (mTOR) و در دیگری پرایمرهای اختصاصی Housekeeping gene (GAPDH) را اضافه می‌نمائیم. از cDNA سنتز شده به مقدار 2 میکرولیتر به هرکدام از میکروتیوپ‌ها اضافه می‌کنیم و به مدت 15 ثانیه محتویات را اسپین کرده و داخل دستگاه گذاشته و برنامه را اجرا می‌کنیم.

د) بررسی مورفولوژی سلولی

سلولها در پلیت 96 خانه چسبان ریخته شده و 24 ساعت اجازه داده می شود تا سلولها به کف پلیت متصل شوند. سپس سلولهای مشتق شده از بافت های سرطانی و غیر سرطانی با داربست های آلی فلزی بارگیری شده با سیلیمارین و سیلیمارین آزاد در محدوده غلظتی بهینه (مطابق با مقالات مشابه) تیمار شده و پس از 48 ساعت مورفولوژی سلولها توسط میکروسکوپ معکوس (invert) مورد ارزیابی قرار گرفته و تغییرات مورفولوژیک توسط یک دوربین دیجیتال ثبت خواهد شد.

ه) مطالعات درون تنی (In vivo)

تعداد 32 سر موش صحرایی نر بالغ (Sprague-Dawley) میانگین وزن 250 گرم از مرکز آزمایشگاه حیوانات دانشگاه علوم پزشکی زاهدان خریداری میشوند. موش ها در اتاق استاندارد در درجه حرارت 24 درجه سانتیگراد و چرخه های طبیعی روشنایی/تاریکی و در تهویه مناسب نگهداری می شوند. اتاق حیوانات دسترسی آزاد به آب لوله کشی و رژیم غذایی مناسب در طول آزمایش دارند. تجویز داروی خوراکی و هندلینگ حیوانات با رعایت  دستورالعمل مراقبت و استفاده از جوندگان آزمایشگاهی بر اساس گایدالین وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشکی انجام  میشود. برای تیمار با هر دارو، رت ها به طور تصادفی در گروه های 8 تایی به صورت کنترل (تیمار نشده)، تیمار شده با تک دوز دارو به فرم آزاد (با غلظت 50 میلی گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن رت)، تیمار شده با تک دوز دارو به فرم نانوفرموله (با غلظت 25 میلی گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن رت) و تیمار شده با تک دوز دارو به فرم نانوفرموله (با غلظت 50 میلی گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن رت) قرار میگیرند. سپس رت ها توسط کتامین (با دوز 100 میلی گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن) و زایلازین (با دوز 10 میلی گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن) بیهوش شده و داروی آزاد و نانوفرموله از طریق ورید دمی با استفاده از scalp vein به صورت تک دوز وارد جریان خون سیستمیک رتها می شود. با گذشت 24 ساعت از تیمار،بیهوشی عمیق توسط CO2 به رتها القاء شده و نمونه خون تام از قلی حیوان جمع آوری شده و سانتریفیوژ میشود تا سرم آن جدا شود. بلافاصله رت ها با گیوتین کشته شده و بافت های آنها به سرعت جدا سازی می شود و تا بررسی هیستوپاتولوژیک در فرمالین 10 درصد فیکس می شوند. اجساد رت ها توسط دستگاه لاشه سوز به خاکستر تبدیل خواهد شد.

- ارزیابی پارامترهای شیمیایی:

سطح سرمی BUN (نیتروژن اوره خون) و کراتینین با توجه به دستورالعمل کیت اندازه گیری میشود. تمام تجزیه  و تحلیل های بیوشیمیایی با استفاده از دستگاه اتوآنالیزور Vital Scientific ،Selectra Pro M انجام میشود. برای ارزیابی سطح سرمی آسپارتات آمینوترانسفراز (AST) و آلانین آمینوترانسفراز سطوح (ALT) از روش رنگ سنجی استفاده میشود. فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدان درون زا نظیر فعالیت کاتاالاز در سرم  اندازه گیری میشود. سوپراکسید دیسموتاز  نمونه های سرم نیز مورد ارزیابی قرار میگیرد.

