بررسی تاثیر رژیم روزه داری متناوب بر نقایص شناختی و غلظت های بافتی ریلین و آلفاسینوکلئین در رت های مبتلا به آلزایمر

آلزایمر رایج ترین نوع فراموشی و در عین حال رایج ترین بیماری نورودژنراتیو که با زوال پیشرونده حافظه و عملکردهای شناختی تشخیص داده میشود.ویژگی های پاتولوژیک آلزایمر شامل : کلافهای نوروفیبریلاری داخل سلولی (تجمع پروتئین تاو) و تجمع پپتیدهای بتا آمیلویید تشکیل دهنده پلاک ها در پارانشیم مغز و همچنین در دیواره های مویرگ های داخل مغزی است ،تجمع مخرب پلاک ها و کلافها در منطقه ای بنام هیپو کامپ شروع می شود، که مسئول ایجاد خاطرات است. به همین دلیل اختلال حافظه کوتاه مدت معمولا اولین نشانه بیماری آلزایمر است.

با توجه به اینکه مطالعات انجام شده در زمینه ارتباط رژیم روزه داری متناوب و سطوح بافتی ریلین و آلفاسینوکلئین بسیار محدود بوده و تغیییرات این دو ماده پروتئینی در بیماری آلزایمر مشاهده شده است لذا مطالعه حاضر به منظور بررسی تاثیر رژیم روزه داری متناوب بر نقایص شناختی و سطوح بافتی ریلین و آلفاسینوکلئین در رت های مبتلا به آلزایمر انجام خواهد شد

Alzheimer's is the most common type of forgetfulness and at the same time the most common neurodegenerative disease that is diagnosed with the progressive deterioration of memory and cognitive functions. The pathological features of Alzheimer's include: intracellular neurofibrillary tangles (accumulation of tau protein) and accumulation of beta-amyloid peptides forming plaques in In the parenchyma of the brain, as well as in the walls of intracerebral capillaries, the destructive accumulation of plaques and tangles begins in an area called the hippocampus, which is responsible for creating memories. For this reason, short-term memory impairment is usually the first symptom of Alzheimer's disease. 

Studies have shown that Reelin plays a role in the formation of memory and cognitive function after birth. Reelin deficiency is associated with clinical dementia in Alzheimer's patients and cognitive defects in rats, and dementia caused by Lewy bodies (alpha-synuclein accumulation) is the third cause. Neurodegenerative diseases are like Alzheimer's and Alzheimer's disease leads to progressive deterioration of memory and learning and actually cognitive defects.

Currently, there is no definitive cure for Alzheimer's, and adopting a diet has been explored as a new therapeutic and preventive approach. Dietary restriction can prevent Alzheimer's-related brain changes through multiple mechanisms such as neuron protection and amyloid clearance. Mechanisms mediated by metabolic changes following fasting may reduce neuropathology and improve cognitive deficits in Alzheimer's mice. Forgive includes: reduction of amyloidogenic enzymatic processing of beta amyloid precursor protein, suppression of inflammation, positive regulation of adaptive pathways resistant to neural stress.Clinical evidence and experimental studies show the protective effect of the fasting diet against Alzheimer's disease by reducing the accumulation of alpha-synuclein and improving memory and learning, and this diet has the ability to improve Alzheimer's by producing ketone bodies.

Considering that the studies conducted on the relationship between intermittent fasting and tissue levels of reelin and alpha-synuclein are very limited and the changes of these two protein substances have been observed in Alzheimer's disease, therefore the present study aims to investigate the effect of intermittent fasting on cognitive defects and The tissue levels of reelin and alpha-synuclein in rats with Alzheimer's disease will be determined.

آلزایمر(AD)^[1] رایج ترین نوع فراموشی و در عین حال رایج ترین بیماری نورودژنراتیو که با زوال پیشرونده حافظه و عملکردهای شناختی تشخیص داده میشود(1). طبق آمار سازمان جهانی بهداشت در سال 2019 در سراسر جهان نزدیک به 50 میلیون نفر مبتلا به AD یا زوال عقل مرتبط با آن هستد وهمچنین 68% از افزایش پیش بینی شده شیوع جهانی و بار زوال عقل تا سال 2050 در کشورهای با درامد کم ومتوسط خواهد بود(2). این بیماری امروزه در ردیف بیماری هایی که بار سلامتی زیادی بر جامعه تحمیل میکنند قرار میگیرد، و هزینه‎های ناشی از این بیماری رشد رو به جلوی ۵ برابری تا سال ۲۰۲۵ خواهد داشت (3). شیوع AD در ایران 3.2% تخمین زده شد. ویژگی های پاتولوژیک آلزایمر شامل : کلافهای نوروفیبریلاری داخل سلولی (پروتئین تاو) و تجمع پپتیدهای بتا آمیلویید (Aβ ) ^[2] تشکیل دهنده پلاک ها در پارانشیم مغز و همچنین در دیواره های مویرگ های داخل مغزی است(4, 5). تجمع مخرب پلاک ها و کلافها در منطقه ای بنام هیپو کامپ شروع می شود، که مسئول ایجاد خاطرات است. به همین دلیل اختلال حافظه کوتاه مدت معمولا اولین نشانه بیماری AD است.

ریلین یک گلیکو پروتئین ماتریکس خارج سلولی ضروری برای رشد طبیعی سیستم عصبی جنینی، در بیومکانیسم های یادگیری و حافظه نقش دارد(6). مخچه بالاترین بیان ریلین را در مغز دارد(6). نقش های مهمی نه تنها در رشد مغز بلکه در بلوغ مغز شامل: تنظیم مهاجرت عصبی، دندریتوژنز، توسعه سیناپس، انعطاف پذیری سیناپسی هیپوتالاموس و حافظه و یادگیری دارد (7) ریلین تشکیل آمیلوئید بتا را به تاخیر می اندازد و علاوه بر این، نتایج نشان می دهد از نقص شناختی AD پیشگیری میکند(8). کاهش ریلین یک پدیده بسیار اولیه در طول روند بیماری است و حتی خیلی قبل تر از آسیب شناسی آمیلوئید در هیپوکامپ موش و در مرحله پره کلینیکال AD در قشر مغز انسان قابل تشخیص است (9). ریلین واسطه های کلیدی فسفریلاسیون پروتئین تاو را مهار میکند (7). بنابراین کمبود ریلین با میزان بیشتر فراموشی و زوال عقل در بیماران AD و کاهش شناختی در موش ها مرتبط است(10).

