بررسی اثرات فیتو شیمیایی و ضد عصاره تام 4 گونه از گیاهان بومی ایران ( تاجریزی سیاه، خرزهره، کارلا و زوفا ) بر روی سوش های بیماری زای غذایی

گیاه درمانی به عنوان شاخه ای از طب سنتی در یکصد سال گذشته نقش تعیین کننده در درمان بسیاری از بیماری ها ایفا می نموده است. با پیدایش داروهای شیمیایی و صنعتی و جایگزینی آنها با داروهای گیاهی به تدریج نقش آنها کمرنگ و ترکیبات شیمیایی و آنتی بیوتیک ها به طور وسیع در درمان بیماری های مختلف کاربرد پیدا نمود.

Herbal medicine as a branch of traditional medicine has played a decisive role in the treatment of many diseases in the last hundred years. With the emergence of chemical and industrial drugs and replacing them with herbal drugs, their role gradually faded and chemical compounds and antibiotics were widely used in the treatment of various diseases.

آیا محتوی ترکیبات فیتوشیمیایی گیاهان مورد بررسی در حد قابل قبول می باشد؟

آیا گیاه کارلا مهار­کننده رشد باکتری های بیماری زا مواد غذایی است؟

آیا گیاه زوفا مهار­کننده رشد باکتری های بیماری زا مواد غذایی است؟

آیا گیاه تاجریزی سیاه مهار­کننده رشد باکتری های بیماری زا مواد غذایی است؟

آیا گیاه خرزهره مهار کننده رشد باکتری های بیماری زا مواد غذایی است؟

 کدامیک از گیاهان  اثرات ضد باکتریایی بیشتری نسبت به بقیه دارد؟

آیا محتوی ترکیبات فیتو شیمیایی گیاهان مورد بررسی در حد قابل قبول می باشد

هدف از این مطالعه بررسی اثرات ضد باکتریایی و فیتوشیمیایی عصاره تام 4 گونه از گیاهان بومی ایران ( تاجریزی سیاه، خرزهره، کارلا و زوفا )  بر روی سوش های بیماری زای غذایی  است.

تعیین حداقل غلظت  مهار کنندگی و حداقل غلظت کشندگی عصاره گیاهان تاجریزی سیاه، خرزهره، کارلا و زوفا در مهار میکروارگانیسم های بیماری زا با منشا غذایی

بررسی مقایسه ای اثرات ضد باکتریایی گیاهان فوق با آنتی بیوتیک تتراسیکلین، سفکسیم، پنی سیلین، امیکاسین

بررسی خاصیت آنتی اکسیدانی ، فنلی و فلاونوئیدی  عصاره گیاهان تاجریزی سیاه، خرزهره، کارلا و زوفا

وزارت بهداشت درمان و آموزش پزشکی، سازمان غذا ­و دارو، سازمان حفاظت محیط ­زیست کشور و اداره کل دامپزشکی کشور بصورت بالقوه می­توانند از دست­آوردهای این طرح بهره­برداری کنند.

تعیین حداقل غلظت  مهار کنندگی و حداقل غلظت کشندگی عصاره گیاهان دارویی بر روی ده سویه باکتری

 حداقل غلظت مهار کنندگی: به کمترین مقدار از ماده ضد میکروبی گفته می شود که می تواند به طور قابل توجهی رشد یک ارگانیسم را مهار نماید.

فعالیت ضد میکروبی: فعالیت ضدمیکروبی به مفهوم عملکردهای ضد رشد و تکثیر میکروارگانیسم­ها می باشد که از  طریق مکانیسم هایی مختلفی توسط مواد آنتی میکروبیال انجام میشود.

فعالیت آنتی اکسیدانی: آنتی اکسیدان ها ترکیباتی هستند که با اکسایش خود موجب کاهش ترکیبات رادیکال شده و از بروز واکنش های اکسیداتیوی جلوگیری بعمل می آورند.

بنیادی کاربردی

سویه های باکتری های استافیلوکوکوس اورئوس ATCC1189، پروتئوس میرابیلیس ATCC7002 ، لیستریا مونوسیتوژنز ATCC1298، اشرشیا کلی ATCC25922 و ویبریو کلرا ATCC1611  تهیه شده از مرکز کلیکسیون قارچ و باکتری ایران می­باشد.

