بررسی اثر مصرف متفورمین بر سطح سرمی آسپروسین و بیان ژن FBN1 در بافت چربی سفید موش های صحرائی های مبتلاء به دیابت نوع ۲

بین مصرف متفورمین و وزن گروه های مورد مطالعه رابطه معنا دار وجود دارد.

بین مصرف متفورمین و گلوکز خون گروه های مورد مطالعه رابطه معنا دار وجود دارد.

بین مصرف متفورمین  و سطح انسولین گروه های مورد مطالعه رابطه معنا دار وجود دارد.

بین مصرف متفورمین و  HOMA-IR  گروه های مورد مطالعه رابطه معنا دار وجود دارد.

بین مصرف متفورمین و بیان ژن آسپروسین در بافت چربی سفید رابطه معنا دار وجود دارد .

بین مصرف متفورمین و سطح سرمی آسپروسین رابطه معنا دار وجود دارد.

بررسی اثر مصرف متفورمین بر سطح سرمی آسپروسین و بیان ژن FBN1 در بافت چربی سفید  موش های صحرائی های مبتلاء به دیابت نوع ۲

-تعیین و مقایسه میانگین سطح سرمی آسپروسین در گروههای مورد مطالعه

-تعیین و مقایسه وزن در گروههای مورد مطالعه

-تعیین و مقایسه گلوکز خون در گروههای مورد مطالعه

-تعیین و مقایسه سطح انسولین در گروههای مورد مطالعه

-تعیین و مقایسه HOMA-IR در گروههای مورد مطالعه

-تعیین اثر مصرف متفورمین بر بیان ژن آسپروسین در گروههای مورد مطالعه

نتایج این تحقیق میتواند تا حدودی تناقض یافته های متفاوت بر اساس اهداف تحقیق را روشنگری و تفسیر نماید.

وزارت بهداشت ،درمان و آموزش پزشکی

متفورمین : متفورمین یک داروی ضد دیابت خوراکی خط اول است که بیش از 60 سال است که در بالین برای درمان بیماران مبتلا به دیابت نوع 2 استفاده می شود(19).

آسپروسین : آسپروسین، یک آدیپوکین گلوکوژنیک است که از ژن فیبریلین 1 (FBN1) کدگذاری می شود و عمدتاً توسط بافت چربی سفید در طول روزه داری سنتز و آزاد می شود(6).

دیابت نوع 2: دیابت یک بیماری مزمن است که در صورت عدم درمان مناسب عوارض جدی ایجاد می کند که کیفیت زندگی بیماران را کاهش می دهد و هزینه های مراقبت از آنها را افزایش می دهد(20).دیابت انواع مختلفی دارد که دیابت نوع 2 (که قبلاً به عنوان دیابت غیر وابسته به انسولین شناخته می شد) شایع ترین شکل آن است که با هیپرگلیسمی، مقاومت به انسولین و کمبود نسبی انسولین مشخص می شود(21).

 مطالعه تجربی(Experimental study)

موشهای صحرائی بالغ نژاد ویستار آلبینو از جنس نر با محدوده وزنی 200 تا 250 گرم

با توجه به مطالعات گذشته،  در هرگروه 8 سر حیوان و در مجموع 32 سر حیوان با مشخصات فوق الذکر

قرار گرفتن حیوانات در گروه ها به صورت تصادفی ساده خواهد بود.

ابتدا دیابت در موش ها با رژیم پرچرب و دوز پایین STZ القا خواهد شد و پس از آن قند خون آن ها توسط گلوکومتر اندازه گیری می شود .پس از القای دیابت،موش ها با داروی متفورمین(بصورت گاواژ) تحت درمان قرار خواهند گرفت.وزن موش ها به صورت هفتگی و قبل و بعد مداخله توسط ترازو اندازه گیری خواهد شد.پس از پایان مداخله موش ها تشریح می شوند و خون (برای اندازه گیری سطح آسپروسین) و بافت چربی سفید (برای اندازه گیری میزان بیان ژن آسپروسین) جمع آوری می شود .پس از آن با استفاده از کیت الایزا، سطح آسپروسین خون و با استفاده از تکنیکQuantitative real-time PCR  (qRT-PCR) میزان بیان ژن  آسپروسین در بافت چربی سفید را مورد سنجش قرار می دهیم.