آلفاسینوکلئین(Syn –α) ^[3]یک پروتئین 140 اسید امینه ای است که به فراوانی در پایانه های عصبی نورون های پیش سیناپسی وجود دارد، در پایانه های عصبی به سطح خارجی وزیکول های سیناپسی متصل میشودو در فرایند انتقال نوروترنسمیترها نقش دارد(11). پروتئین اصلی تشکیل دهنده اجسام لویی (lewy bodies) است که توده هایی هستند که از تجمع غیرطبیعی پروتئین در داخل سلولهای عصبی تحت تاثیر بیماری پارکینسون و برخی دیگر از اختلالات، رشد میکنند(12). علاوه بر Aβ و تاو پروتئین ، مطالعات اخیر نشان می دهد که Syn –α نیز ممکن است در پاتوژنز بیماری الزایمر مشارکت داشته باشد. حضور همزمان Aβ وSyn –α در کالبدشکافی در بیش از 50% از بیماران مبتلا به AD مشاهده میشود. این بیماران در مقایسه با آلزایمر کلاسیک، نرخ افزایش زوال شناختی و طول عمر کوتاه تری را نشان می  دهند. بار پلاک Aβ قشر مغز با بار Syn –α همبستگی دارد و با زوال شناختی مرتبط است. این داده ها نشان می دهد که Syn –α می تواند تاثیر قابل توجهی بر تجمع Aβ داشته باشد(13). بنابراین، کاهش Syn –α میتواند یک استراتژی درمانی برای بیماری AD در نظر گرفته شود(13).

یکی از ضروریات برای بقاء در انسانها، یادگیری و حافظه است. یادگیری، قدرت تغییر رفتار در نتیجه تجربیات است و حافظه به عنوان محصول نهایی یادگیری برای حفظتجربیات یادگرفته شده ضروری است. یادگیری و حافظه و بطور کلی فرایندهای شناختی در بیماری AD تحت تاثیر قرار می گیرند زیرا هیپوکامپ مغز که برای حافظه و یادگیری ضروری است بسیار مستعد آسیب حتی در سطوح اولیه بیماری است (14). مطالعات نشان داده اند که ریلین پس از تولد در شکل گیری حافظه و عملکرد شناختی نقش دارد.کمبود ریلین با زوال عقل بالینی بیشتر در بیماران AD و نقایص شناختی در رت ها مرتبط است. در مدل رت های آلزایمری که ژن مربوط به ریلین نیز در آنها خاموش شده بود ، اختلال حافظه فضایی در رت های بالغ ایجاد شد(6). فراموشی ناشی از لویی بادی ها سومین علت بیماری های نورودژنراتیو مثل AD است و همانطور که گفته شد الفاسینوکلئین در تشکیل لویی بادی ها نقش دارد و بیماری آلزایمر منجر به زوال پیشرونده حافظه و یادگیری میشود(15).

در چند سال اخیر، به محدودیت رژیمی  به عنوان یک استراتژی محافظت از نورون ها توجه شده است. همچنین محدودیت رژیمی می تواند از تغییرات مربوط به سن در عملکرد حرکتی و شناختی، شکل پذیری دندرتیک و عملکرد گلیال در موش ها و رت ها جلوگیری کند. نتایج مطالعات انسانی و مدل های حیوانی نشان می دهد که محدودیت رژیمی میتواند از تغییرات مغزی مرتبط با الزایمر از طریق مکانیسم های چندگانه مثل محافظت نورونی و پاکسازی امیلوئید پیشگیری کند.علی رغم فواید زیاد محدودیت رژیمی، یک نگرانی مهم اثر این استراتژی بر وزن بدن و متابولیسم انرژی است زیرا کاهش وزن میتواند در زمینه الزایمر باعث افزایش بار بیماری شود. بیشتر پروتکل های محدودیت رژیم شامل محدودیت کالری و در نتیجه کاهش وزن در درصدهای متغیر میشود. برنامه های دوره ای محدودیت غذایی که باعث کاهش وزن  نمیشوند، جایگزین های بالقوه قابل اجرا هستند.در کار حاضر هدف ما بررسی اثرات یک پروتکل محدودیت غذایی دوره ای، که باعث کاهش وزن نمیشود، بر تعدیل تغییرات شناختی و مغزی مرتبط با بیماری الزایمر در مدل موش های صحرایی است(16).

روزه داری متناوب( IF^[4]) به معنی مصرف غذا در دوره های زمانی خاص یا روزه داری به مدت یک روز کامل تعریف میشود و چون روزه داری ممکن است باعث دهیدراتاسیون شود مصرف آب،چای و قهوه بدون شکر در طول مدت روزه داری مجاز است. (17) انواع IF :

1. (TRF^[5]) 16/8: خوردن در محدوده زمانی ، دریافت غذا در بازه زمانی 8 ساعته و عدم مصرف غذا در 16 ساعت باقیمانده
2. روزه به مدت 24 ساعت کامل (ADF^[6]) :روزه داری برای مدت 24 ساعت و بعد از آن دریافت غذا بدون محدودیت یا روزه داری دوره ای مثلا 2-3 روز در هفته

هر بار که غذا مصرف میشود ذخایر گلیکوژن کبد بازسازی میشوند ، گلیکوژن کبدی 700-900 کالری به شکل گلوکز فراهم میکند که این مقدار حدود10-14 ساعت در افرادی که فعالیت ورزشی ندارند طول میکشد و در نهایت ذخایر گلیکوژن کبد تخلیه میشود و سطوح گلوکز در گردش پایین باقی می ماند و در صورت ادامه یافتن محدودیت دریافت غذا(روزه داری) ، در این زمان سلولهای چربی اسید چرب ازاد می کنندکه این اسیدهای چرب در کبد به کتون بادی های بتا هیدروکسی بوتیرات(BHB^[7]) واستواستات تبدیل میشوند اینها وارد خون شده و به عنوان سوبسترای انرژی توسط نورونها مصرف میشوند(18). زمانی که چربی نسبت به گلوکز به عنوان منبع اولیه انرژی محسوب میشود، کتون ها بطور طبیعی در پاسخ به گرسنگی تولید میشوند (19). کتون بادی ها از سد خونی مغزی به واسطه ناقل ها عبور میکنند و منبع عمده انرژی مغز در زمان محدودیت گلوکز هستند(20). مکانیسم هایی که توسط تغییرات متابولیسمی به دنبال IF ممکن است نوروپاتولوژی را کاهش دهد و نقایص شناختی را در موش های مبتلا به AD بهبود ببخشد شامل: کاهش پردازش آنزیمی آمیلوئیدوژنیک پروتئین پیش ساز Aβ ، سرکوب التهاب، تنظیم مثبت مسیرهای سازگاری مقاوم به استرس عصبی است (21).