بسته به شرایط آزمایش 3 تا 7 نمونه برای هر تیمار

خاصیت ضد میکروبی عصاره متانولی و اتانولی 4 گیاه دارویی  بر روی باکتری های استافیلوکوکوس اورئوس، پروتئوس میرابیلیس، لیستریا مونوسیتوژنز، اشرشیا کلی و ویبریو کلرا   با روش های تعیین قطر هاله مهاری و میکرودایلوشن تعیین می گردد

برگ های تازه گیاهان مورد مطالعه پس ازجمع آوری از منطقه سیستان و خشک کردن جهت استحصال عصاره با استفاده از حلال های اتانول و متانول مورد استفاده قرار خواهند گرفتند  میکروارگانیسم های مورد مطالعه نیز از مرکز کلیکسیون قارچ و باکتری ایران تهیه خواهند شدند.

ندارد

برگ­های گیاهان کارلا، زوفا، تاجریزی سیاه، خرزهره از منطقه سیستان جمع آوری خواهد شد . سپس نمونه­ها در شرایط سایه و دمای معمولی اتاق خشک شده و آسیاب خواهند شد. جهت عصاره­گیری به روش ماسراسیون سرد، 20 گرم از برگ گیاه پودر شده بطور جداگانه در حلال متانول و اتانول خیسانده و به مدت 24 ساعت روی شیکر نگهداری خواهند شد. بعد از یک روز، مواد از کاغذ صافی واتمن شماره 2 عبور داده شدند. سپس حلال­ها توسط دستگاه روتاری خلاء از مواد فیلتر شده خارج خواهند شد. عصاره غلیظ شده تا حاصل شدن عصاره خالص و زدوده شدن کامل حلال، به مدت 48 ساعت در آون با دمای 40 درجه سانتی­گراد نگهداری و در نهایت عصاره­های بدست آمده خشک شده و پس از توزین، تا زمان آزمایش در دمای 4 درجه سانتی­گراد در یخچال نگهداریخواهد شد.

سویه­های باکتریایی و شرایط کشت

 سویه­های باکتریایی از مرکز کلیکسیون قارچ و باکتری ایران خریداری می گردد.

 سویه­های باکتری شامل: استافیلوکوکوس اورئوس، پروتئوس میرابیلیس، لیستریا مونوسیتوژنز، اشرشیا کلی و ویبریو کلرا  روی محیط کشت نوترینت آگار تکثیر و تا زمان استفاده در یخچال با دمای 4 درجه سانتی­گراد نگهداری خواهد گردید.  

به منظور تهیه سوسپانسیون باکتریایی از کشت تازه و جوان باکتری، چند کلنی به محیط کشت مولر هینتون براث منتقل خواهد شد.  جهت یکسان نمودن کدورت سوسپانسیون میکروبی تهیه شده مطابق با لوله شماره 5/0 استاندارد مک فارلند (کدورت معادل 10⁸ × 5/1 باکتری در هر میلی­لیتر)، جذب نوری در طول موج 630 نانومتردر محدوده08/0 تا 1/0 تنظیم خواهد گردید. برای رسیدن به غلظت 10⁷ × 5/1 باکتری در هر میلی­لیتر، سوسپانسیون باکتریایی با کدورت 5/0 مک فارلند به نسبت 1/0 رقیق می گردد (معینی و همکاران، 1394). اثرات ضدمیکروبی عصاره­ها با غلظت 250 میلی­گرم بر میلی­لیتر به روش انتشار در آگار مورد بررسی قرار خواهد گرفت . به کمک سواب استریل از کدورت معادل 10⁷ × 5/1 باکتری در میلی­لیتر، روی محیط کشت مولر هینتون آگار به صورت یکنواخت کشت داده خواهد  شد. سپس در فاصله­های مناسب، تعدادی چاهک به قطر شش میلی­متر با عمق 5 میلی­متر ایجاد و  صد میکرولیتر از عصاره­ها درون چاهک مربوط به آن ریخته خواهد شد. آنتی­بیوتیک سیپروفلوکسازین به عنوان شاهد مثبت استفاده می گردد. بعد از 24 ساعت انکوباسیون در 37 درجه سانتی­گراد،قطرهاله عدم رشد نمونه­های باکتریایی بر حسب میلی­متر اندازه­گیری میگردد. به منظور تایید نتایج حاصل از آزمایش برای هر یک از عصاره­ها و برای هر نمونه باکتریایی، سه بار تکرارحواهد شد. 