در این مطالعه در مجموع 32 سر موش نر، نژاد ویستار سفید در محدوده وزنی 250- 200 گرم انتخاب می‌شوند.آن هارا در یک اتاق با دما و رطوبت کنترل شده، با 12ساعت روشنایی 12 ساعت چرخه تاریکی،با دسترسی آزاد به آب و غذای ویژه حیوانات آزمایشگاهی نگهداری می کنیم. پس از تطابق و سازگاری با محیط،موش ها را در 4گروه (n=8) به صورت تصادفی قرار میدهیم.

گروه اول :گروه سالم (شاهد)

گروه دوم :گروه غیر دیابتی و دریافت کننده متفورمین(400mg/kg/day)(22)

گروه سوم : گروهی که به آن ها تنها دیابت نوع 2 القا شده است و مداخله دیگری صورت نمی گیرد .

گروه چهارم : گروهی که به آن ها دیابت نوع 2 القا شده است و دریافت کننده متفورمین(400mg/kg/day)

القای دیابت نوع 2

حیوانات با تغذیه یک رژیم غذایی پرچرب حاوی 40 درصد چربی (HFD) به مدت 4 هفته، و به دنبال آن یک تزریق داخل صفاقی STZ با دوز پایین (45 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن، محلول در 0.05 میلی‌مولار بافر سیترات در  PH 4.5) دیابتی خواهند شد(23). یک هفته پس از تزریق، سطح گلوکز خون ناشتا (FBG) از خون دم با استفاده از گلوکومتر تعیین خواهد شد. موش هایی با سطح FBG بالای 200 میلی گرم در دسی لیتر به عنوان دیابتی در نظر گرفته می شوند.(24).

ضمنا در پایان مطالعه حیوانات با استفاده از داروهای کتامین و زایلازین بیهوشی عمیق میشوند. سپس سر حیوانات با استفاده از گیوتین جدا خواهد شد ودر نهایت لاشه حیوانات در داخل کوره به خاکستر تبدیل میشود.

تجویز  متفورمین

پس از آنکه به موش های گروه های  به مدت یک ماه  متفورمین را به صورت گاواژ و به میزان400mg/kg/day  دریافت خواهند کرد.

استخراج بافت

48 ساعت پس از آخرین مرحله مداخله با متفورمین و پس از یک شب ناشتایی ، حیوانات از طریق تزریق درون صفاقی زایلازین (10میلی گرم/کیلوگرم) و کتامین (75میلی گرم/کیلوگرم) بی هوش خواهیم کرد و پس از تشریح، چربی زیر پوستی از ناحیه ران را برداشته و در داخل میکروتیوب قرار می دهیم . سپس میکروتیوب حاوی بافت را به سرعت در داخل فریزر(80-) نگهداری می کنیم.(پیوست 1)

اندازه گیری آزمایشگاهی

جهت بیان ژن: به جهت بررسی بیان ژن مراحل زیر به ترتیب انجام خواهد شد :

۱- استخراج توتال RNA از بافت چربی موش با استفاده از  محلول RNX شرکت سیناکلون

۲- بررسی کیفیت RNA استخراج شده با استفاده از دو روش الکتروفورز بروی ژل آگارز و سنجش نسبت جذب نوری OD260/OD280 توسط دستگاه نانودراپ

۳- تعیین غلظت RNA استخراج شده توسط دستگاه نانودراپ

۴- استفاده از غلظت ۲۰۰ نانوگرم از RNA استخراج شده به جهت سنتز cDNA

۵- انجام واکنش qRT-PCR با استفاده از پرایمر های اختصاصی مربوط به ژن های FBN1 و ACTB (بتا-اکتین)