- ارزیابی پراکسیداسیون لیپیدی:

بررسی سطح مالوندآلدئید MDA به روش Ohkawa و همکاران انجام میشود (62).

- ارزیابی هیستوپاتولوژیک :

بعد از تیمار رتها با نانوذرات، بیهوشی با پنتوباربیتول انجام شده و بعد از کشتن رتها، بافت مغز، کلیه و کبد و پانکراس و کبد برای ارزیابی های بافت شناسی استخراج و پردازش میشوند. فیکساسیون در بافر فرمالین به مدت دو روز انجام  میشود. در ادامه نمونه های پارافینی از بافت های ذکر شده تهیه و رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین و ارزیابی زیر میکروسکوپ نوری انجام میشود.

و) بررسی حساسیت ضد میکروبی

برای بررسی اثرات ضد میکروبی ترکیب فوق، از روش میکروبراث دیلوشن و سویه های استاندارد اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس اورئوس استفاده می شود. 

تهیه سوسپانسیون باکتری

از کشت تازه باکتری یک یا چند کلونی خالص در محیط کشت مولر هینتون براث کشت می دهیم و 24 ساعت در 37 درجه سانتی گراد انکوبه می کنیم.

سپس کدورت نیم مک فارلند از کشت تازه باکتری در محیط مولر هینتون براث تهیه می گردد( معادل CFU/ml 10⁸× 1.5  با OD= 0.08-0.1. و از این سوسپانسون با رقت سازی کدورت 10⁶×1.5 ساخته می شود.

تهیه غلظت های مورد نظر از ترکیب:

0.2 گرم از داروی آزاد یا نانوفرموله مورد آزمایش را در 2 میلی لیتر از مخلوط DMSO و محیط مولر هینتون براث ( 0.5 سیسی حلال  و 1.5 سی سی محیط) حل می کنیم و غلظت 100  mg/ml از نمونه بدست می آید. سپس رقت های سریالی (100-50-25-12.5- 6.25-3.125- 1.562- 0.781- 0.390 میکروگرم بر میلی لیتر) تهیه می کنیم.

100 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری در هر چاهک اضافه می شود، به طوری که غلظت نهایی تلقیح  CFU/ml 1.5 × 10⁵در هر چاهک است. سپس از هر غلظت ترکیب مورد نظر در حلال مناسب 100 میکرولیتر به چاهک اضلافه شد. پلیت ها به مدت 24 ساعت در 37 درجه سانتی گراد انکوبه می گردد.چاهک ها پس از این مدت از نظر رشد باکتری مورد بررسی قرار می گیرند و کمترین غلظتی از باکتری که هیچ باکتری در آن رشد نکند، به عنوان حداقل غلظت بازدارندگی در نظر گرفته می شود. برای تعیین مقدار MBC دو تا سه غلظت قبل و بعد MIC را روی محیط کشت جامد می بریم و غلظتی که هیچ رشدی در پلیت نداشته باشد به عنوان MBC، گزارش می شود. همچنین چاهک هایی حاوی ٢٠٠ میکرولیتر محیط براث به عنوان کنترل منفی و چاهک هایی حاوی محیط کشت و باکتری به عنوان کنترل مثبت در نظر گرفته شد. چاهک هایی نیز به عنوان شاهد کدورت، حاوی ١٠٠ میکرو لیتر محیط و ١٠٠ میکرو لیتر از هر رقت در نظر گرفته شد.

برای ارزیابی اختلاف میزان پارامترهای مورد بمطالعه در سلوله و بافت های تیمار شده در مقایسه با سلول یا بافت کنترل (تیمار نشده)، از تست ANOVA همراه با آزمون Tukey استفاده می­شود. نتایج به صورت Mean ± SEM گزارش می شود و p<0.05 معنی دار در نظر گرفته می شد.