تعیین حداقل غلظت مهار کنندگی و حداقل غلظت کشندگی عصاره گیاهان مختلف:

حساسیت سویه های باکتری استاندارد  نسبت به عصاره مورد با استفاده از روش رقت سازی در چاهک بررسی خواهد شد. . به هفت چاهک از پلیت های میکروتیتر میزان 100 میکرولیتر از محیط مایع مغذی مولر هینتون (MHB) اضافه شده. به چاهک اول 100 میلی لیتر از محلول رقیق شده عصاره اضافه و پس از مخلوط کردن 100 میکرولیتر از چاهک اول برداشته به چاهک دوم اضافه کرده و بدین ترتیب تا آخرین چاهک این کار انجام داده شد از چاهک آخر 100 میکرولیتر محیط کشت خارج کرده و مقدار 100 میکرولیتر از سوسپانسیون میکروبی حاوی 108 واحد در میلی لیتر معادل 5/0 مک فارلند اضافه خواهد شد و در انکوباتور در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت قرارخواهد گرفت. اولین لوله ای که از رشد باکتری پس از قرار دادن در انکوباتور جلوگیری کند به عنوان (MIC) در نظر گرفته خواهد شد .

 برای اطمینان از چاهک های شفاف 10 میکرولیتر برداشته به محیط مولر هینتون آگار منتقل خواهد کرد و پس از 24 ساعت اولین رقتی که توانسته 9/99 درصد باکتری را از بین ببرد به عنوان حداقل غلظت کشنده نشان داده می شود.

عصاره­گیری جهت سنجش­های فنل کل، فلاونوئید کل و آنتی­اکسیدانی

عصاره متانولی با روش ماسراسیون سرد و با نسبت 1:20 ماده خشک گیاهی و حلال متانول 80% تهیه خواهد گردید. نمونه­ها به مدت 48 ساعت درون حلال و بر روی شیکر با دور 120 rpm خیسانده خواهد شد. پس از آن با کاغذ صافی واتمن No.1 صاف  و جهت تغلیظ به دستگاه روتاری اواپوراتور با دمای 45 درجه انتقال خواهد یافت. یک ساعت پس از تغلیظ عصاره به زیر هود لامینار انتقال یافته تا مابقی حلال به تدریج تبخیر و عصاره خشک حاصل شود. از این عصاره خشک جهت تهیه عصاره متانولی جهت سایر سنجش­ها با غلظت 1 میلی­گرم بر میلی­لیتر استفاده خواهد شد.

سنجش میزان فنل کل

مقادیر ترکیب­های فنلی در عصاره متانولی گیاهی توسط روش لی و همکاران (Li et al., 2015) اندازه­گیری خواهد شد و نتایج بر حسب میلی­گرم گالیک اسید در گرم عصاره بیانمی گردد. بر طبق این روش مقدار 200 میکرولیتر از عصاره­ها (با غلظت 1 میلی­گرم بر میلی­لیتر)، در لوله­های آزمایش ریخته خواهد شد. 400 میکرولیتر معرف فولین سیوکالتو  (رقیق شده با آب مقطر به نسبت 1 به 10) و 400 میکرولیتر کربنات سدیم  7 درصد به مخلوط فوق اضافهو. بعد از 30 دقیقه نگهداری در دمای محیط، جذب نوری آن توسط اسپکتروفتومتر  در طول موج 765 نانومتر قرائتمی گردد. در نهایت با قرار دادن مقدار جذب عصاره در معادله خطی مربوط به منحنی استاندارد گالیک اسید (10، 50، 100، 150، 200 و 250 میلی­گرم بر میلی­لیتر) ، مقدار فنل کل موجود در عصاره محاسبه خواهد شد. داده­ها بر اساس معادل میلی­گرم گالیک اسید  بر گرم عصاره (mg GAE/g) بیان می گردد.