IF ممکن است رویکردی برای افراد در معرض خطر یا مبتلا به بیماری AD باشد که توسط مطالعه ای نشان داده شد که ظرف 48 ساعت پس از شروع روزه داری، 7 تا 8 برابر افزایش جذب مغزی از کتون ها وجود دارد علاوه براین ،در حالی که برداشت سلولهای مغز از گلوکز در بیماران مبتلا به AD به شدت مختل شده ، این سلولها همچنان قادر به استفاده از کتون ها هستند(18).

شواهد بالینی و مطالعات تجربی اثر محافظتی رژیم روزه داری و یا رژیم کتوژنیک را علیه بیماری الزایمر از طریق کاهش تجمع Syn –α و بهبود حافظه ویادگیری نشان میدهد(22) .شواهد نشان میدهد که روزه داری با تولید BHB (از کتون بادی ها) ، توانایی بهبود علائم آلزایمر را دارد(23) . در حال حاضر هیچ درمان موثری برای آلزایمر وجود ندارد و اتخاذ یک رژیم غذایی به عنوان رویکردهای درمانی جدید مورد بررسی قرارگرفته است(22).

هدف از انجام این طرح بررسی تاثیر رژیم IF بر نقایص شناختی و فاکتورهای ریلین و Syn –α است که پیش تر در مورد نقش مهم آنها در بیماری آلزایمر بحث شد

مروری بر مطالعات گذشته:

1. لازیک و همکاران در سال 2020 ، اثرات پیشگیرانه رژیم یک روز درمیان (EOD) را بر روی 27 موش های ماده (تعداد 18 موش ترنسژنیک 5XFAD (مدل موش متداول  بیماری الزایمر) و 9 کنترل) در مدت 4 ماه  ارزیابی کردند. برخلاف اثرات محافظتی پذیرفته شده ناشی از محدودیت غذایی بر روی نورون ها و سیناپس ها در طول پیری ، رژیم EOD اثرات مضری در قشر مغز موش های ماده 5XFAD دارد و تغذیه یک روز در میان التهاب و نقایص عصبی را در مدل موش های مبتلا به آلزایمر تشدید میکند.مطالعات آینده میتواند پاسخ دهد که اگر درمان در موش های 5XFAD قبل از شروع  التهاب عصبی شروع یا از الگوی محدودیت غذایی متفاوتی مانند رژیم محدودیت کالری استفاده شود، تاثیرات متفاوت خواهد بود یاخیر(24).
2. بهومیک و همکاران در سال 2020، این مطالعه بر روی18 موش های صحرایی نر ویستار8 ماهه (3 گروه 6تایی: گروه1: کنترل، گروه 2: TRF ، 16 ساعت روزه داری و 8 ساعت دسترسی به غذا در روز،گروه3: ADF ،دسترسی به غذا یک روز در میان)  اثرات مفید روزه داری متناوب (ADF) و تغذیه با محدودیت زمانی(TRF)  برای سلامتی را در مدت زمان 1 ماه ارزیابی کرده و مقایسه ای بین هر دو نوع مداخله ارائه کردند. در گروه ADF کاهش ROS  نسبت به دو گروه دیگر مشاهده شد و کاهش IL-6 و افزایش سطوح آنتی اکسیدانی در هر دو گروه TRF و  ADF دیده شد و در نهایت روزه داری متناوب منجر به بهبود سلامت و به تاخیرانداختن بیماری های مرتبط با افزایش سن می شود(25).
3. پارک و همکاران در سال 2020، رت های نر با وزن حدود 194گرم به مدت 8 هفته تحت مداخله قرار گرفتند. این مطالعه بیان میکند تولید کتون با رژیم کتوژنیک و روزه متناوب اثرات متفاوتی بر میکروبیوتای روده و پیشرفت بیماری در مدل موش های مبتلا به آلزایمر دارد .رت ها در 5 گروه 10 تایی تقسیم شدند : رت های آلزایمری با رژیم نرمال (28% چربی) ، رژیم کتوژنیک (81% چربی)، رژیم با کربوهیدرات بالا(68% کربوهیدرات، 13% چربی) ،رژیم نرمال به صورت روزه داری متناوب و گروه کنترل. عملکردهای شناختی که  با تست Y-maze سنجیده شد و تجمعات بتا آمیلوئید در دو گروه رت ها آلزایمری که رژیم روزه متناوب و رژیم با کربوهیدرات بالا مصرف میکردند به ترتیب پایین تر و بالا تر بود(26).
4. موریس و همکاران در سال 2015، این مطالعه روی 32 موش نر بالغ (6 هفته) با وزن بین 230-270 گرم انجام شد، موش ها بر اساس نوع رژیم در دو گروه تقسیم شدند: 1. رژیم معمول با 12% چربی، 23% پروتئین، 65% کربوهیدرات) 2. رژیم کافه تریا با 32% چربی، 10% پروتئین و 57% کربوهیدرات( همان رژیم معمول همراه با قند بالا، چربی بالا و غذاهای با مواد مغذی ناچیز (poor junk foods) مثل: کوکی، کیک و بیسکوییت و..). این رژیم ها به مدت 10 هفته ادامه پیدا کرد. کالری دریافتی، وزن و بافت چربی سفید در گروهی که رژیم کافه تریا دریافت کردند بطور معناداری بیشتر بود و از طرفی بیان mRNA ریلین در هیپوکامپ به طور معناداری کاهش یافته بود و نشان داده شد سطوح ریلین کمتر با تجمع چربی بدن در موش ها ارتباط معکوس دارد(27).

ضرورت انجام طرح: با توجه به اینکه مطالعات انجام شده در زمینه ارتباط رژیم IF و سطوح بافتی ریلین و آلفاسینوکلئین بسیار محدود بوده و تغیییرات این دو ماده پروتئینی در بیماری آلزایمر مشاهده شده است لذا مطالعه حاضر به منظور بررسی تاثیر رژیم روزه داری متناوب بر نقایص شناختی و سطوح بافتی ریلین و آلفاسینوکلئین در رت های مبتلا به آلزایمر انجام خواهد شد.