بعنوان house keeping gene

۶- آنالیز نتایج حاصل از واکنش qRT-PCR با استفاده از روش 2^-∆∆CT

۷- گزارش بیان ژن بصورت fold change

پروتکل  استخراج  ‏RNA

1. اضافه کردن 1میلی لیتر RNX^TM -PLUS   سرد به هموژن بافتی 
2. مخلوط کردن به مدت  5 تا 10ثانیه و سپس به مدت 5دقیقه در  دمای اتاق انکوبه خواهد گردید .
3.  اضافه کردن µL200 از کلروفرم به مخلوط مرحله قبل و به مدت  ۱۵ ثانیه به آرامی مخلوط خواهد گردید .
4. انکوبه کردن در یخ یا در دمای ۴ درجه سانتی گراد به مدت ۵ دقیقه
5. در مرحله بعد، در دمای ۴ درجه سانتی گراد وبه مدت ۱۵ دقیقه در ۱۲ هزار دور در دقیقه سانتریفیوژ خواهد شد.
6. فاز آبی را به میکروتیوب RNAse-free منتقل (بدون اختلال در فاز میانی) و به حجم مساوی ایزوپروپانول اضافه می شود.
7.  به آرامی روی یخ به مدت ۱۵ دقیقه انکوبه و مخلوط خواهد شد.
8. در دمای ۴ درجه سانتی گراد برای ۱۵ دقیقه در ۱۲ هزار دور در دقیقه سانتریفیوژ خواهد شد.
9. مایع رویی را دور ریخته خواهد شدو یک میلی لیتر  الکل ۷۵ درصد اضافه می کنیم. به مدت کوتاهی مخلوط و در چهار درجه سانتیگراد برای 8 دقیقه در ۷۵۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ خواهد شد.
10. مایع رویی را دور بریزید و بگذارید رسوب  برای چند دقیقه در دمای اتاق خشک شود.
11. حل کردن رسوب  در آب دپس (DEPC -water) تا به حل شدن کمک کند. بهتر است میکروتیوب  را به مدت ۱۰ دقیقه در آب 60-55 درجه سانتی گراد قرار داده خواهد شد.

پروتکل واکنش سنتز cDNA

1-  مواد مورد نیاز را بر اساس جدول زیر مخلوط کنید:

2- موارد فوق را سریع مخلوط می کنیم.

3- انکوبه کردن به مدت 10 دقیقه در دمای C° 25

4- انکوبه کردن به مدت 60 دقیقه در دمای C° 4

5- پس از رسیدن به دمای C° 85 و نگه داشتن در این دما بمدت 5 دقیقه، واکنش را متوقف می کنیم.

6- سرد کردن در یخ یا در دمای C° 4  

 بعد از سنتز cDNA،  برای ژن  FBN1 (GENE ID: 83727) پرایمر طراحی خواهد شد. صحت  طراحی پرایمر توسط ابزار BLAST مورد تائید قرار خواهد گرفت. در نهایت در واکنش qRT-PCR میزان بیان ژن FBN1 در بافت چربی بررسی خواهد شد.

برای محاسبات آماری از نرم افزار 20 SPSS استفاده خواهد شد. ابتدا توزیع داده ها با آزمون کولموگروف – اسمیرنوف بررسی می شود سپس در صورت نرمال بودن توزیع، برای مقایسه متغیر ها از تست آماری ANOVA استفاده می شود. اگر توزیع داده ها نرمال نباشد از آزمون های غیر پارامتریک معادل استفاده خواهد شد. برای مقایسه بین داده های کیفی از آزمون های ناپارامتریک کروسکال والیس و من وینتی استفاده می شود. سطح معنی داری کمتر از 0.05 در نظر گرفته می شود.

بررسی ها بر اساس پروتکل ها و دستور العمل های توصیه شده دانشگاه برای نگه داری و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی انجام خواهد شد و روش انجام کار به تایید کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی زاهدان خواهد رسید.همچنین چک لیست کار با حیوانات آزمایشگاهی مصوب وزارت متبوعه تکمیل وپیوست-3 می شود. تمام موارد ذیل با رعایت ملاحظات اخلاقی انجام خواهد شد.