کد های زیر از راهنمای ذکر شده در مطالعه حاضر رعایت خواهد شد.
راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی ایران (کدهای 1 و 2و 3و 8) 

راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش‌های علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی  در جمهوری اسلامی ایران (کدهای 1و 9 و 11 و 28 و 29و 30 و 31)

بر اساس گایدالین اخلاقی تمام ملاحظات اخالقی در نگهداری و کار با حیوانات آزمایشگاهی در تمام مراحل:

- نگهداری

- تیمار

- نمونه گیری رعایت میشود.

کد های زیر از راهنمای مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی در امور علمی در مطالعه حاضر رعایت خواهد شد

بخش دوم قسمت 4- 

بخش سوم-قسمت اول

همچنین کدهای بخش سوم از راهنمای اخلاقی تعیین شدّت مداخلات بر روی حیوانات آزمایشگاهی در مطالعه فعلی لحاظ می شوند

 مشکل تهیه مواد و امکان طولانی شدن زمان دریافت آنها

مشکل افزایش هزینه مواد که برای حل آن باید سفارشات در کوتاه ترین زمان داده شده و همینطور به جهت کاهش هزینه ها سعی گردد تا حد ممکن از کیت ها و مواد تولید ایران استفاده گردد.

نانوذره، نانوحامل،سیلیمارین، درون تن، برون تن

1.         Ibrahim M, Sabouni R, A Husseini G. Anti-cancer drug delivery using metal organic frameworks (MOFs). Current medicinal chemistry. 2017;24(2):193-214.

2.         Erucar I, Keskin S. Computational investigation of metal organic frameworks for storage and delivery of anticancer drugs. Journal of Materials Chemistry B. 2017;5(35):7342-51.

3.         Lei B, Wang M, Jiang Z, Qi W, Su R, He Z. Constructing redox-responsive metal–organic framework nanocarriers for anticancer drug delivery. ACS applied materials & interfaces. 2018;10(19):16698-706.

4.         Brierley AS, Fernandes PG, Brandon MA, Armstrong F, Millard NW, McPhail SD, et al. Antarctic krill under sea ice: elevated abundance in a narrow band just south of ice edge. Science. 2002;295(5561):1890-2.

5.         Gardner B, Venkataraman D, Moore J, Lee S. Nature1995, 374, 792.[Crossref],[CAS], Google Scholar (b) Yaghi, OM; Li, G.; Li, H. Nature. 1995;378:703.

6.         Chowdhuri AR, Bhattacharya D, Sahu SK. Magnetic nanoscale metal organic frameworks for potential targeted anticancer drug delivery, imaging and as an MRI contrast agent. Dalton Transactions. 2016;45(7):2963-73.

7.         Vickers NJ. Animal communication: when i’m calling you, will you answer too? Current biology. 2017;27(14):R713-R5.

8.         Kotzabasaki M, Froudakis GE. Review of computer simulations on anti-cancer drug delivery in MOFs. Inorganic Chemistry Frontiers. 2018;5(6):1255-72.

9.         Sun Y, Zheng L, Yang Y, Qian X, Fu T, Li X, et al. Metal–organic framework nanocarriers for drug delivery in biomedical applications. Nano-Micro Letters. 2020;12(1):1-29.

10.       Gong M, Yang J, Li Y, Gu J. Glutathione-responsive nanoscale MOFs for effective intracellular delivery of the anticancer drug 6-mercaptopurine. Chemical Communications. 2020;56(47):6448-51.

11.       Shahcheraghi SH, Tchokonte-Nana V, Lotfi M, Lotfi M, Ghorbani A, Sadeghnia HR. Wnt/beta-catenin and PI3K/Akt/mtor Signaling Pathways in Glioblastoma: Two main targets for drug design: A Review. Current Pharmaceutical Design. 2020;26(15):1729-41.