1. میانگین غلظت ریلین در گروه های مورد مطالعه تفاوت معنی دار آماری دارد.
2. میانگین غلظت آلفاسینوکلئین در گروه های مورد مطالعه تفاوت معنی دار آماری دارد
3. عملکردهای شناختی(مدت زمان سپری شده ، مسافت طی شده ، تعداد دفعات عبور از ربع هدف و مدت زمان شنا در ربع هدف) در گروه های مورد مطالعه تفاوت معنی دار آماری دارد.
4. بین میانگین غلظت ریلین و عملکردهای شناختی (مدت زمان سپری شده ، مسافت طی شده ، تعداد دفعات عبور از ربع هدف و مدت زمان شنا در ربع هدف) در گروه های مورد مطالعه ارتباط معنی دار آماری دارد.
5. بین میانگین غلظت آلفاسینوکلئین و عملکردهای شناختی (مدت زمان سپری شده ، مسافت طی شده ، دفعات عبور از ربع هدف و مدت زمان شنا در ربع هدف) در گروه های مورد مطالعه ارتباط معنی دار آماری دارد.

تعیین تاثیر رژیم روزه داری متناوب بر نقایص شناختی، غلظت های بافتی ریلین وآلفاسینوکلئین در رت های مبتلا به آلزایمر

1. تعیین و مقایسه میانگین غلظت ریلین در گروه های های مورد مطالعه
2. تعیین و مقایسه میانگین غلظت الفا سینوکلئین در گروه های مورد مطالعه
3. تعیین و مقایسه میانگین مدت زمان سپری شده،مسافت طی شده، تعداد دفعات عبور از ربع هدف و مدت زمان شنا در ربع هدف در گروه های مورد مطالعه
4. مقایسه میانگین غلظت ریلین و مدت زمان سپری شده ، مسافت طی شده ، تعداد دفعات عبور از ربع هدف ومدت زمان شنا در ربع هدف در گروه های مورد مطالعه
5. مقایسه میانگین غلظت آلفاسینوکلئین و مدت زمان سپری شده ، مسافت طی شده ، تعداد دفعات عبور از ربع هدف و مدت زمان شنا در ربع هدف در گروه های مورد مطالعه

دانشگاه علوم پزشکی زاهدان و مراکز تحقیقاتی فعال دانشگاه علوم پزشکی زاهدان

استفاده از نتایج مطالعه در تصمیم گیری و سیاست گزاری سازمانهای مربوطه مانند وزارت بهداشت و نظام سلامت 

آلزایمر: یک بیماری نورودژنراتیو مرتبط با سن، بیماری آلزایمر (AD) نوعی زوال عقل پیشرونده است که شامل اختلالات شناختی، از دست دادن یادگیری و حافظه می شود (1).

رژیم غذایی: رژیم تغذیه‌ای یا خوراک روزانه یا غذای معمول مجموعه خوراکی است که یک موجود زنده یا شخص مصرف می‌کند. بعضی اوقات انسان‌ها از رژیم تغذیه ای ویژه‌ای پیروی می‌کنند که ممکن است توسط متخصص تغذیه به آن‌ها توصیه شده باشد که به آن پرهیزانه یا رژیمِ درمانی می‌گویند (17).

 رژیم روزه داری متناوب: یک الگوی رژیمی بر پایه دوره های زمانبندی شده روزه داری است در دو نوع : رژیم روزه داری یک روز در میان و روزه داری متناوب 8/16(17).

ریلین: یک گلیکوپروتئین بزرگ ماتریکس برون سلولی ضروری برای رشد طبیعی سیستم عصبی جنینی و در بیومکانیسم های یادگیری و حافظه نقش دارد (7) .

آلفاسینوکلئین: آلفا سینوکلئین یک پروتئین عصبی است که انتشار وزیکول سیناپسی و ناقل عصبی متعاقب آن را تنظیم می‌کند. مقدار زیادی از این پروتئین در مغز وجود دارد، در حالی که مقادیر کمتری در قلب، ماهیچه‌ها و سایر بافت‌ها نیز یافت می‌شود (12).

عملکردهای شناختی: یکی از ضروریات برای بقاء در انسانها، یادگیری و حافظه است. یادگیری، قدرت تغییر رفتار در نتیجه تجربیات است و حافظه به عنوان محصول نهایی یادگیری برای حفظتجربیات یادگرفته شده ضروری است (14).

اختلال شناختی:  اختلال شناختی زمانی است که فرد در به خاطر سپردن، یادگیری چیزهای جدید، تمرکز، یا تصمیم گیری هایی که بر زندگی روزمره او تأثیر می گذارد، مشکل دارد. اختلال شناختی از خفیف تا شدید متغیر است (14).

تجربی

موش های صحرایی

معیارهای ورود:

1. 1. جنس نر
   2. نژاد ویستار
   3. محدوده وزن 200-250 گرم
   4. سالم

معیار های خروج:

1. جنس ماده
2. وزن کمتر از 200 گرم یا بیشتر از 250 گرم                    

فرمول زیر برای تعیین تعداد رت ها در هر گروه استفاده میشود:

اما برای حیوانات آزمایشگاهی که همسانی و شباهت بالایی دارند، معمولاً«n» بر اساس مطالعات قبلی است. در اکثر مطالعات ، تعداد رت ها در هر گروه 8 انتخاب شده است. با توجه به مطالعه Nermeen Faheem و همکاران حجم نمونه مورد مطالعه 48 سر موش صحرایی نر محاسبه گردید، رت ها در 6 گروه 8 تایی مورد مطالعه قرار خواهند گرفت(28).

در این مطالعه بعد از اطمینان از سالم بودن موشهای صحرایی به طور تصادفی به  چند گروه تقسیم شدند. از روش نمونه گیری آسان در دسترس استفاده خواهد شد.

گروه ها شامل:

1. گروه کنترل سالم با رژیم معمولی
2. گروه کنترل سالم با رژیم ADF
3. گروه کنترل سالم با رژیم TRF
4. گروه آلزایمری با رژیم ADF
5. گروه آلزایمری با رژیم TRF
6. گروه آلزایمری با رژیم معمولی

در مطالعه حاضر سیستم ثبت کننده در تست های رفتاری و دستگاه خوانش با الایزا در تست های بیوشیمیایی خواهد بود. (فرم پیوست1)

تزریق بتا آمیلوئید به داخل هیپوکامپ:

به منظور القای آلزایمر ، از آمیلوئید بتا فرم استات و ایبوتنیک اسید برای القای مدل استفاده می شود. ویال یک میلی گرمی آمیلوئید بتا در 200 میکرولیتر حلال دی متیل سولفوکساید  ده درصد حل خواهد شد،سپس محلول در میکروتیوبهایی با حجم 10 میکرولیتر توزیع خواهد شد.برای تشکیل فیبریل های آمیلوئید بتا که سمیت نورونی دارند محلول به مدت 5-7 روز در انکوباتور 37 درجه نگه داری می شوند. پس از بی هوش نمودن حیوان با ترکیبات کتامین (mg/kg90) و زایلازین (mg/kg  10) به صورت داخل صفاقی، ابتدا سر حیوان تراشیده خواهد شد و در صورت طولانی تر شدن فرایند جراحی تزریقات بیشتری به منظور بیهوشی کامل حیوان در تمامی مراحل جراحی صورت خواهد گرفت و از داروی دگزامتازون به سبب پیشگیری از التهاب مغز استفاده خواهد شد  و سپس حیوان در دستگاه استریوتاکسی قرار خواهد گرفت. سپس پوست سر برداشته خواهد شد و نواحی برگما و لامبدا پیدا خواهد شد و  بر اساس اطلس پاکسینوس ، در مختصات