-امکانات فیزیکی:اتاقهای نگهداری،شرایط محیط نگهداری مثل تهویه ،دما،رطوبت ، روشنایی ، سروصدای .

-پرسنل آموزش دیده

-شرایط نگهداری:تامین غذا،آب،بهداشت

-روش انجام تحقیق مثل تزریق ، خون گیری (پیوست2)

مرگ موش ها در طول دوره دیابتی شدن و مداخله

مشکل  تهیه مواد آزمایشگاهی

Type 2 diabetes mellitus; Asprosin; Metformin

1.            Cho NH, Shaw J, Karuranga S, Huang Y, da Rocha Fernandes J, Ohlrogge A, et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes research and clinical practice. 2018;138:271-81.

2.            Esteghamati A, Larijani B, Aghajani MH, Ghaemi F, Kermanchi J, Shahrami A, et al. Diabetes in Iran: prospective analysis from first nationwide diabetes report of National Program for Prevention and Control of Diabetes (NPPCD-2016). Scientific reports. 2017;7(1):1-10.

3.            Who. Diabetes: Who; 2021 [Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/diabetes.

4.            Zheng Y, Ley SH, Hu FB. Global aetiology and epidemiology of type 2 diabetes mellitus and its complications. Nature reviews endocrinology. 2018;14(2):88-98.

5.            Romere C, Duerrschmid C, Bournat J, Constable P, Jain M, Xia F, et al. Asprosin, a fasting-induced glucogenic protein hormone. Cell. 2016;165(3):566-79.

6.            Yuan M, Li W, Zhu Y, Yu B, Wu J. Asprosin: a novel player in metabolic diseases. Frontiers in endocrinology. 2020;11:64.

7.            Mazur-Bialy AI. Asprosin—A Fasting-Induced, Glucogenic, and Orexigenic Adipokine as a New Promising Player. Will It Be a New Factor in the Treatment of Obesity, Diabetes, or Infertility? A Review of the Literature. Nutrients. 2021;13(2):620.

8.            McCreight LJ, Bailey CJ, Pearson ER. Metformin and the gastrointestinal tract. Diabetologia. 2016;59(3):426-35.

9.            Gong L, Goswami S, Giacomini KM, Altman RB, Klein TE. Metformin pathways: pharmacokinetics and pharmacodynamics. Pharmacogenetics and genomics. 2012;22(11):820.

10.         Zhou J, Massey S, Story D, Li L. Metformin: an old drug with new applications. International journal of molecular sciences. 2018;19(10):2863.

11.         Rena G, Hardie DG, Pearson ER. The mechanisms of action of metformin. Diabetologia. 2017;60(9):1577-85.

12.         Foretz M. xE, brard S, Leclerc J, Zarrinpashneh E, Soty M, Mithieux G, Sakamoto K, Andreelli F, Viollet B. Metformin inhibits hepatic gluconeogenesis in mice independently of the LKB1/AMPK pathway via a decrease in hepatic energy state. The Journal of clinical investigation. 2010;120(7):2355-69.

13.         Li E, Shan H, Chen L, Long A, Zhang Y, Liu Y, et al. OLFR734 mediates glucose metabolism as a receptor of asprosin. Cell metabolism. 2019;30(2):319-28. e8.

14.         Gozel N, Kilinc F. Investigation of plasma asprosin and saliva levels in newly diagnosed type 2 diabetes mellitus patients treated with metformin. Endokrynologia Polska. 2021;72(1):37-43.

15.         Al-Daghri NM, Alokeel RM, Alamro A, Ansari MG, Hussain SD, Amer OE, et al. Serum asprosin levels are associated with obesity and insulin resistance in Arab adults. Journal of King Saud University-Science. 2022;34(1):101690.

16.         El Kattawy HA, Ashour WM. Anti-asprosin: a potential protective role against the progression of diabetic nephropathy in type 2 diabetic rats. American journal of biomedical sciences. 2019;11(3):183-99.