سنجش فلاونوئید کل

محتوای فلاونوئیدی عصاره­ها به روش رنگ­سنجی آلومینیوم کلرید  اندازه­گیری حواهد شد. در این روش به 500 میکرولیتر از عصاره متانولی، 100 میکرولیتر محلول آلومینیوم کلرید (10%)، 100 میکرولیتر محلول استات پتاسیم  یک مولار و 8/2 میلی­لیتر آب مقطر اضافه می گردد. نمونه­ها به مدت 40 دقیقه در دمای اتاق انکوبه و سپس جذب مخلوط در 415 نانومتر اندازه­گیریمی گردد. منحنی استاندارد بر اساس محلول با غلظت‌های متفاوت (mg/ml 550 -450-350-250-150-50) کوئرستین  رسم می گردد و میزان محاسبه فلاونوئید معادل میلی­گرم کوئرستین در هر گرم پودر خشک گیاه (mgQUEg^-1) محاسبه و تعیین خواهد شد ضمناً بلانک محلول نیز به همین صورت و بدون عصاره آماده می گردد . تمامی سنجش­ها در سه تکرار انجام خواهد شد

Y=2.1647x - 2.8775                                                                    

:Y عدد جذب ثبت شده در دستگاه اسپکتوفتومتر

:Xمیزان فلاونوئید کل

سنجش فعالیت آنتی­اکسیدان

سنجش فعالیت مهار رادیکال­­های آزاد DPPH  به روش باروس و همکاران صورت خواهد گرفت. این روش بر اساس تغییر رنگ محلول متانولی بنفش رنگ 2 و 2- دی فنیل-1- پیکریل-­ هیدرازیل به محلول زرد رنگ دی فنیل- پیکریل هیدرازین می-باشد. 250 میکرولیتر از عصاره با 750 میکرولیتر از محلول  DPPH  (دو میلی­گرم DPPH  در 50 میلی­لیتر متانول حل شد) مخلوط و. این نمونه­ها به مدت 30 دقیقه در شرایط تاریکی و دمای اتاق انکوبه خواهد شد و سپس میزان جذب آن در طول موج 517 نانومتر با دستگاه اسپکتوفتومتر قرائت می گردد. درصد مهار رادیکال­های آزاد با فرمول ذیل محاسبه می گردد:

(Ac-As)/Ac×100 = درصد مهار رادیکال آزاد  

AC: میزان جذب برای نمونه شاهد

میزان جذب نمونه گیاهی  :AS

برای هر تیمار سه تکرار مورد اندازه­گیری قرار می گیرد. آنالیز آماری داده­ها به کمک نرم­افزارآماری SAS نسخه 1/9 انجام خواهد شد و داده­ها بر اساس میانگین ± انحراف از معیار ارئه خواهد گردید

 بر اساس  دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهشهای علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی  در جمهوری اسلامی ایران

و بندهای 1-  9- 10- 11- -25 – 28- 29 – 30 –و 31

1- هدف اصلی هر پژوهش‌باید ارتقای سلامت انسان‌ها توأم با رعایت کرامت و حقوق ایشان باشد.

9-در پژوهش‌های پزشکی که ممکن است به محیط زیست آسیب برسانند، باید احتیاط‌های لازم در جهت حفظ و نگهداری و عدم آسیب رسانی به محیط ریست انجام گیرد.

10- هر پژوهشی باید بر اساس و منطبق بر یک طرح‌نامه (پروپوزال) به انجام برسد. در کارآزمایی‌های بالینی باید علاوه بر طرح نامه، دستورالعمل (پروتکل) نیز تهیه و ارائه شود. طرح‌نامه و دستورالعمل باید شامل تمامی اجزای ضروری باشد. از جمله بخش ملاحظات اخلاقی، اطلاعات مربوط به بودجه، حمایت کننده‌ها، وابستگی‌های سازمانی، موارد تعارض منافع بالقوه‌ی دیگر، مشوق‌های شرکت کنندگان، پیش بینی درمان و یا جبران خسارت افراد آسیب دیده در پژوهش .در مواردی که لازم است رضایت‌نامه‌ی آگاهانه به‌صورت کتبی اخذ شود، فرم رضایت‌نامه باید تدوین و به طرح‌نامه پیوست شده باشد. پیش از تصویب یا تأیید طرح‌نامه از سوی کمیته‌ی مستقل اخلاق در پژوهش، نباید اجرای پژوهش شروع شود.