( DV= -2.8 mm، ML= -2.2 mm  و AP = -3.0 mm) ، جهت دسترسی به ناحیهCA1 هیپوکمپ،  ابتدا با مته سوراخ ایجاد خواهد شد، سپس ترزیق انجام، بعد بخیه خواهیم زدو از قطره استامینوفن نیز به عنوان مسکن استفاده خواهد شد.  سپس، با استفاده از نتایج آزمون‏ رفتاری جهت  بررسی حافظه، به وسیله ی دستگاه شاتل باکس پس از 1 هفته از انجام تزریق ،  بیماری آلزایمر تأیید خواهد گردید.

رژیم دریافتی رت ها خوراک تولید شده توسط شرکت بهپرور با کد IVC:913990512871463 از ادراه کل دامپزشکی استان تهران خواهد بودکه حاوی: ذرت گندم ، کنجاله سویا، نشاسته، روغن گیاهی، ویتامین ها و مواد معدنی ضروری که شامل متیونین، لیزین، ترئونین، گلوتن، کولین ، نمک، جوش شیرین، مونو یا دی کلسیم فسفات ، کربنات کلسیم و بنتونیت می باشد. وزن خالص هر کیسه 25±1 کیلوگرم و انرژی قابل متابولیسم 2900 Kcal/Kg می باشدو درصد مواد تشکیل دهنده در جدول زیر آورده شده است:

در رت هایی که تغذیه IF از نوع TRF دریافت می کنند از 7 صبح تا 3 بعدازظهر (8 ساعت) به غذا دسترسی دارند و بعد از آن به مدت 16 ساعت روزه داری آغاز میشود و در رت هایی که نوع ADF دریافت می کنند به مدت 24 ساعت محرومیت از غذا و در 24 ساعت بعدی به غذا دسترسی دارند.

سنجش حافظه و یادگیری فضایی با استفاده از تست Morris Water Maze

ماز آبی موریس: این تست معمولا به نام ماز آبی موریس شناخته می شود. چون ریچارد موریس این تست را برای ترسیم جهت گیری فضایی در  موشهای صحرایی توسعه داد. ماز آبی موریس حوضچه دایره ای شکل تیره رنگی به قطر 160 سانتی متر و ارتفاع 60 سانتی متر است که تا ارتفاع 35 سانتی متر  با آب با دمای 2±25 پر می شود. این حوضچه به لحاظ جغرافیایی به 4 ربع دایره مساوی شمال، جنوب، غرب و شرق تقسیم می شود و در هر ربع دایره یک نقطه برای رها کردن حیوان در آب در نظر گرفته شده است. یک سکو به قطر 10 سانتی متر در مرکز ربع دایره ، 1.5 سانتی متر در زیر سطح آب و بصورت غیر قابل روئیت قرار دارد. بر روی دیوارهای اتاق در اطراف ماز سرنخهای فضایی (Spatial cues) که اشکال هندسی متفاوت هستند، نصب می شود. عملکرد حیوان از طریق یک دوربین مداربسته که متصل به سقف بالای ماز است به کامپیوتر و نرم افزار مربوطه منتقل شده تا پارامترهای لازم ازجمله زمان و مسافت طی شده تا یافتن سکو و همچنین سرعت حرکت حیوان ثبت شود.

تست یادسپاری یا کارآزمایی پروب: تست پروب 24 ساعت بعد از آخرین کارآزمایی روز چهارم انجام میشود.در تست پروب، سکو از داخل استخر برداشته می شود و هر موش از ربع مخالف به داخل استخر رها میشود.کارآزمایی پروب شامل دوره 60 ثانیه ای شنای آزاد بدون سکو و مدت زمانی که موش در ربع هدف شنا میکند و ثبت می شود، می باشد.میزان رفت و آمد به trigger zone و سرعت شنای موش ها نیز ثبت می شود.

اندازه گیری غلظت بافتی آلفاسینوکلئین و ریلین:

اندازه گیری براساس دستورالعمل های اختصاصی کیت های ریلین و الفاسینوکلئین شرکت ZellBio آلمان انجام میشود و براساس واحد مربوطه گزارش میشود.

ﭘﺲ از ﭘﺎﯾﺎن ﮐﺎر وبیهوشی با ترکیبات کتامین (mg/kg100) و زایلازین (mg/kg  10)کشتن حیوانات  ﺑـﺎ رعایت اﺻـﻮل اﺧﻼﻗـﯽ انجام میشود( سر حیوانات با استفاده از گیوتین جدا میشود. در نهایت اجساد در داخل کوره لاشه سوز به خاکستر تبدیل میشود) ، برای جدا کردن هیپوکمپ از باقیمانده مغز ابتدا مغز به شکلی قرار داده خواهد شد که سطح شکمی (ventral) به طرف بالا قرا گیرد .برای نمایان شدن هیپوکمپ توسط پنس مغز میانی( midbrain ) برداشته خواهد شد و در پایان هیپوکمپ جدا خواهد شد. هیپوکامپ ﺟﺪا و پس از شستشو با محلول سالین سرد و خشک کردن آن، به سرعت توزین شده و سپس بافت به همراه بافر تریس به مدت 2 دقیقه با دستگاه هموژنایزر با دور 5000 دور در دقیقه هموژنیزه خواهد شد و محلول هموژنیزه شده، سانتریفوژ خواهد شد. برای جلوگیری از تخریب آنزیم ها و پروتئین ها تمامی مراحل گفته شده در دمای 4 درجه سانتی گراد انجام خواهد شد. پس از انجام سانتریفوژ، محلول رویی شفاف از بقیه محلول جدا شده و بخش زیرین رسوب کرده دور ریخته خواهد شد. از محلول شفاف رویی برای سنجش غلظت ریلین و آلفاسینوکلئین هیپوکامپ استفاده خواهدشد

با توجه به احتمال 20% مرگ و میر در حیوانات گروه الزایمری  در صورت مرگ در ادامه روندکار با رت های دیگر جایگزین خواهد شد.