17.         Zhang X, Jiang H, Ma X, Wu H. Increased serum level and impaired response to glucose fluctuation of asprosin is associated with type 2 diabetes mellitus. Journal of diabetes investigation. 2020;11(2):349-55.

18.         Jiang A, Feng Z, Yuan L, Zhang Y, Li Q, She Y. Effect of sodium–glucose co-transporter-2 inhibitors on the levels of serum asprosin in patients with newly diagnosed type 2 diabetes mellitus. Diabetology & Metabolic Syndrome. 2021;13(1):1-6.

19.         An H, He L. Current understanding of metformin effect on the control of hyperglycemia in diabetes. The Journal of endocrinology. 2016;228(3):R97.

20.         Ríos JL, Francini F, Schinella GR. Natural products for the treatment of type 2 diabetes mellitus. Planta medica. 2015;81(12/13):975-94.

21.         Olokoba AB, Obateru OA, Olokoba LB. Type 2 diabetes mellitus: a review of current trends. Oman medical journal. 2012;27(4):269.

22.         Ismail TA, Soliman MM, Nassan MA. Molecular and immunohistochemical effects of metformin in a rat model of type 2 diabetes mellitus. Experimental and therapeutic medicine. 2015;9(5):1921-30.

23.         Saad MI, Kamel MA. Modulation of Adipocytokines Production and Serum NEFA Level by Metformin, Glimepiride, and Sitagliptin in. 2015.

24.         Saad MI, Kamel MA, Hanafi MY, Helmy MH, Shehata RR. Effect of sitagliptin and glimepiride on glucose homeostasis and cAMP levels in peripheral tissues of HFD/STZ diabetic rats. American Journal of Biomedical Research. 2014;2(3):52-60.

فرم پیوست یک

فرم اطلاعاتی

طرح تحقیقاتی : بررسی اثر مصرف متفورمین بر بیان ژن آسپروسین و  ژن FBN1 در موش صحرائی های مبتلا به دیابت نوع 2

مجری طرح: علی دشت کار

گروه مورد مطالعه(سر)

میانگین وزن موش(gr)

میانگین سطح آسپروسین سرم(ng/mL)

میزان مصرف متفورمین(gr/day)

قند خون ناشتا (mg/dl)

بیان ژن FBN1 در بافت چربی(Fold change)

فرم پیوست 2

وزارت بهداشت درمان و آموزش پزشکی

دانشگاه علوم پزشکی زاهدان

معاونت پژوهشی

چک لیست کار با حیوانات آزمایشگاهی

براساس کدهای راهنمای کار باحیوانات ابلاغی وزارت بهداشت

مقدمه: حیوانات نقش بسیار مهمی در ارتقاء علوم‌پزشکی داشته و مبانی اخلاقی و تعالیم  ادیان الهی حکم می‌کنند که به حقوق حیوانات پایبندباشیم، اگرچه ممکن است در زمینه‌های مختلف علمی پژوهشی حقوق انسانها نیز رعایت نشده و گهگاه اعمال ضد اخلاقی دیده شود ولی بهرحال هرچه به سمت توسعه بالنده و پایدار قدم برمی‌داریم ضرورتهای همراه آن را باید پذیرفته و رعایت حقوق حیوانات در زمینه پژوهشی هم از جمله آنها می‌باشد  بر این اساس محققین می بایست در پژوهشهایی که بروی حیوانات صورت می گیرد ،اصول اخلاقی پژوهش حیوانات را رعایت کنند. در این خصوص چک لیست کار با حیوانات آزمایشگاهی  برای هر یک از طرحهای مرتبط می بایست تکمیل و همراه پروپوزال طرح ارایه گردد.