11- کمیته‌ی اخلاق در پژوهش علاوه بر بررسی و تصویب طرح‌نامه و دستورالعمل، این حق را دارد که طرح‌‌ها را در حین و بعد از اجرا را از نظر رعایت ملاحظات اخلاقی مورد پایش قرار دهد. اطلاعات و مدارکی که برای پایش از سوی کمیته‌ی اخلاق درخواست می‌شود، باید از سوی پژوهشگران در اختیار این کمیته گذاشته شود.    

30 -گزارش‌ها و مقالات حاصل از پژوهش‌هایی که مفاد این راهنما را نقض کرده‌اند، نباید برای انتشار پذیرفته شوند.

31-روش پژوهش نباید با ارزش های اجتماعی، فرهنگی و دینی  جامعه در تناقض باشد.

محدودیت خاصی ندارد

سویه های باکتری، آنتی اکسیدان، میکرودایلوشن

1.Khakpour S, Akhlaghdoust M, Naimi S, Mohammad S, Mirlohi J ,Abedian M, et al.Effect of Biebersteinia Multifida DC. Root Extract on Cholesterol in Mice. Zahedan J Res Med Sci.2013; 15(11): 49-51.

2.Burt S. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods-a Review, International Journal of Food Microbiology,2004; 94(3): 253-223.

3. Abouhosseini Tabari M, Youssefi M R, Moghaddas E, Ebrahimi M A, Nabavi Mousavi N

and Naseri A. Antileashmanial activity of Artemisia sieberi essential oil against Leishmania

infantum in vitro. Advanced Herbal Medicine 2016; 2 (2): 40 - 6.

4. Fereshteh Sedighinia A S A, Saman soleimanpour, Reza zarif, Javad Asili and Ghazvini

K. Antibacterial activity of Glycyrrhiza glabra against oral pathogens: an in vitro study. AJP.

2012; 2 (3): 118 - 24.

.

5.Abu-Shanab B, ADWAN G M, Abu-Safiya D, Jarrar N and Adwan K. Antibacterial activities of some plant extracts utilized in popular medicine in Palestine. Turkish J. Biology 2005; 28 (2 - 4): 99 – 102

6. Dar K, Bhat A, Amin S, Zargar M and Masood A. Evaluation of Antibacterial, Antifungal and Phytochemical Screening of Solanum nigrum. Biochem Anal Biochem 6: 309

7. Shariatifar N, Shoeibi S, Sani M J, Jamshidi A H, Zarei A, Mehdizade A and Dadgarnejad M. Study on diuretic activity of saffron (stigma of Crocus sativus L.) Aqueous extract in rat. JAPTR. 2014; 5 (1): 17

8.Zendehdel M, Fallah R, Baghbanzadeh A, Pourrahimi M, Shariatifar N and Garavand S.  Effect of intracerebroventricular injection of aqueous extract and essential oil of Pulicaria gnaphalodes on PTZ-induced seizures in male rat. Physiology and Pharmacol. 2013; 17 (1): 94 – 100

9.Gandomi H, Abbaszadeh S, Rahimikia E and Shariatifar N. Volatile Organic Compound from Pulicaria gnaphalodes and the Antibacterial and Antifungal Properties of Its Essential Oil and Aqueous, Ethanolic and Methanolic Extracts. J. Food Processing and Preservation 2015; 39 (6): 2129 - 34.

10.Talaei Gh R and Delfan B. A study on the antibactrial effect of extracts of Annona

seneglaensis, Chrysanthemum, Rhus coriria on a number of gram positive and negative bacteria. Herbal Medicines J. 2013; 3 (3): 19 – 23

11. Perumalla A, Hettiarachchy NS. Green tea and grape seed extracts -Potential

applications in food safety and quality. Int. Food Res. J.2011;  44: 827-839.