لازم به ذکر است که متغیرهای زیر به علت ایجاد تداخل احتمالی مد نظر قرار  گرفته اند:

متغیرهای مخدوش کننده:

 الف- دگزامتازون استفاده شده در مطالعه اثرات نوروتوکسیک بر قشر مغز موش شبیه پاتولوژی آلزایمر دارد. البته چون در این مطالعه از این دارو بصورت تک دوز و موضعی و با دوز بسیار کم استفاده می شود می توان از اثرات آن چشم پوشی کرد

ب- موش صحرایی به شکل روتین مدفوع خواری دارد. باید فرآیند مدفوع خواری موش ها مد نظر باشد. برای جلوگیری از این پدیده از صفحات توری در کف قفس استفاده خواهد شد تا حیوان به مدفوع خود دسترسی نداشته باشد.

اختلاف در میانگین داده ها در بین گرو های آزمایشی با آنالیز واریانس یک طرفه وپرتکرار بدنبال آن تست توکی تجزیه و تحلیل می شوند. نتایج غلظت پروتئین ها بر مبنای میکروگرم بر میلی گرم بافت بیان می شوند بعد از محاسبه میانگین گروه ها، میانگین ها با آنالیز ANOVA و بدنبال آن تست توکی تجزیه و تحلیل می شوند، P<0.05 به عنوان سطح معنی داری در نظر گرفته می شود و نتایج به صورت میانگین ± خطای استاندارد بیان می شوند

مقدمه:

استفاده از حیوانات در پژوهشهای دارویی و درمانی نیز کمک بسیاری در حل مشکلات مرتبط با سلامت انسان کرده است .

رسالت انسانی بشر اقتضای می کند در تمامی مراحل این پژوهشها سعی کندکه تا حد ممکن حقوق حیواناتیکه یاری دهنده انسان در دستیابی به رو شهای تشخیصی و درمانی هستند حفظ گردد.

برای آشنایی کاربران روند پژوهش از تولید و تحویل حیوان تا نگهداری و انجام مراحل آزمایش نیاز است که زنجیره موجود به روشنی شناخته و تفکیک شود و برای هر مرحله مقررات و آموزش های لازم تدوین و به اجرا در آید .

در این بحث ابتدا مراحل استفاده از حیوانات در انجام یک پژوهش علمی قدم به قدم مشخص و در هر مرحله ملاحظات اخلاقی مربوط ارائه م یگردد .

1. تهیه و حمل و نقل حیوانات

الف - قوانین معرفی گونه جدید به منطقه

ب - نحوه اسارت حیوانات

ج- نحوه نگهداری در اسارت

د -چگونگی حمل و نقل شامل وسایل حمل و نقل و قفسها

2. روش های نگهداری

الف - مکان: شامل فضای نگهداری، شرایط قفسها، نگهداری در فضای باز، تهویه، فاضلاب، نور پردازی، را ههای فرار در موارد اضطراری

ب - امکانات: شامل غذا، امکانات درمانی، شستشو

3. نیروهای اجرایی (مراقبت کنندگان حیوان)

الف - آموزش های لازم برای حفظ سلامت حیوان و انسان

ب - لباس و امکانات حفاظتی

ج- علاقه به کار و امکانات رفاهی لازم

د- آگاهی نسبت به اهمیت موضوع پژوهش

ه - اطلاع از علایم بیماری و سلامت حیوان

و- رعایت خصوصیات زندگی طبیعی حیوان در شرایط اسارت تا حد ممکن مانند اجتماعی بودن یا انفرادی بودن حیوان

ز -آگاهی از وضعیت آبستنی و شیردهی حیوان

4. کاربران پژوهش و محققین

الف - آگاهی از نوع، جنس و سایر شرایط حیوان مناسب برای آزمایش

ب - اطلاعات لازم در مورد تاثیر شرایط محیطی بر نتایج آزمایش

ج-عدم استفاده از حیوانات بیمار در آزمایش

1- تهیه و حمل و نقل حیوانات

الف - ورود هر گونه حیوانی به هر منطقه باید با مجوز سازمان حفاظت محیط زیست کشور باشد. سلامت حیوانات وارداتی باید پس از قرنطینه به تایید سازمان دامپزشکی کشور برسد تا اجازه حمل حیوان داده شود.در مورد حمل حیوانات بین استان ها نیز باید از قوانین جاری کشور که بر اساس نوع گونه حیوان و بیمار یهای شایع در شرایط خاص هر استان تدوین شده است استفاده شود.

ب - نحوه اسارت حیوان باید با معیارهای اخلاقی مطابقت داشته باشد. اسارت حیوانات در فصل تولید مثل و در دوران شیردهی مجاز نیست همچنین باید از استفادة ابزارهایی که باعث جراحت حیوان شوند پرهیز کرد .

ج- از زمان اسارت تا حمل به محل نگهداری دایم یا آزمایشگاه مورد نظر باید حیوان را در شرایط مطلوب و مناسب با گونه قرار داد. قفس ها باید به شکلی باشند که امکان استراحت حیوان فراهم شود. مجاورت حیوانات شکارچی با حیوانات دیگر حتی در قفس های مجزا که باعث ایجاد استرس در حیوانات میشود، مجاز نیست.

همچنین قفس ها باید طوری طراحی شده باشند که امکان مشاهده دایم حیوان توسط فرد مراقب فراهم باشد و حیوان در حرکات تند و ناگهانی خود توسط قطعات قفس مجروح نشود. همچنین قفس ها باید به شکلی بسته به گونه حیوان طراحی شده باشند که امکان فرار حیوان کاملا از بین رفته باشد.

تغذیه مناسب حیوان بسته به زمان رشد و سن حیوان و نیازهای معمول آن باید به نحو مناسب انجام گردد.

میزان آزار و اذیت حیوان به وضعیت سلامت حیوان، مزاج، گونه، سن، جنس، تعداد حیواناتی که با هم همراه هستند، ارتباط اجتماعی آنها، مدت زمان بی آب و غذا ماندن، طول مدت و روش حمل و نقل، وضعیت و شرایط محیط به خصوص بالا رفتن حرارت و میزان مراقبت در طول حمل و نقل بستگی دارد.

د- برای حمل و نقل حیوان باید از قفسهای مناسب با شرایط ذکر شده استفاده شود. در مسیرهای طولانی باید توقف های لازم و غذا دهی به حیوان بسته به گونه و عادت تغذیه ای انجام گردد. همچنین خودروهای حامل حیوانات باید شرایط برودتی و حرارتی و همچنین تهویه و استانداردهای امنیتی لازم از نظر احتمال تصادف، آتش سوزی و غیره را داشته باشند.