12.       Nussenzweig MC. 2, 3 1 Whitehead Institute for Biomedical Research. Cambridge, Massachusetts.2142:429-57.

13.       Bathina S, Das UN. Dysregulation of PI3K-Akt-mTOR pathway in brain of streptozotocin-induced type 2 diabetes mellitus in Wistar rats. Lipids in health and disease. 2018;17(1):1-11.

14.       Guertin DA, Sabatini DM. Defining the role of mTOR in cancer. Cancer cell. 2007;12(1):9-22.

15.       Okumura Y, Kohashi K, Tanaka Y, Kato M, Maehara Y, Ogawa Y, et al. Activation of the Akt/mammalian target of rapamycin pathway in combined hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma: significant correlation between p-4E-BP1 expression in cholangiocarcinoma component and prognosis. Virchows Archiv. 2020;476(6):881-90.

16.       Hara K, Maruki Y, Long X, Yoshino K-i, Oshiro N, Hidayat S, et al. Raptor, a binding partner of target of rapamycin (TOR), mediates TOR action. Cell. 2002;110(2):177-89.

17.       Kim D-H, Sarbassov DD, Ali SM, King JE, Latek RR, Erdjument-Bromage H, et al. mTOR interacts with raptor to form a nutrient-sensitive complex that signals to the cell growth machinery. Cell. 2002;110(2):163-75.

18.       Frias MA, Thoreen CC, Jaffe JD, Schroder W, Sculley T, Carr SA, et al. mSin1 is necessary for Akt/PKB phosphorylation, and its isoforms define three distinct mTORC2s. Current Biology. 2006;16(18):1865-70.

19.       Takei N, Nawa H. mTOR signaling and its roles in normal and abnormal brain development. Frontiers in molecular neuroscience. 2014;7:28.

20.       Dowling RJ, Topisirovic I, Fonseca BD, Sonenberg N. Dissecting the role of mTOR: lessons from mTOR inhibitors. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 2010;1804(3):433-9.

21.       Neufeld TP. TOR-dependent control of autophagy: biting the hand that feeds. Current opinion in cell biology. 2010;22(2):157-68.

22.       Alemi Serej F, Aliyari Serej H, Ebrahimi Kalan A, Mehdipour A, Aliyari Serej Z, Bravan B. The Role of Mammalian Target of Rapamycine Signaling Pathway in Central Nervous System Cancers: A Review. Journal of Inflammatory Diseases. 2021;24(5):472-85.

23.       Hirao A, Hoshii T. Mechanistic/mammalian target protein of rapamycin signaling in hematopoietic stem cells and leukemia. Cancer science. 2013;104(8):977-82.

24.       Russel D, Rubinstein L. Pathology of tumours of the nervous system. Edward Arnold, London 1977: 348–360. Google Scholar.

25.       Curatolo P, Verdecchia M, Bombardieri R. Tuberous sclerosis complex: a review of neurological aspects. European Journal of Paediatric Neurology. 2002;6(1):15-23.

26.       Frankel SA, German WJ. Glioblastoma multiforme: review of 219 cases with regard to natural history, pathology, diagnostic methods, and treatment. Journal of neurosurgery. 1958;15(5):489-503.

27.       Polivka Jr J, Janku F. Molecular targets for cancer therapy in the PI3K/AKT/mTOR pathway. Pharmacology & therapeutics. 2014;142(2):164-75.

28.       Mossmann D, Park S, Hall MN. mTOR signalling and cellular metabolism are mutual determinants in cancer. Nature Reviews Cancer. 2018;18(12):744-57.

29.       Guo B, Li D, Du L, Zhu X. piRNAs: biogenesis and their potential roles in cancer. Cancer and Metastasis Reviews. 2020:1-9.

30.       Zou Z, Tao T, Li H, Zhu X. mTOR signaling pathway and mTOR inhibitors in cancer: progress and challenges. Cell & bioscience. 2020;10(1):1-11.