عنوان پژوهش : بررسی اثر مصرف متفورمین بر بیان ژن آسپروسین و  ژن گیرنده آن در موش صحرائی های مبتلا به دیابت نوع 2

 شرایط حمل ونقل و نگهداری حیوانات آزمایشگاهی :

- قفس ها امکان استراحت حیوان را دارند    .  بلی     خیر 

- حیوانات در مجاورت حیوانات شکارچی خود قرار نگرفته‌اند .  بلی     خیر 

-قفس مناسب برای مشاهده توسط فرد مراقب می‌ باشد.    بلی     خیر 

- امکان فرار از قفس وجود ندارد .    بلی     خیر 

- امکان آسیب و جراحت حیوان در اثر جابجایی وجود ندارد    . بلی     خیر 

- تغذیه مناسب حیوان صورت می‌گیرد    بلی     خیر 

-شرایط تنظیم حرارت و برودت ،نور و هوای تنفسی تا حمل به محل  دایم حیوان فراهم میباشد     بلی     خیر 

- وسیله نقلیه حمل حیوان دارای شرایط و مجوز لازم برای محل حیوان می‌باشد .              بلی     خیر 

-فضا و قفس مناسب  با گونه حیوان وجود دارد             بلی     خیر                                                                                        

تهویه وتخلیه فضولات بنحویکه بوی آزار دهنده وامکان آلرژیزایی و انتقال بیماری  نباشد وجود دارد     بلی     خیر              

-ذخایر آب و غذا، روشنایی و رنگ مناسب در محل نگهداری حیوانات بکار رفته است      بلی     خیر                                          

 - فضا برای ذخیره سازی اجساد و  لاشه حیوانات و دفع آنها وجود دارد          بلی     خیر                                                        

- فضای کافی وراحت برای پرسنل اداری و تخصصی و تکنیسین ها وجود دارد    بلی     خیر                                                     

- فضای کافی برای استراحت مراقبین و ... وجود دارد      بلی     خیر                                                                                         

-  سلامت حیوان توسط فرد تحویل گیرنده کنترل می‌شود           بلی     خیر                                                              

-از حیوانات بیمار یا دارای شرایط ویژه مثل بارداری وشیردهی استفاده نمیشود بلی      خیر                                       

-فرصت لازم برای سازگاری حیوان با محیط و افراد قبل از پژوهش فراهم می‌شود               بلی      خیر                       

- قبل از ورود حیوانات، براساس نوع و گونه شرایط لازم نگهداری وجود داشته است       بلی     خیر                         

- در صورت نگهداری  درفضای باز حیوان دارای پناهگاه می‌باشد    بلی       خیر                                                     

 - در فضای بسته شرایط لازم از نظر نور ، اکسیژن، رطوبت ،دما ، فراهم می‌باشد .               بلی     خیر         

-قفس‌‌ها و دیوار کف و سایر بخش‌های ساختمانی قابل شستشو وضد عفونی می‌باشد           بلی         خیر                                          

-شستشو و ضدعفونی کردن فضای نگهداری انجام می‌شود    بلی      خیر                                                                

-فضا و ساختمان نگهداری دارای امکانات لازم برای سلامت حیوانات می‌باشد   بلی        خیر                                                                                    

شرایط اجرای پژوهش های حیوانی :

- گونه خاص حیوانی برای آزمایش مناسب با تحقیق انتخاب شده است ؟           بلی      خیر     

-حداقل حیوان مورد نیاز برای صحت آماری و حقیقی پژوهش استفاده شده است؟     بلی      خیر                

-امکان استفاده از برنامه‌های جایگزینی بهینه بجای استفاده از حیوان وجود نداشته است ؟     بلی      خیر                      

-حداقل آزار در مراحل مختلف تحقیق   و در روش اتلاف حیوان پس از تحقیق بکار رفته است؟     بلی     خیر                             

-درپروپوزالهای پژوهشی  کدهای کار با حیوانات رعایت شده است ؟     بلی       خیر                                                                      

- درکل مدت مطالعه کدهای کار با حیوانات رعایت شده است ؟     بلی       خیر                                                                        

-نتایج تحقیق منجر به ارتقاء سلامت جامعه می‌گردد ؟       بلی       خیر                                                 

                                                                                                                                                   نام و نام خانوادگی مجری طرح:علی دشت کار

                                                                                                                                                   امضا  :