قفس ها باید با تسمه های مخصوص در جای خود محکم شده باشند و در مجموع شرایط و قوانین حمل حیوانات به طور کامل رعایت شود.

با توجه به عکس العمل های فیزیولوژیک حیوانات در طول حمل و نقل از جمله بیماری حرکت، در صورت لزوم و با توجه به گونه حیوان لازم است قبل و بعد از حمل حیوان توسط یک دامپزشک معاینه و حیوان تحت آرامبخشی مناسب حمل گردد .

2-روشهای نگهداری

الف - سلامت حیوان توسط تحویل گیرنده باید تایید و در صورت نیاز قرنطینه شود. حیوان جدیدالورود نباید تا اطمینان یافتن از سلامت عمومی به محل حیوانات دیگر منتقل گردد. در صورت وجود بیماری باید حیوان تحت درمان قرار گیرد.

ب - حیوانات قبل از ورود به مطالعه پژوهشی باید با افراد و محیط سازگار شوند .

ج- شرایط لازم نگهداری حیوان بر اساس گونه حیوان و نیازهای اختصاصی آن باید قبلا فراهم شده باشد.

امکانات نگهداری عبارتند از فضای نگهداری و تسهیلات لازم

فضای نگهداری: شامل حیاط ، چراگاه، قفس، ساختمان، دریاچه و غیره است که بر اساس نوع حیوان و مطالعه در دست انجام باید امکانات لازم را داشته باشد. این ساختما نها باید آسایش حیوان را تامین نمایند.

 برخی از امکانات عمومی که در همه موارد باید رعایت شوند عبارتند از:

الف - در صورتی که حیوان در فضای باز نگهداری می شود باید نیاز گونه مربوطه را تامین کند مثلا دارای پناهگاه باشد و غذا و آب و حفاظت در برابر حیوانات دیگر و همچنین نیازهای رفتاری و اجتماعی حیوان در نظر گرفته شوند.

ب - در فضاهای بسته باید کنترل عوامل محیطی مانند سرما، گرما، نور و رطوبت به آسانی ممکن باشد و از ورود موجودات موذی جلوگیری شود. همچنین تامین مواد غذایی و آب و در صورت نیاز دارو و فعالیتهای آزمایشی میسر باشد. قفس ها باید به شکلی طراحی شده باشند که آسایش حیوان تامین گردد و قابل ضدعفونی باشد.

دیوارها وکف و سایر بخشهای ساختمان نیز باید قابل شستشو و ضدعفونی باشند و مقاومت لازم را برای گونه خاص حیوانی داشته باشند.

تهویه کامل و کافی و همچنین تخلیه فضولات حیوانات به خوبی انجام گردد به نحوی که بوهای آزار دهنده وگازهای مضر مانند آمونیاک در محل وجود نداشته باشند.روشنایی و رنگ آمیزی محل نیز باید مناسب باشد و ذخایر غذا و آب نیز به میزان کافی موجود باشد.

از مواد ضدعفونی کننده، خوشبوکننده و حشره کش استاندارد باید استفاده شود به نحوی که برای حیوانات و همچنین روند پژوهش اثر نامطلوب به جا نگذارد.

صداهای اضافی نیز باعث آزار حیوانات می شود و باید از ایجاد آن پرهیز شود. همچنین تراکم قفسها در اتاق و یا تراکم حیوانات در قفس باید بر اساس نحوه زندگی و اندازه حیوان و همچنین نوع مطالعه متفاوت و مورد تایید مسئول باشد.

نحوه چیدن قفسها و طراحی اتاق باید به شکلی باشد که حرکت مراقبین و محققین و مشاهده حیوانات به سادگی امکان پذیر باشد.

3- نیروهای اجرایی شاغل

(باید زیر نظر یک دامپزشک متخصص تمامی موارد بهداشتی زیر آنترل شوند و روزانه گزارش کنترل موارد زیر به اطلاع و تایید او برسد).

الف - این افراد باید آموز شهای لازم را در مورد نحوه زندگی، سلامت و بیماری حیوان و نیازهای رفتاری واجتماعی آنها دیده باشند. بسته به نوع حیوان و نوع پژوهش تربیت این افراد متفاوت است ولی با این حال آموزش های عمومی برای این افراد لازم است تا از فعالیت های فیزیولوژیک مانند نیازهای غذا، آب، وضعیت آبستنی و شیردهی، تهویه، دفع مدفوع و ادرار، تغییرات رفتاری، نحوه زندگی(انفرادی، اجتماعی، شکارچی بودن) و رفتار حیوان مطلع باشد.

ب - کارکنان محل نگهداری حیوانات باید آموز شهایی در ارتباط با بیماریهای مشترک انسان و حیوانات مورد مطالعه و روش های جلوگیری از انتقال این بیمار یها را بدانند. همچنین لازم است که لباس، دستکش، چکمه، ماسک و سایر امکانات حفاظتی لازم را برای حفظ سلامت خود داشته باشند. برخی وسایل خاص مانند دستکش های مخصوص کار با جوندگان نیز باید فراهم باشد. نوع خطر هر حیوان (چنگ زدن، گاز گرفتن، نیش زدن و غیره) باید برای کارآنان کاملا آموزش داده شود تا در حفاظت خود مورد استفاده قراردهند.

ج -کارکنان بخش نگهداری حیوانات و آزمایشگاه پژوهش باید آگاهی نسبت به اهمیت موضوع پژوهش و اهمیت و نقش آنها در حفظ سلامت حیوان و در نتیجه صحت مطالعه داشته باشند.

4- محققین و پژوهشگران

پروژه طراحی شده باید توسط شورای پژوهشی مرکز از نظر رعایت شرایط و مقررات مذکور مورد بررسی قرارگیرد.

این موارد عبارتند از:

-انتخاب صحیح گونه حیوان برای مطالعه خاص

-استفاده از حداقل ممکن حیوان برای مطالعه

-ضرورت استفاده از حیوانات آزمایشگاهی برای مطالعه و عدم امکان جایگزینی آن با نرم افزارهای کامپیوتری و استفاده از تجارب دیگران

-آموزش لازم محققین برای شناخت زندگی و شرایط فیزیولوژیک حیوان (تغذیه، سلامت، بیماری، ناراحتی و درد و سایر تغییرات فیزیولوژیک و پاتولوژیک حیوان (

-آموزش اختصاصی در مورد گونه های خاص مورد استفاده

- اطلاعات لازم در مورد تأثیر شرایط محیطی بر نتایج آزمایش

- عدم استفاده از حیوانات بیمار در آزمایش

رسیدن کیت ها، نواسان قیمت ارز، مرگ و میر حیوانات

Alzheimer's Disease, Time Restricted Feeding, Intermittent Fasting, Reelin Protein, alpha-Synucline, Cognitive declines, Rat

1.            Sliwinska S, Jeziorek M. The role of nutrition in Alzheimer’s disease. Roczniki Państwowego Zakładu Higieny. 2021;72(1).