12. Silvan M, Mingo E, Hidalgo M, Pascual- Teresa S, Carrascosa AV, Martinez-Rodriguez

AJ. Antibacterial activity of a grape seed extract and its fractions against Campylobacter

spp. Food Control. 2013; 29: 25-31

13. Clark A M. Natural products as a resource for new )drugs. Pharm Res . 1996; 13:1133-44.

14.Raghavendra K, Singh SP, Subbarao SK, Dash AP. Indian J. Med. Res. 2009; 130, 74.

15. Chen R, Feng L, Li HD, Zhang H, Yang F. Carbohydr. Res. 2009; 344, 1775.

16. Alam S, Asad M, Asdaq SM, Prasad VS. Antiulcer activity of methanolic extract of Momordica charantia L. in rats. J Ethnopharmacol 2009;123(3):464-469.

17. Santos KK, et al. Trypanocide, cytotoxic, and antifungal activities of Momordica charantia. Pharm Biol 2012;50(2): 162-166.

18.امینی، امیر. (1387). فرهنگ گیاهان دارویی کرد -فارسی- انگلیسی- عربی. تهران. آرام گستر. 286 صفحه.

19.امیدبیگی، رضا. (1378). تولید و فرآوری گیاهان دارویی. مشهد. آستان قدس رضوی.

20.زرگری، علی. (1376). گیاهان دارویی. تهران. دانشگاه تهران. 854 صفحه.

21.Mazzanti G. Salvatore G & Batinellil L. Antimicrobial properties of the linalol – rich essential oil ofHyssopus officinalis var. decumbens (Lamiac.eae). Flavour and Fragrance Journal. 1998, pp: 289- 294

22.Jankovasky M & Landa T. Genus Hy sopusl. recent knowledge. Horticultural science. 2012; 29: 119- 123.

23.Gonul H. Munevver S. Ersan B. Dimitra D & Atala S 2012. Automated and standard extraction of antioxidant phenolic compounds of Hyssopus officinalis L. ssp. Angustifolius. Journal of Industrial. Crops and Products.

24. مکری فاطمه، آسمار مهدی، ضرابی سعید، مسیحا علیرضا. برسی اثربخشی فعالیت ضد باکتریایی عصاره‌های آبی و اتانولی برگ گیاه خرزهره (Nerium oleander) در مقابل سویه‌های استاندارد سالمونلا تیفی و لیستریا منوسیتوژنز در شرایط آزمایشگاهی. مجله تازه های بیوتکنولوژی سلولی و مولکولی. ۱۳۹۷; ۸ (۳۱) :۷۵-۸۵

25. حیدری صادق ب، روحانی ر، دهمرده ن، جوادیان ف. بررسی خاصیت ضدمیکروبی گیاهان دارویی خرزهره، گوا، مرزه و خردل سفید بر روی سالمونلا تیفی موریوم. کیفیت و ماندگاری تولیدات کشاورزی و مواد غذایی، 1402، (4)2: 97-87.

26.هامون نورد سحر، بهرامی علی محمد، رزمجو مصطفی، اسدی سامانی مجید، حاتمی لک معصومه. تاثیر عصاره آبی گیاه خرزهره بر روی گونه های استافیلوکوکوس اورئوس و اپیدرمیس . مجله دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد. ۱۳۹۲; ۱۵ (۱) :۴۶-56

27.سراوانی خ., خواجه ح., سلطانیب., آبخوج., & جوادیانف. (1397). بررسی فعالیت ضد میکروبی عصاره‌ی اتانولی گیاه کارلا (Momordica Charantia) بر روی باکتری اسینتوباکتر بومانی جداسازی شده از نمونه‌های بالینی. مجله دانشکده پزشکی زابل, 1(1), 21-26

28.سعیدیان شهریار، اسلامی مریم، داشی پور علیرضا. بررسی اثر آنتی باکتریال عصاره الکلی و آبی کارلا بر باکتری های اشریشیا کولی و استافیلوکوکوس اورئوس. مجله علمی پژوهان. ۱۳۹۸; ۱۷ (۴) :۱۵-۲۴

29. شریعتی فر ن | پیرعلی همدانی م موذن م | احمدلو م | یزدانی د. مطالعه اثر ضد باکتریایی عصاره های آبی زیتون، تاجریزی سیاه، کلپوره، درمنه و شیرین بیان بر برخی باکتری های بیماریزای منتقله از غذا. 1398، (18)4: 263-273.

-