31.       Zhang Y, Huang B, Wang H-Y, Chang A, Zheng XS. Emerging role of microRNAs in mTOR signaling. Cellular and Molecular Life Sciences. 2017;74(14):2613-25.

32.       Takei N, Inamura N, Kawamura M, Namba H, Hara K, Yonezawa K, et al. Brain-derived neurotrophic factor induces mammalian target of rapamycin-dependent local activation of translation machinery and protein synthesis in neuronal dendrites. Journal of Neuroscience. 2004;24(44):9760-9.

33.       Kim BW, Choi M, Kim Y-S, Park H, Lee H-R, Yun C-O, et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling regulates hippocampal neurons by elevation of intracellular calcium and activation of calcium/calmodulin protein kinase II and mammalian target of rapamycin. Cellular signalling. 2008;20(4):714-25.

34.       Carroll M, Warren O, Fan X, Sossin WS. 5‐HT stimulates eEF2 dephosphorylation in a rapamycin‐sensitive manner in Aplysia neurites. Journal of neurochemistry. 2004;90(6):1464-76.

35.       Ishizuka Y, Kakiya N, Nawa H, Takei N. Leucine induces phosphorylation and activation of p70S6K in cortical neurons via the system L amino acid transporter. Journal of neurochemistry. 2008;106(2):934-42.

36.       Ballou LM, Lin RZ. Rapamycin and mTOR kinase inhibitors. Journal of chemical biology. 2008;1(1):27-36.

37.       Sabatini DM. mTOR and cancer: insights into a complex relationship. Nature Reviews Cancer. 2006;6(9):729-34.

38.       Dixit N, Baboota S, Kohli K, Ahmad S, Ali J. Silymarin: A review of pharmacological aspects and bioavailability enhancement approaches. Indian journal of pharmacology. 2007;39(4):172.

39.       Ramasamy K, Agarwal R. Multitargeted therapy of cancer by silymarin. Cancer letters. 2008;269(2):352-62.

40.       Radko L, Cybulski W. Application of silymarin in human and animal medicine. Journal of Pre-Clinical and Clinical Research. 2007;1(1).

41.       Parish R, Doering P. Treatment of Amanita mushroom poisoning: a review. Veterinary and human toxicology. 1986;28(4):318-22.

42.       Boojar MMA, Boojar MMA, Golmohammad S. Overview of Silibinin anti-tumor effects. Journal of Herbal Medicine. 2020;23:100375.

43.       Cao J, Li X, Tian H. Metal-organic framework (MOF)-based drug delivery. Current medicinal chemistry. 2020;27(35):5949-69.

44.       Wuttke S, Braig S, Preiß T, Zimpel A, Sicklinger J, Bellomo C, et al. MOF nanoparticles coated by lipid bilayers and their uptake by cancer cells. Chemical Communications. 2015;51(87):15752-5.

45.       Chen WH, Luo GF, Sohn YS, Nechushtai R, Willner I. miRNA‐Specific Unlocking of Drug‐Loaded Metal–Organic Framework Nanoparticles: Targeted Cytotoxicity toward Cancer Cells. Small. 2019;15(17):1900935.

46.       Chen Q, Xu M, Zheng W, Xu T, Deng H, Liu J. Se/Ru-decorated porous metal–organic framework nanoparticles for the delivery of pooled siRNAs to reversing multidrug resistance in taxol-resistant breast cancer cells. ACS applied materials & interfaces. 2017;9(8):6712-24.

47.       Gohulkumar M, Gurushankar K, Prasad NR, Krishnakumar N. Enhanced cytotoxicity and apoptosis-induced anticancer effect of silibinin-loaded nanoparticles in oral carcinoma (KB) cells. Materials Science and Engineering: C. 2014;41:274-82.