2.            Poorcheraghi H, Valieiny N, Rahimi M, Nazari S, Navab E. New findings on Alzheimer's and Covid-19 disease in elderly; An Integrated review study. Iranian Journal of Systematic Review in Medical Sciences. 2022;2(2):19-34.

3.            Alzheimer's is not normal aging — and we can cure it [Internet]. 2015. Available from: https://www.ted.com/talks/samuel_cohen_alzheimer_s_is_not_normal_aging_and_we_can_cure_it/transcript.

4.            Castellani RJ, Perry G. Tau biology, tauopathy, traumatic brain injury, and diagnostic challenges. Journal of Alzheimer's Disease. 2019;67(2):447-67.

5.            Selkoe D, Mandelkow E, Holtzman D. Deciphering alzheimer disease. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 2012;2(1):a011460.

6.            Marckx AT, Fritschle KE, Calvier L, Herz J. Reelin changes hippocampal learning in aging and Alzheimer’s disease. Behavioural brain research. 2021;414:113482.

7.            Yu N-N, Tan M-S, Yu J-T, Xie A-M, Tan L. The role of reelin signaling in Alzheimer’s disease. Molecular neurobiology. 2016;53:5692-700.

8.            Pujadas L, Rossi D, Andrés R, Teixeira CM, Serra-Vidal B, Parcerisas A, et al. Reelin delays amyloid-beta fibril formation and rescues cognitive deficits in a model of Alzheimer’s disease. Nature communications. 2014;5(1):3443.

9.            Herring A, Donath A, Steiner KM, Widera MP, Hamzehian S, Kanakis D, et al. Reelin depletion is an early phenomenon of Alzheimer's pathology. Journal of Alzheimer's Disease. 2012;30(4):963-79.

10.          Stranahan AM, Haberman RP, Gallagher M. Cognitive decline is associated with reduced reelin expression in the entorhinal cortex of aged rats. Cerebral Cortex. 2011;21(2):392-400.

11.          Goedert M. Alzheimer’s and Parkinson’s diseases: The prion concept in relation to assembled Aβ, tau, and α-synuclein. Science. 2015;349(6248):1255555.

12.          Shim KH, Kang MJ, Youn YC, An SSA, Kim S. Alpha-synuclein: a pathological factor with Aβ and tau and biomarker in Alzheimer’s disease. Alzheimer's Research & Therapy. 2022;14(1):1-14.

13.          Leitão AD, Spencer B, Sarsoza F, Ngolab J, Amalraj J, Masliah E, et al. Hippocampal Reduction of α-Synuclein via RNA Interference Improves Neuropathology in Alzheimer's Disease Mice. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 2023.

14.          Mu Y, Gage FH. Adult hippocampal neurogenesis and its role in Alzheimer's disease. Molecular neurodegeneration. 2011;6(1):1-9.

15.          Hershey LA, Coleman-Jackson R. Pharmacological management of dementia with Lewy bodies. Drugs & Aging. 2019;36:309-19.

16.          Gregosa A, Vinuesa Á, Todero MF, Pomilio C, Rossi SP, Bentivegna M, et al. Periodic dietary restriction ameliorates amyloid pathology and cognitive impairment in PDAPP-J20 mice: Potential implication of glial autophagy. Neurobiology of Disease. 2019;132:104542.

17.          Volpe SL. Intermittent Fasting—What Is It and Does It Work? ACSM's Health & Fitness Journal. 2019;23(1):34-6.

18.          Mattson MP, Moehl K, Ghena N, Schmaedick M, Cheng A. Intermittent metabolic switching, neuroplasticity and brain health. Nature Reviews Neuroscience. 2018;19(2):81-94.

19.          Dhamija R, Eckert S, Wirrell E. Ketogenic diet. Canadian journal of neurological sciences. 2013;40(2):158-67.

20.          Cunnane S, Nugent S, Roy M, Courchesne-Loyer A, Croteau E, Tremblay S, et al. Brain fuel metabolism, aging, and Alzheimer’s disease. Nutrition. 2011;27(1):3-20.

21.          Zilberter M, Ivanov A, Ziyatdinova S, Mukhtarov M, Malkov A, Alpár A, et al. Dietary energy substrates reverse early neuronal hyperactivity in a mouse model of Alzheimer's disease. Journal of neurochemistry. 2013;125(1):157-71.

22.          Versele R, Corsi M, Fuso A, Sevin E, Businaro R, Gosselet F, et al. Ketone bodies promote amyloid-β1–40 clearance in a human in vitro blood–brain barrier model. International Journal of Molecular Sciences. 2020;21(3):934.

23.          Nasaruddin ML, Syed Abd Halim SA, Kamaruzzaman MA. Studying the relationship of intermittent fasting and β-amyloid in animal model of Alzheimer’s disease: a scoping review. Nutrients. 2020;12(10):3215.

24.          Lazic D, Tesic V, Jovanovic M, Brkic M, Milanovic D, Zlokovic BV, et al. Every-other-day feeding exacerbates inflammation and neuronal deficits in 5XFAD mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiology of disease. 2020;136:104745.

25.          Bhoumik S, Kumar R, Rizvi SI. Time restricted feeding provides a viable alternative to alternate day fasting when evaluated in terms of redox homeostasis in rats. Archives of Gerontology and Geriatrics. 2020;91:104188.

26.          Park S, Zhang T, Wu X, Qiu JY. Ketone production by ketogenic diet and by intermittent fasting has different effects on the gut microbiota and disease progression in an Alzheimer’s disease rat model. Journal of clinical biochemistry and nutrition. 2020;67(2):188-98.

27.          Reichelt AC, Maniam J, Westbrook RF, Morris MJ. Dietary-induced obesity disrupts trace fear conditioning and decreases hippocampal reelin expression. Brain, Behavior, and Immunity. 2015;43:68-75.

28.          Faheem NM, El Askary A. Neuroprotective role of curcumin on the hippocampus against the structural and serological alterations of streptozotocin-induced diabetes in Sprague Dawely rats. Iranian journal of basic medical sciences. 2017;20(6):690.

فرم پیوست 1

پرسشنامه جمع آوری داده های تحقیق