48.       Snima K, Arunkumar P, Jayakumar R, Lakshmanan V-K. Silymarin encapsulated poly (D, L-lactic-co-glycolic acid) nanoparticles: a prospective candidate for prostate cancer therapy. Journal of biomedical nanotechnology. 2014;10(4):559-70.

49. WHO monographs on selected medicinal plants. World Health Organisation. Geneva. 2002; V:2 P: 306-317

50. Van Erp NP, Baker SD, Zhao M, Rudek MA, Guchelaar HJ, Nortier JW. and et al. Effect of milk thistle (Silybum marianum) on the pharmacokinetics of irinotecan. Clin Cancer Res 2005; 11: 7800-7806.

51. Courteix C, Eschalier A. and Lavarenne J. Streptozocininduced diabetic rats: behavioral evidence for a model of chronic pain. Pain 1993; 53: 81-88.

52. Zhang DL, Zhang YT, Yin JJ. and Zhao BL. Oral administration of crataegus Flavonoids protects against ischemia/reperfusion brain damage in gerbils. J Neurochem 2004; 90: 211-219

53. Savickiene N, Dagilyte A, Lukosius A. and Zitkevicius V. Importance of biologically active components and plants in the preventation of complications of diabetes mellitus. Medicina(Kaunas) 2002; 38: 970-975

54. Chlopcikova S, Psotova J, Miketova P. and Simanek V. Chemoprotective effect of plant phenolices against anthracyclineinduced toxicity on rat cardiomyocytes. Phytother Res 2004; 18:

55. Kittur S, Wilasrusmee S, Pedersen WA, Mattson M, Straube-West K, Wilasrusmee C, Jubelt B, Kittur DS. Neurotrophic and neuroprotective effects of milk thistle (Silybum marianum) on neurons in culture. Journal of Molecular Neuroscience. 2002 Jun;18(3):265-9.

56. Tsai YH, Yang YN, Ho YC, Tsai ML, Mi FL. Drug release and antioxidant/antibacterial activities of silymarin-zein nanoparticle/bacterial cellulose nanofiber composite films. Carbohydrate polymers. 2018 Jan 15;180:286-96.

57. Rios JL, Recio MC. Medicinal plants and antimicrobial activity. Journal of ethnopharmacology. 2005 Aug 22;100(1-2):80-4.

58. Faezizadeh Z, Gharib A, Godarzee M. Investigation of Antibacterial Activity of Silymarin-loaded Nanoliposomes against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Journal of Advances in Medical and Biomedical Research. 2014 Jun 10;22(93):86-5.

59.       Zhai C, Zhang H, Du L, Wang D, Xing D, Zhang M. Nickel/iron-based bimetallic MOF-derived nickel ferrite materials for triethylamine sensing. CrystEngComm. 2020;22(7):1286-93.

60.       Ma A, Zhang R. Facile synthesis of redox-responsive paclitaxel drug release platform using metal-organic frameworks (ZIF-8) for gastric cancer treatment. Materials Research Express. 2020;7(9):095402.

61.       Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Bio/technology. 1993;11(9):1026-30.

62. Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Analytical biochemistry. 1979 Jun 1;95(2):351-8.

در پژوهش حاضر چارچوب های آلی فلزی نیکل-آهن بارگیری شده با سیلیمارین سنتز و مشخصه یابی شده و اثرات بیولوژیک این نانوفرمولاسیون در مدلهای درون تنی و برون تنی مورد ارزیابی قرار میگیرد.

ندارد

دستیابی به دانش درمان سرطان با استفاده از متابولیت های طبیعی (گیاهی) به جای درمان کلاسیک با شیمی درمانی

ندراد

ندراد

تمامی هزینه ها توسط مجری طرح تامین خواهد شد

ندارد

شامل این مطالعه نمی شود

مجری طرح (دکتر سامان سرگزی) پاسخگوی تمامی سوالات خواهد بود 

شامل این مطالعه نمی شود

شامل این مطالعه نمی شود

ندارد